含有瑞卡丁素的苔藓提取物及其制备方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种含有瑞卡丁素的苔藓提取物及其制备方法，以及其在预防植物真菌感染中的应用。
背景技术
植物在长期的进化过程中产生的次生代谢产物具有拮抗外界微生物侵袭的作用，利用这一特性可以从植物中寻找抗菌杀虫等活性的化合物，并应用于植物病害的预防，这类从植物中获得的有效成分称为植物源抗菌杀虫剂，或植物源农药。与化学合成农药相比，植物源杀菌剂有效成分为天然物质具有选择性高、低毒、易降解、病虫不易产生抗性等优点。植物源农药所用植物可以种植，开发费用也较低。植物源农药是新型高效、无残留、无公害的所谓的“绿色农药”。
随着人类对环境的关注度越来越高，发展和应用植物源农药成为创新农药的重要途径。而且随着公众对“绿色食品”、“无公害食品”的要求迫切程度的增加，开发高效低毒植物源农药成为一种趋势，植物源农药的开发对保护环境、保障健康、实现现代农业的可持续发展都具有重要的意义，引起了农药研究专家的高度重视。
植物是生物活性化合物的天然宝库，植物次生代谢产物种类繁多，结构多样，为植物源农药开发提供了宝贵的物质基础。成功的例子有很多，如利用银杏外种皮提取物抗菌杀虫作用特点开发的拟天然银杏毒素化合物作为杀虫、杀菌剂可以有效防治苹果轮纹烂果病、干腐病、枝腐病，蔬菜霜霉病、灰霉病，小麦白粉病、纹枯病和菜蚜等，其它植物如苦楝中的苦楝素、苦参中的苦参碱、除虫菊中的除虫菊酯、龙胆草中的龙胆苦苷等等在农业病害防治中都有较广泛的使用。
苔藓植物特殊生物学特性如不生虫、不为其它动物吃食、不长病毒等与含有的特殊结构的化合物密切相关，对多种真菌具有明显的抑制作用，因此可以探讨其作为植物源农药在植物病害防治中的应用。
【发明内容】
针对上述现有技术，本发明对苔藓进行了一系列的研究，并对其中一类提取物进行了成分鉴定，确定为瑞卡丁素，并发明该提取物做成的制剂能够有效防治葡萄腐烂、预防植物真菌感染，在植物病害防治中具有重要的潜在应用价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种含有瑞卡丁素的苔藓提取物，是以钝鳞紫背苔为原料，通过以下制备方法得到的：
1)将洗净并自然阴干的钝鳞紫背苔粉碎，用95％乙醇回流提取1～3次，合并乙醇提取液，浓缩至相对密度为1.05～1.25(热测)，得乙醇浸膏；
2)将乙醇浸膏混悬水中，用乙醚萃取2～5次，合并萃取液，浓缩至相对密度为1.1～1.3；
3)向上述浓缩液中加入60％乙醇，全部溶解后，用60％乙醇预先装好的MCI柱层析，60％乙醇洗脱，TLC检测，瑞卡丁素作对照，洗脱至无瑞卡丁素为止，合并洗脱液，蒸干，得粉末状固体，即为含有瑞卡丁素的苔藓提取物，其中，瑞卡丁素的含量在5～95％之间。
所述的含瑞卡丁素的苔藓提取物的制备方法，步骤如下：
1)将洗净并自然阴干的钝鳞紫背苔粉碎，用95％乙醇回流提取1～3次，合并乙醇提取液，浓缩至相对密度为1.05～1.25(热测)，得乙醇浸膏(收率5～15％)；
2)将乙醇浸膏混悬水中，用乙醚萃取2～5次，合并萃取液，浓缩至相对密度为1.1～1.3；
3)向上述浓缩液中加入60％乙醇，全部溶解后，用60％乙醇预先装好的MCI柱层析，60％乙醇洗脱，TLC检测，瑞卡丁素作对照，洗脱至无瑞卡丁素为止，合并洗脱液，蒸干，得粉末状固体，即为含有瑞卡丁素的苔藓提取物。
所述步骤1)中，乙醇回流提取优选3次，提取时间分别为2小时，1小时，1小时。
所述的含瑞卡丁素的苔藓提取物在预防水果腐烂中的应用。
所述的含瑞卡丁素的苔藓提取物在预防植物真菌感染中的应用。
一种以含瑞卡丁素的苔藓提取物为有效成分的喷雾剂，每1L喷雾剂中，含有以下份量的组分：瑞卡丁素的苔藓提取物，1克；吐温80，10ml；聚乙二醇，40ml；95％乙醇，60ml；余量为水。
所述喷雾剂的制备方法如下(以制备1L为例)：将1克含瑞卡丁素的苔藓提取物与10ml吐温80混合，研钵中研匀，加40ml聚乙二醇和60ml95％的乙醇，温热溶解，过滤，然后加水约900ml至规定量，灌封至1000ml棕色玻璃瓶中。使用前，用蒸馏水10倍量稀释后，灌封于喷雾瓶中即可。
本发明的发明人对钝鳞紫背苔所含抗真菌成分利用溶剂提取，提取物进行硅胶柱层析，分离得到三个单体化合物(化合物I，II，III)，生物自显影显示其最低抑菌浓度为(白色念珠菌)：化合物I地最低检出浓度为：1.25μg，化合物II的最低检出浓度为：0.31μg，化合物III的最低检出浓度为：1.25μg。表明化合物II抑菌活性最强。经1HNMR，13CNMR测定和X-ray单晶衍射分析，确定化合物II的结构为瑞卡丁素(Riccardin D)，为首次从钝鳞紫背苔中分离得到的具有抗真菌活性的双联苄化合物。抗真菌活性试验表明瑞卡丁素对多种真菌具有抑制活性，最小抑制浓度MIC在6～64μg/ml，其抗真菌活性与抑制真菌菌丝生长密切相关。依据此试验结果，发明人制备了抗真菌喷雾剂，并制定了含量测定方法，制剂中瑞卡丁素含量不少于0.5mg/ml。
本发明通过对苔藓提取物的研究，首次发现含瑞卡丁素的抗真菌喷雾剂能有效防止水果(葡萄)霉变，预防植物霉菌感染，预示其是一类结构类型新、有潜在应用前景的植物源农药。
【附图说明】
图1为瑞卡丁素的质谱图。
图2(1)为瑞卡丁素的X-ray衍射图。
图2(2)为瑞卡丁素的化学结构示意图。
图3为瑞卡丁素对亮白曲霉孢子萌发和菌丝形成的抑制作用示意图(200倍)。
图4为葡萄防腐实验结果示意图；图中，1：未感染；2、3：高低药物浓度组；4：未加药组。
图5为不同浓度瑞卡丁素预防葡萄腐烂结果曲线示意图。
图6为葡萄防腐实验结果；其中，1：未感染，2，3：高低药物浓度组，4：未加药组。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1：钝鳞紫背苔中瑞卡丁素的提取与分离
将洗净自然阴干的钝鳞紫背苔(1.95kg)粉碎，用乙醚(5L)回流提取3次，分别为2小时，1小时，1小时，合并乙醚浸提液，浓缩得乙醚浸膏(28.6g)。乙醚浸膏用硅胶柱层析(200-300目，6×15cm)，石油醚-丙酮系统不同比例梯度洗脱，TLC检测，合并相同的馏分，得10个组分。组分4，5，6经进一步凝胶Sephadex LH-20柱层析，甲醇/水(50/50)纯化得到化合物I(30mg)，II(200mg)，III(17mg)。
可以看到，化合物II的含量高，活性强，对其进行结构确定：化合物II为无色、无味块状结晶，mp：194.8-195.8℃、HREI-MS：[M]+424.1685(图1)，计算值424.1675，推导出分子式为C28H24O4。该化合物不溶于水，可溶于乙醇，结构中含有酚羟基，具有酚性化合物的特征，易溶解于碱性溶液，TLC(石油醚∶丙酮＝6∶4)Rf＝0.52，1％三氯化铁溶液-2％铁氰化钾溶液显蓝色。
该化合物碳谱(13C NMR)显示有28个碳原子，δ110-δ160有24个，δ36-δ39有4个。1HNMR可知化合物中有13个芳香氢信号(如表1所示)，4个脂肪氢信号。初步确定为一种苔藓植物中所特有的双联苄类化合物。经过X-射线单晶衍射技术确定了化合物的立体结构(如图2(1)所示)，经查阅文献，证明该化合物的结构为瑞卡丁素(Riccardin D)(图2(2)所示)。
表1.瑞卡丁素的核磁共振碳谱和氢谱数据表
实施例2：含有瑞卡丁素的苔藓提取物的制备：
将洗净自然阴干的钝鳞紫背苔粉碎，用95％乙醇回流提取3次，分别为2小时，1小时，1小时，合并乙醇提取液，浓缩得乙醇浸膏。乙醇浸膏混悬水中，用乙醚萃取5次，萃取液合并，浓缩。浓缩液加适量60％乙醇溶解，用60％乙醇预先装好的MCI柱层析，60％乙醇洗脱，TLC检测，瑞卡丁素作对照，洗脱至无瑞卡丁素为止，合并，蒸干得含有瑞卡丁素的总提取物(瑞卡丁素含量5～95％)。
实施例3：含有瑞卡丁素的苔藓提取物的制备：
将洗净自然阴干的钝鳞紫背苔粉碎，用95％乙醇回流提取3次，提取时间依次为2小时，1小时，1小时，合并乙醇提取液，浓缩至相对密度1.05(相对于水)，得乙醇浸膏。乙醇浸膏混悬水中，用乙醚萃取3次，萃取液合并，浓缩至相对密度为1.1。浓缩液加60％乙醇溶解，用60％乙醇预先装好的MCI柱层析，60％乙醇洗脱，TLC检测，瑞卡丁素作对照，洗脱至无瑞卡丁素为止，合并，蒸干得含有瑞卡丁素的总提取物。
实施例4：含有瑞卡丁素的苔藓提取物的制备：
将洗净自然阴干的钝鳞紫背苔粉碎，用95％乙醇回流提取2次，提取时间依次为2小时，1小时，合并乙醇提取液，浓缩至相对密度1.25，得乙醇浸膏。乙醇浸膏混悬水中，用乙醚萃取3次，萃取液合并，浓缩至相对密度为1.3。浓缩液加60％乙醇溶解，用60％乙醇预先装好的MCI柱层析，60％乙醇洗脱，TLC检测，瑞卡丁素作对照，洗脱至无瑞卡丁素为止，合并，蒸干得含有瑞卡丁素的总提取物。
实施例5：含有瑞卡丁素的苔藓提取物的制备：
将洗净自然阴干的钝鳞紫背苔粉碎，用95％乙醇回流提取1次，提取时间依次为2小时，将乙醇提取液浓缩至相对密度1.15，得乙醇浸膏。乙醇浸膏混悬水中，用乙醚萃取2次，萃取液合并，浓缩至相对密度为1.2。浓缩液加60％乙醇溶解，用60％乙醇预先装好的MCI柱层析，60％乙醇洗脱，TLC检测，瑞卡丁素作对照，洗脱至无瑞卡丁素为止，合并，蒸干得含有瑞卡丁素的总提取物。
实施例6：含有瑞卡丁素的喷雾剂的制备
喷雾剂处方：
瑞卡丁素提取物 1.0g
吐温80 10ml
聚乙二醇(分子量400) 40ml
乙醇(95％) 60ml
蒸馏水加至 1000ml
制备方法：将瑞卡丁素提取物与吐温80混合，研钵中研匀，加聚乙二醇和乙醇温热溶解，过滤，然后加水约900ml至规定量，灌封至1000ml棕色玻璃瓶中。使用前取药液用蒸馏水10倍量稀释后，灌封于喷雾瓶中即可。
含量测定：分别取瑞卡丁喷雾剂，瑞卡丁素对照品溶液各20μL，分别点样于同一薄层板上，以石油醚与丙酮(6∶4)的混合溶剂为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下观察。将薄层板置于扫描仪中254nm处扫描图像。扫描为256级灰度图像，图像分辨率为600DPI，必要时作一些滤波处理。根据斑点面积，以瑞卡丁素为参比，按照标准曲线，计算瑞卡丁素喷雾剂中瑞卡丁素的含量。
结果：三批瑞卡丁素含量测定结果分别为：0，68mg/ml，0.64mg/ml，0.67mg/ml。
含量限度：初步确定瑞卡丁素喷雾剂含瑞卡丁素为每毫升不少于0.5mg。
通过上述实验，确定了钝鳞紫背苔中主要含有的双联苄类化合物为抗真菌有效化合物，其中含量最高的成分为瑞卡丁素(Riccardin D)，并通过质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、X-ray单晶衍射方法确定了瑞卡丁素的结构。该化合物为双联苄类化合物。
试验1：抗真菌活性实验
植物致病菌抑制实验：按美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)推荐的M38-A方案，采用微量稀释法测定实验菌株对瑞卡丁素的敏感性。真菌在28℃培养7d后，向菌落中滴加0.85％的无菌盐水5ml，用无菌移液管尖端轻轻探划受试菌落，制备菌悬液。将菌悬液转移入无菌离心管中，漩涡震荡15s，然后用无菌玻璃网过滤除去菌丝碎片。以血球计数板计数孢子浓度。取上述菌液加到含有不同浓度的瑞卡丁素稀释液的微孔板中，每孔100μl，使每孔中菌悬液终浓度约为1-5×104cfu/ml。微孔板置30℃孵育24h，然后判读MIC结果，以无可见生长的最低药物浓度为MIC值。
结果表明，瑞卡丁素对多数真菌表现出较好的抑制作用，结果见表2。最小抑制浓度在8～64μg/ml，个别真菌无效，表明该化合物在植物病虫害防治中将具有潜在的应用。
表2瑞卡丁素对不同真菌的抑制实验结果
MICr(minimal inhibitory concentration range)：最小抑菌浓度范围；
MICg(minimal inhibitory concentration geometric mean)：最小抑菌几何平均值。
将马铃薯葡萄糖培养基加入琼脂后，溶解均匀，在高压灭菌釜中，用0.1MPa压力灭菌20min，并冷却至60℃左右，用吸管准确量取20ml该培养基，加入水平放置的培养皿内，凝固后并使培养皿中水份干燥透，取150μl的孢子悬液在平板上均匀涂布，涂布后以平板无可见水滴为准，此时的平板立刻进行抑菌试验。将4只无菌牛津杯均匀地放置于培养皿内，吸取不同浓度的瑞卡丁素250μl加入到牛津杯中。将平皿放置于30℃培养24h，拍照并测量抑菌圈直径，计算其抑菌效果列于表3中。
表3不同浓度的瑞卡丁素的抑菌圈直径(cm)
抑菌圈直径(cm) 对照 0 64μg/ml瑞卡丁素 0.87±0.06 128μg/ml瑞卡丁素 1.13±0.15 256μg/ml瑞卡丁素 1.63±0.06
试验2：瑞卡丁素对真菌菌丝的抑制
用PDA固体平板复活冻存的亮白曲霉，28℃培养，待长出孢子后，挑取少许孢子溶于RPMI1640培养基中，将孢子浓度稀释倒104个/ml。将孢子悬液加入到96孔板中，每孔100μl，采用药物梯度稀释法使每孔中瑞卡丁素的浓度依次为128、64、32、16、8、0(μg/ml)，每组三个重复。30℃培养箱中静置培养，于15小时和40小时后显微镜下观察
结果：由图3可以看出，药物处理后，15小时后，小于16μg/ml的瑞卡丁素对亮白曲霉的孢子萌发无抑制作用，32μg/ml的瑞卡丁素对菌丝的伸长有显著抑制作用，64μg/ml的瑞卡丁素可以抑制孢子的萌发。40小时后，小于32μg/ml的瑞卡丁素无法抑制菌丝的伸长，64μg/ml的瑞卡丁素仍然可以抑制孢子的萌发。
结论：亮白曲霉的菌丝随药物浓度的增加而明显变短、变少，在32μg/ml作用效果明显，64μg/ml时已能够彻底抑制菌丝生长而发挥杀菌作用。为将来利用瑞卡丁素抑制亮曲霉菌提供了那浓度设计依据。
试验3：预防葡萄腐烂实验
分别用3个无菌针蘸取孢子悬液，在每个果实上均匀扎三个孔，深度约为2mm。接种完毕后，室温下培养3h。
将接种好孢子的葡萄平均分为三组，分别用无菌水、88μg/ml瑞卡丁素和176μg/ml瑞卡丁素的喷雾剂稀释液浸泡10min。将处理好的葡萄放入盒子里，转移入恒温水浴培养箱中，28℃培养每隔24h计数一次腐烂葡萄的个数。观察一周，结果见图4。
实验结果：见表4，以时间为横坐标，腐烂百分率为纵坐标作图，如图5所示。由图可以看出，瑞卡丁素对预防亮曲霉菌导致的水果腐烂具有明显的保护作用。
表4不同时间不同处理组中腐烂的葡萄个数占总个数的百分比(％)
试验4：预防植物真菌感染
取培养一周的尖镰孢菌，加入20ml无菌水，用接种环充分刮取表面菌丝，将菌液移入50ml无菌离心管中，4500r/min离心10分钟，弃上清，重复2次，收集沉淀，血球计数板计数，调整无性孢子的悬浮液浓度到106个分生孢子/ml无菌水。选取组织培养条件下生长6周的植株，在茎的基部接种200μl的孢子悬浮液，同时在植株培养基喷洒瑞卡丁素喷雾剂(0.068mg/ml)作为药物预防组，不喷洒药物的植株作为感染组。
结果：如图6所示尖镰孢菌侵染植株5天后观察，喷洒瑞卡丁素喷雾剂的植株未出现明显病变；未施药组约一半植株叶片逐渐枯萎，部分茎基部及根部受害后变褐腐烂。
结论：枯萎病是一类幼苗期从根部侵染、维管束内寄生的全株性病害，由半知菌亚门、瘤座孢目、镰刀菌属尖镰孢菌侵染引起。在实验中，我们观察到供试植株尖镰孢菌感染后植株枯萎，植株根部变褐甚至腐烂，而喷洒瑞卡丁素喷雾剂可以有效预防植株致病真菌感染。