TRL-2 拮抗剂在治疗再灌注损伤和组织损伤中的用途 技术领域 本发明涉及一种用于缺血再灌注损伤治疗和预防的方法。特别的， 本发明确定 Toll 样受体 2 为一种用于治疗或预防缺血再灌注损伤的新靶标。利用拮抗剂阻断 Toll 样 受体 2 的功能活性， 可下调与再灌注损伤有关的炎性过程， 对于给药 Toll 样受体 2 拮抗剂 的受体， 可改善其治疗结果。
背景技术
心力衰竭是一种病理生理性状态， 其中心脏不能以足够高的速率泵血来通过身体 的循环系统。该病症可引起充血性心力衰竭， 其由于心脏泵血功能降低导致过量液体堆积 而发生。心肌梗塞则是由于心脏组织的供血中断引起丧失供血区域的组织坏死而发生。
当器官或部分身体不能接受充足的供血时引起缺血。 据称缺乏足量供血的器官会 产生缺氧。短暂缺失后当血流重新回至器官时即发生再灌注。 再灌注损伤指当缺血一段时间供血再次恢复至组织时， 组织或器官发生的损伤。 缺血期间的氧和营养素缺乏使得当循环恢复时引起一段时间的炎症和氧化性损伤。 缺血再 灌注损伤的实例包括低氧、 中风、 心脏病发作、 慢性肾衰或器官移植。
再灌注损伤的病因是多方面的， 尽管其与促炎性免疫应答密切相关。 特别的， 血流 恢复至之前血流缺乏的区域可产生多种促炎性过程如白细胞粘附和浸润、 自由基释放和细 胞因子生成。而且， 发生缺血的区域中细胞膜的损伤可引起自由基进一步释放。还可发生 程序化细胞死亡 ( 凋亡 )， 而白细胞迁移至缺血区域可引起毛细血管阻塞， 从而导致血流限 制以及进一步缺血的伴随风险。 因此， 实际上， 缺血期后的血流恢复可能比缺血本身更具有 损伤性。
用于心肌梗塞治疗的治疗策略， 不论是药物或机械， 目的均在于开放闭塞的冠状 动脉或者使其保持开放， 以恢复心肌组织的血流和灌注。梗塞的相关动脉中血流的早期恢 复以及濒危的存活心肌的再灌注改善了临床结果， 然而， 自相矛盾的是， 再灌注本身引起心 肌坏死以及凋亡加速， 称为缺血 / 再灌注 (I/R) 损伤。因为由存活心肌组织丧失引起的并 发症在心肌梗塞后仍然比较普遍， 仅再灌注看来不足以拯救濒危心肌。
再灌注激活了由固有免疫系统介导的炎症反应， 由于促炎性细胞因子的释放以及 中性粒细胞与心肌细胞之间有害的细胞间相互作用， 该固有免疫系统的激活也引起了心肌 细胞的死亡。细胞内核因子 -κB(NF-κB) 信号通路介导心肌缺血 / 再灌注 (I/R) 损伤中 促炎性基因的转录。 此外， 氧的再引入导致有害自由基的生成增加， 促炎性介质增加以及与 此相关的坏死。再灌注的严重性可由于多个因素如缺血持续时间、 缺血的严重程度以及再 灌注的速度等而有所变化。
Toll 样受体 (TLRs) 构成一个模式识别受体家族， 其在激活固有免疫应答时具有 关键的作用。迄今已在人类中鉴定了 11 种 Toll 样受体。Toll 样受体家族的成员高度保 守， 大多数哺乳动物种属均具有 10-15 种 Toll 样受体。每一种 Toll 样受体均识别特异病 原体相关的分子标记。Toll 样受体 2(TLR2、 CD282、 TLR-2) 可利用粘肽、 脂蛋白和脂膜酸而
活化。 迄今为止的研究尚未能充分阐明缺血和再灌注过程中激发的调节性和炎性机制 之间的复杂相互作用。而且， 在不同动物样本、 不同受体和不同组织中， 缺血再灌注损伤表 现出的性质和变异性对于鉴定用于缺血再灌注的治疗性干预和预防的方法造成了进一步 的障碍。
经过深入的实验后， 本发明人惊人的鉴定出 Toll 样受体 2 在固有免疫应答的启动 和进展中发挥重要作用， 而其与经过缺血期的组织或器官中的缺血再灌注损伤有关。本发 明者还鉴定出， 具有 Toll 样受体 2 结合特异性且作为 Toll 样受体 2 激动剂发挥作用的化 合物在预防有害促炎性免疫应答 ( 其与再灌注损伤的形成有关 ) 方面非常有用。本发明者 因此鉴定出， 一种用于缺血再灌注损伤预防和治疗的治疗途径， 通过抑制 Toll 样受体 2 的 激活和信号传导而介导， 可能非常有效， 特别是由于 Toll 样受体 2 的保守性提示该治疗途 径在多种种属、 组织和细胞类型中治疗该病症提供一种通用方法。
发明内容 根据本发明的第一方面， 提供了一种降低缺血再灌注损伤中相关 TLR2 表达细胞 或组织中一种或多种 Toll 样受体 2(TLR2) 生物学活性的方法， 包括 ：
- 使该细胞或组织与至少一种 TLR2 活性或表达的拮抗剂相接触， 其量足以降低细 胞或组织中的一种或多种生物学活性。
如本文中定义的， 术语 “与缺血再灌注损伤相关的 TLR2 表达细胞或组织” 表示一 种可引起缺血再灌注损伤发病或进展的细胞或组织或者一种正经历缺血再灌注损伤的细 胞类型或组织。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 表达细胞或组织是心肌的细胞或组织。在某些实施 方式中， 该 TLR2 表达细胞或组织是与再灌注诱发的心脏炎性疾病相关的细胞或组织， 该疾 病选自由 ( 但不限于 ) 心肌缺血、 缺血性心脏病、 高血压性心肌缺血、 充血性心力衰竭、 组织 缺血、 器官缺血、 急性冠状动脉综合征、 肥大、 脑梗塞、 心肌梗塞、 心律失常和缺血再灌注损 伤 (I/R 损伤 ) 组成的组。
在某些实施方式中， 使组织和 / 或细胞与 TLR2 拮抗剂相接触的步骤在细胞裂解 物、 重组系统或培养的细胞中实施。 在某些实施方式中， 该接触步骤在受体体内存在的细胞 或组织上实施。在某些实施方式中， 该 TLR2 可能是人 TLR2 或鼠 TLR2。
在某些实施方式中， 该方法在正患有缺血再灌注损伤或有患缺血再灌注损伤风险 的人类个体上实施。
在某些实施方式中， 至少一种 TLR2 拮抗剂选自由 ( 但不限于 ) 蛋白、 肽、 拟肽、 核 酸、 碳水化合物、 脂质和小分子化合物组成的组。
在某些实施方式中， 该 TLR2 拮抗剂是一种抗体分子。典型的， 该抗体具有对人 TLR2 上所存在抗原表位 ( 抗原决定部位， epitope) 的结合特异性， 特别是包含已确定的 TLR2 胞外域中氨基酸残基的抗原表位的结合特异性。在某些实施方式中， 该 TLR2 拮抗剂 结合至包含源自人 TLR2 氨基酸序列中氨基和羧基末端的氨基酸残基的非连续性抗原表 位。在某些实施方式中， 该 TLR2 拮抗剂结合至包含 SEQ ID NO ： 1 中氨基酸残基 19-39 或 538-549 的 TLR2 上的抗原表位。
在某些实施方式中， 所述抗体选自由 ( 但不限于 ) 人的、 人源化的、 嵌合的、 合成 的、 骆驼科的、 鲨鱼的或体外的抗体组成的组， 其具有对 TLR2 的结合特异性。在某些其他实 施方式中， 可采用结合片段， 所述结合片段源自前述抗体中的任何一种。在某些实施方式 中， 所述抗体是抗体结合片段， 选自由 Fab、 scFv、 Fv、 dAb 和片段组成的组。在某些实施方 式中， 所述抗体分子包括两条完整重链和两条完整轻链或者它们的抗原结合片段。在某些 实施方式中， 所述抗体是同种型 IgG、 IgA、 IgM。在某些所述抗体是同种型 IgG 抗体的实施 方式中， 该抗体可以为亚型 IgG1、 IgG2 或 IgG3。
在某些实施方式中， 所述抗体是鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 ( 小鼠 Toll 样受体 2(TLR2) 抗体， 源自杂交瘤克隆 T2.5， HyCult Biotechnology b.v.， CellSciences， Canton， USA ： 目 录号 1054) 或者其人源化抗体。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 拮抗剂抑制至少一种编码 TLR2 蛋白的核酸的表达。 在某些实施方式中， 所述 TLR2 拮抗剂选自由 ( 但不限于 ) 反义寡核苷酸、 三螺旋分子、 反义 DNA、 反义 RNA、 核酶、 iRNA、 miRNA、 siRNA、 shRNA 分子组成的组。
在某些实施方式中， 将一种以上的 TLR2 拮抗化合物给药细胞、 组织或受体。例如， 可给药 TLR2 特异性 TLR2 拮抗性抗体来预防 TLR2 激活， 还可同时给药抑制性核酸来抑制 TLR2 表达。 根据本发明的另外一方面， 提供了一种用于治疗和 / 或预防缺血再灌注损伤或由 其引起或与其相关的病症的方法， 该方法包括以下步骤 ：
- 提供治疗有效量的调节 Toll 样受体 2 功能的试剂， 以及
- 将所述化合物给药需要该治疗的受体。
如本文中所定义的， 术语 “调节功能” 表示该试剂改变或变更一种或多种 Toll 样 受体 2 生物学功能活性。在某些实施方式中， Toll 样受体 2 的调节表示该试剂在结合 TLR2 特异性配体后抑制 Toll 样受体 2 的功能性激活和 / 或在利用 TLR2 配体激活后抑制或阻遏 Toll 样受体 2 介导的下游细胞内信号传导， 等等。TLR2 功能的调节还可以进一步延伸为抑 制或阻遏 Toll 样受体 2 蛋白表达或者抑制或阻断编码 Toll 样受体 2 的基因表达， 因此， 调 节 TLR2 功能的试剂可进一步抑制 TLR2 蛋白的表达或者阻断 TLR2 基因产物的表达。
如本文中所定义的， 调节 TLR2 的 “试剂” 是一种抑制或阻断 Toll 样受体 2 激活或 功能的化合物。该 “试剂” 可以是一种抑制或阻断配体或结合化合物与 Toll 样受体 2 结合 的拮抗性化合物。例如， 该 “试剂” 可以是一种结合至 Toll 样受体 2 胞外域的 Toll 样受体 2 结合试剂， 所述试剂抑制激活性配体 ( 其具有对 TLR2 的结合特异性 ) 的结合。此外， 该 “试剂” 可以是一种在配体结合和 / 或 Toll 样受体 2 激活后抑制或阻遏 Toll 样受体 2 所介 导的胞内信号传导的化合物。该 “试剂” 还可以是一种调节 Toll 样受体 2 蛋白或基因表达 的化合物， 例如通过抑制编码 Toll 样受体 2 蛋白的基因的表达。 这种化合物还可称为 TLR2 调节剂。
在某些实施方式中， 所述调节 TLR2 功能的 “试剂” 可以是一种具有结合特异性或 特异性结合 Toll 样受体 2 的结合化合物。在某些实施方式中， 该结合化合物可选自由 ( 但 不限于 ) 蛋白、 肽、 拟肽、 核酸、 多核苷酸、 多糖、 寡肽、 碳水化合物、 脂质、 适体 ( 适配子 )、 小 分子化合物和天然存在的化合物， 如植物源性化合物或其模拟物、 类似物或衍生物组成的 组。
在某些实施方式中， 所述试剂是一种在除已知 TLR2 配体结合位点之外的结合位 点结合 Toll 样受体 2 的结合化合物， 且其一旦结合于 TLR2 即引起 Toll 样受体 2 的构象变 化， 从而引起 Toll 样受体 2 激活和 / 或 TLR2 激活性配体结合的抑制。
术语 “特异性结合” 或 “结合特异性” 指与结合非靶抗原表位相比， TLR2 调节剂 或 TLR2 结合化合物结合至 TLR2 上靶抗原表位具有更高亲和力的能力。在某些实施方式 中， 特异性结合指以高于与非靶抗原表位亲和性至少 10、 50、 100、 250、 500 或 1000 倍的亲 和性结合 TLR2 上存在的特定靶抗原表位。在某些实施方式中， 结合特异性通过亲和性 ELISA 分析来测定。在某些实施方式中， 亲和性通过 BIAcore 分析来测定。在某些实施方 式中， 通过动力学方法来测定结合亲和性。在某些实施方式中， 亲和性通过平衡 / 液吸附法 (equilibrium/solution method) 来测定。
根据一种实施方式， TLR2 调节剂 ( 包括 TLR2 结合试剂 ) 如 TLR2 拮抗剂以高亲和 性结合 TLR2， 这可定义为结合亲和性， 其例如具有至少约 107M-1， 通常约 108M-1， 更典型的 约 109M-1 至 1010M-1 或更强的亲和性常数， 且其调节， 例如降低和 / 或抑制 TLR2 反应性细 胞和 / 或组织中的一种或多种 TLR2 生物学活性。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 调节剂靶向于在缺血期后可能发生再灌注的细胞 或组织上表达的 Toll 样受体 2。这种靶向可以是本领域中熟练技术人员已知的任何恰当 方式， 如定位递送、 采用递送载体或定向方式， 如对在所靶向的细胞或组织上表达的细胞表 面靶标具有结合特异性的抗体。可利用本发明所述方法和组合物进行调节， 如抑制或降低 的示例性 TLR2 活性的实例包括但不限于以下一种或多种 ： (i) 抑制或阻遏 TLR2 表达， (ii) 抑制 TLR2 配体结合和相关的 TLR2 激活， 以及 (iii) 抑制或阻遏由 TLR2 介导的细胞内信号 传导。
因此， 在另一方面， 本发明提供一种调节 TLR2 反应性细胞和 / 或组织 ( 例如已发 生缺血或可能发生缺血或者可能发生再灌注的组织 ) 中功能 ( 例如， 改变 TLR2 的一种或多 种生物学活性 ) 的方法。该方法包括使 TLR2 反应性细胞 / 或 TLR2 反应性组织与 TLR2 调 节剂如 TLR2 结合剂 ( 例如人 TLR2 活性或表达的拮抗剂， 以足以调节 TLR2 反应性细胞或组 织的功能的量 ) 相接触。在一种实施方式中， 该接触步骤可在体外例如在细胞裂解物或重 组系统中实现。可替代的， 该受体方法 (subject method) 可在例如体外或离体培养的细胞 中实施。例如， 细胞， 诸如纯化或重组细胞可在体外培养， 该接触步骤可通过将 TLR2 调节剂 加入培养基中而实现。典型的， 所述 TLR2 反应性细胞是哺乳动物细胞， 如人细胞。在某些 实施方式中， 该 TLR2 反应性组织是已发生缺血和可能发生再灌注的组织或者与其相关的 细胞群。在其他实施方式中， 该方法可作为体内流程的一部分在受体或者动物受体 ( 包括 如人类受体或者体内动物样本 ) 体内存在的细胞上实施样本。该体内流程可为治疗性或预 防性的， 且该炎性样本可为例如遗传改性的样本， 如具有过表达 TLR2 或 TLR2 受体突变或缺 失的动物样本。对于体内方法， 所述 TLR2 调节剂， 可单独或与另一种试剂一起给药患自身 免疫性疾病如类风湿性关节炎的受体， 其量足以调节受体体内一种或多种 TLR2 介导的活 性或功能。在某些实施方式中， 所给药的 TLR2 调节剂的量或剂量可在给药前通过体外或离 体检测， 对改变如降低或抑制一种或多种 TLR2 功能活性所需 TLR2 调节剂的量而确定， 所述 功能活性为本文所述的一种或多种 TLR2 生物学活性。
在某些实施方式中， 其中需要抑制、 降低或减少一种或多种 TLR2 生物学活性， 通过例如给药受体 TLR2 拮抗剂而使该 TLR2 反应性细胞和 / 或组织与 TLR2 拮抗剂相接触。 在一种实施方式中， 所述 TLR2 拮抗剂与 TLR2 蛋白表达相关的 TLR2 多肽或 mRNA 相互作用 ( 如结合 )。典型的， 所拮抗的 TLR2 是哺乳动物 TLR2( 或其功能性变异体 )， 如人 TLR2 或鼠 TLR2。在某些实施方式中， 所拮抗的 TLR2 包括如图 12 中定义的人 TLR2 序列 (SEQ ID NO ： 1)( 包括如基因库登录号 AAC 34133(URLwww.ncbi.nlm.nih.gov) 定义的 784 个氨基酸的全 长人 Toll 样受体序列 ) 或者包括图 13 中所定义氨基酸序列的鼠 TLR2 序列 (SEQ ID NO ： 2)( 基因库登录号 NP_036035( 小鼠 ))， 或者它们的一部分， 和 / 或与它们基本同源的氨基 酸序列， 特别具有至少 90％序列同源一致性， 或与核苷酸序列编码的氨基酸序列基本同源 的氨基酸序列。
如本文中定义的， 术语 “Toll 样受体 2 激活” 表示用配体结合 Toll 样受体 2， 其中 该配体作为激动剂起作用并激活 Toll 样受体 2 以诱发细胞内信号传导的级联反应。Toll 样受体 2 激活和信号传导后介导的细胞内信号传导引起转录因子的活化以及介导促炎性 免疫应答的基因的表达。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 调节剂抑制 Toll 样受体 2 与 Toll 样受体 2 激动配 体之间的相互作用。 在某些实施方式中， 阻遏 Toll 样受体 2 激活和 / 或传导的 TLR2 调节剂是一种作为 Toll 样受体 2 拮抗剂发挥作用的化合物。典型的， Toll 样受体 2 功能的拮抗通过 Toll 样 受体 2 调节剂与 Toll 样受体 2 的结合从而防止配体与 Toll 样受体 2 结合而实现。该 Toll 样受体 2 配体结合的抑制可通过多种方式而实现， 例如通过部分或全部阻断 Toll 样受体 2 的配体结合位点或通过与 Toll 样受体 2 结合或连接后诱发构象变化从而引起 Toll 样受体 2 的配体结合位点改变来防止 Toll 样受体 2 的配体结合， 例如由于 Toll 样受体 2 配体结合 位点的三级结构发生构象变化而防止 TLR2 配体结合。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 调节剂结合至 TLR2 上存在的至少一个抗原表位， 其 中该抗原表位引起 TLR2 功能， 最常见的是 TLR2 激活或者 TLR2 所介导下游信号传导， 的抑 制。如本文中定义的， “抗原表位 ( 抗原决定部位， 抗原决定基， epitope)” 指编码 TLR2 蛋 白的多种氨基酸残基， 其能够被结合化合物如配体、 小分子、 抗体等识别或结合。抗原表位 通常包括化学活性表面基团且具有特异性三维结构特征， 以及特异性电荷特征， 前述均促 成该抗原表位的三维结构。
典型的， 所述 TLR2 调节剂拮抗 TLR2 的功能活性， 且本身结合至称为抑制或抑制性 抗原表位的抗原表位。 “抑制” 或 “抑制性” 抗原表位表示 TLR2 上存在的抗原表位， 当由结 合化合物， 如小分子或抗体， 结合时引起 TLR2 生物学活性的丧失， 例如由于 TLR2 激动剂， 结 合化合物阻断 TLR2 的结合。存在于 TLR2 上且由结合化合物结合以拮抗 TLR2 功能的抗原 表位， 可包括 5 个或更多个氨基酸残基。
在某些实施方式中， 本发明所述的 TLR2 调节剂识别连续性抗原表位。在其他实施 方式中， 所述抗原表位是不连续性抗原表位， 其包含源自成熟 Toll 样受体 2(TLR2) 蛋白的 N 末端 ( 氨基端 ) 和 C 末端 ( 羧基端 ) 部分的残基。在某些实施方式中， 该抗原表位可包括 残基 19-39， 如从 SEQ ID NO ： 3( 图 14) 中示出的 Toll 样受体 2 胞外域的 586 个氨基酸序 列限定的。这种抗原表位可进一步参照其所包含的氨基酸来定义， 所述抗原表位至少包含 SEQ ID NO ： 3 中定义的 TLR2 胞外域氨基酸残基 keessnqaslscdrngickgs(SEQ ID NO ： 4)。
此外， 该结合抗原表位可进一步包含如存在于 SEQ ID NO ： 1 氨基酸序列中 C 端区域的 Toll 样受体 2 中的氨基酸残基 538-549， 该序列包含氨基酸 CSCEFLSFTQEQQ(SEQ ID NO ： 5)。该 TLR2 调节剂结合位点可进一步通过 SEQ ID NO ： 1 中的氨基酸残基 19-39 或 538-549 来限 定， 或者通过 SEQ ID NO ： 1 中的氨基酸残基 19-39 和 538-549 来定义。
不论 Toll 样受体 2 是否与另一个 Toll 样受体， 如 Toll 样受体 1、 Toll 样受体 6 或者另一种 Toll 样受体， 如 Toll 样受体 4 或 Toll 样受体 10， 形成异源二聚体， 均可发生 Toll 样受体 2 功能活性的降低、 抑制或拮抗。术语 “Toll 样受体 2 激活及下游介导的信号 传导” 表示任何由 TLR2 激活诱导的细胞内信号传导通路。 所述信号传导通路可以是 TLR2 特 异性通路或者可以为 “共有” 信号通路， 例如其中该信号通路可有其他来源通过例如除 TLR2 之外的受体 ( 其促进免疫应答介质如转录因子 NF-κB 的激活 ) 活化而激活。
已知 TLR2 二聚合为 2 功能性异源二聚体。特别的， 已知 TLR2 与 Toll 样受体 1 或 Toll 样受体 6 形成异源二聚体， 可能与 Toll 样受体 4(TLR4， TLR-4) 和 Toll 样受体 10(TLR10， TLR-10) 形成其他异源二聚体。可认为， 二聚合与鉴别有关， 由不同微生物源配 体引起 TLR2 的结合。此外， TLR2 的胞外域可与循环系统中及哺乳动物乳汁中的 CD14 形成 可溶性异源二聚体。
本发明者已经认识到， 为了提供能广泛阻遏缺血后再灌注期间或其后 TLR2 介导 性炎症的治疗途径， 需要提供具有 TLR2 结合特异性的结合化合物， 不论 TLR2 与另一种 TLR 如 TLR1、 TLR6、 TLR4 或 TLR10 之间是否形成异源二聚体。在这方面， 经过广泛实验后， 本发 明者已经确定了一种由存在于 TLR2 蛋白 N 末端和 C 末端的氨基酸残基构成的构象性不连 续抗原表位， 其结合后即阻遏 TLR2 的功能活性。该抗原表位被 TLR2 拮抗性结合化合物结 合可阻遏 TLR2 的功能， 不论 TLR2 是否与 TLR1、 TLR6、 TLR4 或 TLR10 形成异源二聚体。
因此， 在某些其他方面， 本发明提供的 TLR2 调节剂具有下列特征中的至少一种 ： (i) 是一种单克隆抗体， (ii) 是一种人源或体外生成的抗体， (iii) 结合至包含氨基酸 SEQ ID NO ： 4 和 / 或 SEQ ID NO ： 5 的人或鼠 TLR2 的构象性不连续性抗原表位并介导 TLR2 的 功能阻遏， 不论 TLR2 与 TLR1、 TLR6、 TLR4 或 TLR10 之间是否形成异源二聚体， (iv) 以至少 10-6M 的亲和常数 (Ka) 结合 TLR2 胞外域上存在的抗原表位。
在某些实施方式中， 所述阻遏或抑制 Toll 样受体 2 功能和 / 或信号传导和 / 或表 达的 TLR2 调节剂选自由 ( 但不限于 ) 蛋白、 肽、 拟肽、 核酸、 多核苷酸、 多糖、 寡肽、 碳水化合 物、 脂质、 小分子化合物和天然存在化合物组成的组中的至少一种。
典型的， 所述调节 TLR2 功能的试剂是一种 TLR2 拮抗剂。在某些实施方式中， 该 TLR2 拮抗剂是一种结合化合物， 选自由蛋白、 肽、 拟肽、 核酸、 碳水化合物、 脂质和小分子化 合物组成的组。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 拮抗剂是一种抗体或源自该抗体的结合片段。在某 些实施方式中， 该抗体选自由单克隆抗体、 多克隆抗体或合成抗体组成的组。在某些其他 实施方式中， 该抗体选自由人、 人源化、 骆驼科、 针对人 TLR2 的体外生成抗体组成的组。该 抗体可为一种选自由 IgG、 IgA、 IgM 和 IgE 组成的组的同种型。该抗体可以约 10-7M 至约 10-11M 的解离常数 (Kd) 结合 TLR2 上存在的抑制性抗原表位。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 调节剂是一种可溶形式的重组 Toll 样受体 2。 特别的， 该可溶形式的 TLR2 是一种融合蛋白， 基本上包括连接于次级蛋白 ( 第二蛋白，secondary protein) 的 TLR2 蛋白上的胞外域。 在某些实施方式中， 次级蛋白可以为抗体的 Fc 域或其片段。
在某些其他实施方式中， 所述 TLR2 调节剂是一种抑制 TLR2 蛋白表达的抑制性核 酸。在某些实施方式中， 该抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、 三螺旋分子、 反义 DNA、 反义 RNA、 核酶、 iRNA、 miRNA、 siRNA 和 shRNA 组成的组。
在某些实施方式中， 本发明所述方法用来将治疗有效量的 TLR2 调节剂给药需要 该治疗的受体， 以降低或抑制心肌的 TLR2 表达细胞或组织中一种或多种 TLR2 生物学活性， 从而治疗该病症。
在某些实施方式中， 本发明所述方法可用于治疗或预防缺血再灌注损伤， 其可能 来自于至少一种选自由受体体内低氧、 中风、 心脏病发作、 慢性肾衰或器官移植组成的组的 病症。
在某些实施方式中， 所述方法可进一步包括一个步骤即给药至少一种治疗有效 量的用于治疗或预防缺血 / 再灌注损伤或相关病症的次级治疗化合物。典型的， 所述次 级治疗化合物可选自由糖皮质激素 (glucocorticoid)、 细胞增殖抑制药 (cytostatic)、 抗 代 谢 药、 抗 CD2 抗 体 或 相 关 的 结 合 片 段、 抗 CD20 抗 体、 抗 -TNF-α 抗 体， 环孢霉素 (cyclosporine)、 他克莫司 (tacrolimus) 西罗莫司 (sirolimus) 或 FTY720 组成的组。
在某些其他实施方式中， 所述次级治疗化合物可选自由 HMG-CoA 还原酶抑制剂、 扩血管剂、 利尿剂、 血管紧张素转化酶抑制剂、 β- 阻滞剂、 血管紧张素 II 受体拮抗剂、 钙通 道阻滞剂、 抗凝血剂、 二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻氯匹啶 (ticlopidine) 或氯吡格雷硫酸 氢盐、 糖蛋白 IIb/IIIa 受体拮抗剂如比伐卢定 (bivalirudin)、 阿戈托班或肝素、 β- 肾上 腺素能受体激动剂、 抗血栓药、 抗氧化剂和 α 阻滞剂组成的组。
在某些实施方式中， 所述次级治疗剂可与至少一种 TLR2 调剂试剂同时、 依次或独 立给药。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 调节化合物在受体经历手术操作之前、 期间或之后 给药该受体， 所述手术操作选自由血管成形术、 心脏搭桥术、 溶栓术、 动脉内膜切除术、 器官 移植和冠状动脉搭桥术 (CABG) 组成的组。在某些实施方式中， 该方法于细胞或组织内发生 缺血事件之前、 期间或之后在受体身上实施。 在某些实施方式中， 该方法于再灌注发生之后 在受体身上实施。 在某些实施方式中， 该方法在急性窗口期在受体身上实施， 该时段于缺血 经历后在临床上确定。
在某些实施方式中， 本发明该方面所述方法可预防缺血再灌注损伤从而抑制再 灌注之后或期间抑制器官损伤。在某些其他实施方式中， 本发明该方面所述方法通过遏 制或抑制促炎性免疫应答来预防缺血再灌注损伤， 该促炎性免疫应答由通过 Toll 样受体 2(TLR2、 TLR-2、 CD282) 的信号传导来介导， 并且是细胞、 组织或器官缺血后再灌注期间或之 后细胞、 组织或器官损伤的原因。
根据本发明另外一方面， 提供了一种用于治疗和预防缺血再灌注损伤或与其相关 病症的药物组合物， 其包含一种调节 Toll 样受体 2 功能或表达的试剂以及至少一种药学可 接受的载体、 稀释剂、 助溶剂、 乳化剂、 防腐剂和 / 或佐剂。
在某些实施方式中， 该 TLR2 调节剂是一种作为 TLR2 拮抗剂的化合物， 其选自由多 克隆抗体、 单克隆抗体、 人源化抗体、 嵌合抗体或抗体片段、 适配体、 融合蛋白和拟肽组成的组。 在某些实施方式中， 该 TLR2 调节剂是一种可溶形式的 TLR2 受体。所述可溶形式 的 TLR2 可以是重组的。
在某些实施方式中， 该 TLR2 调节剂是一种基于抑制性核酸的化合物， 其抑制 TLR2 的表达。
在某些实施方式中， 所述药物组合物可进一步包含次级治疗性试剂， 例如但不限 于， 免疫抑制剂， 其可为由 ( 但不限于 ) 糖皮质激素特别是阻遏细胞活素表达的糖皮质激 素； 细胞增殖抑制药如烷化剂、 抗代谢药如甲氨蝶呤 ； 抗体或相关结合片段如抗 CD3 抗体 如 OKT-3、 抗 CD20 抗体、 抗 TNF-α 抗体英夫利昔单抗 (REMICADETM)、 依那西普 (ENBRELTM) 或阿达木单抗 (HUMIRATM) ； 对亲免疫因子起作用的药物复合物如环孢霉素、 他克莫司或西 罗莫司 ； 或小分子如 FTY720 或治疗性心血管复合物组成的组中的至少一种， 其中该治疗性 心血管复合物包含 HMG-CoA 还原酶抑制剂、 扩血管剂、 利尿剂、 血管紧张素转化酶抑制剂、 β- 阻滞剂、 血管紧张素 II 受体拮抗剂、 钙通道阻滞剂、 抗凝血剂、 二磷酸腺苷受体拮抗剂 如噻氯匹啶 (ticlopidine) 或氯吡格雷硫酸氢盐、 糖蛋白 IIb/IIIa 受体拮抗剂如比伐卢定 (bivalirudin)、 阿戈托班或肝素、 β- 肾上腺素能受体激动剂、 抗血栓药、 抗氧化剂和 α 阻 滞剂中的至少一种或多种。
在某些实施方式中， 所述 Toll 样受体 2 调节剂以约 1mg/kg 至约 10mg/kg 受体体 重 / 天的剂量口服给药受体。在某些实施方式中， 所述 Toll 样受体 2 调节剂的剂量为约 100mg/ 天至约 1000mg/ 天。在某些其他实施方式中， 所述 Toll 样受体 2 调节剂的剂量为约 200mg/ 天至约 300mg/ 天。
在某些实施方式中， 所述 Toll 样受体 2 调节剂以约 0.001mg/kg 至约 1.0mg/kg 哺 乳动物体重的剂量范围经胃肠外给药该受体。
在某些实施方式中， 所述 Toll 样受体 2 调节剂在足以下调 Toll 样受体 2 水平和 / 或活性的条件下给药受体一段时间。
本发明另外一方面提供一种用于治疗或预防心脏病或与其相关疾病症状的方法， 该方法包括以下步骤 ：
- 提供治疗有效量的调节 Toll 样受体 2 功能的试剂， 以及
- 将所述化合物给药需要该治疗的受体。
在某些实施方式中， 所述心脏炎性病症选自， 但不限于， 由心肌缺血、 缺血性心脏 病、 高血压性心肌缺血、 充血性心力衰竭、 组织缺血、 器官缺血、 急性冠状动脉综合征、 肥大、 脑梗塞、 心肌梗塞、 心律失常和缺血再灌注损伤 (I/R) 组成的组。
在某些实施方式中， 调节 TLR2 功能的试剂是一种 TLR2 拮抗剂。在某些实施方式 中， 该 TLR2 拮抗剂是一种结合化合物， 选自由 ( 但不限于 ) 蛋白、 肽、 拟肽、 核酸、 碳水化合 物、 脂质和小分子化合物组成的组。
在某些实施方式中， 该 TLR2 调节剂是一种作为 TLR2 拮抗剂的化合物， 其选自由多 克隆抗体、 单克隆抗体、 人源化抗体、 嵌合抗体或抗体片段、 适配体、 融合蛋白和拟肽组成的 组。
在某些实施方式中， 该 TLR2 调节剂是一种可溶形式的 TLR2 受体。所述可溶形式 的 TLR2 可通过重组技术而生成。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 调节剂是一种基于抑制性核酸、 抑制 TLR2 表达的化 合物。在某些实施方式中， 该抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、 三螺旋分子、 反义 DNA、 反义 RNA、 核酶、 iRNA、 miRNA、 siRNA 和 shRNA 组成的组。
在某些实施方式中， 所述 TLR2 拮抗剂是一种抗体或源自该抗体的结合片段。该抗 体可选自由单克隆抗体、 多克隆抗体或合成抗体组成的组。
在某些实施方式中， 该方法可包括一个给药如上文所述次级治疗化合物的步骤。
因此， 本发明的另一方面提供一种预防再灌注所引起组织或器官损伤的方法， 该 方法包括以下步骤 ：
- 提供一种治疗有效量抑制性核酸， 其阻断 Toll 样受体 2 蛋白表达， 以及
- 将其给药需要该治疗的受体。
在某些实施方式中， 该抑制性核酸可包括但不限于 ： 反义寡核苷酸、 反义 DNA、 反 义 RNA、 核酶、 iRNA、 miRNA、 siRNA、 shRNA。
在某些实施方式中， 再灌注在所述器官或组织缺血一段时间后发生。
如本文中定义的， 当术语 “阻断” 和 “阻遏” 与 Toll 样受体 2 基因表达相关应用时， 表示沉默至少一种基因的表达， 该基因引起 Toll 样受体 2 蛋白表达。 基因沉默是通过除遗传修饰之外的机理关闭基因的表达。 基因沉默可在转录水平 或在转录后水平介导。转录性基因沉默可导致基因不能进入转录机制， 且可通过例如组蛋 白修饰的方式来介导。转录后基因沉默是由于基因的 mRNA 被破坏， 从而阻断了活性基因产 物如蛋白 ( 在本发明中， 为 TLR2 蛋白 ) 而产生的。
因此， 在一个实施方式中， 本发明这个方面适于给药受体有效量的抑制性核酸分 子如 RNAi(RNA 干扰 ) 试剂， 例如干扰性核糖核酸 ( 如 siRNA 或 shRNA) 或其转录模板如编 码 shRNA 的 DNA 至受体体内至少一种细胞类型、 组织或器官以阻断 TLR2 蛋白的表达。
在某些其他实施方式中， 所述抑制性核酸分子可以为反义 RNA 分子。反义引起基 因表达的抑制， 并包含可物理性结合 mRNA( 这可阻断 mRNA 转译 ) 的单链 RNA 片段。制备用 作抑制性核酸的恰当核酸的技术为本领域中的熟练技术人员所熟知。
根据本发明的另外一方面， 提供了阻断 Toll 样受体 2 蛋白表达的抑制性核酸在制 备用于治疗由再灌注所引起细胞、 组织或器官损伤的药剂中的用途。
本发明的另外一方面提供一种用于阻断 Toll 样受体 2 表达的抑制性核酸， 用于治 疗由再灌注引起的细胞、 组织或器官损伤。
在某些实施方式中， 再灌注发生于缺血一段时间后。
在某些实施方式中， 所述抑制性核酸选自由反义寡核苷酸、 反义 DNA、 反义 RNA、 核 酶、 iRNA、 miRNA、 siRNA、 shRNA 组成的组。
根据本发明另外一方面， 提供一种用于治疗缺血 / 再灌注损伤引起的细胞、 组织 或器官损伤的药物组合物， 该组合物包含治疗有效量的抑制性核酸 ( 其阻断 Toll 样受体 2 的表达 ) 以及至少一种药学可接受的载体、 稀释剂、 助溶剂、 乳化剂、 防腐剂和 / 或佐剂。
在某些实施方式中， 该抑制性核酸选自由 ( 但不限于 ) 反义寡核苷酸、 反义 DNA、 反 义 RNA、 核酶、 iRNA、 miRNA、 siRNA、 shRNA 组成的组。
在某些实施方式中， 所述药物组合物可进一步包含至少一种免疫抑制化合物。在 某些实施方式中， 该免疫抑制剂 ( 也称为免疫抑制药 ) 可为由 ( 但不限于 ) 糖皮质激素特
别是阻遏细胞活素表达的糖皮质激素 ； 细胞增殖抑制药如烷化剂、 抗代谢药如甲氨蝶呤 ； 抗体或相关结合片段如抗 -CD3 抗体如 OKT-3、 抗 -CD20 抗体、 抗 TNF-α 抗体英夫利昔单抗 (REMICADETM)、 依那西普 (ENBRELTM) 或阿达木单抗 (HUMIRATM) ； 对亲免疫因子起作用的药 物复合物如环孢霉素、 他克莫司或西罗莫司 ； 或小分子如 FTY720 组成的组中的至少一种。
制备用作抑制性核酸 ( 其阻断 Toll 样受体 2 表达 ) 的恰当核酸的技术为本领域 中的熟练技术人员所熟知。
在某些实施方式中， 所述抑制性核酸在受体经历手术操作之前、 期间或之后给药 该受体， 所述手术操作选自由 ( 但不限于 ) 血管成形术、 心脏搭桥术、 溶栓术、 动脉内膜切除 术、 器官移植和冠状动脉搭桥术 (CABG) 组成的组。
在某些实施方式中， 所述抑制性核酸于缺血之前、 期间或之后给药受体。 在某些实 施方式中， 该抑制性核酸在再灌注发生期间或之后给药受体。 在某些实施方式中， 该抑制性 核酸在缺血事件后的急性窗口期给药受体。
在某些实施方式中， 所述抑制性核酸在受体经历手术操作之前、 期间或之后给药 该受体， 该手术操作是细胞、 组织或至少一种器官的移植或与其相关。典型的， 实施所述方 法是为了预防或限制 TLR2 介导的免疫应答， 其引起组织损伤特别是由来自再灌注的细胞 或组织损伤。
在另外一方面， 本发明扩展至提供至少一种具有 Toll 样受体 2 结合特异性的适配 体， 其导致 Toll 样受体 2 功能活性的阻断或抑制。用于选择恰当适配体的技术为本领域的 熟练技术人员所熟知， 例如采用 SELEX 技术。
因此， 在多种其他实施方式中， 本发明提供一种鉴定并分离具有 Toll 样受体 2 结 合特异性的核酸配体， 该方法包括以下步骤 ：
(a) 提供一种候选的核酸混合物
(b) 表达 Toll 样受体 2 的细胞与该候选核酸混合物接触
(c) 选择比其他候选核酸， 对 Toll 样受体 2 的亲和性有所增强的核酸
(d) 扩增所选定的核酸， 以提供至少一种具有 Toll 样受体 2 亲和性的核酸， 以及
(e) 从中选择至少一种具有较高 Toll 样受体 2 亲和性和特异性的核酸。
本发明者还进一步确定， Toll 样受体 2 功能的抑制可通过降低配体的量来获得， 该配体可用于结合至并激活膜结合 Toll 样受体 2。可用于结合膜结合 Toll 样受体 2 的配 体的量引起 Toll 样受体 2 介导的信号传导下调， 以及因此引起 TLR2 介导的促炎性免疫应 答的激活。特别的， 本发明者确定了可溶性肽 ( 其为一种可溶形式的 Toll 样受体 2 或其功 能片段 ) 在抑制 Toll 样受体 2 介导的促炎性反应应答方面的用途。所述抑制是由于可溶 形式 Toll 样受体 2 或截取型非膜形式 Toll 样受体 2 与膜结合形式的 TLR2 对 TLR2 特异性 结合配体的竞争引起的。该竞争性结合使得可溶或截取形式的 TLR2 有效 “清理” 可利用的 Toll 样受体 2 配体。伴随着膜结合 Toll 样受体 2 结合和激活的降低引起 Toll 样受体 2 介 导的促炎性免疫应答下调。
因此， 给药可溶形式的 Toll 样受体 2 在用于抑制促炎性免疫应答的方法中比较有 用， 该炎性免疫应答是缺血再灌注期间或之后的组织损伤的原因之一。
因此， 本发明的另外一方面提供一种用于治疗和 / 或预防细胞、 组织或器官的缺 血再灌注损伤的方法， 该方法包括以下步骤 ：- 提供一种治疗有效量的能够结合 Toll 样受体 2 配体的可溶形式 Toll 样受体 2 或其可溶性片段， 以及
- 将治疗有效量的所述化合物给药需要该治疗的受体。
本文中如 SEQ ID NO ： 3( 图 14) 提供人 Toll 样受体 2 胞外域 ( 胞外域 ) 的氨基 酸序列。人类 Toll 样受体 2 形式的胞外域包含 587 个氨基酸残基， 特别是如基因库登录号 AAC 34133(URL www.ncbi.nlm.nih.gov) 所定义的 784 个氨基酸的全长人 Toll 样受体序列 中的氨基酸 1-587。如本文中所定义的， TLR2 的胞外域是膜结合形式 TLR2 中延伸入细胞外 间隙的部分。
在某些实施方式中， 可溶形式的 TLR2 通过重组技术制备。可溶形式的 Toll 样受 体 2 通常仅包含 TLR2 的胞外域， 因此缺乏如基因库登录号 AAC34133 中所定义的 Toll 样受 体 2 的胞内域和跨膜域。在某些实施方式中， 可溶形式的 Toll 样受体 2 可包含所定义 Toll 样受体 2 序列中的氨基酸 1-587。可溶的 Toll 样受体 2 序列可通过添加、 缺失或取代 1 个 或多个氨基酸残基而加以修饰。因此， 在某些实施方式中， 可溶形式的 Toll 样受体 2 来源 于已确定的膜结合形式 Toll 样受体 2 的胞外域， 如本文在 SEQ ID NO ： 3 中定义的。在其他 实施方式中， 可溶形式的 Toll 样受体 2 来源于截取形式的全长膜结合形式 Toll 样受体 2 的氨基酸序列， 如本文在 SEQ ID NO ： 3( 图 14) 中定义的， 其中所述截取形式表现出以下功 能特征 (i) 可溶， 以及 (ii) 能够由配体结合， 该配体对膜结合形式 Toll 样受体 2 上存在的 至少一种抗原表位具有结合特异性。
在某些实施方式中， 除了从膜结合形式 TLR2 限定的胞内和 / 或跨膜域相关的氨基 酸残基缺失和 / 或取代， 还可进一步对胞外域的氨基酸残基进行缺失和 / 或取代。只要修 饰形式的 TLR2 能够结合到结合膜结合形式 TLR2 上存在的至少一个抗原表位的配体， 可对 TLR2 胞外域氨基酸残基进行任何这种缺失和 / 或取代。
在某些实施方式中， 该可溶形式的 Toll 样受体 2(sTLR2) 可靶向于已经历缺血后 再灌注或正经历缺血后再灌注的器官、 组织或细胞， 或者靶向于至少一种正经历缺血且可 能在适当时机经历再灌注的特异性细胞类型。这种方式的 sTLR2 靶向比较有利， 因为全身 给药 sTLR2 可能引起 TLR2 受体的全身性免疫抑制以及由此产生的 TLR2 介导的信号传导， 其在某些情况下是不需要的。
可溶形式的 sTLR2 靶向作用可通过形成融合蛋白而提供， 其中所述融合蛋白由 TLR2 受体的可溶部分通常是胞外域或其一部分连接于另一种肽而构成， 通常该 Fc 受体结 合蛋白源自免疫球蛋白 ( 典型的， 人免疫球蛋白 ) 的重链。该 Fc 域已广泛用来延长治疗性 蛋白的循环半衰期。
在某些实施方式中， 可溶形式的 sTLR2 可在受体经历手术操作之前、 期间或之后 给药， 该手术操作选自由 ( 但不限于 ) 血管成形术、 心脏搭桥术、 溶栓术、 动脉内膜切除术、 器官移植和冠状动脉搭桥术 (CABG) 组成的组。
在某些实施方式中， 可溶形式的 sTLR2 可在缺血之前、 期间或之后给药受体。在某 些实施方式中， 该可溶形式的 sTLR2 可在发生再灌注期间或之后给药受体。在某些实施方 式中， 该可溶形式的 sTLR2 可在缺血后的急性窗口期给药受体。
在某些实施方式中， 所述可溶形式的 sTLR2 在受体经历手术操作之前、 期间或之 后给药该受体， 该手术操作是细胞、 组织或至少一种器官的移植或与其相关。典型的， 实施所述方法是为了预防或限制可引起组织损伤的 TLR2 介导的免疫应答。
在某些实施方式中， 建议详细说明， 该制剂应该在手术操作之前、 期间或之后给药 受体， 该手术操作选自由 ( 但不限于 ) 搭桥术、 溶栓术、 内膜切除术和血管形成术组成的组。
本发明进一步扩展至用于鉴定能够预防再灌注后细胞、 组织或器官再灌注损伤的 化合物的筛查分析， 其中所述再灌注损伤通过 TLR2 激活或借助于抑制 Toll 样受体 2 功能 穿过 TLR2 通路的信号传导来介导。
本发明另外一方面提供一种用于鉴定可抑制 Toll 样受体 2 介导的炎症及再灌注 期间或之后出现的相关细胞、 组织或器官损伤的化合物的筛查方法， 该方法包括 ：
- 提供膜结合 Toll 样受体 2 受体以及一种对其具有结合特异性的配体，
- 候选化合物与 Toll 样受体 2 接触，
-Toll 样受体 2 暴露于 Toll 样受体 2 配体，
- 测定 Toll 样受体 2 配体与 Toll 样受体 2 的结合，
其中， Toll 样受体 2 与 Toll 样受体 2 配体结合的抑制表明， 所述候选化合物是一 种 Toll 样受体 2 激活和信号传导的调节剂。
在某些实施方式中， 可抑制 Toll 样受体 2 所介导炎症及再灌注期间或之后相关的 细胞、 组织或器官损伤的化合物是 TLR2 激动剂。
本发明另外一方面提供一种按照本发明前述方面鉴定用于抑制 TLR2 所介导炎症 应答的调节剂， 用于预防或治疗再灌注损伤。
如本文中定义的， 再灌注损伤指缺血期后当供血恢复至组织时引起的组织损伤。 可认为再灌注损伤与大脑的缺血级联反应 ( 这一点与中风和脑创伤有关 ) 有关， 因此本发 明所述用于预防再灌注损伤的 TLR2 调节剂还可用来预防中风和 / 或脑创伤。
本发明者还进一步认识到本发明所述方法和 TLR2 调节剂通过预防受者体内对已 移植供者细胞或组织的免疫排斥而用于改善受体的细胞、 组织或器官移植的用途。
通常， 在移植操作过程中， 由于缺少供血， 供者器官、 组织或细胞团 (cell mass) 会 经历较长时间的缺血， 且因此减少了供者器官、 组织或细胞团内的氧水平。 据信免疫应答是 再灌注损伤的一个主要作用因素， 其可进一步引起更广泛的免疫应答， 从而导致移植操作 后宿主发动的移植物排斥。
因此， 本发明的另外一方面提供一种用于抑制有害免疫应答 ( 其可使移植的组 织、 器官或细胞团被受者排斥 ) 的方法， 该方法包括以下步骤 ：
- 提供治疗有效量的调节 Toll 样受体 2 激活和 / 或信号传导的试剂， 以及
- 将治疗有效量的所述化合物给药需要该治疗的受体。
本发明的另外一方面提供阻遏 Toll 样受体 2 功能的试剂在制备用于预防有害免 疫应答的药剂中的用途， 该有害免疫应答可引起移植手术操作后受者所接受供者器官的排 斥。
本发明者还进一步鉴定了本发明所述方法和化合物用于治疗与再灌注相关或与 涉及其的心脏病的用途。
因此， 本发明的另外一方面提供一种用于治疗或预防心脏病或与其有关的疾病症 状的方法， 该方法包括以下步骤 ：
- 提供一种治疗有效量的 Toll 样受体 2 抑制剂， 以及- 将其给药需要所述治疗的受体。
在某些实施方式中， 所述心脏炎性病症可为至少一种选自由心肌缺血、 缺血性心 脏病、 高血压性心肌缺血、 充血性心力衰竭、 组织缺血、 器官缺血、 急性冠状动脉综合征、 肥 大、 脑梗塞、 心肌梗塞、 心律失常和缺血再灌注损伤 (I/R) 组成的组的病症。
根据本发明的另外一方面， 提供了一种用于治疗心脏病或与其有关疾病或炎性病 症的药物组合物， 该组合物包含对 Toll 样受体 2 具有结合特异性且抑制其功能的结合化合 物以及至少一种药学可接受的载体、 稀释剂、 助溶剂、 乳化剂、 防腐剂和 / 或佐剂。
在某些实施方式中， 所述心脏病或与其有关的疾病症状可为至少一种选自由心肌 缺血、 缺血性心脏病、 高血压性心肌缺血、 充血性心力衰竭、 组织缺血、 器官缺血、 急性冠状 动脉综合征、 肥大、 脑梗塞、 心肌梗塞、 心律失常、 缺血再灌注损伤 (I/R)、 动脉粥样硬化、 同 种异体移植物血管病变、 高血压、 充血性心力衰竭组成的组的病症。
在某些实施方式中， 所述药物组合物可进一步包含次级治疗剂， 例如但不限于 ： 免 疫抑制剂， 其可为由 ( 但不限于 ) 糖皮质激素特别是阻遏细胞因子表达的糖皮质激素 ； 细胞 生长抑制药如烷化剂、 抗代谢药如甲氨蝶呤 ； 抗体或相关结合片段如抗 CD3 抗体如 OKT-3、 抗 CD20 抗体、 抗 TNF-α 抗体英夫利昔单抗 (REMICADETM)、 依那西普 (ENBRELTM) 或阿达木 单抗 (HUMIRATM) ； 对亲免疫因子起作用的药物复合物如环孢霉素、 他克莫司或西罗莫司 ； 或小分子如 FTY720 或治疗性心血管复合物组成的组中的至少一种， 其中该治疗性心血管 复合物包含 HMG-CoA 还原酶抑制剂、 扩血管剂、 利尿剂、 血管紧张素转化酶抑制剂、 β- 阻 滞剂、 血管紧张素 II 受体拮抗剂、 钙通道阻滞剂、 抗凝血剂、 二磷酸腺苷受体拮抗剂如噻 氯匹啶 (ticlopidine) 或氯吡格雷重磷酸盐、 糖蛋白 IIb/IIIa 受体拮抗剂如比伐卢定 (bivalirudin)、 阿戈托班或肝素、 β- 肾上腺素能受体激动剂、 抗血栓药、 抗氧化剂和 α 阻 滞剂。
本发明另外一方面提供一种结合剂的用途， 其对 Toll 样受体 2 具有结合特异性且 可阻遏 Toll 样受体 2 的功能， 可用于制备治疗心脏病相关炎症的药剂。 附图说明
接下来， 本发明将参照下列实例加以阐述， 实例仅是为了阐述而非限制本发明， 其 图 1 示出了给药 p38 抑制剂 (SB239063) 后的心脏切片， 作为阳性对照 ； 图 2 示出了给药 PBS 后的心脏切片 ； 图 3 示出了给药 IgGT 同种型抗体后的心脏切片， 作为阴性对照 ； 图 4 示出了给药实验性抗 TLR2 拮抗性单克隆抗体 OPN-301 后的心脏切片 ； 图 5 示出了危险区 (AAR) 占整个左心室 (LV) 百分比的图表 ； 图 6 示出了梗塞面积占危险区 (AAR) 的百分比 ； 图 7 示出了梗塞面积占整个左心室 (LV) 的百分比 ； 图 8 示出了梗塞面积占整个左心室 (LV) 的百分比 ； 图 9 示出了梗塞面积占危险区 (AAR) 的百分比 ； 图 10 示出了危险区 (Aar) 占左心室的百分比 ； 图 11 示出了梗塞面积占危险区的百分比 ；20中：
101848724 A CN 101848725
说明书14/38 页图 12 示出了人 Toll 样受体 2 的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 1) ；
图 13 示出了人 Toll 样受体 2 的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2) ；
图 14 示出了人 Toll 样受体 2 的胞外域 (SEQ ID NO ： 3) ；
图 15 示出了给药 p38 抑制剂 (SB239063) 后的第二心脏切片， 作为阳性对照 ；
图 16 示出了给药 PBS 后的第二心脏切片 ；
图 17 示出了给药 IgGT 同种型抗体后的第二心脏切片， 作为阴性对照 ；
图 18 示出了给药实验性抗 TLR2 拮抗性单克隆抗体 OPN-301 后的第二心脏切片 ；
图 19 示出了危险区 (AAR) 占整个左心室 (LV) 百分比的第二图表 ；
图 20 示出了梗塞面积占危险区 (AAR) 百分比的第二图表 ；
图 21 示出了另一个梗塞面积占整个左心室 (LV) 的百分比 ；
图 22 示出了梗塞面积占整个左心室 (LV) 的百分比 ；
图 23A 示出了缺血 30 分钟并再灌注 24 小时后， 血液 KO 和器官 KO 嵌合小鼠的心 脏切片中巨噬细胞数量的图表。针对巨噬细胞 ( 具有蓝核的红色细胞 ) 染色的心脏切片的 代表性图片。膜染色的细胞的密度差异 ；
图 23B 示出了针对小噬细胞染色的心脏切片的代表性图片， 针对巨噬细胞 ( 具有 蓝核的红色细胞 ) 染色的心脏切片的代表性图片。细胞密度差异在于染色的膜 ； 以及
图 24 示出了基线 (t ＝ 0) 和梗塞后 (t ＝ 28) 的心脏功能和形态。 具体实施方式
本发明涉及特异于 Toll 样受体 2(TLR2) 的调节剂， 其抑制 TLR2 的生物学功能或 阻断 TLR2 表达， 用于预防缺血后再灌注引起的组织或器官损伤。
如本文中定义的， Toll 样受体 2 还可称为 TLR2、 TLR-2 或 CD282。典型的， 该 Toll 样受体 2 是人 Toll 样受体 2。可替代的， 该 Toll 样受体 2 是鼠 Toll 样受体 2。在其他实 施方式中， 该 Toll 样受体 2 是人 TLR2 的同系物或直系同源物， 其源自任何除人或小鼠之外 的哺乳动物如牛或猫。在某些其他实施方式中， 所述阻遏 TLR2 功能的化合物是交叉反应性 的， 因为其介导对源自不同种属的 Toll 样受体 2 中的 Toll 样受体 2 功能的阻遏。
如本文中使用的， 术语 “抗原表位” 指大分子中能够被特异性结合配体结合的部 分， 在本文中， 指多肽特别是 Toll 样受体 2 的一部分。抗原表位可从多肽序列中包含的相 邻或非相邻氨基酸残基序列而确定。 术语 “相邻抗原表位” 指包括多肽内部可确定该抗原表 位的线性氨基酸残基序列的抗原表位。 “非相邻抗原表位” 是包括一系列排列呈非线性的氨 基酸残基的抗原表位， 使得所述残基沿着全长多肽序列以非连续性方式间隔开或成组。非 连续性抗原表位可以是一种不连续抗原表位， 其中该氨基酸残基分为两个线性序列组， 或 者可替代的该非连续性抗原表位可为一种不连续分散分布的抗原表位， 其中对该抗原表位 起作用的残基在沿多肽全长排布的 3 组或更多组线性氨基酸序列中提供。
抗体
“抗体” 是一种天然或者部分或完全合成而得到的免疫球蛋白。该术语还涵盖任 何具有结合区的多肽、 蛋白或肽， 该结合区是抗体结合区或与其同源。 这些抗体可为天然来 源， 或者其可通过部分或全部合成而得到。抗体实例是免疫球蛋白同种型和其同种亚型和 片段 ( 其包含抗原结合区如 Fab、 scFv、 Fv、 dAb、 Fd) 及双特异性抗体。在某些实施方式中， 该抗体可为骆驼科抗体特别是骆驼科重链抗体。 此外， 该抗体 片段可为源自骆驼科重链抗体的域抗体或纳米抗体。在某些实施方式中， 该抗体可为鲨鱼 抗体或鲨鱼源抗体。
在某些实施方式中， 该抗体是 “分离的抗体” ， 这表示该抗体 (1) 游离于至少部分 常见的蛋白， (2) 基本游离于相同来源如相同种属的其他蛋白， (3) 由不同种属的细胞表 达， 或 (4) 自然界中不存在。
抗体可以多种方式加以修饰， 术语 “抗体” 应该理解为涵盖任何包含具所需特异性 的结合区的结合成员或物质。本发明所述抗体可以为单克隆抗体或者其片段、 衍生物、 功 能等价物或同系物。该术语包括任何包含免疫球蛋白结合区的多肽， 无论其是天然的还是 全部或部分合成的。因此， 还包括那些包含免疫球蛋白结合区或等价物 ( 融合于另一种多 肽 ) 的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在第 EP 0,120,694 号欧洲专利申请公开案和第 EP 0,125,023 号欧洲专利申请公开案中有所阐述。
抗体恒定区可为任何恰当的免疫球蛋白亚型， 然而， 优选抗体亚型是 IgG1。不过， 在替代性实施方式中， 当采用人免疫球蛋白分子时， 该抗体亚型可为 IgA， IgM， IgD 和 IgE。 这种抗体还可属于任何亚类例如 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3 和 IgG4。 完整抗体的片段可发挥结合抗体的功能。这种结合片段的实例为 ： Fab 片段， 包括 VL、 VH、 CL 和 CH1 抗体区 ； Fv 片段， 包括单个抗体的 VL 和 VH 区 ； F(ab’ )2 片段， 是一种包括 两个相连接 Fab 片段的二价片段 ； 单链 Fv 分子 (scFv)， 其中 VH 区和 VL 区由肽连接子连接 使得这两个区域连接形成抗原结合位点 ； 或者双特异性抗体， 其可为通过基因融合构建的 多价或多特异性片段。
用于本发明中的抗体或多肽片段例如 TLR2 特异性抗体片段， 通常表示一系列氨 基酸残基， 至少 5-7 个相邻氨基酸， 常常至少约 7-9 个相邻氨基酸， 典型的至少约 9-13 个相 邻氨基酸， 较优选至少约 20-30 个或更多个相邻氨基酸， 最优选至少约 30-40 个或更多个连 续氨基酸。
这种抗体或多肽或者 TLR2 特异性抗体片段的 “衍生物” 表示通过改变该蛋白的氨 基酸序列而进行修饰的抗体或多肽， 例如通过修改编码该蛋白的核酸或者通过改变蛋白本 身。这些天然氨基酸序列的衍生物可涉及到插入、 添加、 缺失和 / 或取代一个或多个氨基 酸， 优选同时提供具有 TLR2 结合活性的肽。优选这些衍生物涉及到插入、 添加、 缺失和 / 或 取代 25 个或更少的氨基酸， 较优选 15 个或更少， 甚至较优选 10 个或更少， 更为优选 4 个或 更少， 最优选仅 1 个或 2 个氨基酸。
在 某 些 实 施 方 式 中， 还 提 供 人 源 化 抗 体。 人 源 化 抗 体 可 通 过 例 如 如 第 No 5,585,089 号美国专利中描述的 Winter 法而生成。
人源化抗体可为一种具有单克隆抗体诸如 TLR2 特异性抗体的超变区和人抗体恒 定区的改良抗体。因此， 所述结合成员可包含人恒定区。
除超变区之外的可变区也可源自人抗体可变区， 和 / 或还可源自单克隆抗体诸如 TLR2 特异性抗体。在这种情况下， 整个可变区均可源自鼠单克隆抗体如 TLR2 特异性抗体， 且该抗体据称为嵌合的。用于制备嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。这些方法包括例 如 Boss(Celltech) 和 Cabilly(Genentech) 的美国专利中阐述的那些方法。分别参见第 4,816,397 和 4,816,567 号美国专利。
可能采取单克隆抗体和其他抗体并采用重组 DNA 技术生成其他保持原始抗体特 异性的抗体或嵌合分子。 这些技术可涉及到将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区 (CDRs) 的 DNA 引入不同免疫球蛋白的恒定区， 或恒定区外加框架区。 参见例如第 0,184,187 号欧洲专利申请、 第 2,188,638A 号英国专利申请或第 0,239,400 号欧洲专利申请。可对杂 交瘤或其他生成抗体的细胞进行遗传突变或其他变化， 其可能改变或不改变所生成抗体的 结合特异性。
在某些实施方式中， 其中所述 TLR2 抑制性化合物或 TLR2 结合化合物是一种抗体 或抗体结合片段， 其中该抗体以治疗有效量给药受体。 在某些实施方式中， 该治疗有效量包 含剂量范围选自 1μg/kg 至 20mg/kg、 1μg/kg 至 10mg/kg、 1μg/kg 至 1mg/kg、 10μg/kg 至 1mg/kg、 10μg/kg 至 100pg/kg 以及 500pg/kg 至 1mg/kg 的抗体。
抗体的生成
本发明所提供的抗体可通过多种技术而提供。例如， 可采用组合筛选技术如基于 噬菌体展示的生物扫描分析来鉴定对本发明所述结合抗原表位具有结合特异性的氨基酸 序列。这种噬菌体展示生物扫描技术涉及到通过在丝状细菌表面上展示抗体结合片段而 应用噬菌体展示文库， 其在模拟免疫选择的过程中鉴定恰当抗原表位结合配体的方法中利 用。选择具有特异结合活性的噬菌体。随后， 所选择的噬菌体可用于生成嵌合、 CDR 移植、 人源化或人的抗体。
在其他实施方式中， 该抗体是单克隆抗体， 其可采用任何通过连续培养细胞系生 成抗体分子的适合方法而生成。适合的方法为本领域中的熟练技术人员所熟知， 包括例如 Kohler 和 Milstein 的方法 (Kohler et al.Nature， 256， 495-497.1975)。嵌合抗体或 CDR 移植抗体也包括在本发明的范围内。在某些实施方式中， 本发明所述抗体可通过在宿主细 胞中表达重组 DNA 而生成。
在某些实施方式中， 单克隆抗体可为人抗体， 通过转基因动物如转基因小鼠而生 成， 所述转基因动物已通过遗传修饰以缺失或阻遏内源性鼠免疫球蛋白基因的表达， 优先 表达编码人重链和轻链的基因座， 这样可生成完整人抗体。
在某些实施方式中， 该结合化合物是一种源自抗体的结合片段， 例如抗体结合片 段， 如 Fab、 F(ab’ )2、 Fv 或单链 Fv(scFV)。
在某些实施方式中， 该结合化合物包括天然或合成化合物或拟肽的多克隆抗体、 嵌合抗体、 合成抗体、 融合蛋白或其片段。下文将阐述用于生成对 TLR2 抗原表位具有亲和 性和结合特异性的抗体的方法学。
本发明所述抗体或抗体片段以及用于本发明的抗体或抗体片段还可全部或部分 通过化学合成而生成。 所述抗体按照已确定的标准液相、 优选固相肽合成法进行制备， 这些 方法的一般性描述广泛存在且为本领域中的熟练技术人员所熟知。此外， 其可通过液相法 或通过液相、 固相和溶液化学的任意组合在溶液中制备。
另一种生成适用于本发明的抗体或抗体片段的便利方式是通过利用表达系统中 的核酸来表达编码抗体或抗体片段的核酸。
按照本发明应用的核酸可包括 DNA 或 RNA， 且可全部或部分是合成的。 在一个优选 的方面， 用于本发明的核酸编码如上文定义的本发明所述抗体或抗体片段。熟练技术人员 将能够确定对这些核酸进行取代、 缺失和 / 或添加， 其仍将提供本发明所述抗体或抗体片段。 考虑到可利用的核酸序列和克隆， 编码本发明所用抗体或抗体片段的核酸序列可 易于由熟练技术人员利用本文中包含的信息和参考文献以及本领域中已知的技术 ( 例如， 参见 Sambrook et al.(1989) 和 Ausubel et al， (1992)) 进行制备。这些技术包括 (i) 采 用聚合酶链反应 (PCR) 从例如基因组来源扩增这些核酸样品， (ii) 化学合成或 (iii) 制备 cDNA 序列。 编码抗体片段的 DNA 可以本领域中熟练技术人员已知的任何适合方式生成并应 用， 包括获得编码 DNA、 鉴定待表达部分两侧的恰当内切酶识别位点以及从该 DNA 切去所述 部分。随后将该部分可操作性连接于标准市售表达系统中的恰当启动子。另一种重组途径 是通过恰当的 PCR 引物扩增该 DNA 中的相关部分。可利用定点突变对该序列进行修饰， 以 在用来表达该核酸的宿主细胞中表达该修饰肽或者考虑密码子偏爱性。
该核酸可以质粒、 载体、 转录或表达盒， 其包含至少一种如上文所述核酸， 的形式 作为结构体而包括在本发明中。所述结构体可包含在重组宿主细胞内， 该宿主细胞包含一 种或多种如上所述的结构体。 表达则可通过在恰当条件下培养包含该核酸的重组宿主细胞 而轻易实现。通过表达而生成后， 该抗体或抗体片段可利用任何恰当技术分离和 / 或纯化， 然后适当应用。
用于在多种不同宿主细胞中克隆并表达多肽的系统已为人熟知。 适合的宿主细胞 包括细菌、 哺乳动物细胞、 酵母、 昆虫和杆状病毒系统。本领域中现存可用于表达异源性多 肽的哺乳动物细胞系包括中华仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、 海拉细胞 (HeLa cell， 宫颈癌传代细 胞 )、 幼仓鼠肾细胞、 NS0 小鼠骨髓瘤细胞。一种通用、 优选的细菌宿主是 E.coli。本领域 中已经很好的建立了抗体和抗体片段在原核细胞诸如 E.coli 中的表达。在培养的真核细 胞中表达也可为本领域中的熟练技术人员所用， 作为一种生成结合成员的选择。
用于抗体生成的通用技术为本领域中的熟练技术人员所熟知， 这些方法在例如 Kohler and Milstein(1975)Nature 256 ： 495-497 ； US Patent No.4,376,110 ； Harlow and Lane， Antibodies ： a Laboratory Manual， (1988)ColdSpring Harbor 中有所论述， 其内容 结合于此供参考。用于制备重组抗体分子的技术在上述参考文献以及例如 EP 0,623,679 和 EP 0,368,684( 其结合于此供参考 ) 中有所阐述。
在本发明某些实施方式中， 应用了包含编码抗体的重链可变区和 / 或轻链可变区 的插入子的重组核酸。按照定义， 这些核酸包括编码单链核酸、 双链核酸 ( 由所述编码核酸 以及其互补核酸组成 ) 或者这些互补 ( 单链 ) 核酸本身。
此外， 编码抗体重链可变区和 / 或轻链可变区的核酸可为利用酶合成或化学合成 的核酸， 具有编码天然存在的重链可变区和 / 或轻链可变区， 或其突变体的确定 ( 真实， authentic) 序列。
重组 DNA 技术还可用来改善本发明所述抗体。因此， 可构建嵌合抗体以降低其 在诊断或治疗性应用中的免疫原性。而且， 可通过用一种类似于使抗体人源化的技术进 行 CDR 移植而将转基因生物如猪中的免疫原性降到最低。这些技术的实例在 Winter 的 EP 0,239,400 中有所阐述。 为了降低受者体内的免疫原性， 本发明可应用包含编码抗体重链可 变区 ( 融合于人恒定区 ) 的插入子的重组核酸。同样， 本发明涉及包含编码抗体轻链可变 区 ( 融合于人恒定区 κ 或 λ 区 ) 的插入子的重组核酸。
此外， 抗体还可通过抗体基因致突变而生成， 以得到 5 个人工抗体库 ( 抗体谱 )。 该
技术可制备抗体文库。抗体文库也可购买。因此， 本发明有利的采用人工免疫球蛋白库， 优 选人工 scFv 库作为免疫球蛋白来源鉴定对本发明所述抗原表位具有特异性的结合分子。
抗体选择系统
能够结合本发明所述抗原表位并因此应用于本发明所述方法中的免疫球蛋白可 利用熟练技术人员已知的任何技术加以鉴定。 这些免疫球蛋白可方便的从包含人工免疫球 蛋白多肽库的文库中分出。 “库” 指一组通过一个或多个模板分子在核酸水平进行随机、 半 随机或定向变异而生成的一组分子， 以提供结合特异性的多样性。生成库 (repertoires) 的方法已在本领域中得到了很好的描述。
任何文库选择系统均可与本发明结合应用。 用于分离较大文库中所需成员的选择 流程在本领域中是已知的， 如通过噬菌斑展示技术所代表的。 这些系统中， 多种肽序列展示 于丝状噬菌体表面上， 已证实对于创建抗体片段 ( 以及编码它们的核苷酸序列 ) 文库用于 体外选择并扩增可结合靶抗原的特异性抗体片段非常有用。编码 VH 和 VL 区的核苷酸序 列可连接于编码引导信号 ( 可引导其进入 E.coli 的壁膜间隙 ) 的基因片段， 因此， 可将所 得到的抗体片段展示于噬菌体表面上， 常常作为噬菌体外壳蛋白的融合体 ( 例如 pIII 或 pVIII)。可替代的， 抗体片段向外展示于 λ 噬菌体衣壳蛋白 ( 噬菌体主体 ) 上。噬菌体基 展示系统的一个优势在于， 因为其是生物学系统， 因此所选择的文库成员可简单的通过在 细菌细胞中培育包含所选文库成员的噬菌体而扩增。此外， 因为编码多肽文库成员的核苷 酸序列包含于噬菌体或噬菌粒载体上， 因此， 测序、 表达和随后的基因操作相对比较简单。
用于构建噬菌体抗体展示文库和 λ 噬菌体表达文库的方法在本领域中为人熟知 ( 例如， McCafferty et al.(1990)Nature 348552-554.)。 一种特别有利的方法为采用 scFv 噬菌体文库 ( 参见例如 Huston et al.， 1988， Proc.Natl.Acad.Sci USA)。
应用噬菌体或其他克隆文库的一种备选方案， 是采用源自动物 B 细胞的核酸， 优 选 RNA， 该动物已用所选靶标， 例如本发明所述 TLR2 抗原表位进行免疫。
分离 V 区和 C 区 mRNA 可使抗体片段如 Fab 或 Fv 在细胞内表达。简单而言， 从免 疫动物的 B 细胞中分离 RNA， 例如从免疫小鼠的脾脏或骆马 ( 美洲驼 ) 的循环 B 细胞， 并采 用 PCR 引物从 RNA 池中选择性扩增 VH 和 VL cDNA。将这样得到的 VH 和 VL 序列进行连接而 制备 scFv 抗体。PCR 引物序列可基于已发表的 VH 和 VL 序列。
拟肽
肽类似物如拟肽或肽模拟物是具有模板肽的代表性特征的非肽化合物。典型的， 这些肽类似物利用计算机分子模拟来开发。结构类似于肽 ( 其对本发明所述 TLR2 结合抗 原表位具有亲和性和结合特异性 ) 的拟肽可用来介导类似的诊断、 预防和治疗效应。
通常， 拟肽结构类似于模板肽， 但一个或多个肽键通过本领域中熟知的方法而用 可替代的键取代。例如， 对本发明所述 TLR2 抗原表位具有结合特异性的肽可加以修饰， 使 其包含酰胺键取代、 掺入非肽部分或者骨架环化。恰当的， 如果存在半胱氨酸， 则该残基的 巯基可加以帽化而避免游离硫酸酯 ( 盐 ) 基团的破坏。肽可进一步从天然序列进行修饰以 保护该肽不受蛋白酶攻击。
适当的， 本发明的肽以及用于本发明的肽可进一步利用 C 和 / 或 N 末端帽化和 / 或半胱氨酸残基帽化中的至少一种进行修饰。恰当的， 本发明的肽以及用于本发明的肽可 用乙酰基在 N 末端残基进行帽化。恰当的， 本发明的肽以及用于本发明的肽可用酰胺基在C 末端残基进行帽化。恰当的， 半胱氨酸的巯基可用乙酰氨甲基进行帽化。
确定本发明所述抗原表位的多肽及其片段的表达、 分离和纯化可通过任何恰当的 技术而实现。 用于生产多肽的方法包括 ： 在可促进该多肽表达的条件下， 培养用编码多肽的 重组表达载体进行转化的宿主细胞， 然后从培养物中回收所表达的多肽。本领域中的熟练 技术人员将认识到， 纯化所表达多肽的步骤可根据某些因素加以变更， 如所采用宿主细胞 的类型以及该多肽是细胞内的、 膜结合的还是可溶形式 ( 其从该宿主细胞而分泌 ) 的。
任何恰当的表达系统均可应用。 载体包括编码本发明所述多肽或片段的 DNA， 可操 作地连接于恰当的转录或翻译调节性核苷酸序列， 如那些源自哺乳动物、 禽类、 微生物、 病 毒、 细菌或昆虫基因的调节性核苷酸序列。当该调节性序列与该 DNA 序列功能相关时， 即可 操作性连接该核苷酸序列。因此， 如果启动子核苷酸序列控制 DNA 序列的转录时， 即可将启 动子核苷酸序列可操作性连接于该 DNA 序列。赋予可在所需 (E.coli) 宿主细胞中进行复 制的能力的复制起始点以及通过其鉴定转化体的筛选基因， 通常均包含入表达载体中。
此外， 编码合适信号肽 ( 天然或异源的 ) 的序列也可包含入表达载体中。用于信 号肽 ( 分泌性先导肽 ) 的 DNA 序列可以框架形式融合于本发明所述核酸序列， 使得 DNA 开 始转录， 且 mRNA 翻译为包含该信号肽的融合蛋白。在预期宿主细胞中有功能的信号肽促进 该多肽的细胞外分泌。翻译过程中， 该信号肽从该多肽切割， 但可从细胞分泌该多肽。
用于表达多肽的恰当宿主细胞包括高级真核动物细胞和酵母。原核系统也适 用。特别优选哺乳动物细胞特别是 CHO 细胞用作宿主细胞。哺乳动物、 原核、 酵母、 真菌 和昆虫细胞宿主应用的恰当克隆和表达载体在例如 Pouwels et al.Cloning Vectors ： A Laboratory Manual， Elsevier， New York， (1986)(ISBN 0444904018) 中有所阐述。
小分子
在多个其他方面， 本发明涉及到用于鉴定拮抗 TLR2 活性或表达的小分子化合物 的筛选和分析方法。某些其他方面扩展至由此鉴定的化合物， 其中所述结合化合物对一种 结合后即抑制 TLR2 功能活性的抗原表位具有亲和性和结合特异性。
鉴定为 TLR2 受体拮抗剂的物质， 可以为肽或自然界中的非肽， 如上文所述的拟 肽。然而， 非肽 “小分子” 常常优先用于多种体内药学用途。因此， 用于本发明的 TLR2 结合 化合物模拟物或模仿物可设计用于药学用途。
将模拟物设计为一种已知的药学活性化合物是一种已知的基于 “前导” 化合物开 发药品的途径。如果活性化合物难以合成或者合成费用比较昂贵时， 或者其不适于特定给 药方法时， 该途径则比较理想。例如， 由于其可被消化道中存在的蛋白酶降解， 因此肽不适 于作为口服组合物及口服给药的活性物质。 对于目标属性， 采用模拟设计、 合成和测试可避 免随机筛选大量分子。
从具有特定目标属性的化合物设计模拟物通常需采取几个步骤。首先， 确定化合 物中对于决定该目标属性比较关键和 / 或重要的特定部分。对于肽而言， 这一点可通过系 统性改变该肽中的氨基酸残基例如通过依次取代每一个氨基酸残基而实现。 这些构成该化 合物活性区的部分或残基称为其 “药效团” 。
一旦确定了该药效团， 则利用来自多种来源如光谱技术、 X 射线衍射数据和 NMR 的 数据， 根据其物理性质如立体化学、 键合、 大小和 / 或电荷而模拟其结构。该模拟过程中还 可应用计算机分析、 相似度映射 ( 其模拟药效团的电荷和 / 或体积而非原子之间的键 ) 和其他技术。
在该途径的一个变型中， 对 TLR2 结合化合物的三维结构进行模拟。这一点在配体 和 / 或结合蛋白 ( 结合伴侣 ) 改变结合的构象时尤其有用， 使该样本考虑模拟物的设计。
随后选择模拟该药效团的化学基团可移植其上的模板分子。 所述模板分子及移植 其上的化学基团可方便的进行选择， 因此该模拟物易于合成， 且是药理学可接受的， 在体内 不会降解， 同时保留该先导化合物的生物学活性。 随后可筛选通过该途径发现的模拟物， 观 察其是否具有目标属性或者其表现出目标属性的程度。 接下来可进一步优化或改良以得到 一种或多种用于体内或临床检测的最终模拟物。
在某些实施方式中， 该模拟结合化合物可为用于药物筛选项目中的天然或合成的 化合物。还可采用包含几种已鉴定或未鉴定组分的植物提取物。
在 另 外 的 方 面， 本 发 明 扩 展 至 组 合 文 库 技 术 (Schultz， JS(1996)Biotechnol. Prog.12 ： 729-743) 的用途， 该技术提供一种高效方式， 检测大量不同物质结合抗原表位或 调节可结合该抗原表位的配体活性的能力。筛选活性调节之前或筛选时， 可在例如酵母双 杂交系统 ( 其要求在酵母中， 多肽及待测物质均可从编码核酸表达而来 ) 中筛选待测物质 与该多肽相互作用的能力， 可用作测试该物质调节多肽活性的实际能力之前的粗筛。 待测物质或可加入本发明分析中的化合物的量通常将通过反复试验根据所采用 的化合物类型而确定。典型的， 可采用浓度从约 0.01 至 100nM 的公认的抑制化合物， 例如 从 0.1 至 10nM。当待测物质是肽时， 可采用较大的浓度。
组合药剂
如上文所述， 本发明扩展至组合疗法， 其中组合物或方法涉及到抑制 TLR2 功能活 性的结合化合物可与至少一种其他可用来阻遏免疫应答 ( 其对再灌注损伤起作用 ) 或治疗 心脏病的治疗剂联合给药。
典型的， 首要治疗组合物和次级治疗组合物同时期给药。 在某些实施方式中， 首要 治疗组合物 ( 即拮抗 TLR2 功能活性的结合化合物 ) 和次级治疗化合物同时给药。在某些 其他实施方式中， 它们可依次给药。
在某些实施方式中， 所述组合疗法可包含一种 TLR2 功能抑制剂， 其可与下列试剂 其中之一同时给药受体 ： 细胞因子抑制剂 ( 如但不限于 IL-1、 IL-6、 IL-8 和 IL-15 的抑制 剂 )， 以及肿瘤坏死因子抑制剂、 生长因子抑制剂、 免疫抑制剂、 消炎药、 酶抑制剂、 代谢抑制 剂、 细胞毒性试剂或者细胞增殖抑制剂。
本领域中的相关技术人员将认识到， 给药受体一种组合疗法将是有益的， 因为其 可使得给药受体较低剂量的治疗药物而获得相似的治疗效果。 给药较低的组合剂量也可使 受体暴露的源自所给药化合物的毒性水平较低。此外， 由于作为本发明所提供组合疗法的 一部分而给药的次级治疗化合物针对不同的方向， 因此可能引起整体疗效的协同性增强。 疗效增强还将引起对待给药剂量的要求较低以及本身伴随的毒性降低。
在鉴定和选择与本发明所述 TLR2 抑制性化合物一起给药的适合的次级治疗化合 物时， 所述次级治疗化合物可根据这些在免疫应答 ( 其引起与再灌注损伤有关的炎症 ) 的 不同阶段调节免疫应答的化合物而加以选择。这些次级化合物可包括但不限于 ： 可溶性受 体、 肽抑制化合物、 小分子、 融合蛋白或配体、 抗体以及介导抗炎效应的细胞因子。
给药
本发明所述单克隆抗体或融合蛋白可单独给药， 但优选作为一种药物组合物给 药， 通常该组合物将包括恰当的药学可接受赋形剂、 稀释剂或载体， 根据希望给药的途径而 选择。恰当药学载体的实例包括 ： 水、 甘油、 乙醇或其他 GRAS 试剂。
本发明所述单克隆抗体或融合蛋白可通过任何恰当途径给药需要进行治疗的受 体。如本文中所详述的， 优选该组合物优先胃肠外注射或输注给药。用于胃肠外给药的优 选途径包括但不限于 ： 静脉内、 贲门内、 动脉内、 腹膜内、 肌内、 腔内、 皮下、 经粘膜、 吸入或经 皮给药。
给药途径还可进一步包括局部和肠内， 例如粘膜 ( 包括肺 )、 口服、 鼻、 直肠给药。
在某些实施方式中， 该组合物可作为注射组合物递送。对于静脉内、 肌内、 皮内或 皮下的应用， 活性成分将为胃肠外可接受的水性溶液形式， 其为无热原的， 且具有恰当的 pH、 等张性和稳定性。 本领域中的相关技术人员可利用等张赋形剂如氯化钠注射液、 林格注 射液或乳酸钠林格注射液等熟练制备恰当溶液。如果需要， 还可包含防腐剂、 稳定剂、 缓冲 液、 抗氧化剂和 / 或其他添加剂。
所述化合物还可通过微球、 脂质体、 其他微颗粒递送系统或置于某些组织包括血 液中的缓释制剂而给药。
上文提到的技术和流程以及其他可按照本发明应用的技术和流程实例可在 Remington’ s Pharmaceutical Sciences， 18th edition， Gennaro， A.R.， Lippincott Williams & Wilkins ； 20th edition ISBN 0-912734-04-3andPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems ； Ansel， H.C.et al.7th Edition ISBN 0-683305-72-7 中查到， 其整个披露案均结合于此供参考。
该组合物优选以 “治疗有效量” 给药个体， 这个量足以向给药该组合物的个体表现 出成效。 所给药的实际剂量以及给药速率和时程将依赖于且可适当参照所治疗病症的性质 和严重程度以及诸如年龄、 性别和待治疗受体体重以及给药途径而确定。且应进一步对该 组合物属性如其结合活性和体内血浆寿命、 该制剂中融合蛋白的浓度以及递送途径、 位点 和速率等加以合理考虑。
给药方案可包括单次给药本发明所述组合物或多次给药该组合物。 该组合物还可 与其他治疗剂和药剂 ( 其用于治疗给药本发明所述融合蛋白所治疗的病症 ) 依次或独立给 药。
可给予受体的给药方案实例可从包括但不限于 1μg/kg/ 天至 20mg/kg/ 天、 1μg/ kg/ 天至 10mg/kg/ 天、 10μg/kg/ 天至 1mg/kg/ 天的组中加以选择。
本发明所述 TLR2 调节剂优选以 “治疗有效量” 给药个体， 这个量足以使该个体受 益。所给药的实际剂量以及给药速率和时程将依赖于正治疗病症的性质和严重程度。开具 该疗法例如决定剂量等， 最终在全科医生和其他内科医生的职责范围内， 应慎重决定， 且通 常考虑待治疗疾患、 受体个体的病症、 递送位点、 给药方法以及执业医生所知的其他因素。
除非另有定义， 本文中应用的所有技术和科学术语具有本发明领域中熟练技术人 员通常所理解的含义。
在整个说明书中， 除非上下文另有要求， 术语 “包含” 或 “包括” 或者其变形均应理 解为提示涵盖所述整数或一组整数， 但不排除任何其他整数或一组整数。
如本文中使用的， 术语如 “一” 、 “一个” 和 “所述” 包括单数或复数个指示物， 除非上下文另外明确指出。因此， 例如提到 “一种活性试剂” 或 “一种药理学活性试剂” 时， 包括 单种活性试剂以及两种或更多种不同活性试剂联用， 而提到 “一种载体” 则包括两种或更多 种载体的混合物以及单种载体等。
用来描述本发明所述融合蛋白中多肽组分的命名法遵循传统惯例， 其中氨基 (N) 位于每一个氨基酸残基的左侧， 羧基则位于右侧。
如本文中使用的， 术语 “氨基酸” 用来既包括天然和合成的氨基酸， 又包括 D 和 L 氨 基酸。合成的氨基酸还涵盖化学修饰的氨基酸， 包括但不限于盐类以及氨基酸衍生物如酰 胺。 本发明所述多肽内存在的氨基酸可通过甲基化、 酰胺化、 乙酰化或用其他可改变循环半 衰期但不会负面影响其生物学活性的化学基团取代而修饰。
本文中， 术语 “肽” 、 “多肽” 和 “蛋白” 可互相交换使用， 来描述一系列至少两个通 过肽键或其他修饰肽键如电子等排体共价连接的氨基酸。 构成肽或蛋白的氨基酸最大数目 未加限制。 此外， 术语多肽扩展至肽的片段、 类似物和衍生物， 其中所述片段、 类似物或衍生 物保留与该片段、 衍生物或类似物所来源的肽相同的生物学功能活性。
此外， 如本文中使用的， 术语 “融合蛋白” 还可用来表示融合多肽、 融合肽或相似 物， 或者可称为免疫交联物。术语 “融合蛋白” 指一种分子， 其中两个或多个亚单位分子， 通 常为多肽， 可共价或非共价连接。
如本文中使用的， 术语 “治疗有效量” 表示阻遏 TLR2 介导炎症所需本发明试剂、 结 合化合物、 小分子、 融合蛋白或拟肽的量， 其中该炎症是再灌注损伤的起因， 而再灌注损伤 则来自于至少一种选自由但不限于受体低氧、 中风、 心脏病发作、 慢性肾衰或器官移植组成 的组的病症。
如本文中使用的， 术语 “预防有效量” 指预防 TLR2 介导炎症最初发病、 进展或复发 所需组合物的量， 其中该炎症是再灌注损伤的起因， 而再灌注损伤则来自于至少一种选自 由但不限于受体低氧、 中风、 心脏病发作、 慢性肾衰或器官移植组成的组的病症。
如本文中使用的， 术语 “治疗” 以及相关术语表示 TLR2 介导炎症或其至少一种症 状进展、 严重度和 / 或持续时间的减慢或减少， 其中所述减少或减慢是由于给药一种对本 发明所述 TLR2 结合抗原表位具有特异性的结合化合物。因此， 术语 “治疗” 指任何可有利于 受体的方案。所述治疗可针对现有病症或为预防性的 ( 预防性治疗 )。本文中提到 “治疗 性” 和 “预防性” 治疗时， 可在最宽泛的范围内加以考虑。术语 “治疗性” 并非必须表示受体 经治疗达到完全康复。类似的， “预防性” 并非必须表示该受体将最终染上一种疾病症状。
如本文中使用的， 术语 “受体” 指动物， 优选哺乳动物， 特别是人。在一个特定实施 方式中， 受体是哺乳动物尤其是人。术语 “受体” 如本文中使用的 “病人” 可相互交换使用。
实施例
实施例 1-TLR2 拮抗性抗体对心脏内再灌注损伤的效果
材料和方法
(i) 动物 & 实验设计
雄性 C57BL6 小鼠 (8-12 周大， 重 25-30 克 ) 经历 30 分钟缺血随后再灌注 24 小时。
实验化合物于再灌注前 5 分钟通过尾静脉给药。小鼠给药 400-450μl 的汤 药 ( 库 存 料， stock)， 10mg/kg IgG 同 种 型 抗 体 作 为 阴 性 对 照 (n ＝ 10) 或 0.5mg/kg 的 SB239063((Alexis Corporation， 目录号 ALX-270-351)， SB239063 也称为反式 -1-(4- 羟基环己基 )-4-( 氟代苯基 )-5-(2- 甲氧嘧啶 -4- 基 ) 咪唑， 一种有效的透细胞性 p38MAP 激 酶抑制剂 ( 重组纯化的人 p38α 的 IC50 ＝ 44nM)， 其抑制 LPS 刺激的人外周血单核细胞中 IL-1 和 TNF-α 的生成 (IC50 分别为 120nM 和 350nM)， 作为阳性对照 (n ＝ 10)， PBS(n ＝ 11) 以及实验性 OPN-301 单克隆抗体 15mg/kg(n ＝ 6)10mg/kg(n ＝ 10， n ＝ 5)， 10mg/kg(n ＝ 5)。OPN-301(OPN301) 是鼠 IgG1 抗 -TLR2 抗体 ( 小鼠 Toll 样受体 2(TLR2) 抗体， 克隆 T2.5， HyCult Biotechnology b.v.， Cell Sciences， Canton， USA ： 目录号 1054)。
将 小 鼠 用 FENTANYLTM(N-(1- 苯 乙 基 -4- 哌 啶 基 )-N- 苯 基 - 丙 酰 胺 )0.05mg/ kg， DORMICUMTM( 咪唑安定， 8- 氯 -6-(2- 氟代苯基 )-1- 甲基 -4H- 咪唑 [1， 5-a][1， 4] 苯 ( 并 ) 二氮卓类 )5mg/kg 和 DOMITORTM( 盐酸美托咪定 )0.5mg/kg( 腹膜内注射 ) 的混合 物进行麻醉。冠脉结扎前， 皮下给药 0.05mg/kg 阿托品 ((8- 甲基 -8- 氮杂双环 [3.2.1] 辛 -3- 基 )3- 羟基 -2- 苯基丙酸 )。手术过程中， 通过用直肠体温计持续监控以及自动加热 毯使中心体温保持在 36℃与 37.5℃之间。 培育小鼠并通入 100％氧气 (Harvard Apparatus Inc.)。左前降支 (LAD) 冠状动脉利用 8-0vicryl 缝线与置于 LAD 上的一段聚乙烯 -10 插 管相连接。
缺血通过心肌脱色而确认。再灌注通过解开结扎线并移走聚乙烯 -10 插管而启 动。濒危心肌的再灌注通过最初几分钟内的典型充血而鉴定。留置一条松弛的缝线以确定 缺血区。 闭合胸壁， 动物皮下接受 ANTISEDANTM( 盐酸阿替美唑， 一种替代 DOMITORT( 盐酸美 托咪定 ) 的镇静催醒试剂 )2.5mg/kg， ANEXATETM( 氟马西尼 ( 也称为 flumazepil))0.5mg/ kg 和 TEMGESICTM( 丁丙诺啡叔丁啡 )0.1mg/kg。
梗塞面积
梗塞面积 (IS) 表示为占危险区 (AAR) 和整个左心室 (LV) 的百分比。AAR/LV 的比 值是心肌组织缺血和再灌注 ( 即危险区 ) 程度的一个测量指标。比值 AAR/LV 是一种用来 测定危险心肌内梗塞面积的准确测量指标， 且是从治疗发挥效果开始的第一个终点。第二 个终点 IS/LV 比值是梗塞面积占整体左心室壁的百分比。
为了确定 AAR， 再次结扎 LAD( 在由留置于适当位置的缝线所标记的水平 )， 并通过 以逆行方式注射 4％ Evans 蓝染料。迅速移出心脏， 用 0.9％盐水冲洗并包裹在干净的食品 包装膜中， 于 -20℃冷冻 1 小时。随后用机器将心脏切成 5 个 1mm 的切片。心脏切片在 1％ 氯化三苯基四氮唑 (Sigma-Aldrich) 中于 37℃培育 15 分钟， 然后再置于甲醛中 15 分钟。 存活组织染为红色而梗塞组织呈白色。心脏切片在显微镜 (CARL ZEISSTM) 下进行数字化 成像 (CANON EOS 400D)。IS、 AAR 和总 LV 面积利用 ImageJ 软件 ( 版本 1.34) 进行测量。
统计分析
全部数据均表示为均值 ±SD。用偏态 (skewness)±SD 和峰态 (kurtosis)±SD 确定正态性后， 利用含邦弗朗尼 (Bonferroni) 校正的单因素方差分析 (ANOVA)( 表 2) 和 Dunnett’ s T 检 验 (2 侧 )( 表 4) 检 测 组 间 差 异。 如 果 疑 似 呈 非 正 态 分 布， 则进行 Kolmogorov-Smirnov 检验 ( 柯尔莫诺夫 - 斯米尔诺夫检验 )( 即， 当峰态和偏态值两倍于 其标准差时 )。所有的统计分析均采用 Windows 的 SPSS 13.0(SPSS， Chicago， USA) 进行， p ＜ 0.05 可认为具有显著性。
结果
生存 - 所有动物均活过了 30 分钟缺血期以及随后的 24 小时再灌注期。心脏切片 - 图 1 至 4 示出了不同组中心脏切片的代表性实例。
描述性统计 - 表 1、 表 3 及图 5、 6、 7、 8 和 9 示出了数据及其分布。所有数据均呈 正态分布。疑似 p38 抑制剂组为非正态分布， 但 Kolmogorov-Smirnov 检验证实了其正态性 (p ＝ 0.077)。
整个左心室内的危险区 (AAR)- 组间的 AAR/LV 无显著性差别， 意味着组之间操作 对左心室的影响相等 ( 图 5)。
梗塞面积 - 表 2 和表 4 示出了实验组之间均值的比较。相比于其他组， mAb 是唯 一一个平均 IS/AAR 表现出显著性差异的组。与 IgG 同种型 (p ＝ 0.007) 和 p38 抑制剂处 理的小鼠 (p ＝ 0.006) 相比， 用 OPN-301 单克隆抗体进行处理引起 AAR 内的梗塞面积 (IS/ AAR) 降低 43％。与 PBS( 硫酸盐缓冲溶液 ) 处理小鼠相比， IS/AAR 的降低更加显著， 50％ (p ＜ 0.001)( 图 6)。
在实验性抗 TLR2 的 OPN-301 单克隆抗体处理的小鼠中， 梗塞面积占整个左心室的 百分比 (IS/LV) 也有所降低 ： 与 IgG 同种型相比降低 53％ (p ＝ 0.01)、 与 p38 抑制剂相比， 降低 49％ (p ＝ 0.032)， 与 PBS 处理的小鼠相比， 降低 65％ (p ＜ 0.001)( 图 7)。
p38 抑制剂与 IgG 同种型处理的小鼠及 PBS 处理的小鼠之间平均 IS/LV 的差异 ( 分 别是降低 26％和降低 31％ ) 无显著性 ( 图 7)。
表1：
表 1. 独立变量的描述性统计
表2：
平均差在 .05 水平具有显著性。
表3： 独立变量的描述性分析 ( 修正表包括 IS/LV 数据， 而 TLR2KO、 血液 KO 和器官 KO 数据未预先包括在表 3 中 )
*
表4： Dunnettt( 双侧 )
平均差在 .05 水平具有显著性。
Dunnettt 检验以一个组为对照， 其他所有组均与其进行比较。
已证实， 对 TLR2 具有结合特异性的实验性 OPN-301 单克隆抗体引起的梗塞面积降 低比较显著。
实验性化合物于再灌注前 5 分钟给药， 这可解释为什么阳性对照 (SB239063) 不能 降低梗塞面积。 在已证实阳性对照有效的研究中， 可在缺血之前和 / 或再灌注期间给药 p38 抑制剂 (SB239063 或 SB203580)。临床使用时， 该流程由于几个原因而不大可行。首先， 心 肌梗塞不可预测， 因此受体无法在缺血期前服用 p38 抑制剂。p38 抑制剂可能需要一段较 长的时间发挥其作用， 因为其在整个缺血期一直给药。这使得其不适于作为一种用于心肌 缺血 / 再灌注的疗法， 其中血流的早期恢复对于受体有益 ： 该药物不具有足够的时间起效。 甚至在这些情况下， 所述抗 TLR2 单克隆抗体 OPN-301 也不能降低梗塞面积。
现在存在一个趋势， 即 p38 抑制剂 SB239063 降低梗塞面积占整个左心室百分比 (IS/LV) 的效应 (p ＝ 0.059， Table 2)。这可由以下原因引起 ： a)PBS 组中数据比较分散 ； b)SB239063 的确具有轻微效应， 但当缺血期之前给药时不如前期研究中那么大或 c) 动物 对 SB239063 的反应性存在变异性。
图 9 表明， 相比于盐水组的 34.5％， 给药 15mg/kg， 10mg/kg 和 5mg/kg 的抗 TLR2 单 克隆抗体 OPN-301 引起的梗塞分别占危险区的 21％、 21％和 25％。 经统计， 给药 10mg/kg(n ＝ 5) 时与图 6 中获得的结果 ( 用 OPN-301 单克隆抗体时， 梗塞为 19％ ) 类似。然而， 5mg/
36*101848724 A CN 101848725说明书30/38 页kg 组与盐水组之间的梗塞面积差异不能达到统计学显著性 (p ＝ 0.131)。
综上， 相比于 10mg/kg 或 15mg/kg 的鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 的剂量， 5mg/kg 的鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 不能显著性降低梗塞面积。15mg/kg 的鼠 IgG1 抗 TLR2 抗 体 OPN-301 的效应表明了该抗体的较强效力， 因为对于 10mg/kg 而言， 相比于 n ＝ 10， 相对 较少数量的小鼠即 n ＝ 5 足以获得正态分布的数据， 具有同样大小的标准差。因此， 15mg/ kg 的鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 与 10mg/kg 的鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 同等有效。
实施例 2- 对 TLR2 拮抗性抗体对心脏再灌注损伤效应的进一步研究
重复实施例 1 中的实验， 如下文所示以及图 15-23 中进一步展示的。
生存
所有动物均活过了 30 分钟缺血期 /24 小时再灌注期。除了 2 只用 IgG 同种型处 理的小鼠之外， 所有动物还存活过了 MI/R 损伤后的 28 天。死因与操作和 / 或感染性原因 无关。
心脏切片
图 15、 16、 17 和 18 示出了不同组中心脏切片的代表性实例。
描述性统计
表 5 及图 19、 20 和 21 示出了数据及其分布情况。所有数据均呈正态分布。疑似 p38 抑制剂组呈非正态分布， 但 Kolmogorov-Smirnov 检验证实了其正态性 (p ＝ 0.077)。
整个左心室内的危险区
AAR/LV 在不同组间没有差别， 表明左心室受不同组间操作的影响相等 ( 图 1)。
梗塞面积
表 5 示出了与 PBS 处理的多个比较。 TLR2 敲除处理及鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 处理引起梗塞面积的显著性降低。用鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 处理引起 AAR 内的梗塞 面积 (IS/AAR) 降低 45％ (p ＝ 0.001)。TLR2 敲除 (KO) 小鼠引起梗塞面积降低 33.3％ (p ＝ 0.025)。预期的阳性对照 p38 抑制剂处理的小鼠未表现出梗塞面积降低 (p ＝ 0.956) ( 图 20)。
梗塞面积占整个左心室的百分比 (IS/LV) 在 OPN-301 处理的小鼠中也有所降低 ： 与盐水处理相比下降了 52％ (p ＝ 0.001)。而且， IgG 同种型处理与 p38 抑制剂处理未观 察到梗塞面积的差异 ( 图 21)。
仅循环细胞上缺少 TLR2 的小鼠由于整体敲除的受益于类似程度的心脏保护。血 液敲除小鼠中的梗塞面积类似于 TLR2 整体敲除的小鼠 (AAR 内的梗塞降低 33.3 ％ ； p＝ 0.019)。相反， 实质细胞上缺乏 TLR2 的小鼠不能得到保护而免于 MI/R 损伤 ( 图 22)。按 照我们的假设及 TLR2 介导 MI/R 损伤中的炎症反应， 再灌注 24 小时后， 血液敲除小鼠的心 肌中巨噬细胞流入少 2.5 倍 (p ＝ 0.0005 ； 图 23)。这些数据支持一个观点即循环细胞上的 TLR2 表达介导 MI/R 损伤。
心脏功能 & 形态
图 24 和表 6 示出了梗塞 28 天后心功能和形态的变化。舒张末期容积和收缩末期 容积随着盐水和 IgG 同种型处理而增加， 而 OPN-301 处理则引起两个参数的降低。此外， 射 血分数在用盐水和 IgG 同种型处理的小鼠中较差。相反， 鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 则 于梗塞后 28 天仍然保持了心功能， 如通过射血分数的轻微增加而证实的。这些数据表明，OPN-301 处理引起的梗塞面积降低转变为 MI/R 损伤后的心功能以及心脏形态的保持。
表5： 危险区和梗塞面积的多重比较
*平均值差异在 .05 水平呈显著性。 a Dunnettt 检验以一组为对照， 所有其他组均与其进行比较。 表6： 基线 (t ＝ 0) 及梗塞后 (t ＝ 28) 的心功能 & 形态
将功能结果与盐水处理进行比较。 p ＜ 0.05 ； 与盐水处理相比， 有显著性差异 ；NS ： 与盐水处理相比， 无显著性差异。实施例 3- 猪血液样品中 TLR2 活性的抑制
猪血液样品将在肝素化管中提供 (n ＝ 4-5)， 在室温保存， 且将测定 OPN-301 单克 隆抗体拮抗 TLR2 功能的抑制性潜能。 TLR-2/TLR-4 抑制性肽和 TLR-4 抑制性肽还将在用特 定 TLR 激动剂刺激纯化的猪 PBMC 后进行评估。
实验流程
猪 PBMC 将在鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301( 剂量范围 ： 1000-0.01ng/ml) 或 TLR 阻 断性肽存在或不存在时用 TLR-2 激动剂 Pam3CSK4 和 FSL-1 或 TLR-4 激动剂 LPS 进行刺激。 细胞将刺激 6 和 24 小时， 并检测上清液中 TNF-α 的存在情况。
猪的品系之间可存在显著性差异， 即在血栓形成研究中， 小型猪可能不对鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 起反应， 而其他品系则起反应。
在大鼠或恒河猴的 PBMC 中， 鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 对 TLR2 配体诱导的 TNF-α 生成几乎未表现出抑制或根本无抑制。 然而， 短尾猴的 PBMC 中的结果则与最初开展 的参照研究中不一致， 因此进一步的工作利用短尾猴的 PBMC 而开展。
这 些 额 外 研 究 的 确 证 实， 鼠 IgG1 抗 TLR2 抗 体 OPN-301 结 合 上 短 尾 猴 的 PBMC 的 TLR2( 通过 FACS 分析 )， 而猴淋巴细胞上则观察到的 TLR2 表达极少。此外， 浓度高达 2000ng/ml 时， 在短尾猴的 PBMC 中仅观察到 TLR2 配体诱导的 TNF-α 生成的极微弱抑制或 无抑制。因此， 短尾猴中似乎存在相当微弱的鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 交叉反应性， 该 种属 PBMC 的效力分析中观察到的低活性表明与人和小鼠制剂相比， 其生物学活性极低。
由于小鼠不是用于开展安全性研究的有用种属， 因此鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 将需要更广泛的毒理学程序以符合管理机构的要求。由于器官体积和代谢类似， 因此猪的 急性病症如缺血及安全性研究与人类病症更加相关。因此， 本实验确认了鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 是一种用于猪缺血再灌注损伤样本将来可能的毒理学研究中的恰当治疗剂。
实施例 4- 兔中 TLR2 活性的抑制
兔 PBMC 将在鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301( 剂量范围 ： 1000-0.01ng/ml) 或 TLR 阻 断性肽存在或不存在时用 TLR-2 激动剂 Pam3CSK4 和 FSL-1 或 TLR-4 激动剂 LPS 进行刺激。 细胞将刺激 6 和 24 小时， 并检测上清液中 TNF-α 的存在情况。
该实验将确认鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 是否是一种用于兔动脉生成样本中的 恰当治疗剂。
小鼠可用于这些研究， 但对于人类的疾病症状， 认为兔是一种更适当的样本。然 而， 为了实施兔动脉生成， 必须证实抗体或肽在体外能够阻断 TLR 激动剂所介导的来自于 兔 PBMC 的炎症反应。
实施例 5- 缺血鼠的机制性研究
之前的实验已证实了鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 在鼠缺血再灌注损伤中的治疗 性效应。一个更彻底确定鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 作用机制的研究将是有益的。将采 用与之前在小鼠中开展的缺血研究相同的流程， 但还将测定其他参数如免疫组化、 炎症、 中 性粒细胞、 细胞因子、 凋亡和基质更新。
该实验将确定该治疗性鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 对免疫系统的作用机制。此 外， 还将采用嵌合小鼠研究， 其将确定药物给药的最佳途径。具有野生型小鼠血液的 TLR2 敲除小鼠将与具有野生型心脏的 TLR2 敲除小鼠进行比较， 以确定该抗体 / 肽是否通过最血液中免疫细胞 ( 浸润性单核细胞等 ) 或心脏上皮细胞起作用而发挥其治疗性效应。这些研 究的结果将确定静脉内 (i.v.) 还是冠脉内途径给药该本发明的治疗性化合物是最佳的。
实施例 6- 双重干预性研究
缺血再灌注将联用 TLR-2 和 TLR4 抑制剂进行评估， 这个过程将在猪体内实施， 假 设鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 在该动物样本中表现出功能性。之前开展的研究已清楚的 证实了 TLR4 在心脏缺血性炎症反应中的功能。考虑到前期用鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 开展的研究已证实了阻断 TLR2 的治疗性效应， 因此联合治疗途径可能更加有益。
实施例 7-TLR-2 阻断对动脉粥样硬化的效应
我 们 将 通 过 实 验 评 估 鼠 IgG1 抗 TLR2 抗 体 OPN-301 在 特 异 性 小 鼠 样 本 1(ApoE-/-cuff 样本 ) 中是否具有治疗性效应。 动脉粥样硬化斑块形成的一系列事件中， 最 初步骤之一是募集单核细胞至血管损伤部位。TLR 家族的 10 个成员中， TLR1、 TLR2 和 TLR4 的表达在人动脉粥样硬化斑块中显著增强。最近， 观察到 TLR4 与 TLR2 的连接加速了小鼠 动脉中新内膜的形成。此外， 还证实了 TLR2 表达增强可使斑块不稳。因此， 该实验过程将 检测 OPN-301 和 TLR 阻断性肽在降低斑块大小和形成方面的治疗性潜能， 以及评估小鼠动 脉粥样硬化样本中的斑块稳定性。
实施例 8- 涂布 TLR2 拮抗性化合物的支架
放置支架后， 炎症反应是已植入支架的受体免疫系统经常遇到的问题。 典型的， 动 脉阻塞将由于该炎性免疫应答而形成。 这些实验将检测新型治疗方案的治疗潜能， 其中， 支 架涂布了鼠 IgG1 抗 TLR2 抗体 OPN-301 或类似的 TLR 阻断性肽。该方式的优势在于其将为 炎症局部提供一个急性的强烈的局部， 并防止新内膜形成， 且可能稳定更下游的其他斑块。
实施例 9- 抗 TLR2 单克隆抗体处理对梗塞面积的影响
该实施例考虑抗 TLR2 单克隆抗体 OPN-301 有效降低小鼠梗塞面积的机制。该实 验将充分考虑炎症反应标志物、 凋亡程度及存活通路的激活。
嵌合小鼠实验将评估局部还是全身性 Toll 样受体抑制对于降低梗塞面积更加有 效。为了上述目标， 将于再灌注 1、 24 和 72 小时后对小鼠的对照和实验组加以评估。最后， 评估处理前和处理后 28 天的心功能。
该抗 Toll 样受体 2(TLR2) 的实验性单克隆抗体在缺血 30 分钟并再灌注 24 小时 后显著降低梗塞面积。一旦激活， Toll 样受体即启动炎性级联反应 ； 释放细胞因子和其他 促炎性化学引诱因子， 活化中性粒细胞和巨噬细胞。还阐述了 TLR 与促存活通路 PI3K/Akt 之间的交叉。
由于 Toll 样受体既在循环 ( 炎性 ) 细胞又在驻留 ( 器官特异性 ) 细胞上表达， 因 此， 那些引起 I/R 损伤中有害效应的受体仍有待于处理。这个问题从临床角度考虑也非常 重要， 因为 Toll 样受体抑制可发生于全身和局部。全身性给药抗 TLR2 的 OPN-301 将既抑 制循环细胞又抑制驻留细胞， 但将需要较多的化合物。局部 ( 即冠脉内 ) 注射单克隆抗体 主要抑制冠脉内皮细胞和心肌细胞上的 TLR， 需要的化合物较少。
该研究的目标是为了阐明通过给药 OPN-301 而降低梗塞面积的潜在过程。将研究 对照组和实验组在炎症活性、 凋亡和存活通路激活之间的差异。在两个时间点移出小鼠心 脏进行免疫组化和细胞因子分析， 以研究时间依赖性生物化学过程。嵌合小鼠实验将解决 实质或循环细胞表达的 TLR2 对心肌再灌注损伤的相对贡献。此外， 我们将利用磁共振成像(MRI) 技术揭示该抗 TLR 单克隆抗体 OPN-1 对心功能的影响。
材料和方法
再灌注前 5 分钟， 通过尾静脉给药 10mg/kg 的同种型对照或实验性抗 TLR2OPN-301 单克隆抗体 (mAb)， 每组 6 只小鼠。
处理组如下 ：
组别 处理
1. 媒剂对照 PBS
2. 实验性 mAb 10mg/kg OPN301
3. 阴性对照 10mg/kg IgG 同型对照
4. 假手术 PBS
5. 嵌合体 - 全身性 10mg/kg OPN 301
6. 嵌合体 - 心脏 10mg/kg OPN 30
再灌注后 1、 24 和 72 小时处死小鼠， 进行免疫组化、 细胞因子和趋化因子分析。心 肌缺血 / 再灌注损伤之前或之后， 评价盐水处理、 OPN-301 抗 TLR 单克隆抗体处理及模拟手 术小鼠中的心功能。
小鼠中缺血再灌注的步骤
C57/BL6 小鼠 (25-30g) 经历了 30 分钟心肌缺血和 24 小时再灌注或模拟手术。简 单来说， 小鼠用 Fentanyl-Dormicum-Domitor 的混合物进行麻醉 ( 如前所述 )。按需要给 药额外剂量以保持麻醉状态。小鼠进行插管并通 100％氧气。缺血通过利用 8-0 丝缝线结 扎左冠状动脉 (LCA) 而实现， 其中一段 PE-10 管置于 LCA 正上方距正常定位的左心房顶端 1mm 的位置。阻塞 30 分钟后， 通过解开结扎线并移开该 PE-10 插管而启动再灌注。在模拟 手术的小鼠中， 放置丝缝线但未结扎 LCA。
小鼠在再灌注期保持麻醉状态 1 小时。其后， 移出心脏并迅速用盐水冲洗。通过 梗塞区将心脏切为 2 半 ： 一半用福尔马林包埋用于免疫组化分析， 并分离另一半的梗塞区 与远端区域， 并储存于液氮中用于分离蛋白 RNA/cDNA。
在存活达 24 和 72 小时的小鼠中， 解开结扎线后关闭胸壁， 动物进行插管并通过采 用 37℃加热板保持体温。生存 24 和 72 小时后， 在这些动物中重复上述终止过程。
免疫组化分析
为了进行免疫组化分析， 将心脏于 4％福尔马林溶液中固定过夜， 并用石蜡包埋。 切 4μm 切片， 并用苏木素和伊红染色以评价形态及损伤征象。免疫组织学染色剂包括 ： 抗小鼠 MAC-3(#550292， Pharmingen， Clone M3/84， 兔抗小鼠 IgG1)， CD45 抗体 (#550539， Pharmingen， Clone 30-F11， 兔抗小鼠 IgG2b) 和中性粒细胞特异性 GR-1(#Ab34345， Abcam， Clone 7/4， 兔抗小鼠 IgG2a)。 采用适当的独立二抗检测阳性结合。 利用种属和同种型匹配 的抗体检测对第一抗体的特异性。
核氧化应激利用一种特异于 8- 羟基 -2`- 脱氧鸟苷 (8-OHdG)( 一种 DNA 氧化应激 的产物 ) 的免疫染料进行评价。组织切片用 10％正常马血清孵育 30 分钟， 用 0.1％ PBSA 1 ∶ 20 稀释的小鼠抗 -8-OHdG(OXIS internat.， FosterCity， CA， USA)in 4℃孵育过夜， 1 ∶ 500 稀释的生物素标记马抗小鼠 (VectorLab.， Burlingame， CA， USA) 孵育 1 小时， 并 用 1 ∶ 1000 稀释的抗生物素蛋白链菌素 -HRPO 孵育 1 小时。最后， 切片用 H2O2- 二氨基联苯胺四盐酸盐孵育 10 分钟。每片随机挑选 4 个视野 (200 倍放大 )， 用数字成像显微软件 (Olympos， Munster， Germany) 对 8-OHdG 阳性核进行定量。
细胞因子分析
通过检测关键生物学标志物 TNF-α， IL-1b/6/8， ICAM-1 和 VCAM-1 的表达。其他 相关分析包括评估巨噬细胞炎性蛋白 (MIP)、 单核细胞化学引诱蛋白 (MCP)-1 和存活通路 蛋白的磷酸化 ( 例如 MAPK， PI3K/Akt)。
总 RNA 按照制造商的说明书利用 Tripure 试剂 (Roche) 从梗塞和远端心肌中提 取， 转化为 cDNA 并进行定量逆转录酶 - 聚合酶链反应 (RT-PCR)。利用来自 uperarray Bioscience Corporation 的引物在 mRNA 水平上测定 TNFα， ICAM and VCAM。利用市售 cytoflowmix multiplex array(BenderMedSystems) 在 蛋 白 水 平 测 定 MCP-1、 白介素和 MIP( 通用参照 Tripureisolation， Roche)。用 OPN-301 单克隆抗体抑制后， Akt 磷酸化和 TLR2 蛋白的量将利用 Western Blotting 进行定量。
嵌合小鼠实验
通过用含 10 ％ FCS、 100IU/ml 青霉素和 100ug/ml 链霉素 (InvitrogenCorp.) 的 无菌 PBS 冲洗股骨和胫骨而从雄性 TLR2+/+ 或 TLR2-/- 小鼠收集总骨髓。为了确保受者 的短期生存， 通过一个 40μm 细胞过滤网在含 10％ FCS、 青霉素和链霉素的 PBS 中挤压脾 脏而获得雄性 TLR2+/+ 或 TLR2-/- 小鼠同系基因型脾脏的单细胞悬液。雄性 TLR2+/+ 和 TLR2-/- 小鼠在人计算机断层扫描中以 7Gy 的剂量进行致死性照射。照射后， 将悬于无菌 6 5 PBS 中的 5x10 个 TLR2+/+ 或 TLR2-/- 骨髓细胞和 2×10 TLR2+/+ 或 TLR2-/- 脾细胞注射 入受照的受者小鼠尾静脉内。将该小鼠在微隔离笼中饲育 6 周， 以完成供者骨髓的移入， 其 后诱导心肌的 I/R 损伤并在 TTC 染色 24 小时后测定梗塞面积。还可利用上文提到的免疫 组化分析实施病理生理学评估。
磁共振成像
心肌缺血 / 再灌注损伤之前和其后 28 天， 通过高分辨率磁共振成像 (MRI， 9.4T， Bruker， Rheinstetten， Germany) 对心肌大小和功能实施连续评价。得到切片之间具有 1.0mm 间隔的长轴和短轴图像并用来计算舒张末期容积 (EDV)、 收缩末期容积 (ESV)、 心搏 出量 (SV) 和心输出量 (CO)， 射血分数 (EF) 以 100*(EDV-ESV)/EDV 计算， 而 SV 是 EDV 与 ESV 之间的绝对差。心输出量是 1 分钟内的总输出体积， 计算为 SV* 平均每分钟心跳次数。所 有 MRI 数据均利用 Qmass 数字成像软件 (Medis， Leiden， theNetherlands) 进行分析。
结果
我们将利用用于 Windows v15.0 的 SPSS 软件包进行数据分析和统计分析。
(i) 梗塞后的 MRI 心功能
基线时不存在差异。梗塞后 28 天， 用 OPN-301 抗 TLR2 单克隆抗体处理的小鼠心 功能优于盐水处理， 因为终末舒张和收缩体积 (EDV、 ESV) 较低， 且 OPN-301 处理的小鼠中心 搏出量 (SV) 和射血分数 (EF) 较高。左心室 (LV 质量 ) 在各组之间没有差别 ( 这一点比较 好， 因为否则心脏增大时可能引起功能增强 )。
然而， 假手术组被排除了该分析， 因为在基线时， 它们与其他组差异太大， 而不能 用生物学变异解释。我们疑似可能与小鼠的不同批次 / 背景有关。我们将检验误差或者新 订一批 C57B16J 小鼠进行模拟手术。表 7- 分组统计 ：
表 8( 独立样本检验 )(ii) 嵌合小鼠的实验结果
已证实嵌合是成功的。一只小鼠由于梗塞极低而被排除该分析。在两组中均观察 到了梗塞面积降低。然而， 血液中缺乏 TLR2 的小鼠降低更多。似乎 TLR2 阳性的循环细胞 与再灌注损伤的相关性更强。由于样本量小， 梗塞面积降低之间的差别未能达到显著性差 异。
表9
表 10( 多重比较 ) Dunnettt(2 侧 )在 .05 的水平， 平均值呈显著性差异。
Dunnettt 检验将一个组作为对照， 所有其他组均与其进行比较。
表 9 中示出的结果进一步在图 10 和 11 中进行阐释。图 10 示出了危险区占左心 室的百分比 (AAR_LV)。图 11 示出了梗塞面积占危险区的百分比 (IS_AAR)。
本说明书中提到的所有文献均结合于此供参考。 对于本领域中的熟练技术人员来 说， 对本发明所述实施例进行多种改良和变动将是显而易见的， 而不背离本发明的范围。 尽 管本发明已结合特别优选的实施例进行了阐述， 但应该理解如所声明的， 本发明不应过分 限于这些特殊实施例。 事实上， 对所述执行本发明的模式进行多种改良， 对于本领域熟练技 术人员来说是很明显的， 也希望涵盖在本发明的范围内。
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