核酸、亲和素和聚合物的纳米组装的复合体、其用途和制备 【发明领域】
本发明涉及新型的纳米组装的复合体(此后也称为纳米复合体或纳米组装体)，并且更具体地涉及核酸、亲和素和聚合物的纳米组装体，涉及其在生物技术领域和纳米医学中的用途以及涉及其制备。
领域状态
亲和素是四聚的糖蛋白，主要熟知其以非常高的亲和力(Kd～10-15M)结合于四个分子的生物素的能力。从实践观点来看，亲和素对生物素的高和多亲和力的性质形成了其在大量生物技术应用中用作分子仪器的基础(亲和素-生物素技术)(Wilchek M和Bayer EA，Analytical Biochemistry.1988，171：1-32；Wilchek M和Bayer EA，Methods Enzymol.1990，184：14-45)。在该特性方面，亲和素可用作分子桥，随后将不同的生物或化学单元稳定地连接在一起，只要这些生物或化学单元共价结合于一个分子的生物素。
亲和素-生物素技术最常用的应用是用于分析目的，更准确地用于检测和定量系统，这通常基于其将抗体、或对分析物(配体/抗原)具有高亲和力的任何其它分子连接于标志物系统(荧光团、能够发出光/颜色的酶、放射性核素等等)的能力；其它应用包括以特异性的化学/生化实体进行的表面官能化，这是一个通常通过使用由亲和素-生物素复合体形成的分子桥来进行的步骤；另一应用是将以肠胃外方式施用的药物或诊断元件靶向于体内特定部位(Goldenberg DM，Sharkey RM，Paganelli G，Barbet J和Chatal JF，J.Clin.Oncol.2006，24：823-834)。
典型亲和素-生物素技术的主要缺陷之一是最大数目即四个生物素可连接于单个亲和素分子，这形成系统的中心核。使中心核能够将更大数目的生物素分子结合于自身的可能性使得该系统的潜力在理论上得以增强。
这种增加的能力可通过将数个亲和素分子连接到一起成为单个单元(本文定义为多亲和素单元)而实现。在这方面，文献描述了获得所述多亲和素核的各种技术方法。通常采用和目前可用的策略是基于以数个亲和素分子包被微球或纳米球(由不同聚合物诸如聚苯乙烯或金属诸如金组成)的表面，或基于亲和素经由共价交联的化学“聚合作用”。
因此，目前可用于形成多亲和素单元的策略或者是基于目标为在亲和素单元之间形成共价键的化学合成工艺，或者是基于导致亲和素分子附着于聚合物或金属核表面的非特异性吸附工艺。然而，所有这些系统具有某些共同的缺点。尤其是，如此获得的多亲和素通常特征为：a)取决于其获得方法，某种程度的多分散性；b)亲和素活性的部分丧失。就实践方面而言，亲和素的失活造成与生物素(因此与任何其它生物素化的配体)结合的能力降低，而多分散性造成产物的性质虽在统计学上是确定的，但因此并不是高度确定的。
借助上述方法获得的多亲和素的另一共同缺点是，它们不能用在某些生物医学场合，因为用于组装它们的材料(如用于化学聚合作用的连接体、或用于非特异性吸附的聚合物或金属中心核)既不是天然来源也通常不是生物相容的，因此可能有毒。因此这些方法获得的多亲和素可能展现与包含它们的元件相关的毒理学风险，而当预想亲和素组装体与人类或动物组织在体内接触时，该风险限制了它们在制药/诊断情况中的适用性。
近来，揭露了亲和素特有的其它性质，即其以高亲和力结合于核酸的能力(Morpurgo M，Radu A，Bayer EA和Wilchek M，Journal of MolecularRecognition.2004，17：558-566)。所述结合源于高亲和力相互作用，这还牵涉蛋白的特定区域但不直接牵涉生物素结合部位。在该相互作用后，亲和素以有序方式自组装到DNA上，产生化学计量确定的附聚物。在附聚物中，核酸被亲和素分子包被，亲和素对核酸碱基对的化学计量比等于18±4。这些复合体在高度稀释([DNA]＝10pM)时和溶液中存在电解质时稳定。
考虑到该相互作用在生理条件下的稳定性，上述组装体可实际上描述为多亲和素，这部分类似于已提及的那些。该组装体是稳定的，仅包括生物和生物可降解来源的元件，并且所述元件中所包含的亲和素结合生物素的能力得以完整地保留。
然而，这些多亲和素系统作为改进典型亲和素-生物素系统的性能的手段的实际益处取决于能够以可重复和多分散性差的确定胶体大小的离散聚集体的形式来获得该多亲和素系统。从宏观观点来看，取决于亲和素-核酸组装体所处的条件，观察到所述亲和素-核酸组装体采取各种形状和几何学。例如，通过在缓冲水环境中混合亲和素和核酸，获得了大尺寸(＞＞1微米)的附聚物，该附聚物是高度多分散的，以及具有不明确的几何学，并且从实践观点确实是不合用的。相反地，在无盐环境中和在浓度和核酸与蛋白的比例的具体条件下，可获得超环面或杆状的纳米微粒结构，其中单个核酸分子被数个亲和素分子围绕。在这一实例中，纳米组装体的多分散性差，并且其尺寸仅取决于所用核酸的类型和长度。然而，已描述于文献(Morpurgo M等人2004，引证文献)的后面这种设置在无盐水溶液中是稳定和可分离的；在电解质存在下它们经历聚集的快速过程，随后再次获得多分散的大聚集体，但实际上不可用于实用目的。
因为亲和素/生物素系统的任何普通分析或生物医学应用包括盐水环境中的生物识别反应，所以上述亲和素和核酸的复合体不具有实际用途，原因是在所需的缓冲条件下它们不能以离散和稳定的实体存在。
任何情况下，聚集是许多小尺寸颗粒的普遍问题，尤其是当它们处于胶体范围时(＜1微米-纳米颗粒)。聚集取决于颗粒表面特性(电荷类型和密度、疏水性、亲水性等等)以及取决于悬浮它们的介质类型(无机溶剂、水溶剂、缓冲剂类型、离子强度、pH等等)；可采用各种技术解决方案来避免或减慢聚集。
如果悬浮介质是水溶液，最常采用的策略是使用亲水聚合物，该亲水聚合物共价结合或吸附于颗粒表面上以便部分或完全地从周围环境隐藏它。从而产生空间位阻和焓增加，这阻止颗粒不可逆地彼此相互作用。例如，亲水聚合物用于保护脂质体纳米颗粒的表面(Cattel L，Ceruti M等人Tumori，2003，89：237-249)，该脂质体纳米颗粒用作将以肠胃外方式施用抗肿瘤药物的载体。
亲水聚合物阻止其所连接的不同表面之间(及因此纳米颗粒之间)的非特异性相互作用的效力与两个参数有关：a)聚合物链长度和b)接枝密度(Jeon SI，Lee JH等人J.Colloidal and Interface Sci.1991，142：149-158；JeonSI和Andrade JD J.Colloidal and Interface Sci.1991，142：159-166；Sofia SJ，Premnath V等人Macromolecules 1998，31：5059-5070)。因此，对于各种系统而言，通过改变上述参数的一个、或另一个或两者，可实现阻止聚集的相同效力。
应注意，各种系统无论是表面还是纳米微粒，均以独特性质(化学、曲率角等等)为特征，因此必须每次校准表面保护的效力以优化效果。如前述的，优化期间考虑各种参数，包括聚合物类型、其长度和连接密度、以及特别是接枝方法(Owens DE和Peppas NA Int.J.Pharm.2006，307：93-102)。因此，以确定的颗粒系统获得的结果不能直接转变为另一个系统的结果，同样地，文献中已经描述的信息不能直接应用于由亲和素和核酸组成的纳米微粒系统。因此，这些系统的表面保护方面首次描述在本发明范围中。本发明一方面是为了获得核酸和亲和素组成的在水/盐水环境中稳定的纳米颗粒。
本发明的另外方面是所述稳定系统能够识别其它生物素化的元件，原因在于其自身具备药理学活性；或者能够识别第三元件(例如受体)；或者能够自身或联合溶液中的其它试剂产生信号(例如荧光、颜色、放射性、光子)。
概述
发明人提供的纳米组装的复合体满足前述目的，因为它们允许克服来自本领域已知技术的已报道缺陷。
尤其是，所获得的纳米组装的复合体从定性和定量组成观点而言是高度确定的，甚至在电解质存在下是稳定的。
第一方面，本发明目的是纳米组装的复合体，其包括通过一个或多个亲和素单元与一个或多个核酸分子之间高亲和力相互作用的方式获得的核，其中所述核通过生物素化的表面保护剂稳定化，所述纳米组装的复合体以通式(I)表示
NBnAvy(B-Xa-PAb)z (I)
其中：
-NB是单链或双链核酸的单个核碱基；
-Av是亲和素单元；
-B-Xa-PAb是生物素化的表面保护剂，其中PA是具有至少一个或两个可官能化的残基的聚合物单元，所述可官能化的残基之一借助生物素残基B的羧基官能团由共价键直接或经由间隔子X结合于生物素残基B；
-n是从16到10,000,000变化的数字；
-y是等于或大于(≥)1的整数，并且与n相关，可从(0.0001)·n到(0.0454)·n变化。如果包括在范围(0.0001-0.0454)·n中的值小于(＜)1，则y等于(＝)1；
-z是等于或大于(≥)1的整数，并且与y相关，可从(0.02)·y到(4)·y变化。如果包括在范围(0.02-4)·y中的值小于(＜)1，则z等于(＝)1；
-a是从0到50变化的数字；
-b是从1到128变化的数字。
本发明的纳米组装的复合体是纳米颗粒的形式，这是本发明的另一目的。
本发明的进一步目的是式(I)的纳米组装的复合体作为体外和体内诊断工具、在用于朝体内具体位点靶向和浓集生物活性分子的纳米医药领域中、在通常用于定位分子到表面上的纳米技术领域中、以及在要求在中心核(其进而存在于胶体悬浮液中或局限于表面上)上共定位不同特性的数个化学或生物功能部分的任何应用(生物医药和工程)中的用途。
本发明的又一目的是制备通式(I)的纳米组装的复合体的方法。
根据以下对具体实施方案的详述并参考附图，本发明可实现的益处对本领域技术人员将变得更明显，提供对具体实施方案的详述是为了非限制性地示例。
附图简述
图1：该图显示以下纳米组装的复合体的颗粒尺寸分布(INTENSITY-加权的-GAUSSIAN分析)：A)Av-pEGFP 3(实施例1和2的样品1)；B)Av-pEGFP 3-B-Xa-PAb-IV-30(实施例2的样品26)；C)Av-GenNB 2-B(实施例4的样品31)；D)Av-GenNB 2-B-Xa-PAb IV-30(实施例4的样品35)。
图2：该图显示实施例2的不同纳米组装的复合体在缓冲溶液中的聚集动力学，其是所用的B-Xa-PAb类型和其量的函数。各种制剂的组成概述于表2。A：B-Xa-PAb I，％总占据的生物素结合部位(BBS＝生物素结合部位)等于0(●)、20(○)、30(■)、40()、50(▲)、60(△)％；B：B-Xa-PAbIIa，％占据的BBS等于0(●)、20(○)、30(■)、40()、50(▲)、60(△)％；C：B-Xa-PAb IIb，％占据的BBS等于0(●)、20(○)、30(■)、40()、50(▲)、60(△)％；D：B-Xa-PAbIII，％占据的BBS等于0(●)、20(○)、30(■)、40()、50(▲)、60(△)％；E：B-Xa-PAb IV，％占据的BBS等于0(●)、20(○)、30(■)、40()、50(▲)、60(△)％。
图3：该图显示以点印记荧光检测的测定中使用的膜的荧光显微图像，比较了单体形式和与核酸的纳米复合形式的亲和素。使用1.3μg/ml的亲和素-生物素-Alexa溶液进行孵育。A1：单体亲和素(实施例5的样品38)；A2：Av-pEGFP 1.5B-Xa-PAb IV-25(实施例5的样品39)；A3：Av-pEGFP 0.75B-Xa-PAb IV-25(实施例5的样品40)。
图4：该图显示以点印记荧光检测的另外测定中使用的膜的荧光显微图像，比较了单体形式和与核酸的纳米复合形式的亲和素。使用5μg/ml单体形式(实施例5和6的样品38)和纳米组装形式(实施例6的样品41)的亲和素-生物素-Alexa溶液进行孵育。
图5：该图显示在以酶(HRP)联检测系统的点印记中，单体形式(○)和与核酸的纳米复合形式(●)的亲和素的检测效力的比较。以生物素-HRP孵育，并以膜的DAB底物显色来进行点检测，该膜此前以5μg/ml单体形式(实施例5、6和7的样品38)和纳米组装形式(实施例7的样品42)的亲和素溶液孵育。
发明详述
以下描述的本发明涉及以纳米颗粒形式的纳米组装的复合体的获得和应用用途，该纳米颗粒包含多亲和素核，其是通过将数个亲和素单元在一个或多个核酸分子上成核而获得的，随后由表面保护剂的存在来稳定，从而能够在盐水溶液中保持为离散和稳定的实体，而没有进一步的非特异性相互作用。
用本发明的纳米组装的复合体，获得了借助其表面上保护性元件的存在而对以下风险稳定的离散纳米颗粒：a)在盐水环境中聚集和b)与溶液中其它分子的非特异性相互作用。
所述保护性元件本身以受控和高度确定的量存在于颗粒表面上。而且，根据本发明人开发的制备方法进行表面保护而不破坏核酸-亲和素自组装的复合体，并且不改变组装的亲和素结合于生物素的总能力(即，不改变生物素结合部位)。
这些纳米颗粒的尺寸可从为更多亲和素单元组装核的核酸的长度确立，且因此，由不同尺寸和亲和素上不同电荷表征的颗粒可通过适当改变成核核酸(NA)的尺寸获得。
所述颗粒的特征被准确地限定，并且使用者通过改变以下可以调整其特性：
a)成核NA的类型和尺寸；
b)亲和素和核酸碱基之间的比例；
c)表面上存在的保护剂的性质和量。
为了本发明目的，相同的目标化合物是包含核的纳米组装的复合体，其中所述核通过数个亲和素单元向一个或多个核酸分子上高亲和力相互作用及随之的成核作用而获得，并由生物素化的表面保护剂稳定，所述纳米组装的复合体以通式(I)表示
NBnAvy(B-Xa-PAb)z (I)
其中：
-NB是单链或双链核酸的单个核碱基；
-Av是亲和素单元；
-B-Xa-PAb是生物素化的表面保护剂，其中PA是具有至少一个或两个可官能化的残基的聚合物单元，所述可官能化的残基之一借助生物素残基B的羧基官能团由共价键直接或经由间隔子X结合于生物素残基B；
-n是从16到10,000,000变化的数字；
-y是等于或大于(≥)1的整数，并且与n相关，可从(0.0001)·n到(0.0454)·n变化。如果包括在范围(0.0001-0.0454)·n中的值小于(＜)1，则y等于(＝)1；
-z是等于或大于(≥)1的整数，并且与y相关，可从(0.02)·y到(4)·y变化。如果包括在范围(0.02-4)·y中的值小于(＜)1，则z等于(＝)1；
-a是从0到50变化的数字并且优选地包括在从0到10；
-b是从1到128变化的数字。
如果z小于4，那么核NBnAvy上存在的生物素结合部位没有因与保护剂(B-Xa-PAb)的生物素B结合而饱和，本发明的纳米复合体可将不同于保护剂的额外生物素化的化合物结合到所述结合部位上。
因此，NB是指由数目等于n的核碱基(NB)组成的核酸，其中n从16到10,000,000变化，指总碱基数，而无论核酸是单链还是双链的。优选地，核酸由从30到100,000变化的碱基数组成，并且更优选地碱基数是从3,000到50,000。
因此，术语核酸等同地是指：
i)单链(ss)或双链(ds)脱氧核糖核酸(DNA)聚合物的任何序列；
ii)以单链形式或与RNA或互补DNA链杂交的核糖核酸(RNA)聚合物的任何序列；
iii)根据以上各要点的序列中部分或所有碱基已被化学修饰的序列。
而且，对式(I)的纳米组装的复合体可用的核酸可以是线性或环状形式，处在松弛、卷曲的或超螺旋状态。
对于术语亲和素，亲和素定义为来源于鸡蛋或另一类似来源(一般是鸟类的卵)或来自重组技术，以糖基化或去糖基化形式。还包括其它化学或遗传修饰的亲和素形式，只要它们能组装到如此前确立的单链或双链核酸上。
鉴于NB的数目n与自组装到核酸上的亲和素单元的数目y之间的关系，y优选地被包括在从(0.0001)·n到(0.0357)·n，并且更优选地被包括在从(0.01)·n到(0.0357)·n。例如，如果n＝10,000，y可从10到357变化，优选地从100到357。如果替代的n＝100,000，y被包括在从10到3,570，并且优选地从1,000到3,570。
此外，对于生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb：
-B是指生物素；
-PA优选地是指任何分子量的亲水聚合物的线性单元，其能够借助生物素的羧基基团由共价键直接或经由间隔子X结合于生物素。如果PA具有两个可官能化的残基，则所述残基的第二个是自由的或被本领域技术人员已知的保护基例如甲氧基基团保护。
如果b大于1，那么PA代表由数个聚合物单元组成的亲水聚合物，该数个聚合物单元被具有等于或大于3(≥3)的官能度数目的另外的配体连接在一起，这些官能团之一结合于间隔子X或生物素B，而其余的其它官能团结合于聚合物单元PA；
-X是由通式(II)的双官能分子组成的间隔子
Y-R-Y′ (II)
其中：
Y、Y′彼此相同或不同地为-COO-；-NH-；-O-；SO2-；-S-；-SO-；-CO-；-COS-；-NH-CO-；-NH-CO-；HN-SO-NH-；
R可为烷基、链烯基、链炔基、环烷基或芳基，具有被包括在从1到20、优选地从5到20的碳原子数，并且也是任选取代的。
因此，间隔子X与生物素B之间的键以及间隔子X与亲水聚合物PA之间的键可任意地为酰胺键、氨基键、尿素键、酯键、酮键、醚键、硫酯键、硫醚键、脲键、硫脲键、磺酸键或亚砜键。
鉴于亲和素单元的数目y与生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb单元的数目z之间的关系，z被包括在从(0.02)·y到(4)·y，并且优选地被包括在从(0.4)·y到(4)·y。
例如：在n＝10,000和y＝357(0.0357·n)的颗粒中，z从7到1,429变化，且优选地从143到1,429变化；在n＝10,000和y＝100的颗粒的情形中，z从2到400变化，且更优选地从40到400变化；在n＝50,000和y＝1,786(＝0.0357·n)的颗粒的情形中，z从36到7,143变化，且更优选地从714到7,143变化；在n＝50,000和y＝500(y＝0.01·n)的颗粒的情形中，z从10到2,000变化，且更优选地从200到2,000变化。
在本发明式(I)的纳米组装的复合体中，聚合物单元PA是生物相容的和优选地亲水聚合物，并且是已知的聚合物(Owens DE和Peppas NA2006，引证文献)，其中聚合物单元PA具有优选地包括在从400到40,000，且更优选地从1,000到20,000的分子量。所述聚合物单元优选地选自也任选取代的聚环氧乙烷或聚乙二醇(PEO或PEG)、聚氧乙烯与聚氧丙烯的共聚物(PEO-PPO)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰吗啉(PacM)、聚草酰胺(polyoxamine)、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLG)、乳酸与乙醇酸的共聚物(PLGA)组成的组。
更优选地，聚合物PA是取代的聚氧乙烯(PEO)，因此由下式(III)表征：
-(CR1R2CR3R4O)m- (III)
其中：
R1、R2、R3和R4可独立地等于氢、烷基、环烷基、芳基、链烯基、链炔基、烷氧基(alcoxyl)、硫代烷氧基、芳氧基和硫代芳氧基；
m是从2到900的整数。
如果聚合物由数个聚合物单元组成，且这些数个聚合物单元由官能度等于或大于3(≥3)的多官能配体结合在一起，所述配体可为赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、树型化合物。术语“树型化合物”是指一种对称的大分子化合物，其由围绕由较小分子或聚合物核构成的中心核的重复分支组成。树型化合物之外存在的官能团，其数目取决于分支数目，本身可以其它分子包括例如PA聚合物官能化。
此外，如果聚合物单元PA是双官能的，其可经由第二自由官能团进一步共价结合于适于纳米组装的复合体的目标用途的化合物，特别是选自配体、糖、生色团或荧光团、药物、放射性核素的螯合剂、肽、抗体、蛋白、酶和类似物的化合物。
制备本发明的纳米组装的复合体包括水溶液中的三个连续步骤：第一步骤中获得仅由亲和素和核酸组成的纳米颗粒，其构成本发明复合体的中心核。随后的两步骤包括任选制备生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb，但主要是向第一步骤中获得的核酸-亲和素纳米颗粒加入所述表面保护剂。
因此，制备通式NBnAvy(B-Xa-PAb)z(I)的纳米组装的复合体的方法包括至少以下步骤：
a)通过以化学计量预确定的亲和素对核碱基的摩尔比混合亲和素Av与核酸，制备自组装的基本核NBnAvy；
b)混合生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb与此前获得的基本核。
任选地，制备本发明的纳米组装体还可包括制备生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb。
第一步骤通过在搅拌下混合亲和素和核酸的溶液而进行，优选地两种溶液都在无盐水中。在第一步骤中，亲和素对核碱基NB的摩尔比在从0.44到0.0001的范围，优选地从0.133到0.0044的范围，且更优选地为0.044。在持续搅拌下在从0℃到50℃的温度混合各种试剂1秒到600秒的时间。
生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb通过合成制备，或如果可市售获得则购买。通过合成制备B-Xa-PAb包括通过化学手段，使用本领域任何技术人员已知的典型生物共轭技术将生物素分子共轭于聚合物PAb。随后，加入相对于溶液中存在的生物素结合部位浓度化学计量控制的量的此前制备的或购买的生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb，生物素结合部位浓度本身是相对于亲和素的浓度。因此亲和素：B-Xa-PAb的摩尔比包括在4到0.02之间。
生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb的加入也在搅拌下在水溶液中以从0℃到50℃的受控温度进行1分钟到120分钟之间的时间。
而且，本发明的纳米组装的复合体可由其中步骤a)和b)大致颠倒的方法制备，因此该制备方法可包括：
a)以化学计量预确定的生物素对亲和素的摩尔比向亲和素加入生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb；
b)以化学计量预确定的亲和素对核碱基的摩尔比向前一步骤中获得的共轭物Avy(B-Xa-PAb)z加入核酸。
制备条件与之前对第一方法所述的那些条件相同。
如果需要，如同前述步骤，无论纳米组装的复合体是通过第一方法还是第二方法制备的，该制备方法还可包括从溶液中作为第一步骤残余物最终存在的任何单体亲和素纯化颗粒。纯化可在步骤a)或步骤b)之后进行。
从溶液中存在的任何单体亲和素纯化纳米组装的复合体可以已知方法，例如超滤或尺寸排阻色谱进行。在超滤的情况中，使用特征为截留值等于或大于(≥)100kDa的适当系统。在尺寸排阻色谱的情况中，使用适于保留尺寸达(＜)200kDa的蛋白分子的色谱介质。
如果核的亲和素上存在的生物素结合部位没有被生物素化的表面保护剂B-Xa-PAb饱和，该制备方法还可包括加入彼此相同或不同的额外生物素化的化合物的另外的任选步骤。
由此前描述的制备方法，可获得具有任何尺寸的纳米颗粒特征的纳米组装的复合体。特别是，所述纳米组装的复合体是以尺寸至少10nm的纳米颗粒的形式，并且优选地是以尺寸从50nm到1,000nm的纳米颗粒的形式。
本文描述的纳米微粒形式的纳米组装的复合体的用途延伸到亲和素-生物素系统所有目前已知的应用，对于所述应用它们作为“扩增”系统。这些应用的实例包括它们作为以下的用途：a)体外诊断中的检测手段；b)定位和描摹(patterning)表面上的分子(例如微阵列、蛋白芯片和DNA)中的放大器；c)体内诊断手段；d)药物的主动或被动靶向系统。
所述用途将取决于生物素化的化合物的性质，该生物素化的化合物经由亲和素上存在的生物素结合部位可进一步引到纳米组装体表面上、并且没有因为与保护剂B-Xa-PAb的生物素结合而被饱和。
实验部分
制备本发明的纳米组装化合物和其表征的一些实施例将在以下以非限制性示例的方式提供。
尤其是，通过此前所述的制备获得的纳米组装化合物可由以下表征：
a)其尺寸，使用光散射和电镜技术；
b)分散程度，使用光散射；
c)可用于引入额外生物素化的官能团的生物素结合部位数目。该评价使用HABA测定进行，如文献中所述的(Green NM Biochem.J.1965，94：23C-24C)；
d)在缓冲介质中的聚集速度，使用光散射技术；
e)它们对冻融、以及对冷冻干燥的稳定性，使用光散射技术。
实施例1：以不同摩尔比的质粒DNA和亲和素而不加入表面保护剂所获得的纳米组装体的制备和表征
通过混合如下表1中提供的不同摩尔比的亲和素(Av，Belovo，Belgium)和核酸(pNM，质粒p-EGFP C1(Clonetech#6084-1)(4.7Kb))的水溶液而制备复合体。
在0℃冰浴中放置溶液以平衡一小时，离心(15,000rpm 5分钟)后，以光散射分析溶液中纳米组装体的尺寸，使用由Spectra Physics Stabilite 2017激光器、Pacific Scientific “Nicomp 370计算自相关器”和控制样品温度的系统组成的仪器系统。
表1.去离子水中亲和素∶质粒多核酸的摩尔比和颗粒的尺寸特性
样品 制备溶液中的 亲和素∶核碱基 (NB)(y∶n) 溶液中的亲和 素∶质粒 (pNB) 溶液中的纳米 组装体的平均 直径(nm) 1-Av-pEGFP 3.0 0.125∶1 1175∶1 106±33 2-Av-pEGFP 2.0 0.0833∶1 783∶1 124±51 3-Av-pEGFP 1.5 0.0625∶1 587∶1 144±55 4-Av-pEGFP 0.5 0.0208∶1 196∶1 148±68
对第一样品测量的尺寸分布在图1中提供。从图可观察到，所述组装体可以中等多分散性表征。表1中的数据还显示，当y/n比减少时纳米组装体的尺寸和多分散性增加，表示当该值减少时，核酸分子在组装体中的缩合程度减少。然而，当y/n变化时的尺寸变化限于约70nm至200nm的值中。
实施例2：以质粒DNA、亲和素和表面保护剂获得的纳米组装体的制备和表征
将不同量的各种表面保护剂(B-Xa-PAb)加至如实施例1所述制备的样品1Av-pEGFP 3，使用在0到2.4之间变化的B-Xa-PAb∶亲和素摩尔比，如表2中所示。使用五种不同的B-Xa-PAb剂(I、IIa、IIb、III和IV)，其化学式如下提供：
生物素-CO-NH-(CH2)6-NH-O-CO-mPEG2000(B-PA I)
生物素-CO-NH-(CH2)6-O-CO-NH-mPEG5000(B-PA IIa)
生物素-CO-NH-(CH2)6-NH-O-CO-mPEG5000(B-PA IIb)
生物素-CO-NH-(CH2)6-NH-Lys-(mPEG2000)2(B-PA III)
生物素-CO-NH-(CH2)6-NH-Lys-(mPEG5000)2(B-PA IV)
所述保护剂B-Xa-PAb如下描述地合成和表征。
B-Xa-PAbI：通过缩合生物素的6-氨基-正己基酰胺与单甲氧基聚乙二醇2,000的N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯而获得(Monfardini C，Schiavon O等人Bioconjugate Chemistry 1995，6：62-69)。
B-Xa-PAbIIa：通过缩合α-氨基，ω-甲氧基-聚乙二醇5,000(Fluka目录号06679)与生物素基-正己醇酰胺的N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯而获得(Morpurgo M，Bayer EA等人J.Biochem.Biophys.Meth.1999，38：17-28)。
B-Xa-PAbIIb：以获得B-Xa-PAb I的类似方式获得，使用单甲氧基聚乙二醇5,000代替2,000。
B-Xa-PAbIII：通过缩合单甲氧基聚乙二醇2,000的N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯与2，6二氨基己酸的酰胺的氨基基团以及生物素基-正己基二胺(2，6-二氨基-己酸(6-生物素基酰氨基己基)-酰胺)而获得。
B-Xa-PAbIV：以获得B-Xa-PAbIII的类似方式获得，使用单甲氧基聚乙二醇5,000代替2,000。
组装溶液中最终纳米组装的复合体的尺寸以光散射测量，如实施例1中所述。尺寸结果概述于表2和图1中。
表2.组装溶液的组成和实施例2中所述的相对纳米组装体的尺寸特性。
样品 B-Xa-PAb 的类型 ％ 占据的 BBS B-Xa-PAb∶ 亲和素 (z/y) 平均直径 (nm) 1-Av-pEGFP 3(实施例1) 无 0 0 106±33 5-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb I-20 生物素- mPEG2000(I) 20 0.8 88±20 6-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb I-30 同上 30 1.2 96±33 7-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb I-40 同上 40 1.6 85±25
样品 B-Xa-PAb 的类型 ％ 占据的 BBS B-Xa-PAb∶ 亲和素 (z/y) 平均直径 (nm) 8-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb I-50 同上 50 2.0 88±26 9-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb I-60 同上 60 2.4 92±23 10-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIa- 20 生物素- mPEG5000 (IIa) 20 0.8 91±31 11-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIa-30 同上 30 1.2 87±21 12-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIa- 40 同上 40 1.6 90±26 13-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIa- 50 同上 50 2.0 88±32 14-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIa- 60 同上 60 2.4 96±34 15-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIb- 20 生物素- mPEG5000 (IIb) 20 0.8 111±28 16-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIb- 30 同上 30 1.2 109±39 17-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIb- 40 同上 40 1.6 112±14 18-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIb- 50 同上 50 2.0 115±28
16-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIb- 30 同上 30 1.2 109±39 19-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IIb- 60 同上 60 2.4 116±36 20-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb III-20 生物素-Lys- (mPEG2000)2 (III) 20 0.8 91±28 21-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb III-30 同上 30 1.2 91±22 22-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb III-40 同上 40 1.6 90±27 23-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb III-50 同上 50 2.0 93±32 24-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb III-60 同上 60 2.4 96±31 25-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IV-20 生物素-Lys- (mPEG5000)2 (IV) 20 0.8 101±41 26-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IV-30 同上 30 1.2 101±20 27-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IV-40 同上 40 1.6 100±24 28-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IV-50 同上 50 2.0 101±20 29-Av-pEGFP3-B-Xa-PAb IV-60 同上 60 2.4 100±34
最初在无盐水和无离子水中制备的所有样品随后以PBS缓冲液稀释，其聚集率由光散射测量。聚集动力学显示在图2中。可从图观察到，在含盐环境中，当B-Xa-PAb被引到纳米组装体表面上时，它们使纳米组装体的聚集减慢，直到其完全抑制聚集。各种B-Xa-PAb的保护效力随B-Xa-PAb的表面浓度增加而增加。保护效力还取决于B-Xa-PAb的类型，其中B-Xa-PAb IV和B-Xa-PAbIIb在所测试的所有B-Xa-PAb中是最有效的。
实施例3：以质粒DNA和亲和素获得的纳米组装体的制备和表征，并由超滤纯化。
将Alexa-Fluor546-生物胞素(Molecular probes#A12923)加至如实施例1所述地制备的样品1Av-pEGFP3，加入的量等于使2％的总生物素结合部位饱和所需的量。对制备的产物使用Vivaspin 100K PES膜(Sartorius，100,000Da截留值)进行各种超滤步骤，以使单体而不是纳米组装的亲和素滤过。上清液和滤液中的亲和素浓度由荧光确定，基于Alexa-Fluor546荧光团的信号。四个超滤步骤后获得的上清液由光散射分析。纳米微粒系统中的亲和素∶NB比从其中存在的亲和素浓度计算，假设存在的DNA与超滤前存在的相同。
表3.在纯化之前和之后含纳米颗粒的溶液的组成，以亲和素∶核碱基比(y/n)表示
样品 亲和素∶核碱基 (NB)(y/n) 尺寸(nm) 纯化前 1-Av-pEGFP 3 (实施例1) 0.125∶1 106±33 纯化后 1-Av-pEGFP 3 (实施例1) 0.0375∶1 152±68
从该表提供的结果，显然超滤处理能够除去在制备阶段引入的过量单体亲和素。发现颗粒尺寸略微大于纯化前记录的。这一差异(不是统计学上相关的)很可能归因于当溶液中的y/n比减少时记录的DNA包装水平较低，如已在实施例1中描述的。
实施例4.以不同摩尔比的基因组DNA和亲和素、加入和不加入表面保护剂所获得的纳米组装体的制备和表征。
纳米复合体通过混合不同摩尔比(参见表4)的亲和素(Av，Belovo，Belgium)和片段的细菌基因组核酸(Gen pNB，Sigma目录号D1760)(平均尺寸约16-24Kb)的水溶液而制备。将溶液在0℃冰浴放置一小时，离心(15,000rpm 5分钟)后，由光散射分析溶液中纳米组装体的尺寸(表4)，如实施例1中所述的。
表4.去离子水中亲和素∶基因组核酸∶B-Xa-PAb的摩尔比和颗粒的尺寸特性
样品 溶液中的亲和 素∶核碱基 (NB) 溶液中的亲 和素∶核酸 (GenpNB) B-Xa-PAb∶ Av 溶液中的纳米组装 体的平均直径(nm) 30-Av-GenpNB 3 0.125∶1 5000∶1 0 132±75 31-Av-GenpNB 2 0.0833∶1 3333∶1 0 133±37 32-Av-GenpNB 1.5 0.0625∶1 2500∶1 0 160±23 33-Av-GenpNB 0.75 0.0312∶1 1666∶1 0 140±18
样品 溶液中的亲和 素∶核碱基 (NB) 溶液中的亲 和素∶核酸 (GenpNB) B-Xa-PAb∶ Av 溶液中的纳米组装 体的平均直径(nm) 34-Av-GenpNB 3-B-Xa-PAb IV 30 0.125∶1 5000∶1 1.2 未检测 35-Av-GenpNB 2- B-Xa-PAb IV 30 0.0833∶1 3333∶1 1.2 107±50 36-Av-GenpNB 1.5 B-Xa-PAb IV 30 0.0625∶1 2500∶1 1.2 112±62 37-Av-GenpNB 0.75-B-Xa-PAb IV 30 0.0312∶1 1666∶1 1.2 205±79
实施例5：在点印记荧光检测中第一次比较单体形式和与核酸纳米复合的形式的亲和素的效力
通过点样(1μl)在硝酸纤维素膜上，固定生物素化的抗体(抗-hPSMA)。通过浸入含2％w/v BSA的PBS(PBS/BSA)封闭膜，随后以含亲和素的溶液(PBS/BSA中1.3μg/ml)处理，该溶液此前加有使25％的总生物素结合部位饱和的量的生物素-Alexa-所述溶液中的亲和素以单体或纳米组装的形式使用(表5)。
表5.在点印记荧光测定中使用的检测亲和素溶液的组成特性
样品 亲和素的形式 亲和素∶核碱基 (NB)(y/n) B-Xa-PAb∶亲和素 (z/y) 38-Av. 单体 - 1 39-Av-pEGFP 1.5 B-Xa-PAb IV 25 纳米微粒 0.0625 1
40-Av-pEGFP 0.75 B-Xa-PAb IV 25 纳米微粒 0.0312 1
在室温孵育2小时后，以PBS洗涤膜，并以荧光显微镜显像(图3)。从图可观察到，纳米组装的亲和素在检测膜上固定的样品方面更有效。
实施例6：在点印记荧光检测中第二次比较单体形式和与核酸纳米复合的形式的亲和素的效力
通过点样(0.1μl)在硝酸纤维素膜上，固定不同量的生物素化的BSA(100、50、20、10、5、2ng的蛋白分别对应于10、5、2、1、0.5和0.2皮摩尔的生物素/点)。通过浸入含2％w/v BSA的PBS(PBS/BSA)封闭膜，随后以含亲和素的溶液(PBS/BSA中5μg/ml)处理，该溶液此前加有使40％的总生物素结合部位饱和的量的生物素-Alexa-所述溶液中的亲和素以单体或纳米组装的形式使用(表6)。
表6.在第2次点印记荧光测定中使用的检测溶液的组成特性
样品 亲和素的形式 亲和素∶核碱基 (NB)(y/n) B-Xa-PAb∶亲和素 (z/y) 38-Av. 单体 - 1 41-Av-pEGFP 0.5 B-Xa-PAb IV 25 纳米微粒 0.0208 1
在室温孵育2小时后，以PBS洗涤膜，并以荧光显微镜显像(图4)。从图可观察到，使用单体亲和素的检测限值等于1皮摩尔生物素，而当以纳米微粒形式使用亲和素时，甚至当量等于或小于0.2皮摩尔时生物素也是可见的。该实验中未达到纳米组装系统的检测限值。
实施例7.在不存在和存在B-Xa-PAb剂时纳米组装体对冻/融的稳定性
对以基因组DNA获得的如实施例4提供的纳米组装样品进行冻-融循环。将融化后溶液中存在的颗粒的尺寸测量值与处理前相同制品的尺寸相比。结果显示在表7中。
表7.纳米组装体在冻/融之前和之后的尺寸特性
样品 冷冻之前溶液中纳米组 装体的平均直径(nm) 冻融之后溶液中纳米组 装体的平均直径(nm) 30-Av-GenpNB 3 132±75 ＞1000 31-Av-GenpNB 2 133±37 ＞1000 32-Av-GenpNB 1.5 160±23 ＞1000
样品 冷冻之前溶液中纳米组 装体的平均直径(nm) 冻融之后溶液中纳米组 装体的平均直径(nm) 33-Av-GenpNB 0.75 140±18 ＞1000 34-Av-GenpN B 3-B-Xa- PAb IV 30 未检测 143±75 35-Av-GenpNB 2-B-Xa- PAb IV 30 107±50 210±147 36-Av-GenpNB 1.5B- Xa-PAb IV 30 112±62 193±155 37-Av-GenpNB 0.75-B- Xa-PAb IV 30 205±79 129±55
可以从结果推论，缺乏保护剂的颗粒不能抵抗冻-融过程，在那之后它们不可逆地聚集。相反，当保护剂B-Xa-PAb存在于表面上时，聚集被抑制。
实施例8.在酶联检测系统中比较单体形式和与核酸纳米复合的形式的亲和素的效力
通过点样(0.5μl)在硝酸纤维素膜上，固定不同量的生物素化的IgG(IgG-B)(0.054、0.18、0.6、2.0、6.7和22.3ng的蛋白)。通过浸入含2％w/vBSA的PBS(PBS/BSA)封闭膜，随后以含亲和素的溶液(PBS/BSA中5μg/ml)处理。所述溶液中的亲和素以单体或纳米组装的形式使用(表7)。在室温孵育1小时后，以PBS洗涤膜，并与生物素-辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich，PBS/BSA中4μg/ml)孵育(1h)。以二氨基联苯胺(DAB)进行膜显影。以Image J软件分析点密度，并转化为图5的图表。从图可观察到，使用单体亲和素的检测限值等于0.6ng IgG-B，而当以纳米微粒形式使用亲和素时，甚至当量等于或小于0.054ng时IgG也是可见的。该实验中未达到纳米组装系统的检测限值。
表7.在酶联点印记测定中使用的检测亲和素溶液的组成特性
样品 亲和素的形式 亲和素∶核碱基 (NB)(y/n) B-Xa-PAb∶亲和素 (z/y) 38-Av 单体 - 1
样品 亲和素的形式 亲和素∶核碱基 (NB)(y/n) B-Xa-PAb∶亲和素 (z/y) 42-Av-pEGFP 0.95 B-Xa-PAb IV 25 纳米微粒 0.0396 1