双歧杆菌的基因组.pdf

本发明涉及双歧杆菌的基因组。具体地，本发明涉及长双歧杆菌属的新微生物，分别涉及它的基因组和质粒序列以及生产所述双歧杆菌的多肽的方法。本发明还涉及分别检测所述核酸或多肽的方法。提供了一种包括NCC2705的核苷酸序列和/或多肽序列的数据载体。另外，本发明涉及长双歧杆菌菌株NCC2705，并且，还涉及用于预防和/或治疗由轮状病毒和致病性细菌引起的腹泻的、含有所述双歧杆菌或其活性成分的食品和药物组合物。

1.  长双歧杆菌CNCMI-2618。

2.  长双歧杆菌CNCMI-2618、长双歧杆菌CNCMI-2618的培养上清液或其活性级分在制备用于治疗或预防肠道失调或肠道不适的载体中的用途。

3.  权利要求2的用途，其中所述肠道失调或肠道不适是肠病、克隆氏病或腹泻。

4.  权利要求2-3的任一项的用途，其中所述肠道失调或肠道不适是由致病性细菌和/或轮状病毒引起的。

5.  权利要求2-4的任一项的用途，其中所述载体是食品组合物、宠物食品组合物或药物组合物。

6.  权利要求5的用途，其中所述食品组合物选自乳、酸乳、凝乳、奶酪、发酵乳、乳基发酵制品、冰淇淋、谷基发酵制品、乳基粉末、婴儿配方。

7.  权利要求5的用途，其中所述药物组合物选自片剂、液体细菌悬浮液、干燥口服添加剂、湿口服添加剂、干管装饲料或湿管装饲料。

双歧杆菌的基因组
本申请是申请日为2002年1月30日的中国专利申请02807287.1“双歧杆菌的基因组”的分案申请。
技术领域
本发明涉及长双歧杆菌属的新微生物，分别涉及它的基因组和质粒序列以及生产所述双歧杆菌的多肽的方法。本发明还涉及分别检测所述核酸或多肽的方法。提供了一种包括NCC2705的核苷酸序列和/或多肽序列的数据载体。另外，本发明涉及长双歧杆菌菌株NCC2705，并且还涉及用于预防和/或治疗由轮状病毒和致病性细菌引起的腹泻的、含有所述双歧杆菌或其活性成分的食品和药物组合物。
背景技术
能产生乳酸作为主要代谢成分的生物从几十年以前就是已知的。所述细菌通常分别存在于乳或乳加工工厂中，存在于活的或腐烂的植物中，不过，还存在于人和动物的肠道中。所述微生物被归纳成术语“乳酸杆菌”，它们代表不同源的群体，并且包括乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、片球菌属等。
乳酸菌业已被人类用作发酵剂，用于利用低pH和在其发酵活动期间所产生的产物的作用，抑制有害细菌的生长，以便防止食品腐烂。另外，业已将乳酸菌用于由奶制备多种不同的食品，如奶酪、酸奶和其他发酵乳制品。
最近，乳酸菌业已引起了高度的关注，因为业已发现某些菌株在被摄入之后，具有对人和动物有价值的特性。具体地讲，业已发现乳杆菌属或双歧杆菌属的特定菌株能够以有存活力的和活性形式通过其胃肠道，而不会在其胃肠道上部遭到破坏，特别是不会受到胃中以低pH为主的影响，并且能够集群在肠粘膜中，它们在肠道中的临时或长时间的保持，被认为可以对生物的健康产生多种积极效果。所述菌株被统称为益生菌。
EP 0 768 375披露了双歧杆菌属的这样一种特殊菌株，该菌株可以被植入肠道菌群并且可以粘附在肠细胞上。另外，该双歧杆菌有助于免疫调节，能够竞争性排斥致病细菌对肠道细胞的粘附，从而支持个体健康的维持。
就有价值的特性而言，可以提供乳酸杆菌的特殊菌株，本领域需要对人和/或动物的健康有益的其他乳酸菌菌株。另外，需要与所述菌株的生物学有关的更详细的信息，特别是有关与宿主的相互作用，通过肠道中的不同环境条件的表现，以及粘附在肠粘膜上的能力，和最终参与免疫系统的加强和抵御病原体的信息，这些信息有助于更好地理解所述机制。
发明内容
因此，本发明的一个问题是提供有关具有对人和/或动物有利的特征的细菌菌株的大量数据。
针对所述问题，本发明的一个主题是具有乳酸菌长双歧杆菌NCC2705基因组的序列SEQ ID.No.1的核苷酸序列和/或它所包含的质粒的核苷酸序列SEQ ID.No 1099。不过，本发明并不局限于分别在SEQ.ID.NO.1和SEQ ID.NO.2中所示出的序列，而是包括编码菌株变体，多型性，等位变体及其突变体的多肽的基因组核苷酸。
附图说明
在附图中，
图1表示曲线图，它表示长双歧杆菌NCC2705粘附培养物中的人肠细胞上的能力；作为对照，使用了另一种双歧杆菌属菌株BL28 Cal；
图2表示致病细菌对长双歧杆菌NCC2705的病原体敏感性；
图3表示细胞系NCC2705和B1 28对鼠伤寒沙门氏菌SL1344感染的Caco-2细胞的活性；
图4表示受鼠伤寒沙门氏菌SL1344感染的，并且用双歧杆菌NCC2705处理过的小鼠的存活率；
图5表示用于评估细菌菌株NCC2705的轮状病毒保护特性的细胞培养物筛选的示意图。
具体实施方式
本发明基于对长双歧杆菌菌株NCC2705的基因组的全基因组测序，该菌株业已按照布达佩斯条约于2002年1月29日交由国立微生物保藏中心保藏，保藏号为CNCM I-I-2618。
在第一方面，本发明涉及选自下列一组的核苷酸序列，(a)SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列；(b)与SEQ.ID.NO.1的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列；或(c)与SEQ ID.No.1同源或者能在严格条件下与SEQ ID.No.1杂交的核苷酸序列或其部分。
在另一方面，本发明涉及选自下列一组的核苷酸序列，(a)SEQ.ID.NO.2的核苷酸序列；(b)与SEQ.ID.NO.2的序列具有至少90％同一性的核苷酸序列；或(c)与SEQ ID.No.2同源或者能在严格条件下与SEQ ID.No.2杂交的核苷酸序列或其部分。
术语基因组或基因组序列应当被理解为表示长双歧杆菌染色体的序列。术语质粒应当被理解为表示在本发明的双歧杆菌中所包含的任何染色体外DNA片段。核苷酸序列、多核苷酸或核酸，被理解成表示双链DNA、单链DNA或所述DNA的各种长度的转录产物，包括长度为大约10-100个核苷酸的寡核苷酸。
本发明的同源核苷酸序列被理解为表示与核苷酸序列SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2的碱基具有至少90％，更优选95％，96％，97％，98％或99％的百分同一性的核苷酸序列。所述同源性可以包括，例如，相当于属于双歧杆菌菌种，优选属于长双歧杆菌菌种的细菌的基因组序列或其典型片段的序列的序列，以及相当于属于双歧杆菌菌种的变体的细菌的基因组序列或其典型片段的序列的序列。在本发明中，术语种和属可以相互交换使用。
因此，所述同源序列相当于与相同种或种之间的突变相关的变异，并且可能特别相当于至少一个核苷酸的截短、取代、缺失和/或增加。所述同源序列还可以相当于与遗传密码简并性或遗传密码偏倚性相关的变异，所述变异是该家族所特有的，并且是可能存在于双歧杆菌属中的种或变体所特有的。
可以用本领域所功知的多种序列比较算法和程序中的任一种，评估蛋白和/或核酸序列同源性。所述算法和程序包括，但不局限于TBLASTN，BLASTP，FASTA，TFASTA和CLUSTALW(例如，参见Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Thompson等，1994，Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680；Higgins等，1996，Methods Enzymol.266：383-402；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Altschul等，1993，Nature Genetics 3：266-272)。
在一种特别优选的实施方案中，蛋白和核酸序列同源性是用本领域众所周知的Basic Local Alignment Search Tool(″BLAST″)评估的(同上文)。具体地讲，业已将四种具体的BLAST程序用于完成以下任务：
(1)BLASTP：将氨基酸查询序列与蛋白序列数据库进行比较
(2)BLASTN：将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库进行比较
(3)BLASTX：将以所有读框翻译的核苷酸查询序列与蛋白序列数据库进行比较
(4)TBLASTN：将蛋白查询序列与以所有读框动态翻译的核苷酸序列数据库进行比较
在上述典型片段中，能够在严格条件下与本发明的核苷酸序列杂交的片段是优选的。在严格条件下杂交，表示温度和离子强度条件是选择过的，以便能够维持两个互补DNA片段之间的杂交。例如，所述高严格性条件例如可以通过在65℃的优选温度下，在存在SSC缓冲液的条件下进行，例如，1xSSC相当于0.15M NaCl和0.05M柠檬酸钠。例如，洗涤步骤可以如下：2xSSC，0.1％SDS，在室温下进行，然后在68℃下用1xSSC，0.1％SDS；0.5xSSC，0.1％SDS；0.1xSSC，0.1％ SDS洗涤3次，每次15分钟。
SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的核苷酸序列分别是通过对长双歧杆菌NCC2705的基因组及其中所包含的质粒进行测序获得的，所述测序是通过以下方法进行的：在对克隆的插入片段进行荧光自动化测序之后直接测序，并且通过软件将所述核苷酸片段(插入片段)的序列组装在一起。为此，制备了所述基因组的片段，将其连接到合适的载体上，用于扩增和增殖，并且对相应的片段进行测序。借助于合适的软件对所述片段的重叠和最终排列、其核苷酸序列进行评估。
可将本发明用于通过利用来自SEQ.ID.NO.1的开放读框(ORFs)的知识生产多肽。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种生产多肽的方法，包括选择长双歧杆菌基因组的开放读框(ORF)，并且按照众所周知的技术表达所需要的多肽。
例如，可以通过使用聚合酶链式反应特异性扩增相应的序列获得被鉴定为SEQ.ID.NO.1的来自基因组序列的核酸分子。由于本文所提供的序列信息，技术人员可以设计并且合成任何合适的引物核苷酸，并且利用聚合酶链式反应扩增感兴趣的片段。因此，本发明还包括选自SEQ.ID.NO.1的核苷酸序列，可将其用作扩增核酸序列的引物。当然，也可以使用其他技术扩增所述靶核酸，例如，TAS(基于转录的扩增系统)技术，3SR(自我维持的序列复制)技术，NASBA(基于核酸序列的扩增)技术，SDA(链置换扩增)技术或TMA(转录介导的扩增)技术。
还可将所述多核苷酸用作探针，并且可应用于扩增或修饰被用作探针的核酸的技术，如LCR(连接酶链式反应)技术，RCR(修复链反应)技术，CPR(循环探针反应)技术或Q-β-复制酶扩增技术。
因此，本发明涉及用于检测本发明核苷酸序列(靶核苷酸)的杂交(检测)探针和引物。当所述靶分子是RNA分子，例如，mRNA时，所述mRNA可以直接检测，或者在检测之前转化成cDNA。
另外，为了获得SEQ.ID.NO.1所示的核酸的片段，可以用选择的限制酶对长双歧杆菌基因组DNA进行消化，通过诸如电泳或其他合适的分离技术分离其片段。所述技术是本领域众所周知的，并且这一技术披露于以下文献中：Sambrook等A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，1992。通过分离长双歧杆菌NCC2705(CNCM I-2618)的基因组DNA，并且进行必要的步骤，可以方便地获得所述片段。
在另一种方法中，当所述核酸的大小不是太大时，还可以根据本领域技术人员熟知的方法通过化学合成获得所述核酸。
修饰过的核苷酸序列应当被理解成表示通过本领域技术人员所熟知的技术诱变所获得的，并且表现出相对正常序列的修饰的任何核苷酸序列，例如，用于表达一种多肽的调控和/或启动子序列中的突变，特别是导致所述多肽表达水平的修饰或导致复制周期的调节。修饰过的核苷酸序列还应当被理解成表示编码下文所定义的修饰过的多肽的任何核苷酸序列。
在研究长双歧杆菌基因组期间，可以进行通过序列鉴定的以下注释，所述序列具有通过NO.1-NO.1147鉴定的开放读框，如下面的表I所示。
-表I


















































在上面的表I中示出了NO.1-1147的ORFs，并且通过其在基因组序列SEQ.ID.NO.1的位置表示，例如，ORF3序列是通过序列SEQNo.1上的4622和6472号核苷酸之间的核苷酸序列确定的，包括末端。
业已通过同源性分析和通过分析潜在的ORF起始位点鉴定了所述开放读框。应当理解的是，每一个鉴定的ORF包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列跨越从前面的终止密码子3’的密码子经SEQ.ID.NO.1框内的下一个终止密码子的5’密码子，到ORF核苷酸序列的连续核苷酸序列。
表1还表示同源性检索结果，该结果比较了存在于公开数据库中的序列和每一个ORFs编码的多肽的序列。应当理解的是，在一种实施方案中，在表1中所示出的与公开数据库中的多肽具有超过大约99％同一性的多肽不被认为是本发明的一部分。与本实施方案相似，编码所述多肽的核苷酸序列不被认为是本发明的一部分。
就与ORF核苷酸序列的同源性而言，与所述ORF核苷酸序列之一的碱基具有至少80％，优选至少90％和95％的百分同一性的同源序列是优选的。例如，所述同源序列是通过上文所披露的以及在下面的实施例中所披露的程序鉴定的。所述同源序列相当于上文所定义的同源序列，并且可以包括，例如相当于属于双歧杆菌科的细菌的ORF序列的序列。
所述同源序列同样可以相当于相同种或种之间的突变相关的变异，并且可以特别相当于至少一个核苷酸的截短、取代、缺失和/或添加。所述同源序列还可相当于与该科所特有的遗传密码简并性或遗传密码偏倚性相关的、与可能存在于双歧杆菌科的种或其变体相关的变异。
特别感兴趣的序列是编码以下多肽或其片段的核苷酸序列：
(a)SEQ.ID.NO.5(ORF13)
MPTGRVRWFDAAKGYGFITSEEGKDVFLPAQALPTGVTTLRKGAKVEYSV    VDGRRGPQAMDVRLIASAPSLVKATRPKADDMAAICEDLIKMLDAAGNTL    RRHRYPSAADSKKLATLLRAVADQFDVQD
(b)SEQ.ID.NO.525(ORF1827)
MTTAAAQAPAPGKLEFKDDYTPDEAERVIRNSKGLPVGVRPKMVWTWKKA    LLWAAIAIVCACGWAILAVSRGEQISAIWFLVVALSSYAIAYRFYAYYIQ    IKIMRTDDANATPAERVHDGANFERTDRRVLFGQHFAGISGAGPLVGPIL    AAQMGYLPSTLWIILGVIFAGAVQDMLVLWISAKRRGRSLGQMATDEMGK    FGGMILSIFLVVMTAIAMAFLALVAIKAMAASPWAVFSIGMTIPIALIMG    CYQRFLRPGRVIETTLLGFVLLVLDIVAGGWIASIPAVAAVFTLDAKQLV    IALVIYSFAAAALPHWLLVTPRDYLSTLMKIGTLVLLVIGIIIANPSVKV    PGLTELASTSTGPTFSGNLFPFLFITIACGALSGFHGAVSSGLTPKAVEK    ENQIRMIGYGSMLVESFTAVIALIAAITISQGVYFSTNMSAAQITAASGV    SISATSTPGEQADAAVKAVESMKVSDIEGNQMQVTWDSVDENGAAKTYEG    AAALEQAAADIGETSIVSRTGGATTFAMGMANFLKSYLGGHDSMAFWYHF    AIMFEALFILTTVDNGTRVARYQIGEMLGNVRKLKKFADPTWKPGN    IITTLIATALWGGLLWMGVSDANGGINAMVPIFGISNQLLAAACFV    LITVCVAKMGYWKHLWIPVVPLVWDIAVTFTADFQKIFGPLSYFTT    ASKYQAQIDSGELTGEALTNAKAALSNAYLDGVLSVFFLVMMGVFV    VVGIVVVARTFAAGKYGAETTSEEPFVESQWFAPSSLVATALEKKV    QREYSAKLHELVRNGQVAA
c)SEQ.ID.NO.424(ORF1473)
MTQSRRMLVLRAVVEDYIRSQEPVGSTSLTRDHDLGVSSATIRNDMAALE    DEGYLIQPHTSAGRVPTEKGYRYFVDRLATVVPLSEAQRRGINSFLSGSV    SLKDALQRSARLLSEITGQVAVVASPSLAKATLRHVEMVPVAMTTLLAVV    ITDTGRVAQHGLTIASMPAVDEINRLSNTVNEQCDGLSLSKSAETVRSIA    ASAGYESVRGVADTLADAFESMALDERANELYMSGTSHLAHSRSLADLAP    LFDALEEQVVLMKLMSNLSEETNASGVGVAIGSEMHTPGLLHASVVSSGY    GRSGAAGEPAGNDPVGEPETESETESQTNDTEPIAFVGSIGPTHMDYAAT    MAAVRAVARYLTAFLSEGRTQD
d)SEQ.ID.NO.548(ORF1905)
MYFKDGNDNAQRGGSTVRRSRQRRIMGRVVSYNEDVPRCTFCGKTEHQVR    KLVAGPNASICDECIALCVDIISEERVKDAEVNSLSLPKPAQIFDYLNRY    VIGQENAKRALSVAVYNHYKRVNMELQESAEQLDGNNGHSGQTSKQAKQS    VPTQTRATRRSNDPLADVEVAKSNILLLGPTGVGKTYLAQALARVMNVPF    VITDATTLTEAGYVGDDVETVLQRLLQAADGDVSRAQHGIIYIDEIDKIA    RKSGENTSITRDVSGEGVQQALLKILEGTIASVPLEGTRKHKEQDVAQMD    TRGILFICGGAFVGLTDIVRKRLGRRETGFGANWHDADMKDEELLEQVNA    DDLAEFGLLPEFIGRLPVTSVLKELTVDDLTAILTQPANALIKQYRKLFA    VDGVDLQFTEQAIRAIADIAIKQGTGARGLRSIIERTLQDTMFQLPSLDD    VRQVIVDKASVEGSSTPKLLREAVDVPQGRLKVAQSVLLDRVRTHEA
e)SEQ.ID.NO.74(ORF219)
MSEQLMEQYRLRGQRKCRNACIAAIVTVVLVLAVAGGVWWTAGDGSALVR    NMFKPKATPATQPVVNSTATFAYRTAPEFLAMEAGDRGTGNVNYSPASMW    MALAIAAQGANGTTRSQLNELLGSGSLTDSDYQSLLSSINGQYSGAKSEM    SAANSLWIDDDYSLASDYQSTVKKMFEAEVTTLPFDDQAAAKMSDWIAKH    TNGSLKPKITLRDREVLSIINTVYADGRWKDPFEEQSTGNGTFHGEAGDA    QVPMMHQTFSQMAYGHDEYNTWQRVEIPFDNGGNLAIVLPAEGHFDELAG    DAEKLSWAFGTCSTASLGEGAMGCAADSMPGWGVSVNSVMVNVTLPRFTI    DSMFDSEATIKAFEKLGVTDAFSAGDADFTKMIDTGSHGENLYIGSILQG    TRIEVNEAGAKAMSFTKVGADSVSAPVDNVEFTVDRPFLYSYVTPDGIPL    FIGAVRNLGGVGGEN
f)SEQ.ID.NO.576(ORF1972)
MQIRPGSMYPLGASYDGAGVNFALYSQVAQKVELCLFDEHDVETRIEMTE    RNSYVWHNYIPGLHPGQRYGYRVYGPYDPVHGLRCNPNKLLLDPYAKAIE    GNIDGDESLFSYWFKSPDDNSAMNDLDSAAHTMKSAVINPYFDWGNDQHP    YISYHDSVIYEAHVRGMTNLNMDVPPDIRGTYAGLAYPSVIEYLKKLGIT    AIELMPIHQFVNDSFLQEKGLSNYWGYNTIGFFAPHNAYSSSGERGEQVN    EFKSMVKAYHRAGMEVILDVVYNHTAEGNHMGPTLSFKGIDNASYYRLVE    GDQQHYFDTTGTGNSLLMRSPHALQLITDSLRYWVTEMHVDGFRFDLAAT    LARQFQEVDKLSAFFDIVEQDPIISRVKLIAEPWDLGSGGYQVGGFPSSW    SEWNGRYRDTVRDFWRSQPSTLPEFASRLMGSSDLYQVNGRRPVASVNFI    TAHDGFTMNDLVSYNEKHNEANGEGNRDGESNNRSWNCGVEGPTNIPDVN    DLRQRQMRNMFATLLFSQGIPMICGGDEVARTQQGNNNAYCQDNEISWTN    WHLDKGRKELLAFVSKLIHLRLDHPVLHRRRFFTGREPGDDSNTIPQVEW    FDHTGSIMDMDDWQNTHAFSMMIYLNGSDIPEVDWYGNRMVDNDFILIFN    AHYEPIMFTLPDERYGRKWQLVVDTHNPNEPALSYEAGFMITAQSRSFLM    LMSAKKPKKPMGL
g)SEQ.ID.NO.403(ORF1403)
MEIRARPHMASGSYRELFSARMMYGMQYIQQTIVGIDGSEARFFGYVADN    SEEMEPDRIRPAILILPGGGYAMTSDREAEPVALQFLAKGFAVFVLRYSV    QPSRYPVALLEAAEAMRLIRANVDQWHVNPAQVAVLGFSAGGHLAANLAT    SVGDEDIREQGGMDPDAVRPNALMLSYPVITAGKYAHRGSFQCLLGDQAH    NQALLDKFSIEKHIDAKTPPVFVWHTMTDDAVPVENTLMLIQACRAAGVS    IEAHLFPEGSHGLSLANAETAGNGFYAHIVECVQCWPDLAEAWLRRLF
(h)SEQ.ID.NO.804(ORF2676)
MFLKPEQQLERCRRIVRQRVDPHIHPSIAQLTVESYDIPGEPMPSDEFFA    KLDRGDIDFKPFMLGSEWGTTWGTVWFRLTGTVPAGYPKGKPLELILDLG    WYPHSCGGHIEGLVYRADGTAIKAVHPLNYWVPFMDAEGNAQVPVAEDGS    FTLYLEAASNPLLLGVPPFIETELGDHATGKPDEPYVFKSADLAEFDERY    ENYSVDLDVVSSLMEFADKQSPRYWQLAKALQRSLNAYDERNPESVEAAR    AVLAGVLAKPANASAMNVSAIGHAHIDSAWLWPVRETRRKVARTVSNALA    LMDADPDFKYAMSSAQQYAWLEEDHPDIFKRMKRRIEEGRFIPVGGMWVE    ADGMLPAGESLIRQIAYGRKYFKEHLGVEPKGVWLPDSFGYTGAWPQIAR    RAGYEWFLTQKISWNDTTKFPHHSFMWEGIDGSRIFTHFPPADTYAAWCK    VQELDYAEKNFQDKDLSDRSLLLFGFGDGGGGPTRNMMEHLHRYENLEGV    SKVSIEEPNDFFDKAHQQLAENAGPEMPVWKGELYLELHRGTLTSQQDMK    RGCRQEESLLRTVEYLGAAAVLSDPEYVYPREELDRIWKTLLLNQFHDIL    PGSAIAWVHREAREDYRRDLKRLAEIAQDMCAVLRKANPQADLLAEARIS    QFRNDGASWHANRINEPTDALSVLTQTLDNGRVLLANGVLSVTIEADGTI    SSLLDEEHGRELVPAGTRLGQYELLRDEPAVWDAWEIERESLLMANAVTG    SIESVNTENGAAQVHVHTADGDTVITTTITLRPGSHTLDFHADIDWHERE    RFLKVDLPLGIVADQATYDCQYGLIRRPIVKNTASDEAKYESSTNRFAII    GDAGYAAAVINGSVYGSDASPIAGNAAEGRDSGTMFRLSLLSAPTFPDPR    TDIGSHEFDWSVVADATVDRALDAAGVLNAPVLHDVPDITPLASIESVNG    TVVLDWMKLADDGSGDLIVRAYEAAGGQADAMLHVCPALAGASVHETNVL    EGDDLAADLPVALQDGRQNAEGATLHFGPFQLATLRITR
(i)SEQ.ID.NO.313(ORF1077)
MISRDGWAVIDDSAANIIIETDTVNGKANPFGTWVSPRATAETDLYFFGY    GHRYIEAVRDFYRLTGPTPLLPRFAMGNWWSRYYRYTQDGYLALMDRFKR    EGIPFTTSVIDMDWHRVDDVDPKYGSGWTGYSWNRELFPDPPAFLADLHR    RGLRTTLNVHPRDGVRAFEDAYPEVAKRVGIDPATEENVEFDLTNPDFVD    AYFDMHHRMEAEGVDFWWLDWQQGGVTRQKGLDPLWMLNHMHYLDSGRGG    NWPLTFSRYAGPGSHRYPVGFSGDTIVTWESLAFQPQFTATASNIGYGWW    SHDIGGHMFGYRNEELEARWYQLGAFSPINRLHSSNSPFSGKEPWNFNRD    VSAAMVDALRLRHAMMPYLYTMNYRAAEAGRPLVEPMYWQNPDTPDAYEV    PDEFRFGTELVVAPIVSPDDAAACRGRADAWLPQGEWFDFFDGRRYVSSD    AAGRRLEVWRSLDRTPVFAKAGAIVPLQDVAESGEAINSIANPQALRVLV    FPGADGSFVMREDRGTWGAPSADTAIAFTWGGADASPSAFTVAPVTGDTS    AVPELRDWTVVFRGVAPVDAASGVRAWSGEAPVEATVAYDEATMSLTVSV    TGISSAASLRIEIPGGLRIADNPVESDAMDLLLHAQMLYRTKELALQAVH    KLGIGAIGALRTMNRGPRYANDFWITDMPDAVAGALEEILLRS
应当理解的是，本申请中所包含的序列信息可用于筛选感兴趣的多核苷酸，即含有编码已知或未知的、推测多肽的开放读框的核酸，并且用所述选择的多核苷酸转化微生物。作为转化载体，可以使用众所周知的质粒、噬菌体载体(转染)或F-载体(接合)。可以表达导入特定微生物中的核酸，并且如果其生物学功能已知的话，可以直接使用，或者如果表达的是迄今为止所未知的多肽的话，则揭示其生物学功能。所选择的微生物可以是双歧杆菌本身或其他公知的微生物，如细菌，例如大肠杆菌、乳杆菌属、链球菌属或酵母、昆虫细胞甚至是动物和植物细胞。
应当理解的是，所述多肽可以原样表达或作为一种融合蛋白表达。本领域技术人员十分熟悉进行所述连接，以及在合适细胞中表达相应的融合多肽的技术。
对本发明来说，同样可以设计出用于克隆和/或表达本发明核苷酸序列的新的重组载体。所述载体包括能够在特定宿主细胞中表达和/或分泌所述核苷酸序列的必需元件，如启动子，用于启动和终止翻译的信号，以及用于调控转录的合适区域。例如，蛋白或肽的表达，可以通过本领域已知的任何启动子/增强子因子控制。典型的启动子有CMV启动子，SV40早期启动子区，包括在劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复中的启动子，疱疹胸苷激酶启动子，金属硫蛋白基因的调控序列，或对于原核表达系统来说，包括β-内酰胺酶启动子，tac启动子或T7启动子。
所述启动子应当能够在所述宿主细胞中稳定地保持，并且可选择性地具有指导翻译蛋白分泌的特定信号。所述不同的元件是根据所使用的宿主细胞选择的。为此，可以将本发明的核苷酸序列插入所选择的宿主的自主复制的载体中，或插入所选择的宿主的自主复制的载体中，如酵母人工染色体，质粒，或病毒载体。可以理解的是，所述载体可以是如SEQ.ID.NO.2的质粒或其重组形式，在它上面业已补充了能够获得高拷贝数的ori′s。
本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入载体的任何标准方法都可用于构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因由合适的转录/翻译控制信息和蛋白编码序列组成。所述方法可以包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组体(遗传重组)。
所述载体可用于转录和/或翻译SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2中所包含或由其构成的核酸，以便分别产生RNA或反义RNA。所述载体可以保持附加形式，或整合到染色体上，只要它能够转录产生需要的转录物就行。
本发明的反义核酸包括互补于SEQ.ID.NO.1中的多核苷酸序列的RNA转录物的至少一部分的序列，将具有足够的互补性的序列称为能够与所述RNA杂交形成稳定双链体。对于双链反义核酸序列来说，可以测试双链DNA的单链，或评估三链形成。
本发明还包括用上文所述的本发明的核酸或载体转化过的宿主细胞。所述细胞可以通过以下方法获得：将上述核苷酸序列或载体导入合适的细胞，然后在所述转化/转染的核苷酸序列能够复制和/或表达的条件下培养所述细胞。
所述宿主细胞可选自真核或原核系统，如细菌细胞、酵母细胞、动物细胞和植物细胞。在本发明的范围内，细胞应当被理解为包括高等生物学系统。如动物、完整的植株或其部分。另外，宿主细胞株可以是选择过的，它能调节插入序列的表达，或以所需要的特定方式修饰并且加工所述基因产物。
用于表达本发明蛋白的优选的宿主细胞包括原核细胞，如格兰氏阴性或格兰氏阳性细菌。本发明的另一种优选的宿主细胞是属于双歧杆菌属家族的细菌，更优选属于长双歧杆菌，或选自与长双歧杆菌相关的微生物。
可以将本发明的转化的/转染的细胞优选用作模型，并且可用于研究、鉴定和/或筛选能够决定由本发明的双歧杆菌菌株引起的任何有益作用的化合物的方法中。
本发明还提供了由长双歧杆菌ORFs编码的多肽，特别是在表1中列举的并且在序列表中限定的多肽。在本说明书中，术语多肽、肽和蛋白是交换使用的。另外，本发明还涉及通过重组方式制备所述多肽的方法，包括以下步骤：(a)在适合生产由所述多核苷酸编码的多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)从所述培养物中回收所述多肽。
可以理解的是，上述多肽还可以通过组合化学方法获得，其中，在模型系统中测试所述多肽之前，在某些位点上对它进行修饰，以便筛选活性最高的或者具有理想特性的化合物。
在本发明中，化学合成具有可以使用非天然氨基酸或非肽键的优点。因此，例如，为了延长本发明多肽的寿命，使用所述非天然氨基酸可能是有利的，例如D型氨基酸，或使用氨基酸类似物，优选含硫的形式。
最后，可以将本发明多肽的结构、其同源或修饰形式，以及相应的片段整合到所述多肽类型等的化学结构上。因此，为了在体内环境中保存所述多肽，优选在N-和C-末端提供能够产生对蛋白酶的降解作用的抗性的化合物。
还应当理解的是，通过上述方法生产的本发明的不同的多肽可能是宿主动物免疫系统的抗原，以便能够产生直接针对所述多肽的抗体。可以将所述抗体用于检测混合物或样品中双歧杆菌菌株的感兴趣的多肽。另外，还可将其用作研究工具，例如，包括生产抗细胞表面表位的抗体，以及测定阻断细菌细胞壁上的某些多肽的作用。因此，根据另一方面，本发明提供了针对本发明所提供的各种多肽的表位的抗体。
根据另一方面，本发明还提供了一种用于在生物学样品中检测和/或鉴定长双歧杆菌的方法。该方法可能包括本领域已知的若干种技术，如PCR或与合适探针的简单杂交。另外，可以将针对长双歧杆菌的细胞壁表位的抗体用于所述目的。应当理解的是，上述方法还可以颠倒过来，并且通过在能够形成免疫复合体的条件下，让待检测的样品与双歧杆菌属的多肽接触，确定抗双歧杆菌属抗体的存在。
可以将本发明的多肽、下文所披露的本发明的抗体和本发明的核苷酸序列用于体外和/或体内方法，用于在可能含有它们的生物学样品(生物学组织或流体)中检测和/或鉴定属于双歧杆菌的细菌。根据将要使用的本发明的多肽、抗体和核苷酸序列的特异性，所述方法可以检测和/或鉴定属于双歧杆菌菌种的细菌变体以及能够通过将要选择的本发明的多肽抗体和核苷酸序列检测的相关微生物。例如，选择能够检测双歧杆菌科的任何细菌的本发明的多肽、抗体或核苷酸序列可能是有利的，包括选择对该科特异的本发明的多肽、抗体和/或核苷酸序列。
本文所提到的所有序列(SEQ ID.NO.1和SEQ ID.NO.2)列举在所附序列表中，该序列表被认为是本说明书的一部分。
本发明还包括共价或非共价固定在固体支持物上的本发明的核苷酸序列或多肽。在第一种情况下，所述固体支持物可用于通过特异性杂交，捕获从待检测的生物学样品中获得的靶核酸。如果必要的话，可以将所述固体支持物与所述样品分离，并且随后通过用容易检测的元素标记过的被称为检测探针的第二种探针，检测由所捕获的探针和靶核酸所形成的杂交复合体。
所述支持物可以是所谓DNA阵列或DNA芯片，多个分子探针精确组织或排列在固体支持物上，它能够对基因进行测序，研究它所包含的突变以及基因的表达，并且由于它非常小以及在分析数量方面的高容量使它现在非常有价值。
所述阵列/芯片的功能基于分子探针，主要是基于与一种载体连接的寡核苷酸，根据需要，它通常具有几个平方厘米或更大的尺寸。为了进行分析，用探针对所述载体(DNA阵列/芯片)进行包被，所述探针排列在该载体的预定位置上。然后将含有要分析的、事先业已标记过的诸如DNA或RNA或cDNA的靶核酸片段的样品与所述DNA阵列/芯片接触，以便通过杂交形成双链体。在洗涤步骤之后，通过分析芯片表面，可以根据标记所述靶分子的标记物发射的信号定位有效杂交。通过对由该分析所获得的杂交指纹结果进行适当的计算机处理，可以获得诸如基因表达、特定片段在样品中的存在，序列测定和突变存在的信息。
例如，可以通过荧光、放射性或通过电子检测确定在所述DNA芯片上原位沉积或合成的本发明探针与要分析的样品之间的杂交。
可以将本发明的核苷酸序列用在DNA阵列/芯片上，以便分析双歧杆菌属基因的表达。该分析基于在它上面存在根据其对要表征的特定基因的特异性选择的探针的DNA阵列/芯片。在与所述芯片杂交之前对要分析的靶序列进行标记。在洗涤之后，检测并定量标记过的化合物，所述杂交至少重复进行2次。对比分析用相同的探针获得的有关不同样品和/或用不同探针获得的有关相同样品的信号强度，确定来自所述样品的RNA的有差别的转录。
本发明的DNA阵列/芯片还可能包括对其他微生物特异的核苷酸探针，它能进行一系列检测，以便快速鉴定一种微生物在一种样品中的存在。
上文详细说明的DNA芯片的原理还可用于生产蛋白芯片，在该芯片上，所述支持物业已用取代所述DNA的本发明的多肽或抗体，或其阵列进行包被。所述蛋白芯片可以分析通过将靶分析物亲和捕获在支持物上诱导的生物相互作用分析(BIA)，所述支持物是通过表面等离子共振(SPR)用诸如蛋白的分子包被过的。本发明的所述多肽或抗体能够特异性地结合待分析样品的抗体或多肽，因此，可用于蛋白芯片上，用来检测和/或鉴定样品中的蛋白。
本发明还涉及计算机可识读的介质，在它上面记录了本发明的一种或多种核苷酸和/或多肽序列。该介质还可以包括来自本发明的其他信息，例如，与已知序列的相似性和/或与其他微生物的核苷酸和/或多肽相同的信息，以便对所获得的结果进行对比分析和说明。例如，优选的介质是磁、光学、电学和复合型介质，例如，软盘、CD-ROMs或记录磁带。
本发明还涉及用于检测和/或鉴定属于长双歧杆菌或属于相关微生物的细菌的试剂盒或装置，它包括本发明的多肽，如果合适的话，包括用于组成适合免疫学或特异性反应的介质的试剂，所述试剂能够检测通过本发明的多肽和可能存在于所述生物学样品中的抗体之间的免疫反应所产生的抗原-抗体复合物，所述试剂还可以带有一种标记，或者能够被一种标记过的试剂识别，更具体地讲，当本发明的多肽是未标记过的时，可以被不含可以由本发明的多肽识别的抗体的参考生物学样品(阴性对照)，含有预定数量的由本发明的多肽识别的抗体的参考生物学样品(阳性对照)识别。
本发明还涉及用于检测和/或鉴定属于长双歧杆菌或属于相关微生物的细菌，或用于检测和/或鉴定一种微生物的试剂盒或装置，其中，所述试剂盒包含本发明的蛋白芯片。
在本文中通过其基因组序列披露的所述新微生物被命名为NCC2705，该微生物业已按照布达佩斯条约规定，于2001年1月29日交由国立微生物保藏中心保藏，保藏号为CNCM I-2618。该微生物属于双歧杆菌属，长双歧杆菌种，并且是益生性微生物，即，它能够以基本上活的和有存活力的形式通过胃肠道，并且具有抑制导致腹泻的致病细菌在肠道中集群的能力，另外，还可以预防或减轻由轮状病毒导致的肠细胞感染的发生。
所述微生物是格兰氏阳性的、过氧化氢酶阴性的、和二氧化碳生产阴性的，它能产生(L+)乳酸，并且基本上能抑制能引起腹泻的细菌在肠细胞中集群，如致病性大肠杆菌，例如，肠致病性大肠杆菌(EPEC)，或沙门氏菌属，例如鼠伤寒沙门氏菌，并且预防轮状病毒感染肠细胞。
所述新型微生物可用于制备多种载体材料，例如，乳、酸乳、凝乳、发酵乳、乳基发酵制品、谷基发酵制品、乳基粉末、婴儿配方，并且能够以大约10⁵cfu/g-大约10¹¹cfu/g的用量包含在所述支持物中。对本发明来说，缩略语cfu表示“集落形成单位”，它被定义为通过在琼脂平板上进行微生物学计数发现的细菌细胞的数量。
本发明还提供了一种至少含有双歧杆菌NCC 2705和/或含有上清液的食品或药物组合物，其中，所述微生物业已生长过，或者分别是它的活性级份/代谢物。
为了制备本发明的食品组合物，将本发明的至少一种双歧杆菌掺入合适的支持物中，其用量为大约10⁵cfu/g-大约10¹²cfu/g，优选大约10⁶cfu/g-大约10¹⁰cfu/g，更优选大约10⁷cfu/g-大约10⁹cfu/g。
对于药物制剂来说，所述产品能够以片剂、液体细菌悬浮液、干口服添加剂、湿口服添加剂、干管装饲料(tube feeding)或湿管装饲料形式制备，要掺入其中的双歧杆菌属的用量最高可达约10¹²cfu/g，优选大约10⁷cfu/g-大约10¹¹cfu/g，更优选大约10⁷cfu/g-大约10¹⁰cfu/g。
当然，人体肠道内所述新微生物的活性是取决于剂量的。就是说，通过摄取上述食品材料或药物组合物掺入的所述新微生物或其活性成分越多，其保护和/或治疗活性就越高。由于所述新微生物对人类和动物是无害的，并且业已最终从婴儿粪便中分离到了这种微生物，可以掺入大量的这种微生物，以便大部分人体肠道能够由所述新型微生物集群。
另外，根据另一种优选实施方案，本发明双歧杆菌培养物的上清液或其活性级份可用于制备所述载体。所述上清液可以直接使用，或者在不会破坏由所述微生物分泌到液体培养基中的代谢产物的条件下干燥，例如，冷冻干燥，并且可以添加在载体中。为了减少所述上清液中未知化合物的数量，优选在确定成分培养基中生长双歧杆菌，该培养基的组成是已知的，并且不会对宿主对它的掺入造成负面影响。另外，技术人员可以根据其一般知识选择性地消除所述上清液中不想要的产品，例如通过层析方法消除。
本发明人业已研究了婴儿粪便，并且从中分离了多种不同的细菌菌株。随后检查了这些菌株抑制已知会导致腹泻的细菌集群和/或入侵上皮细胞的能力，所述细菌如大肠杆菌、志贺氏菌属、克雷伯氏菌属、椰尔森氏菌属、铜绿假单胞菌、李斯特氏菌属、链球菌属、葡萄球菌属、艰难梭菌、幽门螺杆菌以及白色链球菌。
筛选了包括双歧杆菌属、乳球菌属和链球菌属在内的若干种细菌属的腹泻抑制特性。对所述抑制特性的检测是用致病微生物进行的，如作为会导致受感染个体腹泻的致病微生物的代表的大肠杆菌、克雷伯氏菌属、椰尔森氏菌属、铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。
在相当于其最佳生长温度的大约30-40℃的温度下，在诸如MRS，Hugo-Jago或M17的培养基的合适培养基中生长所述各种细菌。在达到稳定生长之后，通过离心收集所述细菌，并且重新悬浮在生理NaCl溶液中，在不同的测试之间，将所述细菌细胞冷冻保存(-20℃)。
为了评估抗细菌特性，选择以下方法。
根据一种方案，检验本发明的培养的双歧杆菌属降低不同致病微生物存活力的能力。为此，让致病细菌的培养物与双歧杆菌属培养物的浓缩上清液接触，并且评估所属致病细菌的生长潜力。
根据第二种方案，通过与T₈₄细胞一起培养所述双歧杆菌，测定本发明的双歧杆菌对T₈₄细胞(用于肠道的细胞培养模型)的粘附能力，并且评估粘附比例。
根据另一种方案，测定了本发明的双歧杆菌抑制沙门氏菌属感染肠细胞的潜力，用细胞系Caco-2作为所述肠细胞的模型。在这一方面，将本发明双歧杆菌属的细胞培养物上清液与所述致病微生物一起添加到所述肠细胞中，并且分别评估所述粘附或侵入比例。
因此，可以证实的是，所述培养的双歧杆菌属和所述上清液被证明为在预防粘附和入侵到所述肠细胞两方面都是非常有效的，这表明由所述微生物分泌的一种或多种代谢化合物很有可能决定所述抗腹泻活性。
根据另一种方案，进一步评估了NCC2705是否能够抑制轮状病毒对上皮细胞的入侵。采用了两种不同方案。根据一种方案，检验了所述各种细菌菌株与所述轮状病毒菌株的直接相互作用，而在第二种方案中，筛选了所述细菌中能够与所述细胞轮状病毒受体相互作用的菌株。
所述第一种方案包括让相应的细菌上清液分别与不同的轮状病毒菌株接触，并且在合适的培养基中培养。然后将所述病毒-细菌混合物添加到人未分化的结肠腺癌细胞HT-29(肠上皮细胞系)的细胞单层上，并且继续培养。分析了病毒复制。
所述第二种方案包括首先与人未分化的结肠腺癌细胞HT-29的细胞单层一起温育相应的细菌悬浮液，并且随后添加所述病毒。在继续温育之后，分析病毒复制。
通过对感染细胞中的轮状病毒蛋白进行组织-免疫学染色，评估轮状病毒复制。与仅接种轮状病毒的细胞相比，当用轮状病毒和所示细菌接种的细胞培养物中，受感染的细胞的数量减少90％时，轮状病毒抑制作用就是由一种特定细菌造成的。
下面将通过实施例形式对本发明进行说明，而不是要对本发明进行限定。
培养基和溶液：
MRS(Difco)
Hugo-Jago(胰化蛋白胨30g/1(Difco)，酵母提取物10g/l(Difco)，乳糖5g/l(Difco)，KH₂PO₄6g/l，牛肉膏2g/l(Difco)，琼脂2g/l(Difco))
M17(Difco)
Eugon番茄琼脂(罐装番茄汁400ml，Eugon琼脂BBL 45.5g，麦芽糖Difco 10g，氯高铁血红素Sigma 5mg，琼脂Difco 5g，蒸馏水600ml)
DMEM(Dulbecco′s改良的Eagle培养基)
CFA(根据Ghosh等，Journal of Clinical Microbiology，199331 2163-6)
Müller Hinton琼脂(Oxoid)
LB(Luria Bertami，Maniatis，A Laboratory Handbook，ColdSpring Harbor，1992)
C¹⁴-乙酸(53，4 Ci/mMol，Amersham Internat ional PLC)
PBS(NaCl 8g/l，KCl 0.2g/l，Na₂HPO₄ 1.15g/l，KH₂PO₄ 0.2g/l))
胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)
FCS胎牛血清(Gibco)
大肠杆菌DAEC C 1845是从西雅图的华盛顿大学获得的，大肠杆菌JPN15是从美国马里兰大学的疫苗开发中心获得的。鼠伤寒沙门氏菌株SL1344是从美国加利弗尼亚州斯坦福大学微生物学系获得的。该菌株起着小鼠致病菌的作用，并且能抗链霉素。它粘附在Caco-2结肠细胞上(Finlay和Falkow，1990)。克雷伯氏菌属是从原始临床分离物中获得的，它是由Facultéde Pharmacie Paris XI的微生物学实验室(-Malabry，法国)获得的。椰尔森氏菌是从INSERM Unit411获得的(Necker，巴黎，法国)。铜绿假单胞菌是从原始临床分离物中获得的，它是由Facultéde Pharmacie Paris XI(-Malabry，法国)的微生物学实验室获得的。
幽门螺杆菌是从瑞士洛桑的洛桑大学微生物学研究所获得的。
人轮状病毒Wa(G1血清型)和猴轮状病毒SA-11(G3血清型)是从美国费城儿童医院P.A.Offit获得的。DS-1xRRV重排病毒是从美国NIH Bethesda的A.Kapikian获得的。血清型4人轮状病毒Hochi是从德国慕尼黑大学的P.Bachmann获得的。
实施例1
双歧杆菌属的分离
从15-27日龄的16位健康婴儿的尿布上收集新鲜粪便。将1克新鲜粪便放置在厌氧条件下，以便转移到实验室中，并且在从取样开始计算的2小时内进行微生物学分析，包括用Ringer溶液进行系列稀释，并且铺板到选择培养基上。将在37℃下厌氧温育48小时的Eugon番茄琼脂(罐装番茄汁400ml，Eugon琼脂BBL 45.5g，麦芽糖Difco 10g，氯高铁血红素Sigma 5mg，琼脂Difco 5g，蒸馏水600ml)用于分离双歧杆菌属。随机挑取菌落，并且纯化。对所述分离物进行生理学和遗传学表征。
实施例2
培养细胞系
Caco-2细胞：
为了进行抑制分析，将细胞系Caco-2用作小肠成熟肠细胞的模型。该细胞系具有肠细胞的特征，例如极性，表达肠酶，生产特定结构的多肽等。在不同支持物上生长所述细胞，即在塑料培养皿(25cm²，Corning)上生长和繁殖，在脱脂和消毒的6孔玻璃平板(22×22mm，Corning)上进行粘附和抑制实验。在培养的第2天后，每天1次地更换培养基(DMEM)。在使用之前，向所述培养基中添加100U/ml青霉素/链霉素，1μg/ml两性霉素，20％的在56℃下失活30分钟的FCS，和含有非必需氨基酸的1％溶液(10mM)(Eurobio，巴黎，法国)。培养是在37℃下，在含有90％空气和10％二氧化碳的环境中进行的。每隔6天剥离所述细胞。通过用pH 7.2的含有0.015％胰蛋白酶和3mM EDTA的PBS处理使所述细胞与所述孔的壁分离。为了中和胰蛋白酶的作用，将等体积的含有FCS的培养基添加到所获得的细胞悬浮液中。对该混合物进行离心(10分钟，1000rpm)，并且将沉淀再次溶解到培养基中。统计活细胞(不能被台盼兰染色)。将大约3.5×10⁵活细胞转移到新的培养瓶中，并且培养每孔大约1.4×10⁵细胞，直到获得铺满的单层。
T₈₄细胞：
为了进行粘附分析，将细胞系T₈₄用作来自肠道的结肠细胞模型。该细胞系具有肠细胞的特征，例如极化、表达肠酶，生产特定结构的多肽等。T₈₄细胞是从加利弗尼亚大学(San Diego，CA)获得的。在37℃下，在10％二氧化碳/90％空气的环境中，在补充了2mM谷氨酰胺，50mM HEPES，1％非必需氨基酸和10％失活的(30分钟，56℃)胎牛血清(Boehringer，Mannheim，德国)的DMEM(50％)和Ham′s F12(50％)中生长细胞。以每平方厘米10⁶细胞的浓度接种细胞。在铺满之后晚期，即10天后，将所述细胞用于粘附分析。
除了双歧杆菌属菌株之外，所有菌株都是在-80℃下，在其含有15％甘油的培养基中保存。由于转移到新培养基中的次数对所述粘附因子有影响，在24小时时间内，仅将沙门氏菌属菌株转移2次，第一次转移是在所述菌株冷冻的状态下进行的。所有培养物是在通气条件下培养的。
双歧杆菌属
细胞菌株(长双歧杆菌CNCM I-2618(NCC2705))是在-20℃下，在含有15％甘油的MRS培养基中保存的。在厌氧条件下，在MRS中生长所述菌株，并且以24小时的间隔，2次转移到新的培养基中，然后用于抑制实验。为了进行所述实验，使用2×10⁹cfu/ml的浓度。通过以20.000rpm的速度离心1小时，收集上清液，并且随后检查所获得的上清液中细菌的存在。在37℃下，在MRS中将双歧杆菌属的菌株厌氧培养18小时。然后对该培养物进行离心(20分钟，4℃)，收集上清液，冷冻干燥，送回所述溶液，然后浓缩10次(10x)。将该上清液的pH最终调整到4.5。
大肠杆菌C 1845：
解冻之后的第一次传代，是在CFA-Müller Hinton琼脂上进行的，它适合所述细菌实现粘附因子的表达。在每一次实验之前，在37℃下温育所述细菌细胞，每隔24小时将其转移到新的培养基中。
克雷伯氏菌属：
在37℃下，在Luria培养液中生长细菌18小时过夜。
椰尔森氏菌属：
在37℃下，在Luria培养液中生长细菌18小时过夜。
铜绿假单胞菌
在37℃下，在Luria培养液中生长细菌18小时过夜。
幽门螺杆菌：
在含有0.25％酵母提取物(Difco Laboratories，Detroit，MI)，10％马血清和0.4％弯曲杆菌属选择性补充物(Skirrow添加剂，SR 69；Oxoid Ltd，Basingstoke，英国)的脑心浸渍(BHI)-琼脂平板上生长细菌。
实施例4
用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)洗涤Caco-2和T₈₄单层两次，所述单层是在放置在6孔Corning组织培养平板(Corning Glass Works，Corning，NY)中的玻璃盖玻片上制备的。将双歧杆菌属(1ml，4×10⁸细胞/ml，在存在于废培养上清液、处理过的上清液或新鲜MRS培养液中)添加到1ml细胞系培养基中。将该悬浮液(2ml)添加到组织培养平板的每一个孔中，并且在37℃下，在10％ CO₂/90％空气中温育该平板。在温育1小时之后，用无菌PBS洗涤所述单层5次，用甲醇固定，用格兰氏染液染色，并且进行显微镜检查。在肠细胞的3次连续传代中，每一次粘附实验都是重复进行的。对于玻璃盖玻片上的每个单层来说，粘附细菌的数量是在20个随机显微镜区域内评估的。为了消除偏差，通过两种不同的技术评估粘附性。
结果如图1所示，从图1中可以看出，与已知的细胞系GG(WO97/00078)，Lal(EP 0 577 903)或另一种双歧杆菌菌株(BL28/Cal)相比，NCC2705能够粘附在肠细胞上。
实施例5
作为致病细菌的候选菌，使用了大肠杆菌，克雷伯氏菌属，椰尔森氏菌属，铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌。
基于在MRS培养基中保持了18小时的NCC2705培养物，生产了指数生长的培养物(37℃，3小时)。取出2ml该溶液，并且在4℃下以5500g的速度离心5分钟。在收集上清液之后，用无菌PBS洗涤细胞沉淀。在离心之后，收集沉淀，并且添加2ml无菌PBS。对所述细菌进行计数，并且以这种方式使悬浮液适应，生产了1-5×10⁶细菌/ml。
由本发明的双歧杆菌属产生的抗菌作用的评估是按照披露于以下文献中的Lehrer方法进行的：Lehrer等，J.Imunol.Methods 137(1991)，167-173，该文献被收作本文参考。其结果如图2和3所示。
通过上述结果可以看出，本发明的双歧杆菌属能有效抑制各种致病细菌的生长。
实施例6
沙门氏菌属的抑制实验
沙门氏菌属是能入侵上皮细胞，并在上皮细胞中复制的细菌。为了确定本发明的双歧杆菌属对鼠伤寒沙门氏菌菌株SL1344的抑制活性，使用了以下方法。
在LB-培养基中培养致病细胞。在第二次传代到新的培养基上之后，在LB培养基中使用10μCi/ml的C¹⁴-乙酸对所述细菌菌株进行同位素标记。在37℃下，在该培养基培养所述菌株18小时。
然后对所述细菌悬浮液进行离心(1041rpm，15分钟)，以便清除上清液中的残余C¹⁴-乙酸。将沉淀悬浮在PBS中，并且用PBS洗涤，将所述细胞以大约10⁸细胞/ml的浓度悬浮在1％无菌甘露糖中。已知甘露糖能抑制非特异性粘附。然后将该细菌溶液调整到2×10⁸细胞/ml。
在37℃下将所述病原体(1ml；2×10⁸细胞)和一等份的双歧杆菌属培养物上清液(1ml)预温育2小时。然后对该悬浮液进行离心，取出所得到的上清液，并且将沉淀再次悬浮在0.5ml PBS中。然后让该病原体溶液(0.5ml)与培养中的人肠细胞接触。用无菌PBS洗涤该培养物2次，并且添加0.5ml粘附培养基(DMEM)。然后在37℃下，在10％CO₂中温育所述细胞1小时。
在温育之后，统计所述温育培养基中和所述肠细胞上或内的细菌数量。为了测定粘附在或业已侵入肠细胞中的细胞数量，选择了以下方法。
为了测定粘附细菌的数量，对所述培养基进行倾析，并且用培养基洗涤所述细胞1次，用无菌PBS洗涤1次。然后，向每个区室中添加1ml无菌水，以便裂解所述细胞并且形成细胞溶液，在37℃下温育该溶液1-2小时，此后，进行连续的稀释。为了统计粘附和入侵细菌的数量，对所述细胞溶液进行离心，以便除去细胞碎片，并且测定放射性。
根据另一种方法，将10份等份样品分别放置在TSA培养基上。然后在37℃下温育所述培养基18-24小时。
为了测定入侵细菌的数量，用PBS洗涤Caco-2细胞，以便除去所有非粘附细胞。然后，添加含有庆大霉素(20μg/ml)的培养基，并且在37℃下继续温育1小时。庆大霉素是一种不能穿透肠细胞的抗生素，以便杀死所有细胞外微生物，而业已侵入肠细胞的细菌能够存活。然后在37℃下将所述细胞再温育1小时，然后用PBS洗涤2次。通过添加无菌蒸馏水，并且在37℃下温育1-2小时裂解所述细胞。在除去细胞碎片之后，测定放射性。根据另一种方法，连续稀释，将其放在TSA培养基上。在37℃下温育18-24小时。
可以看出的是，培养的细胞和培养上清液，在抑制沙门氏菌属粘附并且侵入到肠细胞中方面是非常有效的。
实施例7
鼠伤寒沙门氏菌C5菌株对小鼠的感染
通过口服固定浓度的鼠伤寒沙门氏菌(0,2ml，10⁸cfu/小鼠)，感染在无菌条件下饲养的7-8周龄的成年、纯性、雌性小鼠(C3H/He/oujcoconventional，Iffa Credo，France)。通过植入某些双歧杆菌菌株，使某些小鼠成为单性(monoxenic)。对某些小鼠来说，在取出肠节段之后，计数其中的双歧杆菌数，并且在PBS中粉碎所述器官。对其他小鼠来说，用这种方法评估对感染的保护作用，将其连续保持在无菌环境中，并且将存活天数与对照组进行比较。
结果如图4所示。正如由此可以推导的，在对照组中，几乎所有小鼠都在大约10天时间之后死亡。与此相反，所有用NCC2705处理过的小鼠10天之后都能存活，只有20％的小鼠在30天时间之后由于受到沙门氏菌属产生的有害作用而死亡。
实施例8
第一种方案：
将30μl相应的细菌悬浮液(平均含有3×10⁶细菌)与70μl补充了10％胰蛋白磷酸营养液(Flow)和5％胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)的M199混合，向其中添加存在于补充过的M199培养基中的100μl病毒。将由此获得的病毒-细菌混合物在4℃下温育1小时，并且在37℃下温育1小时。分别让人未分化的结肠腺瘤细胞HT-29的细胞在96孔微量滴定板中生长成铺满的单层(在M199培养基中，该培养基补充了10％胰蛋白胨磷酸培养液(Flow)和5％胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)，用PBS以1∶4的比例稀释)，用磷酸缓冲的盐溶液(PBS；pH 7.2)洗涤3次。将按上述方法处理过的病毒-细菌混合物转移到所述细胞上，并且在CO₂培养箱(Heraeus)中培养所述微量滴定板18小时。按下文所述方法分析病毒复制。
第二种方案：
将30μl细菌悬浮液(同上)与70μl补充了10％胰蛋白胨磷酸营养液(Flow)和5％胰蛋白酶-EDTA溶液(Seromed)的M199混合，并且直接加样到按所述第一种方案在微量滴定板上生长并且预处理过的HT-29细胞上。在37℃下温育1小时之后，将存在于补充过的M199培养基中的100μl病毒，添加到所述微量滴定板上的细胞中。在CO₂培养箱(Heraeus)中继续温育18小时。按下文所述方法分析病毒复制。
通过按下文所述的方法对感染细胞中的轮状病毒蛋白进行组织免疫学染色，评估轮状病毒复制。
在感染1天之后，从所述微量滴定板上取出细胞培养基，并且用无水乙醇固定所述细胞10分钟。倒掉乙醇，并且用PBS缓冲液洗涤该平板3次。然后将50μl抗轮状病毒血清(主要抗VP6蛋白)添加到每一个孔中，并且在37℃下温育1小时，并且用盖玻片防止所述孔变干，所述抗血清是在兔子体内生产的(从洛桑大学的ISREC获得)，并且用PBS以1∶2000的比例稀释。然后去掉所述抗血清，并且用PBS洗涤所述平板3次。将50μl在山羊体中生产的、并且与过氧化物酶偶联的抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗血清(GAR-IgG-PO；Nordic)在PBS中以1∶500的稀释比例添加到每一个孔中，并且在37℃下温育所述平板1小时。去掉所述血清，并且再次用PBS洗涤平板3次。然后将100μl下列底物混合物添加到每一个孔中：10ml的0.05M Tris-盐酸(pH 7.8)，1ml的H₂O₂(30％suprapur，用水以1∶600的比例稀释；Merck)，和200μl的3-氨基-9-乙基咔唑(0.1g/10ml的乙醇，以200μl的等份样品在-80℃下保存；A-5754；Sigma)。在室温下温育所述平板至少30分钟。去掉所述底物，并且用200μl水填充所述孔，以便终止所述反应。用反相显微镜(Diavert；Leitz)计数感染细胞灶。
只有非常少的细菌菌株与轮状病毒相互作用。在至少一种方案中，在260个初步筛选的细菌细胞中只有4个能抑制轮状病毒复制。青春双歧杆菌CNCM I-2618(NCC2705)表现出针对血清型1轮状病毒、血清型3轮状病毒SA-11和血清型4轮状病毒Hochi的非常高的活性。
NCC2705是格兰氏阳性的和过氧化氢酶阴性的，在发酵期间它不能产生CO₂，并且按照披露于以下文献中的方法它只能产生L(+)乳酸：“Genera of lactic acid bacteria”Ed.B.J.B.Wood和W.H.Holzapfel，Blackie A&P。
以上结果证实了本发明双歧杆菌属的非常卓越的特性。
序列表
<110>雀巢制品公司
<120>双歧杆菌的基因组
<130>80290/WO
<150>EP 01102050.0
<151>2001-01-30
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2256646
<212>DNA
<213>长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)
<400>1
gtggtgtggt atcagaatga gaccgataag gccaccgctg aggatgtggc gaccacgctt   60
ggcatttcgg ctgtggagca ggtgcaagga ctcgccgttc ccattacggt ggtgttgctc  120
aactagcgtt gttgatgcgc ccctgatatc ggcgagaaat acatcgaaaa ctgtgagcgt  180
tctcacgtct atggaataat tcgtaccgaa aatgtgccac tgcggttgag attgttccct  240
cgtcactgta caatcgtcat ctagtcgcga ggtaggggga gcgcgatgcg gttctttcta  300
cgttccctat aggttttgtg tcgcgacgcc caagggaaca aaggaaagac cagatatggc  360
acaaggtacc gtgaagttct tccttgccaa gaaggggttc gggttcatcc agccggacga  420
tggcggcgag gacgttttcg tgcactacgc ggaaatcaag gacgacggca gcaccaataa  480
gttcaaaatg ctgtacgaag gcgatcgcgt ggagtatacg cccgcttcgt ccggcaaagg  540
cacgcaggca aaggatgttg tcaagctgtc ttcgggtgaa gcccgctccg agtgagcaac  600
acgcacgcaa ggatgtgcat tgaaggccct gaccgtttcg acggttgggg ctttttcatg     660
cccaaagcgc aatcgccgcc gatggtgttg gcactcggcg ggcgcgagtg ctaatgtctg     720
ggttagcact cggaggtcga gagtgataat cggcagctga cggctggtcg tcacgactcg     780
acgcttgcga gtgataaccg gtatacctag ccatttggag gaatacgcaa ccatggcaaa     840
gatcatctct tatgatgagg aagcccgtca gggcatgctg gagggccttg acaagctcgc     900
caacaccgtc aaggtcactc tgggcccgaa gggccgcaac gtcgtgctcg acaagaccta     960
cggcgctccg accatcacca acgatggcgt gtccatcgcc aaggaaatcg accttgaaga    1020
cccgtacgag cgcatcggcg ccgagctggt caaggaagtc gccaagaaga ccgacgacgt    1080
cgccggtgac ggcaccacca ctgcaaccgt gcttgctcag tccctggttc acgagggtct    1140
gaagaacgtg gtcgccggct ccaacccgat cgccctgcgt cgcggcatcg agaaggccac    1200
cgaggtcatc gtcaaggaac tcgtcgctgc cgccaaggac gtcgagacca aggaccagat    1260
cgctgctacc gccaccatct ccgccgctga ccctgaggtc ggcgagaaga tcgctgaggc    1320
tctggacaag gtcggccagg acggcgttgt gaccgttgaa gacaacaacc gcttcggcct    1380
ggacctcgac ttcaccgagg gcatgcgttt tgacaagggc tacatcgccc cgtacttcgt    1440
caccaacgct gacgaccaga ccgcagtgct cgaagatccg tacattctgc tgacctccgg    1500
caaggtctca tcccagcagg acatcgtgca cgtggccgag ctggtcatga agaccggcaa    1560
gccgctgctg atcatcgctg aggacgtcga cggcgaagca ctgccgacct tgatcctgaa    1620
caacatccgt ggcaccttca agtcctgcgc cgtcaaggcc ccgggctttg gcgaccgtcg    1680
caaggccatg ctgcaggata tggccatcct gaccggtgct caggttgtct ccgacgaact    1740
gggcctgaag ctcgagtccg tcgacacctc cgtgctcggc cacgccaaga aggtcatcgt    1800
ctccaaggac gagaccacca tcgttcaggg cgctggctcc aaggaagaca tcgacgctcg    1860
cgtggcccag atccgcgctg agatcgagaa caccgactcc gattacgacc gtgagaagct    1920
gcaggagcgt ctggccaagc tggctggcgg cgtggctgtc atcaaggtcg gcgctgccac    1980
cgaggtcgag gccaaggagc gcaagcaccg catcgaagat gccgtgcgta acgccaaggc    2040
cgccatcgag gaaggcctgc tgcctggcgg tggcgtggcc ctcgttcagg ctgctgccaa    2100
ggccgagaag accgaggccg tcacctccct gaccggcgaa gaggctaccg gtgccgccat    2160
cgtgttccgc gccatcgagg ccccgatcaa gcagatcgcc gagaacgccg gcgtgtccgg    2220
tgacgtggtc atcaacaccg tccgctccct gcctgatggc gaaggcttca acgccgccac    2280
cgacacctac gaagacctgc tggccgccgg tgtgaccgac ccggtcaagg tgacccgctc    2340
cgctctgcag aacgccgcct ccatcgctgg tctgttcctg accaccgagg ccgtcgttgc    2400
caacaagccg gagccgaagt ctgctgcccc ggccgccggt gccgacatgg gctactgatc    2460
cgcaaacgat cgctagctga ttgagctgaa aggggactcc ttcgggagtc ccttttttgt    2520
attctggctc ccctctttga ggggagccaa gaaactagct ggcaaacagg cgcgaagctt    2580
ggatttcggc gtcagcgtac acggtggagg cttgcgtcag cgagcgttgg atggactcga    2640
gtgaggcctc catctgctgt tgggccgcac gccactgttc ggctaccgcg gtgaactggg    2700
tggccgccga acctcgccat gcgtcctgca aggcattgag attggtgtac atgccgccca    2760
cggcctgcct gatttgcgag atcgaagtgg ccactgcggc cgaggatgat tggattcgct    2820
cggaatctac ctgatattgg ggcatcgttg ctccttttct agagggttaa tggtatgtat    2880
ggcggccgat tgccaatacc ggccgttaag gtggaggata tgtcaacaac gaatcgggaa    2940
gacggaaaaa caactattgt ggtcctagct tcggagccgt cctattcggc cttcgggaat    3000
atggtccgaa aatggcttgt ttgcgccatt tgcgcccttg ctgcagtagc gatgaacgca    3060
atgtggataa ctgcaaatgc ctatggggat aactcgagcg acagctctga cagctccagc    3120
agcagcaccg acagcggcgt gaccatcacc gagaacatca cggatacgga aaatctcctg    3180
ggctcccatg cggccgaagt cacggatgcc atcgccaaaa ccgagaagga aaccggtgta    3240
cacgtgcatc tgctgtatct ttccagtttc aatagtcaac agaaaccggg agactgggcg    3300
gcaaccgtga tggagtccat gaatcccaag ccgaacacag tgatgcttgc cgtggcctcg    3360
aatgacggca acctggtggt cgtcgtgtcc aagaactccg ataagtggct tctcgataac    3420
aaaaccgtcg ataagctatc cgaagccgca cagcagccgt tactggaaaa cccgccgagc    3480
tggtctggcg cggcaacggc aatgatggat caaatcgtga aatccaaaaa agcctccacc    3540
tcatcgtcca cggtgatcgt aggcataatc atcatgggtg tggtattggt ggcgctggtc    3600
atcatcatcg tggtcatggt ggtgattcat cggcgcaagg agatcaagaa ggattccaag    3660
gccgaactcc aagatgacat tcaggaaacg cccagaagag cgcgacactc taggaagcat    3720
gagtaagcct attgaagcat cgattgttgt tgtcgacgac gagccgtcca tccgagaact    3780
gctggtcgct tccctgcact tcgccggatt cgaggtaaac accgccgctt ccggttccga    3840
agccattgag gttatcgaaa aagtgcagcc tgacctcatc gtgttggacg tcatgctgcc    3900
tgacatcgat ggattcaccg tcacccgtcg catccgccag gaaggcatta acgcccctgt    3960
gctgtttctc accgctcgtg acgacaccca agacaagatc atgggcctga ccgtcggcgg    4020
tgacgattac gtcaccaagc cgttcagcct cgaggaagtc gtggctcgca tccgcgccat    4080
tctgcgccgt acccgcgaac aggtggaaga cgatccgatt attcgcgtcg ccgacttgga    4140
aatcaacgag gactcccacg acgtgacccg tgcagggcag ccggttgacc tgagccctac    4200
cgaatacaag ctgctgcgct acctgatgga caacgagggc cgagtactgt ccaaggcaca    4260
gattctcgac catgtctggc aatacgactg gggcggcgac gcagccatcg tcgaatcgta    4320
catctcctac ctgcgcaaga aagtcgacgg catcgaggtc gacgacggcg aaggcggcaa    4380
gcgcaaggtg actccgctga tcgaaaccaa gcgcggcatc ggatacatga ttcgcgaacc    4440
gaagaactaa tcgcctccat ccataacgta tcgcaatctc atgagtatcc ccgataagca    4500
gtcaggcggc gtaccgccga gcagcacgcc gaacgccgcc ccgaacacga atcccatgcc    4560
tgcaatgtcg ccgttcgccg cccatttcca agagcagcgc gagcgtaaga aaaacatgct    4620
gatgcggcat atcgaccgta tctcgttgag cagcaagctg gtggcctgca ccatcgccgt    4680
gctgctcatc ggcgtgtcgg tgatttcctt ctccatccgc gcgttggtga acaactacat    4740
gctgcagaaa accgacaccc agttaagctc gcaaagccaa ctggtggtca acaatatcga    4800
tctgctgtca aaaaatgact catcggggcc gaactcgtac tttctgcaga ttcaatacac    4860
cgacggaacc aaagacaaag aaggcaatcc tctggtcgtg accccgctga tgccgcagat    4920
gcaggacggt atcgtatcgg tgccgattct gcctacctat ggcgatacca atggcatcac    4980
gctcggtcag gcattcacta cgcaggcggt ggccaagcag atcatcacgg tgcagtccga    5040
cagtgcggac agccagaacg atccggccaa cggaaactcc aattcctctg acaccatcac    5100
caaggtactg gccaacccca ctgccaatgc caaccatgcc gccatcgtca cggcgagggc    5160
accatggcgt attctgccgg tgaccttcca gcaaaacggc aaggaccgtg ccgtggtgta    5220
catcggcttg tcgctggccg accaaatcga caccgtcaac acactcaccc gatactgcat    5280
tgtggtcggc atcgccgtgg tgctgctcgg cggctccctg tccacgctga tcatccagca    5340
cacgatgacg ccgctgaagc gcatcgagaa gaccgccgcg aaaattgcag ccggcgacct    5400
gagccaacgt attccttccg cgccggaaaa caccgaggtc ggctctctgg ccgcctcgct    5460
gaattccatg ctcacccgaa tagaatccag tttccatgag caggaggaga ccaccgacaa    5520
gatgaaacgg ttcgtctccg acgccagcca tgagctgcgc accccgttgg ccgccatcca    5580
tggctatgcg gagctgtata agatgcagcg cgatatgcct ggtgccttgg agcgtgcgga    5640
cgagtccatc gaacatatcg aacggtccag ccagcgcatg actgttcttg ttgaggatct    5700
gctgtctttg gcccgtctcg atgaggggcg cggcatcgat atgaccggca cggtgaaact    5760
ctcgtcgctg gtcaccgacg ccgtcgacga tttgcatgcg ctcgacccgg accgtgccgt    5820
tcgccgcatg cagatttccc tcgaaccggc gcgcgatttg aaccatcccg ccgaattcag    5880
ccttgccgaa ggcgattggc ctgaggtcgt actgcccggt gatgcctctc gactgcgcca    5940
ggtggtgacc aacatcgtgg gcaacatcca ccgctacacg cctgccgatt cgcccgctga    6000
agccgcgctc ggtgtgatgc cggccgccat cgatccaaga cagctcgccc gcatgcccgc    6060
cagcgacgcg tcaatgcggc ggttcatcga cgctgccgaa gtaggtgcct cgatgcagac    6120
cggctatcga tatgccgtat tgcgtttcgt ggaccatggc cccggcgtgc cgcctgaatc    6180
gcgctcgaag attttcgaac gcttctacac cgcggaccca tcccgtgccc gcgaaaaggg    6240
cggtactggt ttgggcatgg ccatcgcgca atccgtggtc aaagcacatc acggctttat    6300
ctgcgccacc ggcaccgatg ggggaggcct gaccttcacc gtggtgctgc cgattgagca    6360
gatcgccgct cctgagccca agcagtccac cggcaaaacc aaggacgcca aacagaagac    6420
ttcttggttc agctctgagc gtaagactca ggcgactcag cccaaagcgt gaggtcaagc    6480
cctgtgaggt aaactgtacc ttcggtttac tatttccatt gaggattaag gaaggttcgc    6540
aatgcccacc ggtcgagttc gttggtttga cgcagccaag ggttatggct tcatcaccag    6600
tgaggaaggc aaggacgtgt tcctgccggc tcaggcccta cccactggcg tcaccacgtt    6660
gcgcaagggg gccaaggtgg agtattccgt ggtggacggc cgtcgtgggc cgcaggccat    6720
ggatgttcgc ctgatcgcct ccgctcccag cttggtcaag gccacccgcc cgaaggcgga    6780
tgacatggcc gccatctgcg aggacctcat caagatgctt gatgcggccg gcaatacgtt    6840
gcgccgtcac cgttacccat ctgctgccga cagcaaaaag ctggccacgt tgctgcgtgc    6900
ggtggcggat caattcgatg tacaggactg atctgatcta tgactgatac caccgaaacc    6960
atcgtgacac cggaccctca cgccatcgcg cgcgccgtgc tgctcgaagt ggccgacgag    7020
agcgatcagg tgggggattt cgttacctca tatgatcttg aggatcacgt cactgacttc    7080
cgcttcgccg cgaatatccg tggctacgaa ggatggcaat ggtcggtgac gctgtatcac    7140
gacgaggaga tcgactcctg gaccgtcaac gaatcctcct tgatctccac tgaggacgcg    7200
ttgatgccgc ccaagtggat tccttggaag gatcgccttg agcccacgga tttggctccc    7260
accgattcga tcggtaccga tccggatgac gagcgcatcg aggaaggcga agtcgaggaa    7320
tcctcgctgc aggatgtcaa cgacgccgtc gagaccttcc gactgacccg ccgtcacgtg    7380
ctgacctcgc tgggccgcgc gcaggctgcc aagcgctggt atgaaggtcc gcgaggcccc    7440
aaagcgttga gcaccaaaac cgccgaaggc aacctgtgct ccacctgtgg tttcttcgtg    7500
ccgctcgcgg gcgagctcga ccgtatgttc ggcgtgtgcg ccaacaagtg gagtccggat    7560
gacggccgcg tggtttcctt ggaccacggc tgcggcgagc attccgaaat cgaacctccc    7620
gagccaagcc agctgtgggt gcagtccaag cctgctttcg acgatctgca tatcgacgtg    7680
gtggccaacc gtccgcgcaa gcaggagccg gctgcccagg acgaggccga aggcgaaacc    7740
gacaagacag gcgagcctgc cggtgatgat atcgaagcac agaagactgt tgacgggaac    7800
gccgtcgata ctgagcccgc tgaggaggcg gcaggcgacg ggacctcgca atcccagtct    7860
gccggtgatg agtccgttgc acagaacgta tctgattccg ttgtggatgt tgatgcagct    7920
gattccagcg acgattccaa gtctgatgct gacgacgagg ccaccgaaga ggatatcctc    7980
aacaacaccg ttgccgatga tgatgaggat gatgagatgg acgacgaaga ggataacgtt    8040
cgtccttcag acgatgtgac tcctgaactc gaaaccgtca tcgatctcat tgagcagctg    8100
cgccagaaca gggcggacga ggaataaact ccgaattccg cgaaaagtag atggtgatgg    8160
ggttgcagga ataaagaatt cctccctgca agcccatcac cgaggcgtgc gttagcactc    8220
catgccgatt ttggtgaatc agtgcaccac ggtcaccgtg cattcggcga agttcacgat    8280
ctggcgggac accgatccca ggaagtgcgc gtccagcccg gacaggccac gcgagccgac    8340
caccagatgg ctggcgtacc gcgaggccgc gatcagacct ttggatgcgg gaatatggaa    8400
ggcgtttgtg ctgaccttga cgccatcggg aatccgggcc ttggccatca gctcagagag    8460
aatctcctcg gcgcggcgct gaccgacctt caccggtgcc acggcgttct catagcccgg    8520
aataacgccc aaatccttga gctgccagca gaacatcaca tgcagcggcg cgtcgtgcag    8580
tcgtgcttct tccagtgcga aatcgaacgc acggcgggaa gtctcggaac catccacacc    8640
aaccaccacc gggcggcgag cctcctcaac caccggctga ggctgcgtgt agtgaacggg    8700
cttgtctccc ggagtcaggg cgttggcaat ggcctcggtc acggtctcat cctcgctgcc    8760
ggcgatgcgc accacggtca ccggcacttc ggcggcctcg gccagcgaag cggacaggga    8820
ccccatgaac cagcgggcca tacggctcag cgagcggcgg ccgaccacga tctgctgcga    8880
atcatggccg atctgcagca gggccgaagt accggaggcc ttcaccgagg tgagcttcag    8940
attcgccgga tcgaagtcga tgcctgcagc ggccttgtcg acccacacac gcagctcgtt    9000
ggcaatatcg tggcggacct tggcccaggc ctcgtcgctg tccggttcgg accccatatc    9060
ccaggaatgc gtccagccaa acacggcgtt gacgctctga ccggttaacg aggcctcctc    9120
aagcgcccac ttcagcgcgg caaaggattc atcggaacca tccacaccga caacgatgtc    9180
gggcttggtt gcagcttcac tcatttcgag cctccttgta atcgactacg ggtgaatcta    9240
gaaccagcat atcgttttct tctcctctca cggcgcaatt cgtggaatcc gatgaataaa    9300
cgtcatcgtg aatcggtaga gtaagacgga atgtcaattg aggaaggaca agcatgttcg   9360
aacggtttac cgaccgtgca cggcgcgtga tcgtgttggc gcaggaagag gcgagggccc   9420
ttcagcacaa ctacatcggc accgaacacc tgctgctcgg cctgatccgc gaaggtgagg   9480
gtgtagccgc caaggcactc gcctcgaagg gcgtggagct ggatgccacc cgcaagcagg   9540
ttgaagaaat gatcggcaag ggcaacgcgg ctccgaacgg gcacatcccc tttactccgc   9600
acgccaagca ggtgttggag ttttcgctgc gtgaagccct gcagctgggc cacagctaca   9660
tcggcaccga gcacatcctg ctcggcctga ttcgcgaagg cgaaggcgtg ggcacccagg   9720
tgctcatcaa gatggacgtc gatctgggcg agttgcgtag cgcgaccatc gatatgattc   9780
gcggcaactc cggcaccggc accggtgacg gcaagggcga cttggccaac gccggcggcg   9840
tgacggacaa gcagaacaag tccggttccg ccatcctcga tcagttcggc cgcaacctga   9900
ccgccgaagc cgctgaaggc aagctggacc cggtcatcgg ccgtaccaac gagattgagc   9960
gcgttatggt cgtgctttcc cgccgcacca agaacaaccc ggtgctgatc ggcgagcccg  10020
gcgtgggcaa gaccgctgtg gtcgaaggct tggcccagaa gatccaagcc ggcgacgtgc  10080
cggaaaccct gaagggcaag caggtctact cgctggacct cggttccatg gtggccggct  10140
cccgctaccg tggtgatttc gaggagcgcc tgaagaaggt gctgaaggaa atcaagactc  10200
gtggcgacat cgtgctgttc atcgacgaga ttcacaccat cgtgggcgcc ggctcggctg  10260
acggcgcgct gggtgcctcc gacatgttga agccgatgct ggcccgtggc gagctccaga  10320
ccattggtgc caccaccacc gacgagtacc gcaagtacat cgagaaggac gcggctctgg  10380
aacgccgttt ccagccgatt caggtgcacg agccgaccat cgccgagacc atcgagatcc  10440
tgaagggcct gcgttcccgt tacgagaacc accaccacgt gaccatcacc gatggcgcgc  10500
tgcagtctgc cgcagagctg tccagccggt acatccagga ccgtaacctg cctgacaagg  10560
ccatcgacct gatcgatgag gccggtgcac gcctgcgcat caagcgcctg accgccccgc  10620
ctgagctcaa ggaactcgac gagaagatcg ccaagatcgc cgccgacaag gacgaggcca  10680
tcaagggcca ggacttcgag aaggccgccg aactgcgcga caagcaggag aagctggaag  10740
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tggacgagga cgtgatcgcc gaggtcatca gctccaccac cggtatcccg gtgttcaagc  10860
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