一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法 技术领域 本发明涉及一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法， 属于药理 活性物质的体内递送及其临床应用领域。具体来说， 本发明是一种利用蛋白及多肽展开与 再折叠或自组装的方法将药理活性物质包入蛋白， 形成纳米粒的方法。
背景技术
静脉注射给药能够快速直接地作用于机体。为了降低静脉注射给药的副作用， 有 效的方法之一就是将药理活性物质包入微米或纳米级的粒子中。一方面， 静脉注射的粒子 可以缓释药理活性物质并延长药理活性物质的半衰期 ； 另一方面， 靶向材料可以将粒子中 的药理活性物质靶向地释放。
在 现 有 技 术 涉 及 的 蛋 白 粒 子 的 制 备 方 法 中， 如 Abraxane 的制备方法 （美国专利 No.6,749,868， 美国专利 No.5,560,933） ， 将蛋白溶液与有机溶剂 均匀混合形成乳化液， 高压匀浆， 形成以紫杉醇为核心的白蛋白纳米粒。 除了这种制备方法 比较复杂之外， 还需要用高压及相应的高温来去除有机溶剂， 从而获得纳米粒。二氯甲烷， 乙腈等有机溶剂具有毒性， 需要控制其残留量。 此外， 这些方法包载药理活性物质的能力是 有限的。同时， 由于制备过程中的高压和剪切力， 蛋白和多肽还可能失去生物活性。 蛋白粒子还被众多文献报道作为药理活性物质和诊断试剂的载体。其中， 白蛋 白微球可以用热交联和化学交联的方法来制备。热交联微球是在 100 ～ 150 ℃下从乳化 混合物 （如白蛋白、 需包载的药理活性物质和适当的油相） 中制备。然后微球用适当的溶 剂洗涤并保存。Leucuta 等报道了热交联微球的制备方法 [International Journal of Pharmaceutics Vol. 41:213-217(1988)] ； 化学交联微球的制备， 如文献 [Science Vol. 213:233-235(1981)] 所报道， 用戊二醛交联蛋白， 然后洗涤并保存。
而且， 现有技术中蛋白纳米粒的制备方法很难保持蛋白的生物活性。而且， 难溶 于水的药理活性物质也很难被包入蛋白纳米粒中， 因为这种方法本身依靠乳化液的水相交 联。水溶性药理活性物质因其溶于含蛋白的水相而能够被交联进入蛋白阵列， 而水溶性差 或脂溶性药理活性物质难以进入这种方法所形成的蛋白阵列中。
发明内容 本发明的技术目的在于提供一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒 的方法， 以解决某些药理活性物质由于其疏水的性质而导致无法体内递送， 以及形成纳米 粒之后的蛋白质活性丧失的问题。
为了实现本发明的技术目的， 本发明的技术方案为 ： 一种制备用于体内递送药理活性物质的蛋白纳米粒的方法， 包括以下步骤 ： (a) 用第 一种溶剂溶解蛋白获得蛋白溶液 ； (b) 在变性剂或者适合的变性条件中将药理活性物质加 入步骤 (a) 中所述的蛋白溶液中， 使蛋白展开与再折叠或自组装， 把药理活性物质包入蛋 白， 形成蛋白纳米粒。
本发明技术方案中所述的蛋白纳米粒平均粒径为 5 ～ 2000 nm， 优化的为 25 ～ 500 nm， 最优的为 50 ～ 300 nm。
本发明技术方案中所述的蛋白纳米粒可包载占蛋白纳米粒总重量 1% ～ 40% 的药 理活性物质。
本发明技术方案所述的药理活性物质是疏水性药理活性物质， 如抗肿瘤药物， 心 血管药物， 抗炎药物， 降糖药物， 中枢神经系统药物， 免疫抑制药物， 以及抗病毒药物。
其中， 所述的疏水性药理活性物质是紫杉醇、 多西紫杉醇、 伊立替康、 5- 氟尿嘧啶、 卡莫司汀、 阿霉素、 苯芥胆甾醇、 哌泊舒凡、 他莫昔芬、 洛莫司汀、 藤黄酸、 冬凌草甲素、 鬼臼 毒素、 阿托伐他汀、 斯伐他汀、 非诺贝特、 硝苯地平、 布洛芬、 吲哚美辛、 吡罗昔康、 格列本脲、 地西泮、 利哌利酮、 齐拉西酮、 他克莫司、 雷帕霉素、 茚地那韦、 利托那韦、 Telaprevir （CAS 号 402957-28-2） 、 洛匹那韦、 或它们的组合。
其中， 优选的疏水性药理活性物质是紫杉醇或多西紫杉醇。
本发明技术方案所述的药理活性物质是亲水性药理活性物质。
其中， 所述的亲水性药理活性物质是环磷酰胺、 博莱霉素、 道诺霉素、 表柔比星、 甲 氨蝶呤、 5- 氟尿嘧啶或其类似物、 铂或其类似物、 长春碱或其类似物、 高三尖杉酯碱或其衍 生物、 放线菌素 -D、 丝裂霉素 -C、 依托泊苷、 或它们的组合。 本发明技术方案中所述的蛋白是白蛋白、 转铁蛋白、 胰岛素、 血管内皮抑素、 血红 蛋白、 肌红蛋白、 溶菌酶、 免疫球蛋白、 α-2- 巨球蛋白、 纤维连接蛋白、 纤层蛋白、 胶原蛋白、 明胶、 人造多肽与蛋白， 或者它们的组合。
其中， 优选的蛋白是白蛋白、 转铁蛋白、 胰岛素、 血管内皮抑素或血红蛋白。
本发明技术方案所述的步骤 (a) 的第一种溶剂是水， 生理盐水， 糖， 冻干保护剂或 蛋白稳定剂。其中， 所述的冻干保护剂是磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基氨基甲烷， 过氧 化氢， 谷胱甘肽， 葡萄糖、 或它们的组合。 所述的蛋白稳定剂是海藻糖， 甘露醇， 蔗糖， 乙酰色 氨酸， 辛酸钠或者它们的组合。
其中， 所述的第一种溶剂优选水， 磷酸盐， 醋酸盐， 乙酰色氨酸， 辛酸钠或生理盐 水。
本发明技术方案中所述的步骤 (a) 的操作温度为 -20 ～ 100℃； 优选为 50 ～ 85℃； 最优为 55 ～ 75℃。
本发明技术方案中所述的步骤 (a) 的操作 pH 值为 pH3 ～ 9 ； 优选为 pH5 ～ 8.5 ； 最 优为 pH6 ～ 8。
本发明技术方案中所述的步骤 (b) 的变性剂或者适合的变性条件包括水、 强酸、 强碱、 无机盐、 有机溶剂、 结构展开剂或表面活性剂。 其中， 所述的强酸强碱包括盐酸， 硫酸， 氢氧化钠等。 所述的有机溶剂是甲醇， 乙醇， 异丙醇， 福尔马林， 氯仿， 丙酮， 硫化氢或它们的 组合。所述的结构展开剂是水， 2- 巯基乙醇， 二硫苏糖醇， 盐酸胍， 尿素， 高氯酸， 三丁基膦， 甲巯丙脯氨酸， 过甲酸， 青霉胺， 谷胱甘肽， 甲硫咪唑， 乙酰半胱氨酸或它们的组合。所述的 无机盐是水， 氯化钠， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基氨基甲烷， 过氧化氢， 谷胱甘肽， 葡 萄糖， 蔗糖， 甘露醇， 海藻糖， 乙酰色氨酸， 辛酸钠或它们的组合。
其中， 优选的变性剂或者适合的变性条件是水， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基 氨基甲烷， 氯化钠， 葡萄糖， 乙醇， 丙酮， 硫化氢， 2- 巯基乙醇， 尿素或它们的组合。
本发明技术方案中所述的变性剂或者适合的变性条件的 pH 值为 pH3 ～ 9 ； 优选为 pH5.5 ～ 8.5。
本发明技术方案中所述的步骤 (b) 还包括外力操作以辅助蛋白展开。
其中， 所述的外力包括变化温度、 变化压力、 施加机械力或辐射。
其中， 所述的变化压力为对反应施加 10 ～ 100,000 psi 的压力 ； 优选的对反应施 加 2000 ～ 60,000 psi 的压力。
本发明的技术方案的方法进一步包括 ： (c) 将蛋白纳米粒透析除去多余的小分子 化合物或者进一步浓缩。
本发明的技术方案的方法进一步包括 ： (d) 将透析后的蛋白纳米粒经过脱水步骤 制备成药物制剂。
其中， 所述的脱水的步骤是冷冻干燥、 喷雾干燥或减压蒸馏。
下面是对本发明技术方案的进一步描述 ： 除上述总的技术方案以外， 本发明进一步提出了一种制备用于体内递送疏水性药理活 性物质的纳米粒制备方法， 所述方法包含以下几个步骤 ： (a) 在 -20 ～ 100℃， pH3 ～ 9 的条 件下， 用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液 ； (b) 在变性剂或者适合的变性条件下， 将 疏水性药理活性物质加入步骤 (a) 中所述的蛋白溶液， 从而引起蛋白展开与再折叠或自组 装， 把药理活性物质包入蛋白。 形成的纳米粒平均粒径为 5 ～ 500 nm， 可包载占粒子总重量 约 1 ～ 40% 的疏水性药理活性物质。这里的疏水性药理活性物质可以包括但不局限于紫杉 醇、 多西紫杉醇、 伊立替康、 卡莫司汀、 阿霉素、 苯芥胆甾醇、 哌泊舒凡、 他莫昔芬、 洛莫司汀、 藤黄酸、 冬凌草甲素、 鬼臼毒素、 阿托伐他汀、 斯伐他汀、 非诺贝特、 硝苯地平、 布洛芬、 吲哚 美辛、 吡罗昔康、 格列本脲、 地西泮、 利哌利酮、 齐拉西酮、 他克莫司、 雷帕霉素、 茚地那韦、 利 托那韦、 Telaprevir、 洛匹那韦， 以及它们的组合。
本技术方案的方法中的蛋白一般可以包括但不局限于白蛋白、 转铁蛋白、 胰岛素、 内皮抑素、 血红蛋白、 肌红蛋白、 溶菌酶、 免疫球蛋白、 α-2- 巨球蛋白、 纤维连接蛋白、 纤层 蛋白、 胶原蛋白、 明胶、 人造肽与蛋白， 以及它们的组合。 本实施方案的方法中的第一种溶剂 可以包括水、 生理盐水、 磷酸盐、 醋酸盐、 甘氨酸、 三羟甲基氨基甲烷、 过氧化氢、 谷胱甘肽、 葡萄糖、 海藻糖、 甘露醇、 蔗糖、 乙酰色氨酸、 辛酸钠， 以及它们的组合。此外， 本实施方案的 方法中的变性剂或者适合的变性条件可以包括水， 氯化钠， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲 基氨基甲烷， 过氧化氢， 谷胱甘肽， 甲醇， 乙醇， 异丙醇， 福尔马林， 氯仿， 丙酮， 硫化氢， 2- 巯 基乙醇， 二硫苏糖醇， 盐酸胍， 尿素， 高氯酸， 三丁基膦， 甲巯丙脯氨酸， 过甲酸， 青霉胺， 谷胱 甘肽， 甲硫咪唑， 乙酰半胱氨酸以及它们的组合。
其中， 所述的纳米粒子的平均直径优选为 25 nm ～ 500 nm ； 最优为 50 nm ～ 300 nm。所述步骤 (a) 优选在 50℃～ 85℃进行， 最优在 55℃～ 75℃进行。pH 优选在 5 ～ 8.5 的条件下进行， 最优在 6 ～ 8 的条件下进行。
所述变性剂或者适合的变性条件是水， 氯化钠， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基 氨基甲烷， 乙醇， 丙酮， 硫化氢， 2- 巯基乙醇， 尿素或它们的组合。
其中， 所述的变性剂或者适合的变性条件的 pH 值为 3 ～ 9， 优选为 5.5 ～ 8.5。
上述方法进一步包括 ： (c) 将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓 缩。还进一步包括 ： (d) 将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制剂。其中， 所述的脱水步骤是冻干， 减压蒸馏或喷雾干燥。
本发明技术方案再进一步提出了一种制备用于体内递送紫杉醇蛋白纳米粒的方 法， 所述方法包含以下几个步骤 ： (a) 在 55 ～ 75℃， pH6 ～ 8 的条件下， 用第一种溶剂溶解 所述蛋白获得蛋白溶液 ； (b) 在变性剂或者适合的变性条件下， 将紫杉醇加入步骤 (a) 中所 述的蛋白溶液， 从而引起蛋白展开与再折叠或自组装， 把紫杉醇包在所述蛋白中 ； (c) 将纳 米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩 ； (d) 对所得溶液进行脱水作用， 制得 能够保存的药物剂型。 这里制得的纳米粒平均粒径为 50 ～ 300 nm， 可包载占粒子总重量约 1 ～ 40% 的药理活性物质。本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件可以从水， 氯化钠， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基氨基甲烷， 过氧化氢， 谷胱甘肽， 甲醇， 乙醇， 异丙 醇， 福尔马林， 氯仿， 丙酮， 硫化氢， 2- 巯基乙醇， 二硫苏糖醇， 盐酸胍， 尿素， 高氯酸， 三丁基 膦， 甲巯丙脯氨酸， 过甲酸， 青霉胺， 谷胱甘肽， 甲硫咪唑， 乙酰半胱氨酸以及它们的组合中 选择。此外， 本实施方案的方法中的蛋白可以从白蛋白、 转铁蛋白、 胰岛素、 内皮抑素、 血红 蛋白中选择。
本发明技术方案再进一步提出了一种将多西紫杉醇包入蛋白用于体内递送的纳 米粒制备方法， 这种方法包含以下几个步骤 ： (a) 在 55 ～ 75℃， pH6 ～ 8 的条件下用第一种 溶液溶解所述蛋白获得蛋白溶液 ； (b) 在变性剂或者适合的变性条件下， 将多西紫杉醇加 入到步骤 (a) 中所述的蛋白溶液， 从而引起展开与再折叠或自组装， 把多西紫杉醇包入蛋 白； (c) 将纳米粒透析除去多余的小分子化合物或者进一步浓缩 ； (d) 将透析后的纳米粒 经过脱水步骤制备成药物制剂 ； 这里制得的纳米粒平均粒径为约 50 ～ 300 nm， 可包载占粒 子总重量约 1 ～ 40% 的多烯紫杉醇。本实施方案的方法中的变性剂或者适合的变性条件 可以从水， 氯化钠， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基氨基甲烷， 过氧化氢， 谷胱甘肽， 甲醇， 乙醇， 异丙醇， 福尔马林， 氯仿， 丙酮， 硫化氢， 2- 巯基乙醇， 二硫苏糖醇， 盐酸胍， 尿素， 高氯 酸， 三丁基膦， 甲巯丙脯氨酸， 过甲酸， 青霉胺， 谷胱甘肽， 甲硫咪唑， 乙酰半胱氨酸以及它们 的组合中选择。 此外， 本实施方案的方法中的蛋白可以从白蛋白、 转铁蛋白、 胰岛素、 内皮抑 素、 血红蛋白中选择。
本发明技术方案再进一步提出了一种蛋白包载药理活性物质用于体内递送的纳 米粒， 制备这种纳米粒的方法包含以下几个步骤 ： (a) 在 -20 ～ 100℃， pH3 ～ 9 的条件下， 用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液 ； (b) 在变性剂或者适合的变性条件下， 将药理 活性物质加入到步骤 (a) 所述的蛋白溶液中， 使蛋白展开与再折叠或自组装， 将药物包裹 在所述蛋白中。
本发明技术方案再进一步提出了一种蛋白包载紫杉醇用于体内递送的纳米粒， 制 备这种纳米粒的方法包含以下几个步骤 ： (a) 在 55 ～ 75℃， pH6 ～ 8 的条件下， 用第一种溶 剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液 ； (b) 在变性剂或者适合的变性条件下， 将紫杉醇加入到步 骤 (a) 所述的蛋白溶液中， 使蛋白展开与再折叠或自组装， 将药物包裹在所述蛋白中 ； (c) 透析形成的纳米粒溶液以去除过剩的物质， 得到高浓度的溶液 ； (d) 对所得溶液进行脱水 作用， 制得能够保存的药品剂型。
本发明技术方案再进一步提出了一种蛋白包载多西紫杉醇用于体内递送的纳米 粒， 制备这种纳米粒的方法包含以下几个步骤 ： (a) 在 55 ～ 75℃， pH6 ～ 8 的条件下， 用第 一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液 ； (b) 在变性剂或者适合的变性条件下， 将多西紫杉醇加入到步骤 (a) 所述的蛋白溶液中， 使蛋白展开与再折叠或自组装， 将药物包裹在所述 蛋白中 ； (c) 透析形成的纳米粒溶液以去除过剩的物质， 得到高浓度的溶液 ； (d) 对所得溶 液进行脱水作用， 制得能够保存的药品剂型。
对本发明所述技术方案的说明 ： 本发明所述的 “纳米粒” ， 指的是小的单位， 而在转运和性质方面特指为一个整体。 本发 明所制备的蛋白纳米粒平均粒径分布于 5 nm 到 2000 nm 之间。一个更好的区间是 25 nm 到 500 nm， 再一个更好的区间是 50 nm 到 300 nm。而且， 本发明所制备的纳米粒能够结合 高达 40% 的药理活性物质。
本发明中所述的将药理活性物质包入蛋白， 指的是药理活性物质可以通过蛋白的 展开和再折叠， 进入蛋白中心区域。 一般来说， 药理活性物质包括在 ： 给病人服用时， 能够产 生药理反应的任何的物质。本发明中的药理活性物质包括疏水和亲水的化合物。本领域技 术人员清楚疏水性药理活性物质的水溶性不好， 亲水性药理活性物质能够优化的溶解在水 中。疏水性的药理活性物质包括如下的化合物， 但是不仅仅限于此 ： 抗肿瘤药物， 心血管药 物， 抗炎药物， 降糖药物， 中枢神经系统药物， 免疫抑制药物， 以及抗病毒药物。
本发明涉及的疏水性药理活性物质可以包括， 但是不仅仅局限于此 ： 紫杉醇、 多西 紫杉醇、 伊立替康、 卡莫司汀、 阿霉素、 苯芥胆甾醇、 哌泊舒凡、 他莫昔芬、 洛莫司汀、 藤黄酸、 冬凌草甲素、 鬼臼毒素、 阿托伐他汀、 斯伐他汀、 非诺贝特、 硝苯地平、 布洛芬、 吲哚美辛、 吡 罗昔康、 格列本脲、 地西泮、 利哌利酮、 齐拉西酮、 他克莫司、 雷帕霉素、 茚地那韦、 利托那韦、 Telaprevir、 洛匹那韦， 以及它们的组合。 更优化的说 , 具有药理活性的疏水性物质包括 ： 抗肿瘤药理活性物质如紫杉醇， 多西紫杉醇， 伊立替康， 卡氯芥， 阿霉素， 胆甾醇对苯乙酸氮芥， 哌泊舒凡， 他莫昔芬， 环己亚 硝脲， 藤黄酸， 冬凌草素甲， 鬼臼毒素以及它们的衍生物， 以及它们的组合。
在一个更优化的范围中， 疏水性药理活性物质包括紫杉醇和多西紫杉醇。上述的 药理活性物质包括晶体形式和无定形形式， 其晶体形式包括带有结晶水和不带有结晶水的 形式。
本发明所涉及的药理活性物质还包括亲水性物质。
亲水性物质可以包括如下化合物， 但是不仅仅局限于此 ： 环磷酰胺、 博莱霉素、 道 诺霉素、 表柔比星、 甲氨蝶呤、 5- 氟尿嘧啶及其类似物、 铂及其类似物、 长春碱及其类似物、 高三尖杉酯碱及其衍生物、 放线菌素 -D， 丝裂霉素 -C， 依托泊苷以及它们的组合。
本领域技术人员能够理解本发明中使用的药理活性物质的量会根据蛋白的量的 变化而变化， 同时根据纳米粒的量的变化而变化。 同时， 有经验的人能够意识到本发明中使 用的药理活性物质， 可以是纯的物质， 或者是混合物， 这些都没有背离本发明的范围。
本发明中， 可以选择不同的蛋白去形成本领域技术人员所感兴趣的纳米粒子。本 发明中所涉及的蛋白包括所有的能够展开并结合药理活性物质的蛋白或者多肽。 合适的蛋 白的例子包括如下， 但是不仅仅局限于此 ： 白蛋白， 转铁蛋白， 胰岛素， 血管内皮抑素， 血红 蛋白， 肌球蛋白， 溶菌酶， 免疫球蛋白， α-2- 巨球蛋白， 纤连蛋白， 核纤层蛋白， 胶原蛋白， 明 胶， 人造蛋白以及它们的组合。
在一个更优化的范围， 适合于本发明的蛋白包括如下 ： 白蛋白， 转铁蛋白， 胰岛素， 血管内皮抑素， 血红蛋白以及它们的组合物。本领域技术人员会清楚本发明方法中所使用
的蛋白的量随着活性物质的量和纳米粒的量的变化而变化 [Annalytical Biochemistry Vol. 72:248-254(1976)]. 本发明方法中的步骤 (a) 为用第一种溶剂溶解所述蛋白获得蛋白溶液。这里的蛋白溶 液指的是溶液中包括蛋白和能够溶解蛋白的溶剂， 在蛋白展开之后， 能够再折叠或者自组 装。 这里使用的再折叠指的是一个解折叠或者变性的蛋白能够再折叠恢复到合适的三维结 构的过程。这里使用的自组装指的是再折叠的蛋白结合到一起形成纳米粒的过程。本领域 技术人员清楚蛋白的再折叠过程可以通过很多条件完成。 在蛋白溶液中使用的第一种溶液 举例如下， 但不仅仅局限于此 ： 水， 生理盐水， 糖， 冻干保护剂和蛋白稳定剂， 在更精确的范 围， 溶剂包括水， 氯化钠溶液， 磷酸盐溶液， 醋酸溶液， 甘氨酸溶液， 三羟甲基氨基甲烷溶液， 过氧化氢水溶液， 谷胱甘肽水溶液， 葡萄糖溶液， 海藻糖溶液， 甘露醇溶液， 蔗糖溶液， 乙酰 色氨酸溶液， 辛酸钠溶液， 以及它们的混合物。
在一个更加精确的范围， 蛋白溶液中的溶剂包括水， 磷酸盐， 醋酸盐和氯化钠溶 液。本发明中所使用的蛋白溶液中的溶剂的浓度只要适合溶解蛋白和蛋白再折叠， 都是可 行的。总体上来说， 蛋白溶液中溶剂的含量范围从 0.001 M 到 1.6 M。优化的范围， 从 0.03 M 到 1.5 M。再优化的范围， 从 0.05 M 到 0.8 M。一个更加优化的范围， 从 0.1 M 到 0.3 M。 本领域技术人员能够明白用来溶解蛋白的溶剂的量会根据蛋白的量和蛋白溶液浓度的变 化而变化。 实验表明， 本发明中的步骤 (a) 中的反应参数对于形成纳米粒来说， 是非常重要 的。一般来说， 要获得一个理想的结果， 本发明中的步骤 (a) 须在 -20℃到 100℃范围之间 反应。一个比较精确的范围是从 50℃到 85℃。一个更加精确的范围是从 55℃到 75℃。实 验已经证明， 要获得一个比较理想的结果， 本发明中步骤 (a) 的 pH 须在 3 到 9 之间， 一个比 较精确的范围是从 5 到 8.5， 在一个更加精确的范围是从 6 到 8。本领域技术人员能够清楚 步骤 (a) 需要一段时间以使得蛋白充分的溶解。一般来说， 时间的长短依赖于所使用的蛋 白的种类， 蛋白的使用量， 使用溶剂的种类， 溶剂的含量， 溶剂的浓度和其他的一些因素。 一 般来说， 本领域技术人员能够充分意识到， 反应过程和反应过程的每一个步骤都需要充足 的时间， 举一个例子， 反应过程需要 5 分钟到 8 小时不等。
本发明的第二个步骤即步骤 (b) 包括在变性剂或者适合的变性条件下， 将药理活 性物质加入到经过步骤 (a) 所述的蛋白溶液中， 使蛋白展开与再折叠或者自组装。这里使 用的变性剂或者适合的变性条件指的是能诱导蛋白或者多肽改变它们的三维或者二维结 构的溶液。 一般来说， 这里提到的变性剂或者适合的变性条件能够诱导蛋白温和的变性。 本 领域技术人员能够充分意识到温和变性指的是在蛋白解折叠 / 变性之后， 能够在某些条件 下 （如使用再折叠溶液） 再折叠成合适的结构。变性剂或者适合的变性条件可以提供一个环 境来破坏蛋白的二硫键， 形成氢键， 以使得水能够干扰蛋白内部的疏水作用。 本领域技术人 员能够充分意识到许多溶液能够充当变性剂或者适合的变性条件。 这里所述的变性剂或 者适合的变性条件括水， 强酸， 强碱， 无机盐， 有机溶剂， 结构展开剂和表面活性剂。合适的 变性剂或者适变性条件举例如下， 但是不仅仅局限于此 ： 水， 氢氧化钠， 盐酸， 硫酸， 甲醇溶 液， 乙醇溶液， 异丙醇， 福尔马林， 氯仿， 丙酮， 硫化氢， 2- 巯基乙醇， 二硫苏糖醇， 胍 , 尿素， 高氯酸， 三正丁基膦 , 甲巯丙脯酸， 过甲酸， 青霉胺， 谷胱甘肽， 甲硫咪唑， 乙酰半胱氨酸， 氯 化钠溶液， 磷酸盐溶液， 醋酸盐溶液， 甘氨酸溶液， 三羟甲基氨基甲烷溶液， 过氧化氢， 谷胱
甘肽， 葡萄糖， 蔗糖， 甘露醇， 海藻糖， 乙酰色氨酸， 辛酸钠以及它们的混合物。 在一个更精确 的范围， 变性剂或者适合的变性条件包括水， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基氨基甲烷， 乙醇， 丙酮， 硫化氢， 2- 巯基乙醇， 尿素。实验证明， 当变性剂或者适合的变性条件的 pH 在 3 ～ 9 之间， 获得的结果是令人满意的。一个更加精确的 pH 范围是从 5.5 到 8.5。
另外， 除了变性剂， 本发明中蛋白解折叠还可以使用外加压力。一般来说， 外加压 力包括能够致蛋白解折叠的力量。外加力包括 ： 温度， 压力变化， 机械力， 辐射。外加力包括 从 10 到 100,000 psi 的压力， 一个更合适的范围是从 2000 到 60000 psi。
本发明可能另外需要一个步骤 (c) 将纳米粒子透析除去多余的小分子化合物或 者进一步浓缩。一般来说 , 这个步骤包括任意的能够将小分子从纳米粒中分离出去的方 法， 本领域技术人员能够充分意识到分离的方法包括任意的能够纯化蛋白或者多肽的方 法。这些方法可包括盐沉淀， 透析， 层析以及它们的组合， 这些方法可以适当的选择。一个 更加精细的范围， 透析是可行的。
本发明可能还需要一个步骤 (d) 将透析后的纳米粒经过脱水步骤制备成药物制 剂。一般来说， 保护的方法包括给纳米粒脱水以方便储存和运输， 以致获得合适的剂型。本 发明所涉及的保护的方法包括 ： 离心， 减压干燥， 冻干， 喷雾干燥。
本领域技术人员能够意识到本发明的范围和精髓是变动的。 解折叠的物质是变化 的， 同时许多的药理活性物质是可使用的， 许多的蛋白和合成的多肽也是可以用来作为载 体的。本发明将会在下面的实施例中得到更加明确和清晰地描述。
本发明的有益效果在于 ： 首先， 经本发明提供的方法形成的纳米粒子可以达到 90% 的包封率， 超过现有技术， 形 成了一种高效低耗的方法 ； 其次， 本发明所提供的方法能够获得最高达 40% 的载药量， 即纳 米粒中含有 40% 的药理活性物质。由于有更高的载药量， 在治疗时， 可以获得更小的用药体 积， 更短的用药时间， 对病人更方便。 较高的载药量降低了递送药理活性物质时蛋白的使用 量， 提高了产品的成本效率 ； 最后， 现有技术提供的较低载药能力不能满足高剂量给药， 因 为高剂量的给药需要很大的给药体积。然而， 本实验发明的具有高载药能力的纳米粒不会 受给药体积的限制。
通过本发明制备的纳米粒的另一个有益效果是， 纳米粒能够特异性的递送药理活 性物质。通过本发明制备的纳米粒子能够靶向一些身体器官和系统。比如， 当用白蛋白作 为载体时， 通过改变纳米粒子的大小， 靶向肝脏， 肺， 脾脏或者淋巴系统等。 当用转铁蛋白或 者胰岛素作为载体的时候， 它们的受体在细胞表面高表达， 通过载体和肿瘤细胞表面的亲 和性， 可以特异性的将药理活性物质输送到肿瘤组织。 当载体是血管内皮抑素的时候， 它的 受体分布于血管细胞， 由于肿瘤组织中存在大量的血管的缘故， 纳米粒子能够大量的在肿 瘤组织中蓄积。总之， 不同的蛋白载体可以靶向不同的组织或者器官。因此可以说， 本发明 提供了一种高效低耗的方法来输送药理活性物质到身体的不同部位。 附图说明
图 1 为不同 pH 对本发明中纳米粒粒径大小的影响 （15% 投药， 药物 / 蛋白） 图 2 为本发明中白蛋白 - 紫杉醇纳米粒的粒径分布图 图 3 为本发明中白蛋白 - 紫杉醇纳米粒的透射电子显微镜图像 （载药量 10.59%）图 4 为紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的高分辨率 TEM 照片 其中， (a) 白蛋白 - 紫杉醇纳米粒 ； (b) 放大的空载的白蛋白纳米粒 ； (c) 放大的游离的 紫杉醇 ； (d) 放大的白蛋白 - 紫杉醇纳米粒 图 5 为白蛋白 - 紫杉醇纳米粒的 X 射线粉末衍射图像 其中， (a) 紫杉醇 ； (b) 空白的白蛋白纳米粒 ； (c) 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒 （载药量 12.9%） ； (d) 白蛋白和紫杉醇的物理混合物 (12.9%) 图 6 为白蛋白 - 紫杉醇纳米粒与药品 Abraxane 的再分散 溶液 ； (c)20 溶液 ； (e)50 mg/mL 白蛋 其中， (a)2 mg/mL 白蛋白 - 紫杉醇纳米粒溶液 ； (b)2 mg/mL Abraxane mg/mL 白蛋白 - 紫杉醇纳米粒溶液 ； (d)20 mg/mL Abraxane 白 - 紫杉醇纳米粒溶液 ； (f)50 mg/mL Abraxane 溶液。具体实施方式
以下均是基于本发明的代表性实施例， 但下述实施例不会在任何方面限制本发明 的保护范围。
实施例 1. 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的制备 100 mgHSA 溶于 10 mL pH6 的含 0.5 mg/mL EDTA 和 0.05 M 巯基乙醇的磷酸盐缓冲 液， 55 ℃反应持续两小时， 结束后用 5% 的三氯乙酸沉淀并洗涤蛋白， 加入 1.6 mL10 mg/ mL 的紫杉醇 （乙醇溶解） 溶液到沉淀中， 混合 2 分钟， 加入 50 mL 的 0.08 M 的磷酸盐缓冲 液搅拌， 溶解混合物。得到的悬液透明， 而且载药粒子的平均粒径为 80 ～ 200 nm， (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。用反相 C18 柱测定紫杉醇的包封率， 流动相为乙腈 ： 水 （60:40） ， 检测波长 227 nm。HPLC 分析表明本实验的紫杉醇包封率达到 90% 以上。
实验中三氯乙酸还可以用其他变性剂代替， 比如水， 强酸 （盐酸和硫酸） ， 强碱 （氢 氧化钠） ， 过氧化氢， 谷胱甘肽等。 结果发现， 5% 的三氯乙酸可以达到较窄的粒径分布 （50 ～ 300 nm） 。
实施例 2. 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的制备 100 mg HSA 溶于 50 mL pH7.4 的 TRIS 缓冲液中， 37℃水浴， 加入 350 μL 2- 巯基乙 醇， 反应持续 10 分钟， 加入 2 mL 10 mg/mL 的紫杉醇 （乙醇溶解） 。30 分钟后， 样品用 pH7.4 的 TRIS 缓冲液透析 24 小时， 所得样品冻干 48 小时。所得冻干后的块状样品能够很容易的 用水或生理盐水复溶为原溶液， 且纳米粒粒径保持不变。冻干后粒径主要分布在 80 ～ 200 nm(BIC 90plus Particle Size Analyzer)， HPLC 分析表明本实验的紫杉醇包封率达到 90% 以上。
实施例 3. 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的制备 100 mg 紫杉醇溶解在 10 mL pH4.8 的缓冲液中， 冰水浴 30 分钟， 滴加 7.5 mL 0℃预冷 的丙酮， 继续冰浴 1 小时。离心， 收集沉淀， 向沉淀中加入 1 mL 10 mg/mL 的紫杉醇 （丙酮溶 解） ， 超声混匀， 加入 50 mL 生理盐水， 磁力搅拌， 形成悬液。用 BIC 90plus Particle Size Analyzer 进行粒径分析， 结果为 150 ～ 220 nm。冻干的样品能复溶， HPLC 分析载药量为 8.34%。
附加实验表明甘氨酸， 甘露醇， 乳糖和海藻糖均能作为冻干保护剂， 且用乳糖做冻 干保护剂得到的粒径最小。在制备过程中， 我们考察了不同的缓冲液 （水， 生理盐水， 磷酸盐缓冲液， 醋酸盐缓 冲液， 甘氨酸， 三羟甲基氨基甲烷， 海藻糖， 甘露醇， 蔗糖， 乙酰色氨酸， 辛酸钠和葡萄糖溶液 等） 以及不同的 pH 对粒径和载药量的影响， 结果表明 pH 在 8.0 较好。但是 pH 又不能超过 8.5， 因为药理活性物质在 pH 超过 8.5 的时候会分解。
实施例 4. 紫杉醇 - 转铁蛋白纳米粒的制备 100 mg 转铁蛋白溶于 50 mL pH7.4 的 TRIS 缓冲液中， 75℃搅拌， 加入 350 μL 2- 巯基 乙醇， 反应持续 10 分钟， 缓慢加入 1 mL 10 mg/mL 的紫杉醇 （乙醇溶解） 。测得粒径分布在 154.4 nm（BIC 90plus Particle Size Analyzer） 。
在制备过程中， 我们考察了不同温度对粒径和载药量的影响， 结果表明温度在 0℃ 到 100℃之间均能够形成纳米粒， 在 55 ～ 75℃形成的纳米粒更好。
实施例 5. 多烯紫杉醇 - 转铁蛋白纳米粒的制备 100 mg 转铁蛋白溶于 50 mL pH7.4 的 TRIS 缓冲液中， 65℃搅拌， 加入 350 μL 2- 巯基 乙醇， 反应持续 10 分钟， 加入 5 mL 10 mg/mL 的多烯紫杉醇 （乙醇溶解） 。测得平均粒径为 177.1 nm（BIC 90plus Particle Size Analyzer） 。
若 2- 巯基乙醇和其他无机盐配合使用， 可以得到更好的粒径结果， 比如水， 氯化 钠， 磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨酸， 三羟甲基氨基甲烷， 过氧化氢， 谷胱甘肽， 葡萄糖， 蔗糖， 甘露 醇， 海藻糖， 乙酰色氨酸和辛酸钠等。 当这些无机盐与 2- 巯基乙醇混合作为变性剂时， 粒 子直径分布更窄， 其中， 三羟甲基氨基甲烷， 乙酰色氨酸和辛酸钠的粒子分布最窄， 大约为 80 ～ 130 nm。 实施例 6. 藤黄酸 - 白蛋白纳米粒的制备 100 mg HSA 溶于 10 mL 纯水中。55℃搅拌， 所得溶液和等体积的 5% 三氯乙酸溶液混 合并且离心， 除去上清。加入含有藤黄酸的乙醇溶液混合， 然后加入 50 mL pH8.0 的 TRIS， 搅拌直至蛋白沉淀完全溶解。所得的纳米粒粒径为 110 nm（BIC 90plus Particle Size Analyzer） 。
实施例 7. 紫杉醇 - 血红蛋白纳米粒的制备 -20℃条件下， 向 10 mL3% 的血红蛋白水溶液中缓慢加入 300 mL 含有 3 mL 2 M 的 HCl 的 丙酮溶液。 溶液强力搅拌 15 分钟， 然后离心 15 分钟。 待残余的丙酮蒸发掉以后， 收集沉淀， 溶解在冷的去离子水里， 在 2℃条件下用去离子水透析 5 个小时， 然后用 0.0016 M NaHCO3 透析 30 小时， 过滤得到珠蛋白溶液。
取 7 mL 上述的珠蛋白溶液加入 28 mL 水， 得到 1 mg/mL 的蛋白溶液。在 2 ～ 8℃ 条件下加入 0.7 mL 含 10 mg/mL 紫杉醇的乙醇溶液， 搅拌直至形成浅蓝色溶液。所得粒子 平均粒径为 308.1 nm（BIC 90plus Particle Size Analyzer） 。
实施例 8. pH 对纳米粒粒径的影响考察 本发明考察了不同 pH 的磷酸盐缓冲液以及它们对纳米粒粒径的影响。所有的蛋白溶 液组中均加入 15% 的紫杉醇 (10 mg/mL)， 粒径在恒温条件下测定， 结果如图 1 所示。
实 施 例 9. 紫 杉 醇 - 白 蛋 白 纳 米 粒 的 动 态 光 散 射 (dynamic light scaterring, DLS) 分析 对按照本发明的方法制备的紫杉醇 - 白蛋白纳米粒进行粒径分析， 所用仪器为 BIC 90plus Particle Size Analyzer。结果如图 4 所示， 平均粒径为 121 nm， 且粒径分布在较
窄的范围内。
实施例 10. 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的透射电镜 (Transmission Electron Microscopy, TEM) 表征 按照本发明制备载药量为 10.59% 的紫杉醇 - 白蛋白纳米粒进行透射电镜的分析。所 用仪器为 EM 2100 型 200KV 高分辨率透射电镜 ( 日本 )。结果如图 2 所示， 显示纳米粒子呈 球形。
实施例 11. 复溶的紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的稳定性研究 冻干得到的紫杉醇 - 白蛋白块状物用生理盐水， 5% 的葡萄糖和小牛血清分别溶解成紫 杉醇浓度为 5 mg/mL， 5 mg/mL 和 2 mg/mL 的溶液。分别在 25℃和 37℃放置 12 小时后， 纳 米粒的平均粒径没有变化 （DLS, BIC 90plus Particle Size Analyzer） ， 且没有沉淀产生。 结果如表 1 所示。
表 1 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的稳定性研究直径 (nm) NS, 25℃ GS, 25℃ CS, 37℃ 0 h 113.8 113.7 119.7 3 h 111.5 123.3 151.8 6 h 108.1 122.1 144.6 12 h 108.0 121.1 147.1 18 h 108.9 123.1 160.4 24 h 106.2 116.5 156.8 36 h 108.8 125.3 184.9实施例 12. 紫杉醇 - 转铁蛋白纳米粒的研究 在制备紫杉醇 - 转铁蛋白纳米粒的过程中， 发现除了 TRIS 缓冲液， 生理盐水也可以用 来溶解转铁蛋白。另外， 在 pH 为 3 ～ 9， 特别是在 6 ～ 8 范围内可以获得高载药量和高稳定 性的纳米粒。而且， 蔗糖， 葡萄糖， 甘氨酸和海藻糖可以用作冻干或减压干燥保护剂。
实施例 13. 复溶的紫杉醇 - 转铁蛋白纳米粒的稳定性研究 冻干得到的紫杉醇 -- 转铁蛋白块状物用生理盐水， 5% 的葡萄糖和小牛血清分别溶解 成紫杉醇浓度为 5 mg/mL， 5 mg/mL 和 2 mg/mL 的溶液。 分别在 25℃和 37℃放置 12 小时后， 纳米粒的平均粒径没有变化 （DLS, BIC 90plus Particle Size Analyzer） ， 且没有沉淀产 生。结果如表 2 所示。
表 2 紫杉醇 - 转铁蛋白纳米粒的稳定性研究直径 (nm) NS, 25℃ GS, 25℃ CS, 37℃ 0 h 143.2 168.4 118.8 3 h 132.7 152.3 139.3 6 h 132.9 146.5 152.7 12 h 133.4 144.0 165.6 18 h 134.0 147.5 171.5 24 h 127.3 144.7 177.6 36 h 139.6 145.6 228.8实施例 14. 用透射电镜 (Transmission Electron Microscopy, TEM) 对紫杉醇 - 白 蛋白纳米粒进行的表征 将 2 ～ 3 滴按照本发明制备的紫杉醇 - 白蛋白纳米粒溶液滴在覆盖有碳支持膜的铜网 上 (200 目 )， 2 分钟后用滤纸吸干多余的溶液， 然后将铜网放在空气中干燥， 用 EM-2100 200 KV 型高分辨率透射电镜 （日本） 进行分析。
结果如图 4 所示 ： a) 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒呈球形 ； b) 空白的白蛋白纳米粒呈现 不规则的形状， 且平均粒径在 100 nm 左右 ； c) 游离的紫杉醇在中间呈现处较高的电子密 度， 周围被棒状结构包围 ； d) 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒呈现出核壳结构。
实 施 例 15. 紫 杉 醇 - 白 蛋 白 纳 米 粒 的 X 射 线 粉 末 衍 射 (x-ray powder diffraction, XRD) 表征 紫杉醇在水溶液中超过 1 mg/mL 时就会结晶。因此， 无定形态的紫杉醇非常有利于注射。为了检测本发明中紫杉醇 - 白蛋白纳米粒中紫杉醇的固体形态， 我们使用了 X 射线粉 末衍射来进行表征。共制备了四个样品 ： a) 紫杉醇 ； b) 白蛋白纳米粒 ； c) 紫杉醇白蛋白纳 米粒 （载药量为 12.9%） ； d) 紫杉醇和白蛋白的物理混合物 （12.9%） 。每个样品的 Zeta 角测 定范围从 5 度到 50 度 （ARL, X'TRA ,Applied Research Laboratories, Switzerland） 。
结果如图 5 所示 ： 图 a) 显示了紫杉醇晶体的特征峰 ； 在 2θ 角为 15 度到 45 度范 围内， 图 b) 显示出了白蛋白的晕型峰 ； 图 c) 表明在 2θ 角为 15 度到 45 度范围内， 也显示 了白蛋白的晕型峰， 说明在纳米粒中紫杉醇是以无定形的状态存在 ； 在与纳米粒相同比例 （12.9%） 的紫杉醇和白蛋白的物理混合物中， 图 d) 显示了晶体状态的紫杉醇和无定形状态 的白蛋白的存在。 因此， 我们可以得到结论 ： 本发明制备的紫杉醇 - 白蛋白纳米中紫杉醇以 无定形状态存在。
实施例 16. 紫杉醇 - 白蛋白纳米粒的再分散研究 按照本发明制备的紫杉醇 - 白蛋白纳米粒冻干后的样品和商业化的药理活性物质 Abraxane 按如下蛋白浓度用水溶解 ： (a, b) 2 mg/mL; (c,d) 20 mg/mL; (e,f) 50 mg/ mL。这些样品的照片如图 6 所示， 三个样品中均可以得到稳定的透明的紫杉醇 - 白蛋白纳 米粒的胶体溶液。 实施例 17. 伊立替康 - 胰岛素纳米粒的制备 100 mg 胰岛素溶于 10 mL 水或者生理盐水中， 65℃搅拌， 结束后用甲醇沉淀并洗涤蛋 白， 加入 1.6 mL10 mg/mL 的伊立替康溶液到沉淀中， 混合 2 分钟， 加入 50 mL 的氯化钠溶液 搅拌， 溶解混合物。得到的载药粒子的直径最大为 2000 nm， 最小为 5 nm， 主要分布的范围 在 50 ～ 300 nm， 部分纳米粒分布在 2000 nm (BIC 90plus Particle Size Analyzer)。用 反相 C18 柱测定的包封率，流动相为乙腈 ： 水 （60:40） ， 检测波长 227 nm。 HPLC 分析表明本 实验的伊立替康载药为 2%。
实验发现除了水或者生理盐水溶解胰岛素之外， 一些蛋白稳定剂和冻干保护剂也 可以用来溶解胰岛素。比如甘氨酸， 谷胱甘肽， 乙酰色氨酸， 辛酸钠以及甘露醇等。另外， 在 反应温度为 0℃～ 100℃， 特别是在 55 ～ 75℃范围内可以获得高载药量和高稳定性的纳米 粒。得到的蛋白纳米粒可以用喷雾干燥的方式得到干性粉末。
实施例 18. 5- 氟尿嘧啶 - 血管内皮抑素纳米粒的制备 100 mg 血管内皮抑素溶于 10 mL pH 9 的的含有的 5% 葡萄糖的溶液中， 75℃水浴， 加入 25 μL 0.5 mg/mL 的谷胱甘肽， 反应 10 分钟， 加入 1.6 mL 10 mg/mL 的 5- 氟尿嘧啶， 反应 持续两小时。样品用 pH7.4 的 TRIS 缓冲液透析 24 小时， 所得样品进行喷雾干燥后纳米粒 粒径保持不变。粒径主要分布在 25 ～ 500 nm(BIC 90plus Particle Size Analyzer)， 载 药量达到 40%。
其中， 5% 的葡萄糖可以换成是冻干保护剂中的任何一种， 如磷酸盐， 醋酸盐， 甘氨 酸， 三羟甲基氨基甲烷。谷胱甘肽可以是结构展开剂中的任何一种， 如 2- 巯基乙醇， 二硫 苏糖醇， 盐酸胍， 尿素， 高氯酸， 三丁基膦， 甲巯丙脯氨酸， 过甲酸， 青霉胺， 谷胱甘肽， 甲硫咪 唑， 乙酰半胱氨酸或它们的组合。结果显示， 溶解蛋白质的溶液对最后粒子的大小没有影 响。变性剂或者适合的变性条件中， 2- 巯基乙醇的效果最好， 得到的纳米粒子分布较窄， 50 ～ 300 nm 之间。
实施例 19. 5- 氟尿嘧啶 - 紫杉醇 - 血管内皮抑素纳米粒的制备
100 mg 血管内皮抑素溶于 10 mL pH7.4 的的含有的 5% 海藻糖的溶液中， 25℃水浴， 加入 25 μL 0.5 mg/mL 的巯基乙醇和 6 M 的尿素， 反应 10 分钟， 加入 0.8 mL10 mg/mL 的 5- 氟尿嘧啶和 0.8 mL10 mg/mL 紫杉醇， 持续搅拌， 溶液呈淡蓝色。粒径主要分布在 25 ～ 500 nm(BIC 90plus Particle Size Analyzer)。
其中， 5% 的葡萄糖可以换成是蛋白稳定剂中的任何一种， 如甘露醇， 蔗糖， 乙酰色 氨酸， 辛酸钠。结果显示， 溶解蛋白质的溶液对最后粒子的大小没有影响， 得到的纳米粒子 分布较窄， 50 ～ 300 nm 之间。
实施例 20. 卡莫司汀 - 肌红蛋白纳米粒的制备 100 mg 肌红蛋白溶于 10 mL pH 3 的含 0.5 mg/mL 辛酸钠和 0.05 M 乙酰色氨酸的磷酸 盐缓冲液， 冰浴 30 分钟， 滴加 0℃预冷的丙酮 7.5 mL。继续冰浴 1 小时， 离心， 收集沉淀， 向 沉淀中加入 1.6 mL 10 mg/mL 的卡莫司汀溶液， 超声混匀， 加入 50 mL Tris 缓冲液， 磁力搅 拌， 得到的悬液透明， 溶液经过减压蒸馏得到平均粒径为 80 ～ 200 nm 的粒子 (BIC 90plus Particle Size Analyzer), 其中变性条件丙酮可以替换成为其他能够使蛋白变性的有机溶剂， 如甲醇， 乙醇， 异丙 醇， 福尔马林， 氯仿， 硫化氢或者他们的组合。结果显示， 变性条件若使用有机溶剂， 则丙酮 的效果最好， 粒子直径分布在 50 ～ 300 nm 之间。
实施例 21. 阿霉素 - 溶菌酶纳米粒的制备 100 mg 溶菌酶溶于 50 mL pH 6 的 TRIS 缓冲液中， 55℃搅拌， 通入硫化氢气体， 反应持 续 10 分钟， 加入 5 mL 10 mg/mL 的阿霉素。 测得粒径分布在 347.1 nm （BIC 90plus Particle Size Analyzer） 。
Tris 缓冲液可以换成蛋白稳定剂中的任何一种， 如海藻糖， 甘露醇， 蔗糖， 乙酰色 氨酸， 辛酸钠或它们的组合。
实施例 22. 苯芥胆甾醇 - 免疫球蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 5 相同， 仅改变多西紫杉醇为苯芥胆甾醇， 转铁蛋白为免疫球蛋白。 平均粒径大约为 250 nm， 载药量 9.8%。
实施例 23. 哌泊舒凡 -α-2- 巨球蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 5 相同， 仅改变多西紫杉醇为哌泊舒凡， 转铁蛋白为 α-2- 巨球蛋 白， 反应温度为 65℃。粒径分布 25 nm ～ 500 nm，载药量 11.2%。
实施例 24. 他莫昔芬 - 纤维连接蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 5 相同， 仅改变多西紫杉醇为他莫昔芬， 转铁蛋白为纤维连接蛋白。 反应温度 45℃， 粒径分布 50 nm ～ 200 nm， 载药量 9.8%。
实施例 25. 洛莫司汀 - 纤层蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 5 相同， 仅改变多西紫杉醇为洛莫司汀， 转铁蛋白为纤层蛋白。反应 温度为 75℃， 粒径分布在 100 nm ～ 200 nm 之间， 载药量 35%。
实施例 26. 冬凌草甲素 - 胶原蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 5 相同， 仅改变多西紫杉醇为冬凌草甲素， 转铁蛋白为胶原蛋白。反 应的 pH 为 8.0， 粒径分布在 300 nm ～ 600 nm 之间， 载药量 22%。
实施例 27. 鬼臼毒素 - 明胶纳米粒的制备 本实施例与实施例 5 相同， 仅改变多西紫杉醇为鬼臼毒素， 转铁蛋白为明胶。反应的温度为 70℃， 粒径分布在 50 nm ～ 300 nm 之间， 载药量 20%。
实施例 28. 阿托伐他汀 - 白蛋白纳米粒的制备 100 mgHSA 溶于 10 mL 生理盐水中， 含 0.5 mg/mL 辛酸钠和 0.05 M 乙酰色氨酸， 55℃ 水浴。 加入 350 μL 2- 巯基乙醇， 反应持续 10 min， 加入 2 mL 10 mg/mL 的阿托伐他汀， 继 续搅拌直到溶液呈淡蓝色， 所得的纳米粒粒径为 50 ～ 300 nm （BIC 90plus Particle Size Analyzer） ， 载药量为 24%。
实施例 29. 斯伐他汀 - 转铁蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为斯伐他汀， 白蛋白为转铁蛋白。所得 纳米颗粒粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 5%。
实施例 30. 菲诺贝特 - 血红蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为菲诺贝特， 白蛋白为血红蛋白。所得 纳米颗粒粒径为 30 ～ 300 nm， 载药量为 11%。
实施例 31. 硝苯地平 - 血管内皮抑素纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为硝苯地平， 白蛋白为血管内皮抑素。 所得纳米颗粒粒径为 20 ～ 250 nm， 载药量为 9.7%。
实施例 32. 布洛芬 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为布洛芬。所得纳米颗粒粒径为 20 ～ 250 nm， 载药量为 8.7%。
实施例 33. 吲哚美辛 - 胶原蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为吲哚美辛， 白蛋白为胶原蛋白。所得 纳米颗粒的粒径为 30 ～ 500 nm， 载药量为 8.9%。
实施例 34. 吡罗昔康 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为吡罗昔康。所得纳米颗粒的粒径为 25 ～ 500 nm， 载药量为 8.0%。
实施例 35. 格列苯脲 - 肌红蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为格列苯脲， 白蛋白为肌红蛋白。所得 纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 7.8%。
实施例 36. 地西泮 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为地西泮。 所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 8.8%。
实施例 37. 利哌利酮 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为利哌利酮。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 9.8%。
实施例 38. 齐拉西酮 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为齐拉西酮 , 白蛋白为免疫球蛋白， 所 得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 7.3%。
实施例 39. 他克莫司 - 溶菌酶纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为他克莫司， 白蛋白为溶菌酶。所得纳 米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 12.8%。实施例 40. 雷帕霉素 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为雷帕霉素。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 9.8%。
实施例 41. 茚地那韦 - 转铁蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为茚地那韦， 白蛋白为转铁蛋白。所得 纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 13.5%。
实施例 42. 利托那韦 - 胰岛素纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为利托那韦， 白蛋白为胰岛素。所得纳 米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 9.8%。
实施例 43. 洛匹那韦 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为洛匹那韦。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 11.3%。
实施例 44. 环磷酰胺 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为环磷酰胺。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 11.9%。
实施例 45. 博来霉素 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为博来霉素。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 12.8%。
实施例 46. 道诺霉素 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为道诺霉素。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 13.8%。
实施例 47. 表柔比星 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为表柔比星。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 7.3%。
实施例 48. 甲氨蝶呤 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为甲胺蝶呤。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 6.8%。
实施例 49. 5- 氟尿嘧啶 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为氟尿嘧啶。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 11.1%。
实施例 50. 顺铂 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为顺铂。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 12.8%。
实施例 51. 长春碱 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为长春碱。 所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 6.3%。
实施例 52. 放线菌素 D- 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为放线菌素 D。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 5.8%。实施例 53. 丝裂霉素 C- 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为丝裂霉素 C。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 4.8%。
实施例 54. 依托泊苷 - 白蛋白纳米粒的制备 本实施例与实施例 28 相同， 仅改变阿托伐他汀为依托泊苷。所得纳米颗粒的粒径为 50 ～ 300 nm， 载药量为 14.9%。