阿糖胞苷5’-O-氨基酸酯和其盐类及其制备方法 技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及阿糖胞苷5’-O-氨基酸酯和其盐类及其制备方法，具体涉及干扰DNA合成的药物1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-4-氨基-2(1H)-胞嘧啶酮的5’-O-氨基酸酯及其药学上可以接受的盐和其制备方法。
背景技术：
俗称为阿糖胞苷的化合物其化学名称为1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-4-氨基-2(1H)-胞嘧啶酮。阿糖胞苷在体内转化成活性的三磷酸阿糖胞苷，三磷酸阿糖胞苷通过抑制DNA多聚酶及少量渗入DNA，阻止DNA的合成，抑制细胞的生长，在临床上阿糖胞苷主要用于治疗急性粒细胞白血病。但是阿糖胞苷分子极性很大，导致小肠的膜通透性差，因此差的膜通透性使得阿糖胞苷口服生物利用度很低(约为20％)。因此有必要寻找一种途径来提高阿糖胞苷的膜通透性差，进而提高其口服生物利用度。根据大量的文献报道，如果对核苷类药物的自由羟基进行修饰，可能会提高这类药物的膜通透性和口服生物利用度。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种合成1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-4-氨基-2(1H)-胞嘧啶酮的5’-O-氨基酸酯药学上可以接受的盐，以及这些化合物在提高阿糖胞苷小肠通透性和生物利用度中的应用。
阿糖胞苷的5’-O-氨基酸酯药学上可以接受的盐的合成可以按照以下通用路线进行：
第一步：将氯甲酸苄酯慢慢滴加到由阿糖胞苷、碳酸氢钠和N，N-二甲基乙酰胺溶液中，室温反应后得到化合物A，结构如下：
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第二步：以化合物A和N-叔丁氧甲酰基-氨基酸为原料，在溶液中加入反应试剂进行酯化反应得阿糖胞苷5’-O-氨基酸酯，然后加酸即得阿糖胞苷的5’-O-氨基酸酯药学上可以接受的盐。
酯化反应的温度是25～150℃，反应试剂包括N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基乙酰胺、碳酸氢钠。所用的酸包括盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、甲磺酸、丙酸、丁酸、对甲苯磺酸、磷酸、马来酸、乳酸、碳酸、丙二酸，以及酸性氨基酸。
阿糖胞苷5’-O-氨基酸酯的结构式如下：
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其中R是：L-缬氨酰，D-缬氨酰，L-异亮氨酰，L-苯丙氨酰，D-苯丙氨酰，L-脯氨酰，L-色氨酰。
结构如下：
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L-缬氨酰 D-缬氨酰 L-异亮氨酰 L-苯丙氨酰
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D-苯丙氨酰 L-脯氨酰 L-色氨酰
所述的N-叔丁氧甲酰基-氨基酸为N-叔丁氧甲酰基-L-缬氨酸、N-叔丁氧甲酰基-D-缬氨酸、N-叔丁氧甲酰基-L-异亮氨酸、N-叔丁氧甲酰基-L-苯丙氨酸、N-叔丁氧甲酰基-D-苯丙氨酸、N-叔丁氧甲酰基-L-脯氨酸、N-叔丁氧甲酰基-L-色氨酸.
本发明的优点：本发明第一次合成了系列阿糖胞苷的5’-O-氨基酸酯药学上可以接受的盐，这些化合物显著提高了阿糖胞苷的膜通透性，其中口服阿糖胞苷的5’-O-缬酸酯盐酸盐后，阿糖胞苷在大鼠体内的绝对生物利用度由21.6％提高到60％。
附图说明：
图1为5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐和阿糖胞苷的血药浓度-时间曲线(n＝4)
a.口服化合物5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐(以阿糖胞苷计30mg/Kg)：(◇)阿糖胞苷和(Δ)：5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐)；b.口服阿糖胞苷：(□)阿糖胞苷；c.静脉注射阿糖胞苷：(×)阿糖胞苷
具体实施方式：
根据通用合成路线，分别制备如下化合物。
实施例1：
N-叔丁氧甲酰基-L-缬氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下通入氯化氢气体，约需4-7小时，析出固体。抽滤，用乙醇和乙酸乙酯洗，得5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐。
实施例2：
N-叔丁氧甲酰基-D-缬氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下通入氯化氢气体，约需4-7小时，析出固体。抽滤，用乙醇和乙酸乙酯洗，得5’-O-D-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐。
实施例3：
N-叔丁氧甲酰基-L-异亮氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下通入氯化氢气体，约需4-7小时，析出固体。抽滤，用乙醇和乙酸乙酯洗，得5’-O-L-异亮氨酰阿糖胞苷盐酸盐。
实施例4：
N-叔丁氧甲酰基-L-苯丙氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下通入氯化氢气体，约需4-7小时，析出固体。抽滤，用乙醇和乙酸乙酯洗，得5’-O-L-苯丙氨酰阿糖胞苷盐酸盐。
实施例5：
N-叔丁氧甲酰基-D-苯丙氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物VIII、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下通入氯化氢气体，约需4-7小时，析出固体。抽滤，用乙醇和乙酸乙酯洗，得5’-O-D-苯丙氨酰阿糖胞苷盐酸盐。
实施例6：
N-叔丁氧甲酰基-L-脯氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下通入氯化氢气体，约需4-7小时，析出固体。抽滤，用乙醇和乙酸乙酯洗，得5’-O-L-脯氨酰阿糖朐苷盐酸盐。
实施例7：
N-叔丁氧甲酰基-L-色氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下通入氯化氢气体，约需4-7小时，析出固体。抽滤，用乙醇和乙酸乙酯洗，得5’-O-L-色氨酰阿糖胞苷盐酸盐。
实施例8：
N-叔丁氧甲酰基-L-缬氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下加入稀硫酸溶液，搅拌5-7小时，冷冻干燥，得5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷硫酸氢盐。
实施例9
N-叔丁氧甲酰基-L-异亮氨酸与羰基二咪唑反应，反应溶剂是无水四氢呋喃、二氯甲烷或环己烷，反应温度是0℃至溶剂沸点，优选20-60℃，反应时间110分钟；将该反应液慢慢滴加到化合物A、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺与N，N-二甲基甲酰胺的混和液中。加毕，继续反应1-2小时，温度50-100℃，优选60-90℃。减压蒸去低沸点溶剂，将余下的N，N-二甲基甲酰胺溶液用冰醋酸调pH值至7.69，减压蒸去N，N-二甲基甲酰胺，残余物以乙酸乙酯稀释，依次用蒸馏水、饱和食盐水洗。有机层浓缩到一定程度，加入钯碳并进行常压催化氢化，反应时间约需7小时。抽滤，滤液用硅胶拌样，经硅胶柱层析，甲醇和乙酸乙酯梯度洗脱，收集柱层析物，浓缩，残余物以少量乙醇溶解，冰水浴冷却下加入丙二酸溶液，搅拌5-8小时，冷冻干燥，得5’-O-L-异亮氨酰阿糖胞苷丙二酸盐。
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实施例8：
利用大鼠在体小肠单灌流技术，选取10cm长的大鼠空肠，两端插管。将阿糖胞苷和实施例1～7的化合物分别溶解在Kreb-Ringer’s营养液(pH 5.5)，浓度是0.05mM，以0.2mL/min灌流通过大鼠空肠，得到阿糖胞苷和实施例1～7的化合物在空肠的膜通透率。
表2阿糖胞苷和实施例1～7的化合物的膜通透率
化合物 小肠通透率(×10-5cm/s)
阿糖胞苷 1.2
例1 12.7
例2 3.31
例3 4.72
例4 1.91
例5 1.53
例6 1.78
例7 1.44
实施例9：大鼠体内药物动力学研究
由实施例8可知在实施例1～7的化合物中，实施例1的化合物即5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐的膜通透率最高。
给实验组和对照组Sprague-Dawley大鼠分别灌胃5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐水溶液和阿糖胞苷水溶液(以阿糖胞苷计均为30mg/Kg)，测定血浆中阿糖胞苷的浓度。同时Sprague-Dawley大鼠静脉注射阿糖胞苷水溶液(8mg/Kg)。
由图1和表3可以得出，阿糖胞苷在实验组比对照组吸收明显加快，实验组阿糖胞苷的生物利用度是60％，而对照组仅为21.6％。因此，化合物5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐能明显提高阿糖胞苷的口服生物利用度。
表3口服5’-O-L-缬氨酰阿糖胞苷盐酸盐和阿糖胞苷后，阿糖胞苷的药动学参数(以阿糖胞苷计30mg/Kg)
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说明：Sprague-Dawley大鼠静脉注射阿糖胞苷水溶液(8mg/Kg)后，
平均AUC0-t是23.89μg·h/mL。
实施例10：对人白血病HL-60细胞株抗增殖活性试验
人白血病HL-60细胞株来源于美国细胞收集中心(American TypeCulture Collection(ATTC)，Rockville，MD，USA))。HL-60细胞株培养于RPMI-1640培养液中(Gibco，New York，NY，USA)，其中添加了10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和1mmol/L L-谷氨酸。细胞的接种密度为1×105cells/mL，培养24小时后，分别将阿糖胞苷和实施例1～6的化合物加到培养液中，考察对HL-60细胞的抗增殖活性。采用台盼蓝法测定细胞活性。使用血细胞计数器来计数总细胞和台盼蓝染色的细胞数目。不同浓度下受试化合物对细胞生长速度的影响与对照组(不加药)进行对比，并通过浓度效应曲线回归得到半数抑制浓度(GI50)。结果见表4。
Table 4.阿糖胞苷和实施例1～7的化合物对人白血病HL-60细胞株抗增殖活性
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a均值±SD，n＝3.