人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明属于生物技术与医学领域。具体地说，本发明涉及一种新的人附睾表达精子结合蛋白HEL-190及其编码基因与应用。
背景技术
本世纪人类的发展面临着两个严峻的问题：一方面，全球人口在急速膨胀，预计在2050年将达到90亿；另一方面，据世界卫生组织调查，大约15％的夫妇存在着不育问题，发达国家不育症的发病率在最近10年飚升，欧洲发达国家可高达30％，其中男性因素约占一半。世界卫生组织预测，随着环境污染和性传播疾病等致病因素的增加，本世纪，不育症将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社会和医学界的足够重视，因此有关男性生殖健康的研究进展缓慢，明显落后于其它学科。缺少分子生物学层面诊断与治疗不育症的有效方法。由于精子发育障碍不能自然受精，需要医生通过做试管婴儿获取后代。利用此种技术获取后代，不仅耗费了宝贵的时间与资金，而且存在很多影响健康的潜在因素，失去了正常生育过程中精卵天然结合、优势选择遗传后代的机会。给家庭与社会带来了沉重的精神和经济负担。
全世界人口的急剧增长造成了资源耗竭和环境恶化，成为人类健康与生存的严重威胁。当前世界人口已超过60亿，据专家估计，中国资源环境能支撑的最大人口容量为15-16亿。目前可供人类选择的避孕措施还很有限，离“高效、安全、可逆”的标准还相差较远。发展安全有效、先进实用的避孕节育新技术、新产品，以满足不同人群、不同层次的避孕用药的个性化要求是近年来国内外避孕节育技术发展的总趋势。
附睾是精子成熟的重要器官，睾丸产生的精子需要通过与附睾管腔微环境相互作用才能获得运动、受精、防御和维持正常胚胎发育以及防御等生物学功能。附睾内大约有200余种分泌蛋白与精子相互作用，参与精子成熟过程，但是人们对这些蛋白的功能知之甚少。与精子成熟相关的附睾蛋白的研究将有助于推动男性生殖医学的研究进展，为男性不育症的诊断和治疗以及开发新型避孕药物提供侯选分子靶标，同时有可能对附睾环节的男性避孕带来新的思路和突破。
【发明内容】
本发明的第一个目的是提供一种新的人附睾表达精子结合蛋白HEL-190。
一种人附睾表达精子结合蛋白HEL-190，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质或多肽。
本发明的人附睾分泌蛋白命名为：HEL-190，由218个氨基酸残基组成。HEL-190蛋白存在有1个Amidation位点，1个N-十四烷酰基化位点和8个磷酸化位点，包括5个酪蛋白激酶II磷酸化位点以及3个蛋白激酶C磷酸化位点。另外，该蛋白还有1个NADPHoxidase V功能域，1个EF-hand calcium-binding功能域。
本发明的第二个目的是提供编码人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190的基因。它是下列核苷酸序列之一：
序列表中序列1的DNA序列，GenBank注册号为：EU668337；
编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸；
与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQID No.1，全长cDNA序列为4732bp，定位于人12号染色体上，编码218个氨基酸，编码蛋白为HEL-190，含有信号肽，其开放阅读框为657bp，是一个完整的读码框。
本发明的第三方面，提供了采用基因工程技术制备具有人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞。
本发明的第四方面，提供了与上述人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190特异性结合的抗体，以及由此开发的用于附睾功能异常所致的不育症的辅助诊断。
本发明的第五方面，提供了检测样本中是否存在人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190的方法，它包括：将待测样品与分泌蛋白的特异性抗体在一定条件下共同作用，观察是否形成抗原抗体复合物，有抗原抗体复合物形成就提示样品中存在分泌蛋白。
本发明的第六方面，提供了本发明蛋白和其编码序列的用途。例如本发明蛋白可被作为诊断不育症地分子靶点，或作为有效药物成分用于治疗不育症，或作为开发新型避孕药物的靶分子，或被用于筛选促进人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190活性的激动剂，或被用于筛选抑制人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190活性的拮抗剂，或被用于肽指纹图谱鉴定。根据人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190的编码序列或其片段，可设计引物或探针用于PCR或核酸杂交，或者用于制备基因芯片。本发明蛋白还可用于药物组合物，以此作为有效活性成分，用于生产一种对抗病原微生物感染以及肿瘤等疾病的药物。
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含本发明所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞，以及药学上可接受的载体。
本发明的蛋白能够在附睾内特异性表达，定位于精子头后区域，因此可能与运动有关。因为它是一种天然的蛋白多肽，可以预见可能具有较少的副作用，本发明的其他优点可从以下的详细描述获知。
【附图说明】
图1.HEL-190蛋白在人精子上的免疫荧光定位
红色荧光显示精子核；绿色荧光显示HEL-190蛋白在精子上的定位；
A组：阳性对照，A3显示HEL-75蛋白结合于整个精子(文章已发表)；
B组：阴性对照。
C组：HEL-190蛋白定位，C3.显示HEL-190蛋白结合在精子头后区域。
比例尺：5mm。
图2HEL-190基因组织表达图谱
1附睾头2附睾体3附睾尾4睾丸5心6肝7脾8肾9胃10阴性对照
图3.HEL-190蛋白在附睾液表达的western blot结果
M：Marker；1：阳性对照，HEL-75蛋白；2：阴性对照，小鼠血清；3：HEL-190蛋白
本发明的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)：相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)氨基酸的缺失、插入和取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸；脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了蛋白的片段或衍生物，条件是该片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。
本发明的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，用本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明中，使用本领域技术人员已知的常规方法将包含编码本发明的蛋白的核苷酸序列插入到载体中，这些方法包括但不限于体外重组DNA技术，体内重组技术等。
上述载体可用于转化或转染适当的原核和真核细胞，以使其能够表达所编码的本发明的蛋白，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如昆虫细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体介导等。
本发明的蛋白在细胞内表达，如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种方法分离和纯化表达产物，这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不限于：常规的复性处理、用常规的蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、声波破菌、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种层析技术及这些方法的结合。
本发明还包括对蛋白或其片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
发明人通过研究进一步发现，该蛋白定位于成熟精子头后区域(图1)，RT-PCR结果显示该基因主要在附睾、睾丸、肝、脾、肾、胃多种组织均有特异性表达，但在心脏表达呈阴性(图2)。发明人在大肠杆菌中表达了人HEL-190蛋白，用其免疫小鼠，获得了其多抗血清。发明人用Western blot在附睾体部检测到一条21KD左右条带(图3)。
本发明的药物组合可根据各种需要制成各种剂型，通常可将药物组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬浮液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、溶液载体的固体形式，脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中，本发明的药物组合物可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用，为了提高用药效果，本发明的蛋白也可以与其他药物共同使用。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下面文献中有完整的描述：例如Sambrook《分子克隆实验指南》第二版(1989)；《DNA克隆》第I和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S。J。Higgins编辑。1984)；《蛋白质纯化；原理和实践》第2版(Spring-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)或者，可以按照试剂生产商所提供的说明书进行。
【具体实施方式】
实施例1.采用基因工程技术制备人类附睾表达蛋白HEL-190
基因克隆及序列分析
对本实验室构建的人附睾cDNA文库进行大规模测序筛选，获取表达序列标签(EST)，利用Unigene数据库进行电子克隆，获得人HEL-190全长cDNA。使用Expasy Translate tool(http://us.expasy.orghttp://us.expasy.org)，InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/http://www.ebi.ac.uk/Tools/)和Protein杙roteinblast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等预测HEL-190肽序列及假定功能。SignalP(http://www.cbs.dtu.dkhttp://www.cbs.dtu.dk)，PSORTII和WoLFPSORT(http://psort.nibb.ac.jp)等软件分析预测该蛋白的信号肽及胞内定位。ProfileScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCANhttp://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)预测N端糖基化和磷酸化位点。
对获得的人HEL-190全长cDNA，根据生物信息学预测HEL-190编码区，设计一对特异引物：F01：5’-TTGGTACCGACGACGACGACAAG GAGCTGTCCCCCCGCAG-3’，F02：5’-GCGGCGAATTCGAACAGGCATGAGAGG-3’，，上下游引物两端分别引进限制性内切酶位点KpnI和EcoRI。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以本实验室构建的人附睾cDNA文库为模板，PCR扩增HEL-190基因片段。PCR反应条件：94℃预变性10min，(94℃，40s；55℃，45s；70℃，30s)30个循环，70℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并分离回收目的片段，插入克隆载体pMD-18T中进行测序鉴定。
重组HEL-190蛋白表达及纯化
测序鉴定后HEL-190基因通过KpnI和EcoRI位点克隆至表达载体pET-32b(+)中，使其与融合标签阅读框一致。重组表达载体pET32b(+)-HEL-190转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用菌落PCR筛选阳性克隆，工程菌株在1mM IPTG，32℃条件下诱导4h后，N端带有His-tag的重组蛋白通过“两步镍亲和层析法”对重组HEL-190蛋白进行分离纯化。简单地说，“第一步亲和层析”用于纯化重组Trx-HEL-190融合蛋白。然后融合蛋白用重组肠激酶裂解，释放融合标签。最后，运用“第二步亲和层析”回收重组HEL-190蛋白。纯化后的重组蛋白用Bradford(Bradford 1976)法进行定量，然后用冷冻干燥进行保存。
实施例2.抗HEL-190多克隆抗血清的制备
用重组HEL-190蛋白免疫BALB/C小鼠制备多抗。简单地说，每只老鼠于第1天注射50μg重组蛋白与等量的完全福氏佐剂(CFA)。然后在第15，30和45天注射25μg重组蛋白和等量的不完全福氏佐剂(IFA)加强免疫。第60天从眼球取血，分离血清后用ELASA和western blot分析抗体的效价和特异性。ELISA分析表明抗体效价达到1∶10000。Westernblot显示对重组蛋白和从人附睾液中抽取的天然HEL-190都具有良好的特异性。
实施例3.人HEL-190mRNA组织表达谱研究
为了确定HEL-190的表达模式，采用半定量RT-PCR分析HEL-190基因在人附睾头、体、尾，睾丸，心，肝，脾，肺，肾，胃等组织中的表达差异。用TRIzol(Tiangen，Beijing，China)抽提总RNA，1ug总RNA用20UAMV逆转录酶(Promega)和0.3ugoligodT18(Promega)反转录成cDNA。然后，2ul合成的cDNA利用基因特异引物进行PCR扩增。20ul反应体系含有：2ul 10×PCR buffer(with MgCl2)，2ul dNTP Mix(10mmol/L)，1ul每个引ul(25umol/L)，1ul Taq DNA聚合酶(2.5U/ul)，2ulcDNA模板以及11ulddH2O。PCR反应的程序为：94℃，10min；94℃，1min；54℃(对HEL-190)/49℃(βactin)30s；72℃，1min(35循环)；72℃延伸7min。β-actin的表达作为内参。所有PCR扩增产物用1.5％琼脂糖电泳分析。RT-PCR结果显示该基因主要在附睾、睾丸、肝、脾、肾、胃多种组织均有特异性表达，但在心脏表达呈阴性.
实施例4.人HEL-190蛋白在组织的免疫荧光定位
取人睾丸、附睾组织冰冻切片，进行免疫荧光染色，其中一抗为鼠抗rHEL-190多抗(1∶400)，二抗为FITC-标记羊抗鼠IgG(1∶200)，细胞核用PI染色。染色后所有的切片用80％甘油封片，然后用共聚焦显微镜(Leica TCS SP2AOBS)观察结果。实验同时以小鼠免疫前血清替代一抗作为阴性对照。
实施例5.人附睾蛋白提取物与Western blot
将从人附睾液中提取的总蛋白抽提物20ug，用15％SDS-PAGE分离，然后湿转到PVDF膜上进行western blot。鼠抗人HEL-190多抗为一抗(1∶5000)，二抗为HRP-标记羊抗鼠IgG(1∶500)。辣根过氧化酶的活性用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒分析Western blot显示抗人HEL-190多抗对重组蛋白和从人附睾液中抽取的天然HEL-190都具有良好的特异性。
实施例6.人HEL-190蛋白在精子的免疫荧光定位
收集精子用PBS洗涤后涂布于1％明胶包被的载玻片上，自然晾干，然后用甲醇固定10分钟。含有精子的载玻片用3％BSA在室温下封闭1小时，然后添加鼠抗rhBD32多抗(1∶200)，4℃过夜。免疫前小鼠血清做阴性对照。用PBST(PBS containing 0.1％Tween-20)洗涤三次，加入对应的FITC-标记羊抗鼠IgG二抗(1∶200)。载玻片用PBST洗涤三次，然后用80％甘油封片。用Olympus BX-52显微镜观察，HEL-190蛋白结合在精子头后区。
实施例7.HEL-190重组蛋白的抗菌活性
运用克隆菌落形成单位(CFU)分析抗菌活性。简单地说，过夜培养的E.coli XL-1blue生长到对数期(OD600＝0.4-0.5)后用10mM PBS(pH 7.4)稀释。大约2×106CFU/ml细菌在与12.5～100ug/ml的HEL-190混合，37℃培养。在开始培养后的15，30，60and 120min分别在取样。将样品用10mM PBS(pH 7.4)做系列稀释，每个稀释度取100ul涂布于LB琼脂平板，37℃培养过夜至形成单菌落。统计菌落个数，抗菌活性用细菌存活的百分数表示，公式为：％存活＝(蛋白处理后存活克隆数/未经蛋白处理后存活的克隆数)×100。实验以10mM PBS(pH 7.4)代替蛋白处理细菌作为阴性对照。
实施例8HEL-190与精子运动性以及体外受精的关系研究
利用HEL-190多抗封闭正常人精子，然后进行精子运动性和体外受精分析。实验按照vitro life标准试剂盒提供的方法进行。简单地说，精子先用SpermRinse-30于37℃、5％CO2培养1小时获能。然后按照1∶200加入鼠抗rHEL-190多抗，于37℃、6％CO2培养2小时进行封闭。封闭后的精子分成两部分，一部分直接利用计算机辅助系统分析精子的运动性。另一部分用G-Fert洗涤2次，并调整至终浓度为1.0×107cells/ml。加入100ug精子样品于35mm的培养皿中，然后覆盖石蜡油放入37℃、6％CO2和饱和湿度培养箱内待用。经G-MOPS处理后成熟卵母细胞加入预先准备好的受精滴中，在37℃、6％CO2和饱和湿度培养箱中培养观察受精情况，每日记录胚胎发育情况。以上所有实验同时用免疫前小鼠血清作为阴性对照。
【序列表】
<110>李建远
<120>人类附睾表达精子结合蛋白HEL-190及其编码基因与应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>4732
<212>DNA
<213>人属人种(homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(163)..(819)
<400>1
gcggcagcag cagcggcggt gcggagagct tggactggga gcccaaagct cggctgggca 60
gcgggagagg aggagccgca ggagctgcag ctctgccagc ttgggccgag cctagagaca 120
ccggcctggc tggtccacgc cagccgcaga ccgtggctga gc atg gag ctg tcc 174
Met Glu Leu Ser
1
ccc cgc agt cct ccg gag atg ctg gag gag tcg gat tgc ccg tca ccc 222
Pro Arg Ser Pro Pro Glu Met Leu Glu Glu Ser Asp Cys Pro Ser Pro
5 10 15 20
ctg gag ctg aag tca gcc ccc agc aag aag atg tgg att aag ctt cgg 270
Leu Glu Leu Lys Ser Ala Pro Ser Lys Lys Met Trp Ile Lys Leu Arg
25 30 35
tct ctg ctg cgc tac atg gtg aag cag ttg gag aat ggg gag ata aac 318
Ser Leu Leu Arg Tyr Met Val Lys Gln Leu Glu Asn Gly Glu Ile Asn
40 45 50
att gag gag ctg aag aaa aat ctg gag tac aca gct tct ctg ctg gaa 366
Ile Glu Glu Leu Lys Lys Asn Leu Glu Tyr Thr Ala Ser Leu Leu Glu
55 60 65
gcc gtc tac ata gat gag aca cgg caa atc ttg gac acg gag gac gag 414
Ala Val Tyr Ile Asp Glu Thr Arg Gln Ile Leu Asp Thr Glu Asp Glu
70 75 80
ctg cag gag ctg cgg tca gat gcc gtg cct tcg gag gtg cgg gac tgg 462
Leu Gln Glu Leu Arg Ser Asp Ala Val Pro Ser Glu Val Arg Asp Trp
85 90 95 100
ctg gcc tcc acc ttc acc cag cag gcc cgg gcc aaa ggc cgc cga gca 510
Leu Ala Ser Thr Phe Thr Gln Gln Ala Arg Ala Lys Gly Arg Arg Ala
105 110 115
gag gag aag ccc aag ttc cga agc att gtg cac gct gtg cag gct ggg 558
Glu Glu Lys Pro Lys Phe Arg Ser Ile Val His Ala Val Gln Ala Gly
120 125 130
atc ttc gtg gaa cgg atg ttc cgg aga aca tac acc tct gtg ggc ccc 606
Ile Phe Val Glu Arg Met Phe Arg Arg Thr Tyr Thr Ser Val Gly Pro
135 140 145
act tac tct act gcg gtt ctc aac tgt ctc aag aac ctg gat ctc tgg 654
Thr Tyr Ser Thr Ala Val Leu Asn Cys Leu Lys Asn Leu Asp Leu Trp
150 155 160
tgc ttt gat gtc ttt tcc ttg aac cag gca gca gat gac cat gcc ctg 702
Cys Phe Asp Val Phe Ser Leu Asn Gln Ala Ala Asp Asp His Ala Leu
165 170 175 180
agg acc att gtt ttt gag ttg ctg act cgg cat aac ctc atc agc cgc 750
Arg Thr Ile Val Phe Glu Leu Leu Thr Arg His Asn Leu Ile Ser Arg
185 190 195
ttc aag gtt ggg cag cat cct acc tct acc tcc agg cag gat tct cca 798
Phe Lys Val Gly Gln His Pro Thr Ser Thr Ser Arg Gln Asp Ser Pro
200 205 210
ctc ctc tca tgc ctg ttc taa aagcctccca acaaacagat tccatagatc 849
Leu Leu Ser Cys Leu Phe
215
ccctcactca gtctcaacat cagggaagtc tccccatgcc cacgcccagc ctagcctttc 909
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ctgtcctctg ggagccttga gccttttgaa ggaggcagac ataccctaag ggcgtacaca 2409
gagacagggc ccggattcag agtagctgga cagagctctg gctgctggtg cttttgtgtg 2469
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gcaacccaca tctggctgga agagtcctct ctaggtcatc ttcttcattc ccttacttcc 2589
gagcccttct tcatggtttt ggatgtgggg atggagtggg atgtttggaa ggtaggaggg 2649
aagctttctt tcattttctt tgaaatctcc agggaaataa taataattat agctattctt 2709
tagagagcat ttactaaatg ccttgtactt atctcattaa tttccaggta ggtggtatta 2769
tctttcattc tgcaattaag tatctgaggc acagagaggc atgtgactta cccaaggttg 2829
cacagccagc aggtggtaga ggcaggatat gagccaggtt cacctaacta ggttctgtgc 2889
tctctcccta tgccacactg ccttctaaag aaagttgttg atctcggtcc gtaatcacca 2949
ccattcctgt ggatccttga tatatctcca tttcccctaa ctccccgcag attcccactg 3009
tgtttttgat gagtttcctg gatgccttgg agacaggcta tgggaagtac aagaatcctt 3069
accacaacca gatccacgca gccgatgtta cccagacagt ccattgcttc ttgctccgca 3129
cagggatggt gcactgcctg tcggagattg agctcctggc catcatcttt gctgcagcta 3189
tccatgatta tgagcacacg ggcactacca acagcttcca catccagacc aagtcagaat 3249
gtgccatcgt gtacaatgat cgttcagtgc tggagaatca ccacatcagc tctgttttcc 3309
gattgatgca ggatgatgag atgaacattt tcatcaacct caccaaggat gagtttgtag 3369
aactccgagc cctggtcatt gagatggtgt tggccacaga catgtcctgc catttccagc 3429
aagtgaagac catgaagaca gccttgcaac agctggagag gtggcatctg gtggggtgtg 3489
gctggggcca ggccagaggg aggggtgtgt gaactggggg ggtatacaca agggtagttg 3549
gtgtgccagg tctttacctc gctgtagaga ctccactggc ttcaggtatc agactgcatc 3609
tctatgtgag agagagagag agagagtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 3669
tccttacgtt tactcacagc cttggcagct gatccactgg agagtgcttt gggctgggaa 3729
tctaagatgg gggttctcat cgtagctctg ggacaggctt actctggaat gttggaaaat 3789
tcattcaacc cttctgcccc agttttatta cctctgaaat ggtgaaaatg atacgcctcc 3849
ccccacaaca gcttgcccct agttcctagt ctcatagggc tattgggaga gtcatacgag 3909
gtttaaaaaa atgcatagaa caaatgccat aattacatct aatgttgctt agaagtgagt 3969
gggaatgtat aaatgtgtgt gagagtggac tgtgtgtgtg tgtgtcctga aggtgtgtgt 4029
taatctctgt gtaaggtgtt tatgtgtggg atgcagtgtc acagcgggtc attgttgagg 4089
gtataataat aattattact attctagata atatctactg agcacttatt atgtgctaga 4149
cactctcctg aatacttatt tgttgtttgt cacttaattc tcagaaccac tcgatatgtg 4209
gtagggttgt tatttccatt ttagagttga agaaaatgaa atatggaaat tttaagtaac 4269
ttgctcagtg tcacgcggct aacatgtggt aggtatagac gtgaacccag gccctttgat 4329
tctaagagcc tgggctctca gctactaacc cgtgctgcta cctaaacata tataagtgtg 4389
tgtgtgtctg tgtgtggggt gtgtgtgtag ctttggaggg tgtttgaagt tatgtgaggc 4449
cgggcgtggt ggctcatgcc tataattcca gcactttggg aggccgaggc aggtggatag 4509
cttgaggtca ggaatttgag accagcctgg ccaacacggt gaaacactgt ctctaccaaa 4569
aaaatacaaa aattagctgg gtgtggtggc atgcacgcct gtagtcccag ctattcggga 4629
ggctgaggtg ggagaatcac ttgaacccag gtgacagagg ttgcagtgag ctgagattgt 4689
gccactgcac tccagcccgg gcaacagagt gagaccctgt ctc 4732
<210>2
<211>218
<212>PRT
<213>人属人种(homo sapiens)
<400>2
Met Glu Leu Ser Pro Arg Ser Pro Pro Glu Met Leu Glu Glu Ser Asp
1 5 10 15
Cys Pro Ser Pro Leu Glu Leu Lys Ser Ala Pro Ser Lys Lys Met Trp
20 25 30
Ile Lys Leu Arg Ser Leu Leu Arg Tyr Met Val Lys Gln Leu Glu Asn
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys Asn Leu Glu Tyr Thr Ala
50 55 60
Ser Leu Leu Glu Ala Val Tyr Ile Asp Glu Thr Arg Gln Ile Leu Asp
65 70 75 80
Thr Glu Asp Glu Leu Gln Glu Leu Arg Ser Asp Ala Val Pro Ser Glu
85 90 95
Val Arg Asp Trp Leu Ala Ser Thr Phe Thr Gln Gln Ala Arg Ala Lys
100 105 110
Gly Arg Arg Ala Glu Glu Lys Pro Lys Phe Arg Ser Ile Val His Ala
115 120 125
Val Gln Ala Gly Ile Phe Val Glu Arg Met Phe Arg Arg Thr Tyr Thr
130 135 140
Ser Val Gly Pro Thr Tyr Ser Thr Ala Val Leu Asn Cys Leu Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Leu Trp Cys Phe Asp Val Phe Ser Leu Asn Gln Ala Ala Asp
165 170 175
Asp His Ala Leu Arg Thr Ile Val Phe Glu Leu Leu Thr Arg His Asn
180 185 190
Leu Ile Ser Arg Phe Lys Val Gly Gln His Pro Thr Ser Thr Ser Arg
195 200 205
Gln Asp Ser Pro Leu Leu Ser Cys Leu Phe
210 215