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用于改进对表达 CD138 的肿瘤细胞的靶向的方法和试剂
    相关申请的交叉引用
     本申请要求于 2007 年 12 月 26 日提交的美国临时申请 61/016,614、 2008 年 8 月 8 日提交的临时申请 61/087,466 和同样于 2008 年 8 月 8 日提交的临时申请 61/087,590 的 权益， 本文通过参考并入其全部内容。
     技术领域 本发明涉及抵抗抗原 CD138 的免疫缀合物和包含所述免疫缀合物的组合物在减 少基质细胞粘着至表达 CD138 的靶细胞上的应用， 从而更有效地治疗涉及表达 CD138 的细 胞的疾病状态。
     背景技术 作为细胞外基质的受体的 CD138 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞上过表达， 并且已经表 现出影响 MM 细胞发育和 / 或增殖。 举例而言， CD138 还在卵巢癌、 肾癌、 胆囊癌、 乳腺癌、 前列 腺癌、 肺癌、 结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、 慢性淋巴性白血病 (CLL) 等的细胞上表达。
     在此用于说明本发明， 特别是提供关于实施的额外详细说明的出版物和包括专利 等的其它材料， 均通过参考并入。方便起见， 所述出版物在下文中按照作者和日期引用， 和 / 或按照所附目录中的作者依照字母顺序列出。
     Tassone 等 (2004) 已 经 报 道 了 鼠 IgG1 抗 体 B-B4 对 在 MM 细 胞 表 面 上 表 达 的 CD138 抗原的良好结合。Tassone 还报道了包含类美登素 (maytansinoid)DM1 作为效应分 子的免疫缀合物 B-B4-DM1 对多发性骨髓瘤细胞的高细胞毒性活性 ( 还参见美国专利公开 20070183971)。
     Tassone 还指出其 B-B4 缀合物即使在骨髓微环境中也有效， 所述骨髓微环境诱导 多发性骨髓瘤 (MM) 细胞对通常施用至 MM 患者的许多药物 ( 包括例如地塞米松 ) 产生抗性。 Tassone 的免疫缀合物能够有效地破坏骨髓基质环境中的 MM 肿瘤细胞。
     尽管 Tassone 等已经为提供 MM 的有效治疗和可以在此类治疗中使用的物质的组 成作为贡献， 但本领域仍然存在许多需要。
     仍然存在对改进使用基于 B-B4 的免疫缀合物的治疗的需要。还存在对使用显示 一种或多种有利性质的基于 B-B4 的免疫缀合物的有效治疗的需要。免疫缀合物的性质优 选包括改进的抗原结合、 改进的肿瘤细胞 ( 特别是表达 CD138 的肿瘤细胞以及其附属细胞 ) 杀伤或对靶标更均匀的结合， 但特别是更有效地抗击与表达 CD138 的细胞有关的疾病状态 的能力。
     发明内容 本发明涉及一种用于减少有需要的受试对象的肿瘤细胞中基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞的方法， 所述方法包括 ：
     以对于减少基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞而言有效的量对所述肿瘤细 胞施用靶向所述表达 CD138 的肿瘤细胞 ( 特别是含有如本文所公开的可切割连接子和效应 子的表达 CD138 的肿瘤细胞 ) 的免疫缀合物， 以及可选地以抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤细胞 生长的量对所述肿瘤细胞施用其它细胞毒性剂。
     所述粘着可以减少至少约 10 ％、 约 20 ％、 约 30 ％、 约 40 ％、 约 50 ％、 约 60 ％、 约 70％、 约 80％以上， 和 / 或可以导致对粘着介导的药物抗性的缓解， 所述抗性包括粘着介导 的抵抗其它细胞毒性剂 ( 其不是上述免疫缀合物中的一种 ) 的药物抗性， 并且其中以抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤细胞生长的量施用所述其它细胞毒性剂。可以依次地施用所述免疫缀 合物和该细胞毒性剂， 其中所述细胞毒性剂可以在施用所述免疫缀合物之后施用， 或可以 同时施用。
     本发明的免疫缀合物特别地包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 和
     (b) 效应分子，
     其中所述免疫缀合物均匀地靶向表达 CD138 的靶细胞。
     本发明的基因工程靶向抗体可以 (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区 (ABR)， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体。
     所述 ABR 可以分别包含 ：
     (a) 包含 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸残基 99 ～ 111 的重链可变区 CDR3 和
     (b) 包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 89 ～ 97 的轻链可变区 CDR3。
     所述 ABR 还可以分别包含 ：
     (a) 包含 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸残基 31 ～ 35 和 51 ～ 68 的重链可变区 CDR1 和 CDR2， 和/或
     (b) 包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 24 ～ 34 和 50 ～ 56 的轻链可变区 CDR1 和 CDR2。
     所述另外的抗体区可以分别包含 ：
     (a)SEQ ID NO ： 1 的氨基酸残基 123 ～ 448， 和/或
     (b)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 108 ～ 214，
     以及其突变体， 所述突变体
     (i) 维持或降低所述基因工程靶向抗体的抗体依赖性细胞毒性和 / 或补体依赖性 细胞毒性， 和/或
     (ii) 稳定所述基因工程靶向抗体。
     效应分子可以经由连接子连接至所述基因工程靶向抗体。 所述连接子可以包含二 硫键。效应分子 ( 例如 DM4) 可以在靶向抗体和该效应分子之间提供空间位阻。效应分子 可以为至少一种类美登素 (maytansinoid)( 例如 DM1、 DM3 或 DM4)、 紫杉烷或 CC1065， 或其 类似物。
     所述免疫缀合物可以结合 CD138， 靶向变异 (targeting variation) 小于 150％、 140％、 130％、 120％、 110％、 100％、 90％、 80％、 70％、 60％或 50％。
     本发明还涉及一种免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。所述免疫球蛋白 重链或其一部分的恒定区可以为 IgG4 同型的恒定区。
     本发明还涉及一种治疗受试对象中的 MM 的方法， 所述方法包括 ：
     提供一种或多种本文指定的免疫缀合物， 和
     以对治疗多发性骨髓瘤而言有效的量对所述受试对象施用所述免疫缀合物。
     所述免疫缀合物的靶向剂可以包含与 SEQ ID NO ： 2 具有至少约 70％序列同一性 的轻链序列。所述免疫缀合物的靶向剂还可以包含与 SEQ IDNO ： 1 具有至少约 70％序列同 一性的重链序列。
     本发明还涉及一种用于免疫缀合物介导的药物输送的方法， 所述方法包括 ：
     提供一种或多种本文指定的免疫缀合物， 和
     以治疗有效量施用所述免疫缀合物， 其中所述 IgG4 同型缓解 ADCC、 补体依赖性细 胞毒性和 / 或 Fc- 介导的肝 FcR 的靶向。
     本发明还涉及一种抑制、 延缓和 / 或预防细胞培养物中的肿瘤细胞生长的方法， 所述方法包括 ：
     以抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤细胞生长有效的量对所述细胞培养物施用一种或多 种本文指定的一种或多种免疫缀合物。所述有效的量可以诱导表达 CD138 的肿瘤细胞和可 选的不表达 CD138 的辅助细胞 ( 特别是肿瘤基质细胞 ) 中的细胞死亡或连续细胞周期的停 滞。所述细胞培养物中的细胞可以获自癌症患者， 并且在施用所述有效量的所述免疫缀合 物后， 可以将所述细胞培养物的细胞再植入所述癌症患者。
     本发明还涉及一种用于在有需要的患者中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤 细胞的肿瘤生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的方法， 所述方法包括 ：
     以抑制或降低所述肿瘤生长和 / 或所述肿瘤细胞扩散的量， 对所述患者施用至少 一种或多种上述免疫缀合物，
     其中所述免疫缀合物抑制、 延缓或预防所述肿瘤细胞的生长和 / 或扩散。
     所述免疫缀合物的效应分子可以为毒素、 细胞毒性酶、 低分子量细胞毒性药物、 成 孔剂、 生物响应修饰剂、 前药激活酶、 抗体、 细胞因子或放射性核素。 2 2
     可以以 5mg/m ～约 300mg/m 的单次剂量可选地以每小时、 每天、 每周或其组合施 用本发明的免疫缀合物。
     包括每小时、 每天和每周方案等的多剂量方案为本发明的一部分， 并且特别包括 间隔为 5 小时、 6 小时、 7 小时、 8 小时、 9 小时、 10 小时、 11 小时、 12 小时、 13 小时、 14 小时、 15 小时、 16 小时、 17 小时、 18 小时、 19 小时、 20 小时、 21 小时、 22 小时、 23 小时、 1 天、 2 天、 3 天、 4 天、 5 天、 6 天、 7 天、 1 周、 2 周、 3 周、 4 周、 5 周、 6 周、 7 周或 8 周的施用。
     本发明还涉及一种用于在有需要的患者中抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤的生长和 / 或恶性肿瘤细胞的扩散的方法， 所述方法包括 ：
     (a) 以对于降低肿瘤负荷而言有效的量对所述患者施用一种或多种细胞毒性剂和 / 或放射 ； 和(b) 以对于抑制、 延缓或预防肿瘤的生长和 / 或肿瘤细胞的扩散而言有效的量， 对 所述患者施用至少一种本文指定的免疫缀合物，
     其中所述免疫缀合物抑制、 延缓或预防包含表达 CD138 的细胞的肿瘤细胞的生长 和 / 或扩散。
     特别地， 本发明任何实施方式的细胞毒性剂可以为美法仑 (mephalan)、 长春新 碱 (vincristine)、 多 柔 比 星 (doxorubicin)、 地 塞 米 松 (dexamethasone)、 环 磷 酰 胺、 足 叶 乙 甙 (etoposide)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 顺 铂、 沙 利 度 胺 (thalidomide)、 泼尼松 (prednisone)、 沙利度胺、 硼替佐米 (bortezomib)、 来那度胺 (lenalidomide)、 索拉非尼 (sorafenib)、 罗明待辛 (romidepsin) 或其组合， 或可以为基于抗体的细胞毒性剂。
     本发明还涉及一种用于治疗患有会从抑制骨髓瘤细胞存活受益的疾病的受试对 象的方法， 所述方法包括 ：
     (a) 提供至少一种本文指定的任何免疫缀合物， 和
     (b) 对所述受试对象施用所述免疫缀合物， 从而选择性地降低所述受试对象的骨 髓瘤细胞的存活或生长。
     本发明还涉及一种药物组合物， 所述药物组合物包含用于抑制、 延缓和 / 或预防 肿瘤的生长和 / 或肿瘤细胞的扩散的本文指定的任何免疫缀合物， 以及一种或多种药物可 接受赋形剂。 所述药物组合物可以包含本文所指定的细胞毒性剂。
     本发明还涉及一种试剂盒， 所述试剂盒在分开的容器中包含组合使用以抑制、 延 缓和 / 或预防肿瘤的生长和 / 或肿瘤细胞的扩散的药物组合物， 其中一个容器包含有效量 的上述药物组合物， 和其中另一容器包含含有有效量的用于抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤的 生长和 / 或肿瘤细胞的扩散的试剂 ( 优选细胞毒性剂 ) 的第二药物组合物， 以及一种或多 种药物可接受赋形剂。
     本发明还涉及一种用于在有需要的受试对象中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞的肿瘤生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的方法， 所述方法包括 ：
     (a) 提供免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含 ：
     经由可切割连接子连接至效应分子的抗 CD138 的基因工程靶向抗体， 其中所述效 应分子是空间位阻性的， 和
     (b) 以抑制、 延缓和 / 或预防所述肿瘤的生长和 / 或所述肿瘤细胞的扩散的量， 对 所述受试对象施用所述 (a) 的免疫缀合物， 其中所述 (a) 的免疫缀合物提供的肿瘤生长抑 制活性比其无位阻对应物 (counterpart) 的活性高出约 10％、 约 20％、 约 30％、 约 40％以 上。
     包含非可切割连接子的无位阻对应物的肿瘤生长抑制活性可以高于其包含可切 割连接子的无位阻对应物的肿瘤生长抑制活性， 例如可以高出至少约 5％、 至少约 10％、 至 多约 15％。
     所述抗 CD138 的基因工程靶向抗体可以基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合 区构成， 或可以包含非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区和另外的抗体区， 其中所述另外的 抗体区的至少一部分出自人类抗体。
     所述可切割连接子可以包含二硫键。所述效应分子可以为 DM4。所述免疫缀合物
     可以是药物组合物的一部分， 并且可以以至少一次量为约 5mg/m2 ～约 300mg/m2 的剂量施用 至所述受试对象。
     本发明提供一种用作药物的免疫缀合物， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     本发明提供另一种用作药物的免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     特别地， 在本发明的一个方面， 将上述段落的免疫缀合物用于治疗多发性骨髓瘤。 特别地， 所述免疫缀合物能够用于制造多发性骨髓瘤治疗用药物。 本发明还提供一种免疫缀合物， 所述免疫缀合物用于将免疫缀合物介导的药物 输送至患者， 特别是用于缓解 ADCC、 补体依赖性细胞毒性和 / 或 Fc- 介导的肝 FcR 靶向， 其中所述免疫缀合物包含靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含分离的多肽， 所述多肽包 含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ IDNO ： 1 具有至少 70％序列同一性， 并且所述免疫球蛋白重链或其一部分的恒定区为 IgG4 同型的恒定区。
     本发明还提供用于治疗患者中癌症的肿瘤细胞， 其中所述肿瘤细胞已经在细胞培 养中用免疫缀合物处理， 所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     本发明还提供用于治疗患者中癌症的肿瘤细胞， 其中所述肿瘤细胞已经在细胞培 养中用免疫缀合物处理， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     本发明提供一种用于在患者中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞的肿瘤 生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的免疫缀合物， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     作为另一种选择， 本发明提供在患者中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞 的肿瘤生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的免疫缀合物， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     此外， 本发明提供一种药物， 所述药物包含免疫缀合物和一种或多种癌症药物作 为组合制剂， 以用于同时、 分开或依次地用于治疗包含表达 CD138 的细胞的肿瘤细胞， 其中 所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及 (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138，
     并且其中所述一种或多种癌症药物能够降低肿瘤负荷。
     作为另一种选择， 本发明提供一种药物， 所述药物包含免疫缀合物和一种或多种 癌症药物作为组合制剂， 以用于同时、 分开或依次地用于治疗包含表达 CD138 的细胞的肿 瘤细胞， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性，
     并且其中所述一种或多种癌症药物能够降低肿瘤负荷。
     在上两段应用的另一方面， 将所述组合制剂施用至已经采用放射治疗的患者。
     在一个替代性方面， 本发明提供免疫缀合物在制备用于治疗包含表达 CD138 的细 胞的患者中的肿瘤细胞的药物中的应用， 所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     以及其中将所述药物施用至已用放射治疗的患者， 以降低肿瘤负荷。
     此外， 本发明提供免疫缀合物在制备用于治疗包含表达 CD138 的细胞的患者中的 肿瘤细胞的药物中的应用， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述
     免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性，
     以及其中将所述药物施用至已用放射治疗的患者， 以降低肿瘤负荷。
     在上述段落中， 所述药物能够抑制、 延缓和 / 或预防患者中肿瘤的生长和 / 或恶性 肿瘤细胞的扩散。
     此外， 本发明还提供一种用于抑制个体中骨髓瘤细胞存活的免疫缀合物， 其中所 述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     此外， 本发明提供一种用于抑制个体中骨髓瘤细胞存活的免疫缀合物， 其中所述 免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     特别地， 在上两段中所述免疫缀合物能够选择性地降低个体中所述骨髓瘤细胞的 存活或生长。
     此外， 本发明提供一种免疫缀合物， 所述免疫缀合物用于在个体中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞的肿瘤的生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散， 其中所述免 疫缀合物包含经由可切割连接子连接至效应分子的抗 CD138 基因工程靶向抗体， 其中所述 效应分子为空间位阻性的。
     特别地， 在上段中， 所述免疫缀合物能够提供的抑制肿瘤生长的活性比其无位阻 对应物活性高出约 10％、 约 20％、 约 30％、 约 40％以上。
     本发明还提供一种 CD138 靶向剂， 所述 CD138 靶向剂用于减少受试对象的肿瘤细 胞中的基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞的方法。
     本发明还提供一种药物， 所述药物包含 CD138 靶向剂和其它试剂 ( 例如靶向免疫 缀合物或细胞生长抑制剂 ) 作为组合制剂以用于同时 ( 共施用 )、 分开或依次地用于减少受 试对象的肿瘤细胞中的基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞的方法。
     特别地， 在上段中， 所述组合制剂能够抑制、 延缓和 / 或预防受试对象中肿瘤细胞 的生长。 附图说明
     图 1 提供连接有效应分子的 nBT062 的示意图。
     图 2 为 BT062 的化学示意图。
     图 3 显示安丝菌素 P-3 向美登醇 (maytansinol) 的转换 ( 简化起见省略立体化 学 )。
     图 4 显示 DM4 的代表性合成图。图 5 为抗体缀合 (nBT062 至 DM4) 的示意图。
     图 6 显示对 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1、 nBT062-SMCC-DM1 和 nBT062 抗体 与 OPM-2 细胞的结合的分析。将不同浓度的 nBT062 和缀合物给予所述细胞， 并通过 FACS 分析测定平均荧光。
     图 7(A)-(D) 描述 nBT062-DMx 缀合物对 MOLP-8(CD138+) 和 BJAB(CD138-) 细胞的 体外细胞毒性。 在平底板中培养所述细胞， 并且与指定浓度的免疫缀合物一起温育 5 天。 加 入 WST 试剂， 过 3 个小时估算细胞活力。 在 (D) 中， 在存在或不存在阻断抗体 (1μM nBT062) 时分析 nBT062-SPDB-DM4 的细胞毒性活性。
     图 8 显 示 用 (A)PBS、 (B)nBT062 抗 体、 (C) 游 离 DM4 或 (D) 非 靶 向 缀 合 物 huC242-DM4 处理的个体小鼠， 在用 MOLP-8 肿瘤细胞接种后随时间 ( 天 ) 的肿瘤体积。
     图 9 显 示 用 (A)PBS 、 (B)nBT062-SPDB-DM4 、 (C)B-B4-SPP-DM1 或 (D) nBT062-SPP-DM1 处理的个体小鼠在用 MOLP-8 肿瘤细胞接种后随时间 ( 天 ) 推移的肿瘤体 积。
     图 10 描述 CB.17SCID 小鼠中 MOLP-8 人类多发性骨髓瘤异种移植物在接种后随时 间 ( 天 ) 推移的平均肿瘤体积 (+/-SD)。
     +图 11A 和 B 显示在 SCID 小鼠的大体积 (bulky)MOLP-8 肿瘤模型中， nBT062-DMx 针 对 CD138 MOLP-8 肿瘤细胞的抗肿瘤活性。对于各组， 肿瘤体积以平均值 (+/-SD) 给出。
     图 12 为反映在人类骨髓的环境中的 SCIDhu/INA-6 模型中含有 DMx 缀合物的 nBT062 对多发性骨髓瘤细胞的抗肿瘤效力的图。将由多发性骨髓瘤细胞产生的可溶性 人类 IL-6 受体 (shuIL-6R) 用作肿瘤负荷的指示物。三角形 ： nBT062-SPP-DM1， 正方形 ： nBT062-SPDB-DM4 ； 菱形 ： 运载剂对照。
     图 13 显示体外 nBT062-SPDB-DM4 介导的旁观者杀伤 (bystander killing)。将 CD138 阳性 OPM2 细胞和 CD138 阴性 Namawla 细胞与不同浓度的 nBT062-SPDB-DM4 一起培 养， 并测定细胞活力。OD450 值代表细胞活力的测定值。
     图 14 在 (A) 中显示通过不同 MM 细胞的 CD138 表达， 在 (B) 中显示 DOX40 细胞 ( 上 图 ) 和 OPM1 细胞 ( 下图 ) 的显微分析。CD138 显示在右侧， 核酸显示在左侧。
     图 15(A) 描述 40 小时、 80 小时和 120 小时后 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 对 MM 细胞的细胞毒性。图 15(B) 描述从三个不同的患者分离的 MM 细胞用 nBT062-SPDB-DM4 处理 2 天后的细胞活力。图 15(C) 显示在确定细胞活力前与 nBT062-SPDB-DM4 一起培养 72h 的源自 3 个健康受试对象的外周血单核细胞 (PBMC)。
     图 16(A) 显示其中 OPM1 细胞已经用免疫缀合物处理 0h、 12h 或 24h 的细胞周期 分析， 并通过 PI 染色分析细胞周期曲线。图 16(B) 中， 在存在或不存在免疫缀合物时培养 OPM1 细胞 24h、 48h 或 72h。 通过 Apo 2.7 抗体染色和流式细胞仪分析估算凋亡细胞百分比。 图 16(C) 中， 在存在 885μg/ml nBT062-SPDB-DM4 时培养 OPM1 细胞指定的时间 ( 左图 )， 或 用不同浓度的免疫缀合物 ( 中图 ) 培养 OPM1 细胞。泛半胱天冬酶 (pan-caspase) 抑制剂 zVAD-fmk 阻断的 nBT062-SPDB-DM4 诱导半胱天冬酶 -8、 -9 和 -3 以及聚 (ADP- 核糖 ) 聚合 酶 (PARP) 在 OPM1 细胞中的切割 ( 右图 )。
     图 17 在 (A) ～ (C) 中显示 IL-6、 IGF-1 和 BMSC 对 MM 细胞生长和 MM 细胞对免疫 缀合物的敏感性的影响。图 17(D) 显示使用地塞米松代替免疫缀合物的实验。图 17(E) 显示在存在或不存在免疫缀合物时， 采用肿瘤细胞和 BMSC 共培养物的细胞粘着实验结果。
     图 18(A) 描 述 对 通 过 OPM1GFP 细 胞 的 GFP 表 达 的 分 析。 图 18(B) 显 示 在 用 5×106OPM1GFP 细 胞 注 射 的 SCID 组 中， nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或 缓 冲 液 对 照对肿瘤尺寸的影响。图 18(C) 中与仅用运载剂处理的对照组 ( 实线 ； 正常盐水， n＝ 5) 相比， nBT062-SPDB-DM4 显著地增加存活 (P ＜ 0.0023， 虚线， n ＝ 5)。图 18(D) 证明 nBT062-SPDB-DM4 诱导体内凋亡。 具体实施方式
     本发明涉及一种包含 CD138 靶向剂的免疫缀合物， 和所述免疫缀合物的效应分子 向靶点的输送， 以及所述效应分子在靶细胞、 组织和器官中、 其上或其附近的位点特异性释 放。可以通过在靶点处从免疫缀合物的靶向剂部分切割 / 分离而激活所述效应分子。本发 明特别涉及这些免疫缀合物在抗击体内肿瘤生长中的应用， 和这些免疫缀合物克服或减少 在骨髓微环境中遭遇的保护性机制的能力的应用。
     可以对需要治疗性治疗的受试对象或分离自需要治疗性治疗的此类受试对象的 细胞施用本发明的免疫缀合物。可以通过在靶细胞、 组织或器官中、 其上或其附近切割 / 分 离而从所述免疫缀合物释放效应分子。 在一实例中， 对患有癌症的患者施用所述免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含靶向 表达 CD138 的细胞的抗体 nBT062， 以及至少一种作为效应分子的高细胞毒性药物或毒素。 在该实例中， 对患者静脉内施用治疗有效量的免疫缀合物， 以使所述免疫缀合物在癌细胞 中富集。 然后通过自然手段使所述效应分子从所述抗体释放。 在切割之后或期间， 可以通过 烷基化稳定所述效应分子， 并且使所述效应分子扩散到周围的不表达 CD138 的辅助细胞， 例如基质细胞。
     在第二实例中， 对患有癌症的患者施用所述免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含靶 向表达 CD138 的细胞的抗体 nBT062， 和作为效应分子的至少一种高细胞毒性药物或毒素， 以及另外的细胞毒性剂。 在该实例中， 依次施用治疗有效量的免疫缀合物和细胞毒性剂。 首 先对患者静脉内施用所述免疫缀合物， 以使所述免疫缀合物在骨髓微环境中的癌细胞中富 集。所述免疫缀合物基本上克服了细胞粘着介导的药物抗性 (CAM-DR)， 并且破坏了骨髓微 环境中相当大部分的表达 CD138 的肿瘤细胞。特别地， 所述效应分子通过天然手段从所述 抗体释放并且破坏肿瘤细胞。所述免疫缀合物至少部分地避免肿瘤细胞粘着至基质细胞， 某些所述基质细胞可能被扩散的效应分子破坏。12 小时的时间间隔后， 施用所述细胞毒性 剂。细胞毒性剂 ( 其活性通常被 CAM-DR 至少降低 ) 能够作用于不与基质细胞相粘连的肿 瘤细胞上并且破坏逃过免疫缀合物作用的表达 CD138 的肿瘤细胞。
     CD138 或粘结蛋白聚糖 -1(syndecan-1)( 也称 SYND1 ； SYNDECAN ； SDC ； SCD1 ； CD138 抗原， SwissProt 登录号 ： P18827 人类 ) 为一种膜糖蛋白， 最初记载其存在于源自上皮的细 胞上， 随后发现于造血细胞上 (Sanderson， 1989)。CD138 具有长的细胞外结构域， 该细胞外 结构域与可溶性分子 ( 例如生长因子 EGF、 FGF、 HGF) 和不溶性分子 ( 例如细胞外基质成分 胶原蛋白和纤连蛋白 ) 通过硫酸乙酰肝素链结合 (Langford， 1998 ； Yang， 2007)， 并且充当 细胞外基质的受体。 CD138 还通过由粘附细胞表达的肝素结合分子介导细胞与细胞的粘着。 已经显示 CD138 起骨髓瘤细胞的生长因子的共受体的作用 (Bisping， 2006)。 血浆细胞分化
     的研究表明， CD138 也必须被视为一种分化抗原 (Bataille， 2006)。
     在恶性造血中， CD138 在大多数的以下细胞上高度表达 ： MM 细胞、 卵巢癌、 肾癌、 胆 囊癌、 乳腺癌、 前列腺癌、 肺癌、 结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、 慢性淋 巴性白血病 (CLL)(Horvathova， 1995)、 急性淋巴性白血病 (ALL)、 急性髓细胞白血病 (AML) (Seftalioglu， 2003(a) ； Seftalioglu， 2003(b))、 实体组织肉瘤、 结肠癌以及表达 CD138 的 其它恶性血液病和实体肿瘤的细胞 (Carbone 等， 1999 ； Sebestyen 等， 1999 ； Han 等， 2004 ； Charnaux 等， 2004 ； O’ Connell 等， 2004 ； Oroszh 和 Kopper， 2001)。
     已经对 CD138 表达显示为阳性的其它癌症为多种卵巢腺癌、 膀胱移行细胞癌、 肾 透明细胞癌、 肺鳞状细胞癌、 乳腺癌和子宫癌 ( 参见， 例如， Davies 等， 2004 ； Barbareschi 等， 2003 ； Mennerich 等， 2004 ； Anttonen 等， 2001 ； Wijdenes， 2002)。
     在正常人类造血腔中， CD138 表达局限于血浆细胞 (Wijdenes， 1996 ； Chilosi， 1999)， 并且 CD138 不在外周血淋巴细胞、 单核细胞、 粒细胞和红细胞上表达。特别地， CD34+ 干细胞和祖细胞 (progenitor cell) 不表达 CD138， 并且抗 CD138mAb 不影响造血干细胞培 养物中集落形成单位的数量 (Wijdenes， 1996)。在非造血腔中， CD138 主要在肺、 肝、 皮肤、 肾和肠内的单层上皮和复层上皮上表达。 在内皮细胞上仅看到弱的染色 (Bernfield， 1992 ； Vooijs， 1996)。据报道， CD138 以多态性形式存在于人类淋巴瘤细胞中 (Gattei， 1999)。 已经报道单克隆抗体 B-B4、 BC/B-B4、 B-B2、 DL-101、 1D4、 MI15、 1.BB.210、 2Q1484、 5F7、 104-9、 281-2， 特别是 B-B4 对 CD138 有特异性。其中 B-B4、 1D4 和 MI15 既识别 CD138 的完整分子也识别其核心蛋白， 并且据显示识别相同或密切相关的表位 (Gattei， 1999)。 此 前的研究报道， B-B4 不识别可溶性 CD138， 但仅识别膜结合形式的 CD138(Wijdenes， 2002)。
     B-B4， 一种鼠 IgG1mAb， 与人类粘结蛋白聚糖 -1(CD138) 上的核心蛋白的 90 ～ 95 位残基之间的线性表位结合 (Wijdenes， 1996 ； Dore， 1998)。 与 CD138 的表达模式一致， 据显 示 B-B4 与血浆细胞系 RPMI8226 强烈地反应， 但不与内皮细胞反应。 同样与 CD138 的表达模 式一致， B-B4 还与上皮细胞系 A431( 源自角质形成细胞源 ) 和 HepG2( 源自肝细胞 ) 反应。 免疫毒素 B-B4- 皂草素对血浆细胞系 RPMI8226 也是高度毒性的， 事实上比游离皂草素的毒 性明显更强。然而， 从两个受测的上皮细胞系看出， B-B4- 皂草素仅对细胞系 A431 显示毒 性， 但在集落形成测试中皂草素对 A431 细胞的生长晕未显示出抑制作用 (Vooijs， 1996)。 其它研究者报道了 MM 相关抗原抗肿瘤缺少特异性 (Couturier， 1999)。
     在本发明的背景下， 抗体 / 免疫缀合物 “基本上由特定成分组成” 是指抗体 / 免疫 缀合物由指定的成分和任何不会在实质上影响所述抗体的基本特性的其它材料或成分组 成。
     本发明使用术语 “肿瘤细胞” 来包括癌细胞以及可能形成或可能不形成实体肿瘤 的部分的癌前细胞。
     本发明的 “靶向剂” 能够与由靶细胞表达的分子相连， 并且包括肽和非肽类。特别 地， 本发明的靶向剂包括靶向抗体和非免疫球蛋白靶向分子， 所述非免疫球蛋白靶向分子 可以基于包括但不限于 AFFILIN 分子、 ANTICALINS 和 AFFIBODIES 的非免疫球蛋白蛋 白。 非免疫球蛋白靶向分子还包括非肽靶向分子 ( 例如靶向 DNA 和 RNA 寡核苷酸 ( 适体 ))， 以及生理学配体， 特别是所关注的抗原的配体， 例如 CD138。
     本发明的 “靶向抗体” 为天然抗体或基于天然抗体， 或通过合成或通过基因工程而
     产生， 并且与目的细胞 ( 靶细胞 ) 上的抗原结合。本发明的靶向抗体包括单克隆抗体、 多克 隆抗体、 多特异性抗体 ( 例如双特异性抗体 )、 或抗体片段。所述靶向抗体可以被基因工程 化以便例如提高其与靶细胞的亲和性 (Ross， 2003)， 或减少其免疫原性。 所述靶向抗体可以 与包括效应分子的脂质体制剂相连 (Carter， 2003)。 抗体片段包含完整抗体的一部分， 优选 完整抗体的抗原结合区或可变区。本发明的抗体片段的实例包括 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2 和 Fv 片段以及双链抗体 (diabody) ； 结构域抗体 (domain antibody)(dAb)(Ward， 1989 ； 美国 专利 6,005,079) ； 线性抗体 ； 单链抗体分子 ； 和由抗体片段形成的多特异性抗体。 在单链可 变片段抗体 (scFv) 中， 重链和轻链 (VH 和 VL) 可以通过短的氨基酸连接子连接， 所述连接 子具有例如 (Gly4Ser)n 的序列并且具有足够的柔性而使两个结构域能装配成功能性抗原 结合袋。 添加各种信号序列可以使得靶向抗体具有更精确的靶向性。 添加轻链恒定区 (CL) 可以允许经由二硫键的二聚化， 从而提供更高的稳定性和亲合力。如果可获得针对所关注 的靶标的 mAb， 可以通过 RT-PCR 获得用于构建 scFv 的可变区， 所述 RT-PCR 从提取自亲本杂 交瘤的 mRNA 克隆出该可变区。作为另一种选择， 所述 scFv 可以通过噬菌体展示技术从头 产生 (Smith， 2001)。如本文所用， 当参照靶向抗体使用时， 术语 “功能片段” 是指能够特异 性结合抗原的靶向抗体的一部分， 所述抗原与所参照的抗体特异性地结合。本发明的双特 异性抗体可以例如具有对靶组织有反应性的至少一条臂， 以及对连接子部分有反应性的一 条臂 ( 美国专利公开 20020006379)。 本发明的双特异性抗体还可以与靶细胞上的超过一种 抗原结合 (Carter， 2003)。本发明的抗体可以通过例如引入半胱氨酸残基来引入巯基来修 饰 (Olafsen， 2004)。
     根据本发明， 所述靶向抗体可以源自任何来源， 并且可以为但不限于骆驼抗体、 小 鼠抗体、 嵌合人类 / 小鼠抗体或嵌合人类 / 猴抗体， 特别是例如 nBT062 等的嵌合人类 / 小 鼠抗体。
     人源化抗体为含有源自人类抗体和源自非人类抗体的序列的抗体， 其也在本 发明范围内。用于将抗体人源化的合适方法包括 CDR 移植 ( 互补决定区移植 )(EP 0 239 400 ； WO 91/09967 ； 美 国 专 利 5,530,101 ； 和 5,585,089)、 表 面 修 饰 (veneering) 或 表 面 重 塑 (resurfacing)(EP 0 592 106 ； EP 0 519 596 ； Padlan， 199 ； Studnicka 等， 1994 ； Roguska 等， 1994)、 链 改 组 (chain shuffling)( 美 国 专 利 5,565,332) 以 及 TM DeImmunosation (Biovation， LTD)。在 CDR 移植中， 将来自例如 mAb B-B4 等的小鼠互补 决定区 (CDR) 移植至人类可变框架， 然后将该人类可变框架与人类恒定区连接， 从而形成 人类 B-B4 抗体 (hB-B4)。现在已经将几种通过 CDR- 移植人源化的抗体用于临床， 包括 MYLOTARG(Sievers 等， 2001) 和 HECEPTIN(Pegram 等， 1998)。
     表面重塑技术使用分子模塑、 统计分析和诱变的组合来将抗体可变区的非 CDR 表面改变成与靶标宿主的已知抗体表面类似。在例如美国专利 5,639,641 中公开了用于 将抗体表面重塑的策略和方法， 以及用于降低不同宿主内抗体免疫原性的其它方法。可 以通过包括噬菌体展示方法的本领域已知的各种方法来制备人类抗体。还参见美国专利 4,444,887、 4,716,111、 5,545,806 和 5,814,318 ； 以及国际专利申请公开 WO 98/46645、 WO 98/50433、 WO 98/24893、 WO 98/16654、 WO 96/34096、 WO 96/33735 和 WO 91/10741。
     经受任何非天然修饰的靶向抗体， 例如， 嵌合人类 / 小鼠抗体或嵌合人类 / 猴抗 体、 人源化抗体或经基因工程化以便例如提高与靶细胞的亲和性或减少其免疫原性的抗体， 以及抗体片段、 特别是已经经受任何非天然修饰的此类靶向抗体的功能片段、 双链抗 体； 结构域抗体 ； 线性抗体 ； 单链抗体分子 ； 和多特异性抗体在本文也称为基因工程靶向抗 体。
     嵌合抗体， 保留非人类抗体 ( 例如它们所基于的小鼠抗体 ) 的抗体结合区 (ABR 或 Fab 区 )， 同时可以由例如人类抗体提供任何恒定区。通常， 抗体恒定区的嵌合和 / 或交换 不会影响抗体的亲和力， 这是因为有助于抗原结合的抗体区不受交换的影响。在本发明的 优选实施方式中， 本发明的基因工程抗体， 特别是嵌合抗体可以比其所基于的对应非人类 抗体具有更高的结合亲和力 ( 通过 KD 值表达 )。具体地， nBT062 抗体和基于该抗体的抗体 可以比小鼠 B-B4 具有更高的抗体亲和性。在本发明的另一实施方式中， 包含这些基因工程 抗体 / 嵌合抗体的免疫缀合物也显示出这种更高的抗体亲和性。在某些实施方式中这些免 疫缀合物也可以显示其它有利性质， 例如比其含有 B-B4 的对应物使肿瘤负荷降低得更多。 在优选实施方式中， 基因工程化、 特别是嵌合的靶向抗体显示出特征为解离常数 KD(nM) 小 于 1.6、 小于 1.5 或为 1.4 或约小于 1.4 的结合亲和力， 而其小鼠对应物的特征在于解离常 数 KD(nM) 为约 1.6 或大于 1.6。优选包含靶向抗体等靶向剂的免疫缀合物的特征在于， 解 离常数 KD(nM) 小于 2.6、 小于 2.5、 小于 2.4、 小于 2.3、 小于 2.2、 小于 2.1、 小于 2.0、 小于 1.9 或为约 1.9， 而包含小鼠对应物抗体的免疫缀合物的特征可以在于解离常数 KD(nM) 为 约 2.6 或大于 2.6( 比较表 3、 材料和方法 )。
     也可以使用完全人类抗体。可以通过噬菌体展示方法筛选这些抗体， 其中 CD138 或其抗原性决定子用于选择性地与表达例如 B-B4 可变区的噬菌体结合 ( 参见， Krebs， 2001)。有利的是， 该方法可以与亲和力成熟技术联合， 来提高抗体的亲和力。本文涉及的 所有抗体均为分离的抗体。
     在一个实施方式中， 未缀合形式的靶向抗体被中等或较弱地内化。在 37℃下温育 3 小时后， 中等内化构成约 30％～约 75％的抗体内化， 弱内化构成约 0.01％～最大约 30％ 内化。在另一优选实施方式中， 所述靶向抗体结合 CD138， 例如抗体 B-B4、 BC/B-B4、 B-B2、 DL-101、 1D4、 MI15、 1.BB.210、 2Q1484、 5F7、 104-9、 281-2， 特别是 B-B4。通过将 SP02/0 骨髓 瘤细胞与 Balb/c 小鼠的脾细胞杂交产生的杂交瘤细胞， 已经于 2007 年 12 月 11 日保藏在 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Mascheroder Weg 1， D-38124Braunschweig。这些表达 B-B4 的杂交瘤细胞的识别号为 DSM ACC2874。在 另一实施方式中， 所述靶向抗体基本上不结合非细胞表面表达的 CD138。在本发明的背景 下， 当特异性抗体的名称与术语 “靶向抗体” 结合 ( 例如 “nBT062 靶向抗体” ) 时， 这是指该 靶向抗体具有抗体 nBT062 的结合特异性。如果说靶向抗体 “基于” 一种特异性抗体， 这是 指该靶向抗体具有该抗体的结合特异性， 但可以采用与上述对靶向抗体的描述一致的任何 形式。在本发明的背景下， 当特异性抗原的名称与术语 “靶向抗体” 结合 ( 例如 “CD138 靶 向抗体” ) 时， 这是指该靶向抗体具有对 CD138 的结合特异性。在本发明的背景下， 如果例 如描述靶向抗体 “选择性地” 进行某事， 例如 “选择性地靶向细胞表面表达的 CD138” ， 或对 某事是 “选择性的” ， 这是指在所提供的实例的情况下， 与任何其它抗原相比， 对细胞表面表 达的 CD138 存在显著的选择性 ( 即， 对 CD138 阳性细胞比对于 CD138 阴性细胞更高的亲和 性 )。由于该选择性， 显著减少了甚至避免给定环境中不利的副作用。
     本发明的 “非免疫球蛋白靶向分子” 包括源自非免疫球蛋白蛋白的靶向分子以及非肽靶向分子。将包括在该定义中的小的非免疫球蛋白蛋白设计成对特别是表面表达的 CD138 具有特异性亲和性。 这些小的非免疫球蛋白蛋白包括基于支架的基因工程分子， 例如 具有相对低分子量 ( 例如 10kDa ～ 20kDa) 的 Affilin 分子。合适的支架包括例如 γ 晶 体。这些分子在其自然状态对靶标分子无特异性结合活性。通过对蛋白表面经由溶剂暴露 的氨基酸的局部限定随机化而进行基因工程化， 形成全新的结合位点。由此将此前的非结 合蛋白转变成特异性结合蛋白。可以将此类分子特异地设计成结合例如 CD138 等的靶标， 并允许特异性输送一种或多种效应分子 ( 参见， www.scilproteins.com 的 scil Proteins GmbH， 2004)。另一种非免疫球蛋白靶向分子源自脂钙蛋白 (lipocalin)， 并且包括例如 ANTICALINS ， 所述 ANTICALINS 与免疫球蛋白在结构上具有某种程度的相似性。 然而脂钙 蛋白由具有 160 ～ 180 个氨基酸残基的单链多肽构成。可以将脂钙蛋白的结合袋改造以便 以高亲和性和特异性来识别所关注分子 ( 参见， 例如， Beste 等， 1999)。人工细菌受体 ( 例 如商标为 Affibody (Affibody AB) 的受体 ) 也在本发明范围内。这些人工细菌受体分子 为较小的简单蛋白， 并且可以由基于蛋白 A( 金黄色葡萄球菌 ) 的一种 IgG 结合结构域的支 架的三螺旋束构成。 这些分子具有与许多免疫球蛋白类似的结合性质， 但是明显更小， 分子 量通常不超过 10kDa， 并且相对稳定。合适的人工细菌受体分子例如美国专利 5,831,012 ； 6,534,628 和 6,740,734 中所述。 其它 “非免疫球蛋白靶向分子” 为正讨论的抗原的生理学配体。CD138 的生理学 配体包括但不限于例如 ADAMTS4( 聚蛋白多糖酶 -1)、 抗凝血酶 -3、 bFGF、 组织蛋白酶 G、 CCL5(RANTES)、 CCL7、 CCL11、 CCL17、 CD44、 胶原蛋白 (1 型胶原蛋白、 2 型胶原蛋白、 3 型胶原 蛋白、 4 型胶原蛋白、 5 型胶原蛋白、 6 型胶原蛋白 )、 CXCL1、 弹性蛋白酶、 gp120、 HGF[ 肝细胞 生长因子 ]、 层粘连蛋白 -1、 层粘连蛋白 -2、 层粘连蛋白 -5、 中期因子 (midkine)、 MMP-7、 嗜 中性粒细胞弹性蛋白酶和多效生长因子 (pleiotrophin)(HBNF， HBGF-8)。非肽靶向分子包 括但不限于与 CD138 结合的 DNA 和 RNA 寡核苷酸 ( 适体 )。
     本发明的 “效应分子” 为如下的分子或衍生物或其类似物 ： 所述分子连接至靶向 剂、 特别是靶向抗体和 / 或基因工程靶向抗体， 并且对靶细胞发挥所期望的作用， 例如凋 亡、 或另一类型的细胞死亡、 或连续的细胞周期停滞。本发明的效应分子包括在靶细胞中 能够发挥所期望作用的分子， 并且包括， 但不限于， 毒素、 药物 ( 特别是低分子量细胞毒性 药物 )、 放射性核素、 生物响应修饰剂、 成孔剂、 核糖核酸酶、 具有凋亡诱导活性的凋亡信号 传导级联的蛋白、 细胞毒性酶、 前药激活酶、 反义寡核苷酸、 抗体或细胞因子以及其功能衍 生物或类似物 / 片段。毒素可以包括细菌性毒素， 例如但不限于白喉毒素或外毒素 A ； 植物 毒素， 例如但不限于蓖麻毒蛋白。具有凋亡诱导活性的凋亡信号传导级联的蛋白包括但不 限于粒酶 B、 粒酶 A、 半胱天冬酶 -3、 半胱天冬酶 -7、 半胱天冬酶 -8、 半胱天冬酶 -9、 截短的 Bid(tBid)、 Bax 和 Bak。
     在优选实施方式中， 所述效应子增加免疫缀合物的内部效应子输送， 尤其当免疫 缀合物的靶向抗体所基于的抗体的天然形式可被较弱地内在化时。在另一优选实施方式 中， 所述效应子的天然形式是非选择性的。在某些实施方式中， 当处于天然形式时， 所述效 应子具有高度的非选择性毒性， 包括系统毒性。本发明效应分子的 “天然形式” 为在与靶向 剂连接而形成免疫缀合物之前的效应分子。在另一优选实施方式中， 与靶向剂缀合后基本 上消除了效应分子的非选择性毒性。在另一优选实施方式中， 当到达靶细胞时， 所述效应
     分子在靶细胞中引起死亡或连续的细胞周期停滞。本发明的药物效应分子包括但不限于 如下的药物 ： 包括例如充当微管蛋白聚合的抑制剂的小型高细胞毒性药物 ( 例如类美登素 类、 多拉司他汀 (dolastatins)、 奥雷司他汀 (auristatin) 和念珠藻环肽 (cryptophycin)) 的药物 ； DNA 烷基化剂， 如 CC-1065 类似物或衍生物 ( 美国专利 5,475,092 ； 5,585,499 ； 6,716,821) 和倍癌霉素 (duocarmycin) ； 烯二炔类 (enediyne) 抗生物例如卡里奇霉素 (calicheamicin) 和埃斯培拉霉素 (esperamicin) ； 以及强效类紫杉烷 (taxoid)( 紫杉烷 ) 药物 (Payne， 2003)。特别优选类美登素类和卡里奇霉素类。效应子类美登素包括任何 来源的类美登素， 包括但不限于合成的美登醇和美登醇类似物和衍生物。多柔比星、 道诺 霉素、 甲氨蝶呤、 长春碱、 新制癌菌素、 大分子霉素、 三亚胺醌 (trenimon) 和 α- 鹅膏菌素 (amanitin) 为本发明范围内的一些其它效应分子。 作为效应分子的反义 DNA 分子也在本发 明范围内。当特定药物或药物种类的名称与术语 “效应子” 或 “效应分子” 结合时， 是指基 于该特定药物或该药物种类的本发明的免疫缀合物的效应子。
     美登素是最初源自埃塞俄比亚灌木齿叶美登木 (Maytenus serrata) 的一种天然 产物 (Remillard， 1975 ； 美国专利 3,896,111)。该药物抑制微管蛋白聚合， 从而导致阻断 有丝分裂和细胞死亡 (Remillard， 1975 ； Bhattacharyya， 1977 ； Kupchan， 1978)。美登素的 细胞毒性比临床使用的影响微管蛋白聚合的抗癌药 ( 例如长春花生物碱类或紫杉醇 ) 高 200 ～ 1000 倍。然而， 美登素的临床试验表明， 其由于高的系统毒性而缺少治疗窗。美登素 和类美登素类是高度细胞毒性的， 但是其在癌症治疗中的临床应用受其严重的系统性副作 用限制， 该副作用主要归因于其对肿瘤的不良选择性。使用美登素的临床试验显示出对中 枢神经系统和胃肠系统的严重副作用。
     类美登素类也已经从其它植物、 包括滑桃树 (Trewia nudiflora) 的种子组织分离 出 ( 美国专利 4,418,064)。
     某些微生物也产生类美登素， 例如美登醇和 C-3 美登醇酯 ( 美国专利 4,151,042)。
     本发明还涉及任何来源的类美登素， 包括合成的美登醇和美登醇类似物， 其公开 于 例 如 美 国 专 利 4,137,230、 4,248,870、 4,256,746、 4,260,608、 4,265,814、 4,294,757、 4,307,016 、 4,308,268 、 4,308,269 、 4,309,428 、 4,313,946 、 4,315,929 、 4,317,821 、 4,322,348 、 4,331,598 、 4,361,650 、 4,362,663 、 4,364,866 、 4,371,533 、 4,424,219 和 4,151,042 中。
     在一个优选实施方式中， 类美登素为含巯基的类美登素， 并且更优选根据 Chari 等的美国专利 6,333,410 或 Chari 等 (Chari， 1992) 中公开的方法产生。 2
     在本发明的背景下， DM-1(N - 脱乙酰基 -N2-(3- 巯基 -1- 氧代丙基 ) 美登素 ) 为 一种优选的效应分子。DM1 比美登素的细胞毒性高 3 倍～ 10 倍， 并且通过借助于二硫键将 其连接至针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体而已被转化成前药。某些此类缀合物 ( 有时称为 “肿瘤激活的前药” (TAP)) 在血液腔中无细胞毒性， 因为它们在与靶细胞连接时被激活并内 化， 由此释放药物 ( ， 2001)。已经开发出几种抗体 -DM1 缀合物 (Payne， 2003)， 并 且在临床试验中评价。例如， 在结直肠癌患者中 huC242-DM1 治疗被良好耐受， 不会诱导任 何可检测的免疫响应， 并且具有长循环时间 (Tolcher， 2003)。
     其它特别优选的类美登素包含含有空间位阻巯基键的侧链， 该类美登素例如但不 2’ 2’ 限于类美登素 N - 脱乙酰基 -N -(4- 巯基 -1- 氧代戊基 ) 美登素 ( 也称为 “DM3” ) 和 N2’ -脱乙酰基 -N2’-(4- 甲基 -4- 巯基 -1- 氧代戊基 ) 美登素 ( 也称为 “DM4” )。DM4 的合成如图 3 和图 4 所示并且在本文其它部分有所描述。DM4 与 DM1 和 DM3 的不同之处在于其在 αC 处携带有甲基。当将 DM4 经由连接子 ( 具体为但不限于包含二硫键的连接子 ) 连接至例如 nBT062 等靶向剂时， 会导致空间位阻。携带有空间位阻巯基的各种类美登素 ( 拥有一个或 两个取代基、 特别是烷基取代基， 例如 DM4 的甲基取代基 ) 公开于 2004 年 11 月 25 日公布 的美国专利申请 2004/0235840， 本文通过参考并入其全部内容。由与 DM3 和 DM4 的硫原子 相邻的碳上的例如甲基等烷基赋予的空间位阻可以影响免疫缀合物细胞内切割的速率。 因 此可变的烷基单元可以影响体外和体内潜力、 效力和安全性 / 毒性。
     如 Goldmahker 等在美国专利公开 2006/0233814 中所报道， 一旦在靶标处释放药 物， 此类空间位阻诱导游离药物的烷基化 ( 例如， 甲基化 )。烷基化可以增加该药物的稳定 性， 从而提供所谓的旁观者效应。然而， 本领域技术人员将意识到， 当将效应子经由连接子 连接至靶向剂时， 其它包含处在导致空间位阻的位置的例如烷基等取代基的效应分子也是 本发明的一部分 ( 美国专利公开 2004/0235840)。 优选的是， 这种位阻诱导游离药物的化学 修饰 ( 例如烷基化 ) 从而增加其总体稳定性， 这使得该药物在表达 CD138 的肿瘤细胞中不 仅诱导细胞死亡或连续的细胞周期停滞， 而且在必要时还影响例如支持或保护肿瘤免受药 物影响且通常不表达 CD138 的辅助细胞 ( 特别是肿瘤基质的细胞和肿瘤血管的细胞 ) 以致 减少或丧失其支持或保护功能。
     还特别优选 DNA 烷基化剂作为效应分子， 并且所述 DNA 烷基化剂包括但不限于 CC-1065 类似物或衍生物。 CC-1065 为分离自泽耳链霉菌 (Streptomyces zelensis) 的培养 物的强效抗肿瘤抗生物， 并且在体外已经显示出特殊的细胞毒性 ( 美国专利 4,169,888)。 例如美国专利 5,475,092、 5,585,499 和 5,739,350 所述的 CC-1065 类似物或衍生物落在本 发明范围内。 本领域技术人员会容易地意识到， 美国专利 5,846,545 所述的修饰的 CC-1065 类似物或衍生物， 和例如美国专利 6,756,397 所述的 CC-1065 类似物或衍生物的前药也 在本发明范围内。在本发明的某些实施方式中， CC-1065 类似物或衍生物可以如美国专利 6,534,660 中所述而合成。
     作为优选效应分子的另一组化合物为紫杉烷， 特别是高强效紫衫烷和含有巯基或 二硫基的紫杉烷。 紫杉烷为抑制微管蛋白解聚从而导致维管组装和细胞死亡速率增加的有 丝分裂纺锤体毒剂。 在本发明范围内的紫杉烷公开于例如美国专利 6,436,931、 6,340,701、 6,706,708 和美国专利公开 20040087649、 20040024049 和 20030004210 中。其它紫杉烷 公开于例如美国专利 6,002,023、 美国专利 5,998,656、 美国专利 5,892,063、 美国专利 5,763,477、 美国专利 5,705,508、 美国专利 5,703,247 和美国专利 5,367,086 中。 本领域技 术人员可以理解， PEG 化 (PEGylated) 的紫杉烷 ( 例如美国专利 6,596,757 中所述的紫杉 烷 ) 也在本发明范围内。
     本发明的卡里奇霉素效应分子包括 γ1I、 N- 乙酰基卡里奇霉素和卡里奇霉素的 其它衍生物。卡里奇霉素以序列特异性方式与 DNA 的小槽结合， 进行重排并使自由基暴露， 从而引起双链 DNA 的断裂， 进而导致细胞凋亡和死亡。可用于本发明背景下的卡里奇霉素 效应分子的一个实例描述于美国专利 5,053,394 中。
     本发明的免疫缀合物包含至少一种靶向剂 ( 特别是靶向抗体 ) 和一种效应分子。 所述免疫缀合物可以包含例如用于稳定化的其它分子。对于免疫缀合物， 术语 “缀合物”通常用于定义靶向剂与一种或多种效应分子的有效结合， 并不旨在仅指任一类有效结合， 特别是不限于化学 “缀合” 。只要所述靶向剂能够与靶点结合， 并且连接的效应子 ( 特别 是当输送至靶点时 ) 如预期地充分起作用， 任何连接模式都是适合的。本发明的缀合方法 包括但不限于在将效应分子和 / 或靶向抗体事先修饰或未事先修饰时将效应分子直接连 接至靶向抗体， 或经由连接子连接。连接子可以在功能上分类成例如 ： 酸不稳定性连接子、 光不稳定性连接子、 酶可切割连接子， 例如可以被肽酶切割的连接子。在本发明许多实施 方式中优选可切割连接子。可以在细胞环境、 特别是细胞内环境中存在的条件下切割此类 可切割连接子， 当切割时所述环境对药物释放无有害作用。如存在于特定的细胞内区室的 pH4 ～ 5 等低 pH 会切割酸不稳定连接子， 而光不稳定连接子可以通过例如红外光切割。然 而， 优选被大多数细胞中存在的生理条件切割或者在该生理条件下切割的连接子， 本文将 之称为生理性可切割连接子。因此， 在本发明许多实施方式中优选二硫键连接子。这些连 接子可通过能在生理条件下发生的二硫键交换而切割。 优选的异双官能二硫键连接子包括 但不限于 N- 丁二酰亚胺基 3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)( 参见， 例如 Carlsson 等 (1978))、 N- 丁二酰亚胺基 4-(2- 吡啶基二硫代 ) 丁酸酯 (SPDB)( 参见， 例如美国专利号 4,563,304)、 N- 丁二酰亚胺基 4-(2- 吡啶基二硫代 ) 戊酸酯 (SPP)( 参见， 例如 CAS 登记号 341498-08-6)、 N- 丁二酰亚胺基 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -1- 甲酸酯 (SMCC)( 参 见， 例如 Yoshitake 等， (1979)) 和 N- 丁二酰亚胺基 4- 甲基 -4-[2-(5- 硝基吡啶基 ) 二硫 代 ] 戊酸酯 (SMNP)( 参见， 例如美国专利号 4,563,304)。用于本发明组合物的最优选的连 接子分子为 SPP、 SMCC 和 SPDB。
     其它合适的连接子可以包括 “非可切割性” 键， 例如但不限于磺酸丁二酰亚胺基 马来酰亚胺基甲基环己烷甲酸酯 (SMCC)， 其为能够将化合物与含 SH 化合物连接的异双官 能连接子。双官能连接子分子和异双官能连接子分子， 例如针对糖的异双官能连接子分子 ( 例如 S-(2- 硫代吡啶基 )-L- 半胱氨酸酰肼 (TPCH))， 也在本发明范围内 (Vogel， 2004)。 例 如类美登素等效应分子可以经由两步反应法缀合至靶向抗体， 所述两步反应法包括 ： 第一 步， 将靶向抗体用交联剂 ( 例如 N- 丁二酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯 (SPDP)) 修饰， 以向 所述靶向抗体引入二硫代吡啶基。在第二步中， 可以将具有巯基的反应性类美登素 ( 例如 DM1) 加入经修饰的抗体， 从而引起在所述经修饰的抗体中硫代吡啶基的置换和二硫键连接 的细胞毒性类美登素 / 抗体缀合物的产生 ( 美国专利 5,208,020)。 然而， 一步缀合法， 例如 在 Chari 等的美国专利公开 20030055226 中描述的方法， 也在本发明范围内。在本发明的 一种实施方式中， 将同类或不同类的多种效应分子与靶向抗体相连。 如本文别处所讨论， 所 用连接子的性质可能影响旁观者杀伤 (Kovtun 等， 2006)。也参见图 13 的讨论。
     可以经由例如美国专利 6,716,821 中所述的 PEG 连接基团， 将 CC-1065 类似物或 衍生物缀合至所述靶向剂。
     卡里奇霉素可以经由连接子缀合至靶向抗体 ( 美国专利 5,877,296 和美国专利 5,773,001)， 或根据美国专利 5,712,374 和美国专利 5,714,586 中公开的缀合方法缀合至 靶向抗体。 用于制备卡里奇霉素缀合物的另一优选方法记载于美国专利公开 20040082764。 本发明的免疫缀合物可以采用重组融合蛋白的形式。
     术语 “细胞毒性剂” 包含 “细胞毒性药物 / 癌症药物” ， 包括化疗剂， 例如美法仑、 环 磷酰胺、 长春新碱、 多柔比星和脂质体多柔比星 (DOXIL)、 环磷酰胺、 足叶乙甙、 阿糖胞苷和顺铂， 例如泼尼松 (prednisone) 和地塞米松等糖皮质激素类和例如沙利度胺、 硼替佐米、 来那度胺 (lenalidomide) 等试剂， 以及例如索拉非尼 (sorafenib) 等激酶抑制剂或例如罗 明待辛 (romidepsin) 等 HDAC( 组蛋白脱乙酰酶 ) 抑制剂， 以及生长抑制剂、 抗激素剂、 抗血 管生成剂、 保心剂、 免疫刺激剂、 免疫抑制剂、 血管生成抑制剂、 蛋白酪氨酸激酶 (PTK) 抑制 剂。该定义还包括抗体类细胞毒性剂， 包括具有在本领域内了解的细胞毒性作用的免疫缀 合物和抗体。Anti-CD40 为优选的抗体。其它抗体包括但不限于例如 AVASTIN( 贝伐单抗 (bevacizuab)) 或 MYELOMACIDE( 米拉珠单抗 (milatuzumab))。
     THALOMID(α-(N- 邻苯二甲酰亚氨基 ) 戊二酰亚胺 ； 沙利度胺 ) 是免疫调节剂。 沙利度胺的经验式为 C13H10N2O4， 克分子量为 258.2。沙利度胺的 CAS 号为 50-35-1。其似乎 具有多种作用， 包括以各种方式抑制骨髓瘤细胞生长和存活的能力和抑制新血管生长的能 力。
     VELCADE 是用于治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂。据信 VELCADE 作用在骨髓 瘤细胞上而引起细胞死亡， 和 / 或通过作用于骨微环境而间接作用， 从而抑制骨髓瘤细胞 生长和存活。在不受特定理论或作用模式的限制下， VELCADE 因而破坏正常细胞过程， 导致 促进凋亡的蛋白酶体抑制。
     REVLIMID 是免疫调节剂。 认为 REVLIMID 影响骨髓瘤细胞中的多种途径， 从而诱导 凋亡、 抑制骨髓瘤细胞生长、 抑制血管内皮生长因子 (VEGF)， 由此抑制血管生成和降低骨髓 瘤细胞粘着至骨髓基质细胞。
     地塞米松为充当消炎剂和免疫抑制剂的合成糖皮质激素甾体。 当施用至癌症患者 时， 地塞米松能够对抗癌症治疗的副作用。 地塞米松还能够单独给药或与包括沙利度胺、 阿 霉素或长春新碱等的其它抗癌剂一起给药。
     术语 “与…组合” 不限于在精确地同一时间施用。相反， 该术语涵盖依次或以一定 的时间间隔施用本发明的免疫缀合物与其它治疗方案 ( 例如放射治疗 ) 或试剂 ( 特别是上 述的细胞毒性剂 )， 以使它们可以共同起作用， 从而提供与仅使用本发明的免疫缀合物或例 如其它试剂的治疗相比更大的益处。优选所述免疫缀合物和其它试剂累加地起作用， 特别 优选它们协同地起作用。以对于预期目的有效的量合适地提供此类分子。熟练的医学从业 者能够根据经验， 或通过考虑试剂的药代动力学和作用模式来确定各治疗剂的合适剂量、 以及施用的合适时机和方法。如本发明的背景下所用， “共施用” 是指与免疫缀合物同时施 用， 通常是以组合剂型施用。
     术语 “序列同一性” 是指对核苷酸序列或氨基酸序列同一性的量度。通常， 比对所 述序列， 从而获得最高量级的匹配。 “同一性” 本身在本领域具有公知的含义， 并且可以使用 已公开的技术计算 ( 参见， 例如 ： Computational Molecular Biology， Lesk， A.M. 编， Oxford University Press， New York， 1988 ； Biocomputing ： Informatics and Genome Projects， Smith， D.W. 编， Academic Press， New York， 1993 ； Computer Analysis of Sequence Data， Part I， Griffin， A.M. 和 Griffin， H.G. 编， Humana Press， New Jersey， 1994 ； Sequence Analysis in Molecular Biology， von Heinje， G， Academic Press， 1987 ； 和 Sequence Analysis Primer， Gribskov， M.and Devereux， J. 编， M Stockton Press， New York， 1991)。 尽管存在许多测定两个多核苷酸或多肽序列之间同一性的方法， 术语 “同一性” 对本领域技 术人员而言是公知的 (Carillo， H.& Lipton， D.， SIAM J Applied Math 48 ： 1073(1988))。任何特定的核酸分子是否与例如 nBT062 核酸序列或其一部分具有至少 50 ％、 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性， 可以如下常规 确定 ： 使用已知的计算机程序例如 DNAsis 软件 (Hitachi Software， San Bruno， Calif.) 进 行初始序列比对， 然后使用 ESEE3.0 版 DNA/ 蛋白质序列软件 (cabot@trog.mbb.sfu.ca) 进 行多重序列比对。
     氨基酸序列是否与例如 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 或其一部分具有至少 50％、 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％， 96％、 97％、 98％或 99％的同一性， 能够使用已知 的计算机程序例如 BESTFIT 程序 (Wisconsin Sequence Analysis Package， Unix 用第 8 版， Genetics Computer Group， University Research Park， 575 Science Drive， Madison， Wis.53711) 而 常 规 地 确 定。BESTFIT 使 用 Smith 和 Waterman， Advances in Applied Mathematics 2 ： 482-489(1981) 的局部同源性算法， 来寻找两个序列之间同源性最高的片 段。
     当使用 DNAsis、 ESEE、 BESTFIT 或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与 本发明的参照序列具有例如 95％同一性时， 将参数设置如下 ： 在参照核酸或氨基酸序列的 全长上计算同一性百分比， 允许同源性中的间隔 (gap) 至多为参照序列中核苷酸总数的 5％。
     在本发明的背景下， 如果提及与特定序列的残基组合的序列同一性， 则该序列同 一性涉及所指定的所有残基的总和。
     基本抗体分子为双官能结构， 其中可变区与抗原结合， 而剩下的恒定区可以引起 非抗原依赖性响应。大多数抗体类型 (IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM) 由恒定区确定。这些类 型可以进一步分成亚类 ( 同型 )。例如， IgG 类具有四种同型， 即根据恒定区确定的 IgG1、 IgG2、 IgG3、 和 IgG4。各种人类抗体类型中， 已知仅人类 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgM 有效地激 活补体系统。尽管恒定区不形成抗原结合位点， 恒定区和铰链区的排布可以对所述分子赋 予片段柔性， 这使其可与抗原结合。
     不同的 IgG 同型能够与例如单核细胞、 B 细胞和 NK 细胞等细胞上的 Fc 受体结合， 从而激活细胞以释放细胞因子。 不同的同型还可以激活补体， 导致局部或系统性炎症。 特别 是， 不同的 IgG 同型可以以不同的程度结合 FcγR。 FcγR 为一组属于 Ig 超家族的表面糖蛋 白， 主要在白细胞上表达。 将 FcγR 糖蛋白分成三类， 称为 FcγRI(CD64)、 FcγRII(CD32) 和 FcγRIII(CD16)。尽管 IgG1、 IgG2 和 IgG3 与各种此类 FcγR 糖蛋白强烈地结合， IgG4 显 示出弱得多的结合。具体而言， IgG4 为 FcγRI 的中间体结合剂， 其产生相对低的 ADCC( 抗 体依赖性细胞毒性 ) 甚至不产生 ADCC， 并且不与 FcγRIIIA 或 FcγRIIA 结合。IgG4 也是 FcγRIIB 的弱结合剂， 所述 FcγRIIB 为抑制性受体。此外， IgG4 仅介导微弱的补体固定或 不介导补体固定， 具有微弱的补体依赖性细胞毒性 (CDC) 或不具有 CDC。在本发明的背景 下， IgG4 可以具体用于预防 Fc 介导的肝 FcR 靶向， 这是因为其没有显示出与 LSEC( 肝窦状 内皮细胞 ) 上的 FcRγII 的相互作用， 还显示出与 Kupffer 细胞 ( 巨噬细胞 ) 上的 FcRγI ～ III 无相互作用或具有弱相互作用， 并且与肝 NK 细胞上的 FcRγIII 无相互作用。 进一步降 低任何 CDC 的某些突变也是本发明的一部分。例如在 327、 330 和 331 位的 IgG4 残基显示 出 ADCC( 抗体依赖性细胞毒性 ) 和 CDC 的降低 (Amour， 1999 ； Shields， 2001)。使抗体稳定 化的多种突变之一也是本发明的一部分 ( 本文也称为 “稳定化突变” )。这些突变特别包括IgG4 的 CH2 区中的亮氨酸突变成谷氨酸， 和 IgG4 铰链核心中的丝氨酸交换为脯氨酸。在 本发明的某些实施方式中， 这些突变使半分子 (half-molecule) 的量减少至小于 10％、 小 于 5％且优选小于 2％或 1％。此外， 如此稳定化的抗体的体内半衰期可以增加几天， 包括 1 天、 2 天、 3 天、 4 天和超过 5 天 (Schuurman， 1999)。
     本文所述的包括靶向抗体等靶向剂， 还可以根据它们与抗原、 特别是 CD138 的结 合亲和性来描述或说明。例如靶向抗体等靶向剂的优选结合亲和性的特征在于， 解离常数 KD(nM) 小于 1.6、 小于 1.5 或约为 1.4 或小于 1.4。对于包含如靶向抗体等所述靶向剂的免 疫缀合物而言， 解离常数 KD(nM) 优选小于 1.6、 小于 1.5 或小于 2.5、 小于 2.4、 小于 2.3、 小 于 2.2、 小于 2.1、 小于 2.0、 小于 1.9 或约为 1.9。
     本发明的抗原结合区 (ABR) 会基于所用的靶向抗体或基因工程靶向抗体的类型 而变化。在天然存在的抗体中和在大多数嵌合抗体和人源化抗体中， 抗原结合区由重链的 前两个结构域和轻链组成。然而， 在没有轻链的重链抗体中， 抗原结合区仅由例如重链的 前两个结构域组成， 而在将抗体分子的轻链和重链可变区合并于单个多肽链中的轻链抗体 (ScFv) 中， ABR 仅由一个多肽分子提供。FAB 片段通常通过木瓜蛋白酶消化而获得， 并且具 有一条轻链和重链的一部分， 因此包含仅具有一个抗原结合位点的 ABR。另一方面， 双链抗 体为具有两个抗原结合区的小的抗体片段。 然而， 在本发明的背景下， 靶向抗体或基因工程 靶向抗体的抗原结合区为任何主要决定靶向抗体或基因工程靶向抗体的结合特异性的区 域。
     如果据称 ABR 或另一靶向抗体区 “出自某种抗体” ， 例如人类或非人类抗体， 这是 指在本发明的背景下 ABR 或者与相应的天然存在的 ABR 相同， 或者基于该相应的天然存在 的 ABR。如果 ABR 具有天然存在的 ABR 的结合特异性， 则该 ABR 基于天然存在的 ABR。然而， 此类 ABR 可以包含例如点突变、 添加、 缺失或例如糖基化等翻译后修饰。 特别地， 此类 ABR 可 以与天然存在的 ABR 的序列具有超过 70％、 超过 80％、 超过 90％、 优选超过 95％、 超过 98％ 或超过 99％的序列同一性。
     在本发明的背景下， 靶向剂 ( 例如靶向抗体， 特别是包含靶向抗体的免疫缀合物 ) 的均匀靶向 (homogenous targeting) 是对与用该靶向剂获得所述靶向的期望结果相关的 差异的量度。在本发明的某些实施方式中， 所期望的结果通过与靶标的简单结合而获得。 即， 例如， 其中某种靶向剂提供抵抗随后结合的防护的实施方式的情况。然而， 靶向剂的均 匀性 (homogeneity) 可以通过例如包含所述靶向剂的免疫缀合物的效力而容易地估算。例 如， 所述免疫缀合物针对例如 CD138 等肿瘤抗原 ( 该肿瘤抗原包含旨在破坏肿瘤细胞和 / 或使肿瘤生长停滞的效应子 ) 的效力可以通过包含表达 CD138 抗原的细胞的肿瘤的生长抑 制程度而确定。 此类免疫缀合物可以在其效力方面显示出较高的差异。 例如， 有时其可以以 高效力使肿瘤生长停滞， 但其它时候该效力很难超过对照的效力。 另一方面， 免疫缀合物在 效力方面的较低差异， 显示出免疫缀合物和 / 或靶向剂分别一致地提供所期望的结果。一 种靶向均匀性定量方法为计算靶向差异 (targeting variation)。在包含某种靶向剂的免 疫缀合物使肿瘤生长停滞的情况下， 靶向差异可以如下计算 ： 首先确定肿瘤达到预定体积 3 ( 例如 300mm ) 的时间。优选地， 选择预定体积从而使在达到所述预定体积之前和之后的任 何肿瘤生长均以大致相同的速率稳定地增加。在对于一组受试对象已经确定所述时间后， 计算受试对象组 ( 例如， SCID 小鼠或显示均匀肿瘤生长的另一合适的模型 ) 中这些时间的平均值 (Tm)。然后将 Tm 与观察值相关联， 所述观察值获自显示出最低靶向效力并因此与达 到所述预定体积所需时间 (Tf) 最少的肿瘤相关的组内受试对象， 并在另一方面， 获自显示 出最低靶向效力并因此与达到所述预定体积所需时间 (Ts) 最多的肿瘤有关的组内受试对 象， 所述相关性通过根据下式计算预定体积的靶向差异而获得 ：
     靶向差异 [％ ] ＝ Ts-Tf/Tm×100
     在一个优选实施方式中， 本发明的包含基因工程靶向抗体的免疫缀合物的靶向差 异小于 150％、 小于 140％、 小于 130％、 小于 120％、 小于 110％、 小于 100％、 小于 90％、 小于 80％、 小于 70％、 小于 60％或小于 50％， 在某些实施方式中甚至小于 45％。优选地， 所述靶 向差异为约 10％～约 150％， 优选约 10％～约 100％、 约 10％～约 80％、 约 10％～约 70％、 约 10％～约 60％、 约 10％～约 50％。
     靶向的均匀性还可以通过其它手段 ( 例如确定肿瘤生长延迟 ) 而定量。另外， 本 领域技术人员易于理解， 特定尺寸的肿瘤体积仅仅是一个可以基于其而确定靶向差异的参 数。根据所期望的结果， 可以使用其它参数， 包括时间 ( 例如衡量肿瘤生长延迟的时间 ) 或 结合百分比 (％ )。本领域技术人员能够容易地确定这些其它参数。
     图 9(C) 和 (D) 中显示包含小鼠抗体 BB4 的免疫缀合物 (BB4-SPP-DM1 ； 图 9C) 和包 含基于该抗体的基因工程靶向抗体 nBT062 的免疫缀合物 (nBT062-SPP-DM1 ； 图 9D) 之间， 靶向 / 结合的均匀性的差异。从这些图可以看出， 使用包含基因工程靶向抗体的免疫缀合 物获得的结果比使用包含上述小鼠抗体的免疫缀合物获得的结果明显更均匀。这由于 BB4 的抗体结合区在 nBT062 中未经修饰而特别显著。由此， 包含小鼠抗体的抗体结合区而不是 小鼠抗体其它部分的免疫缀合物显示出远超出本领域技术人员预期结果的性质。 nBT062( 也参见图 1) 为小鼠人类嵌合 IgG4mAb， 为 B-B4 的一种嵌合形式。创造 该嵌合形式的 B-B4 来降低 HAMA( 人类抗小鼠抗体 ) 响应， 同时维持 B-B4 的抗体结合区 对 CD138 的功能。令人惊奇的是， 使用包含该基因工程靶向抗体的免疫缀合物获得的结果 明显更加均匀 ( 结果中的差异降低 )。以下说明用于产生 nBT062 的方案。表达 nBT062 的 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 已 经 于 2007 年 12 月 11 日 保 藏 于 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Mascheroder Weg 1， D-38124Braunschweig。 识别号为 DSM ACC2875。基于 B-B4 的 CD138 特异性嵌合抗体在本文通称为 c-B-B4。
     已从 nBT062 用核苷酸序列的翻译物预测了重链和轻链的氨基酸序列。重链和轻 链的预测氨基酸序列如表 1 所示。预测的可变区用粗体标出， 预测的 CDR 用下划线标出。
     表 1.nBT062 的预测的氨基酸序列
     nBT062 重链预测序列 (SEQ ID NO ： 1) ：
     C 端赖氨酸易于剪切， 并且可以由于不完全切割而在某种程度上存在。括号中的 (K) 不是 SEQ ID NO ： 1 的一部分。
     nBT062 轻链预测序列 (SEQ ID NO ： 2) ：
     表 2 显示 Krabat 和 Chothia 的一般 CDR 定义与对于 BT062 预测的 CDR 的比较。BT062 为一种包含靶向 CD138 的嵌合抗体 nBT062 的免疫缀合物， 所述嵌合抗体 nBT062 经由连接子 ( 此处为 SPDB) 连接至细胞生长抑制性类美登素衍生物 DM4。BT062 的 化学式在图 1 和 2 中提供。 包含 nBT062 和类美登素效应分子的免疫缀合物经常根据它们的 连接子和类美登素效应子来表征， 例如 nBT062-SMCC-DM1 为包含 nBT062、 SMCC( 一种 “非可 切割” 连接子， 含有硫酯键 ) 和作为效应子的 DM1 的免疫缀合物。更通常的是， 含有 nBT062 和效应分子的免疫缀合物还可以描述为 nBT062- 连接子 - 效应子或仅描述为 nBT062- 效应 子 (nBT062N， 其中 N 为本文所述的任何效应子 )。
     本文提到包含抗 CD138 的基因工程靶向抗体 ( 该抗体经由可切割连接子 (CL) 连 接至效应分子 ) 的免疫缀合物的无位阻对应物 (UI ： 无位阻免疫缀合物 )， 在此称为 UICL， UICL 与其中所述效应分子具有空间位阻并且含有可切割连接子的免疫缀合物 (HICL- 位 阻缀合物， 可切割连接子 ) 相反。UICL 为一种与包含基因工程靶向抗体的然而其中所述
     效应分子不是空间位阻的 HICL 等效的免疫缀合物。一对 HICL/UICL 的实例为 BT062 和 nBT062-SPP-DM1。 此类包含非可切割连接子的免疫缀合物的无位阻对应物 (UINCL)， 是指包 含基因工程靶向抗体的等效免疫缀合物， 在该等效免疫缀合物中效应分子不是空间位阻性 的并且包含非可切割连接子。对于 BT062 而言， nBT062-SMCC-DM1 会组成此类包含非可切 割连接子的无位阻对应物 (UNICL) 的实例。
     免疫缀合物的抑制肿瘤生长的活性 ( ＝肿瘤生长抑制活性 ) 是一个相对量度。其 描述一种缀合物相对于最高性能的免疫缀合物 ( 其活性设定为 100％ ) 的活性的肿瘤生长 抑制活性。例如， 如果将最高性能的免疫缀合物 ( 假设为引起 32 天的肿瘤生长延迟 (TGD) 的 BT062) 的活性设定为 100％， 如下计算例如 nBT062-DM1( 其显示 18 天的肿瘤生长延迟 (TGD)) 的活性 ：
     肿瘤生长抑制活性＝ 100×(TGDnBT062-DM1/TGDBT062)，
     更通常的 ：
     肿瘤生长抑制活性＝ 100×(TGD 样品 /TGD 对照 )。
     表 3 提供来自图 11B 中所述结果的合适实例 ：
     TGD*( 天 ) PBS nBT062-SMCC-DM1 BT062 nBT062-SPP-DM1
     ％活性 ** 0 56 100 400 18 32 13表3： 基于接受 450μg/kg 剂量的治疗组的抵抗 SCID 小鼠中的 MOLP-8 肿瘤异种 移植物的 nBT062-DMx 的肿瘤生长延迟 (TGD) 和％活性。
     (*) 肿瘤生长延迟 (TGD)( 以天为单位 )， 为治疗组达到预定尺寸 (160mm3) 的平均 时间 ( 以天为单位 ) 减去对照组达到该预定尺寸的平均时间。
     (**) 肿瘤生长抑制活性＝ 100×(TGDSample/TGDBT062)。 将 BT062 的活性定义为 100％。 在 表 2 提 供 的 实 例 中， BT062 提 供 的 肿 瘤 生 长 抑 制 活 性 比 其 无 位 阻 对 应 物 (nBT062-SPP-DM1) 的活性高出 60％， 并且肿瘤生长抑制活性比其包含非可切割连接子的 无位阻对应免疫缀合物 (nBT062-SMCC-DM1) 的活性高出 44％。
     此前报道了在例如 huC242- 类美登素免疫缀合物中的可切割连接子可以提供所 谓的旁观者效应。Goldmahker 等 ( 美国专利公开 2006/0233814) 也描述了在从靶向剂 切割的情况下， 当对效应分子进行进一步修饰、 特别是烷基化时， 旁观者效应特别明显。 Goldmahker 等也指出 UICL 比相应的 UINCL 显示出更好的 TGD( 参见， 例如美国专利公开 2006/0233814 的图 6)。
     然而， HICL/UICL/UINCL 免疫缀合物的总体有效性似乎在不同免疫缀合物与免 疫缀合物和 / 或靶标与靶标之间有所不同。例如在减小肿瘤尺寸的能力方面 UINCL 曲
     妥 珠 单 抗 -SMCC-DM1 明 显 地 胜 过 HICL 曲 妥 珠 单 抗 -SPP-DM4， 而 UICL 免 疫 缀 合 物 曲 妥 珠 单 抗 -SPP-DM1 的 性 能 基 本 上 与 相 应 的 HICL 类 似 ( 参 见 Eberts 等 的 美 国 专 利 公 开 2008/0171040)， 从而使得所获得的结果为免疫缀合物和靶标的函数。
     图 11A 显示 HICL 胜过 UICL 和 UNICL， 还令人惊奇的发现高的单剂量方案 (250μg/ kg) 中的 UICL 实际上没有比 UINCL 显示出任何更好的结果。事实上， 在此类方案的 UICL 中 观察到的 TGD( 以天为单位 ) 实际上低于 UINCL 的 TGD。随着剂量增加 (450μg/kg)， 该观 察结果变得更明显。总之， 如图 11A 中所示， 在单剂量实验中 HICL 以出乎意料的程度胜过 UICL。与这些结果一致的是， 在反复剂量实验中， HICL 显著地胜过 UICL， 后者提供了仅勉强 超过对照的结果。此外， 在更高剂量下 UINCL 胜过 UICL。
     多发性骨髓瘤细胞对基质细胞、 特别是骨髓基质细胞的粘着， 已经归因于多发性 骨髓瘤患者中观察到的粘着介导的药物抗性 (CAM-DR)。在某些实施方式中， 本发明的免疫 缀合物可以缓解 CAM-DR。 具体而言， 在本发明的某些实施方式中， 通过将免疫缀合物施用至 所述多发性骨髓瘤细胞， 该粘着减少例如至少约 10％、 约 20％、 约 30％、 约 40％、 约 50％、 约 60％、 约 70％、 约 80％以上。如图 17E 所示， 在其中仅基质细胞经过处理的样品中 ( 以及在 其中基质细胞未经处理的样品中 )， 特别是 UICL 和 HICL 能够抑制多发性骨髓瘤细胞粘着至 BMSC( 骨髓基质细胞 )， 而 UINCL 对应物不具有该作用。这些结果表明， 粘着减少作用取决 于免疫缀合物的连接子的性质， 优选具有允许效应分子更容易解离的可切割连接子的免疫 缀合物。事实上当使多发性骨髓瘤细胞至少部分避免粘着至 BMSC 时， 这也使得它们更容易 受到其它细胞毒性剂 ( 包括通常由于 CAM-DR 而对多发性骨髓瘤细胞的作用受抑制 ( 至少 其完全功效受到抑制 ) 的细胞毒性剂 ) 的作用。因此， 免疫缀合物的施用优选组合有同时 或依次施用细胞毒性剂。施用免疫缀合物和细胞毒性剂之间的时间间隔可以包括 12 天～ 6 天， 包括 12 小时、 24 小时、 2 天、 3 天、 4 天或 5 天。
     本文所述的免疫缀合物可以通过任何途径施用， 包括静脉内施用、 胃肠外施用、 口 服施用、 肌内施用、 鞘内施用或作为气雾剂施用。输送模式取决于所期望的效果。根据本发 明本领域技术人员易于了解对于特定的治疗的最佳施用途径。 合适的剂量取决于施用途径 和指定的治疗， 并且考虑到当前的治疗策略可由本领域技术人员容易地确定。
     可以根据常规的药物配混技术制备含有本发明免疫缀合物和 / 或任何其它细胞 毒性剂作为活性成分的药物组合物。 参见， 例如， Remington′ sPharmaceutical Sciences， 第 17 版 (1985， Mack Publishing Co.， Easton， Pa.)。典型地， 将有效量的活性成分与药物 可接受载剂混合。根据所期望用于施用 ( 例如静脉内、 口服、 胃肠外、 鞘内、 透皮或作为气雾 剂 ) 的剂型， 所述载体可以采用各种形式。
     对于口服施用， 可以将所述免疫缀合物和 / 或细胞毒性剂配成固体或液体制剂， 例如胶囊剂、 丸剂、 片剂、 锭剂、 熔融剂 (melts)、 粉剂、 悬浮剂或乳化剂。在制备口服剂型的 组合物中， 可以使用任何常用的药物介质， 例如在口服液体制剂 ( 例如悬浮剂、 酏剂和溶液 剂 ) 的情况下使用水、 二醇、 油、 醇、 调味剂、 防腐剂、 着色剂和助悬剂等 ； 或在口服固体制剂 ( 例如粉末剂、 胶囊剂和片剂 ) 的情况下使用例如淀粉、 糖、 稀释剂、 成粒剂、 润滑剂、 粘合 剂和崩解剂等载剂。由于易于施用， 片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式， 在 该情况下显然使用固体药物载剂。必要时， 可以通过标准技术将片剂包覆糖衣或肠溶衣。 活性剂必须稳定， 以便通过胃肠道。必要时， 可以使用适用于稳定通过的试剂， 此类试剂可以包括在文献中描述的磷脂或卵磷脂衍生物， 以及脂质体、 微粒 ( 包括微球体和巨球体 (macrosphere))。
     对于胃肠外施用， 可以将免疫缀合物和 / 或细胞毒性剂溶解于药物载剂， 并且作 为溶液剂或悬浮剂施用。 例举的合适的载体为水、 盐水、 磷酸盐缓冲液 (PBS)、 右旋葡萄糖溶 液、 果糖溶液、 乙醇、 或者动物油、 植物油或源自合成的油。所述载剂还可以含有其它成分， 例如防腐剂、 助悬剂、 增溶剂和缓冲剂等。当在脑室内或鞘内施用未缀合的靶向剂和 / 或免 疫缀合物和 / 或细胞毒性剂时， 还可将它们溶于脑脊液中。
     施用至受试对象的剂量可以根据受试对象 ( 包括人类以及非人类动物 ) 表面积而 指定。施用至此类受试对象的剂量可以优选但不限于约 5mg/m2 ～约 300mg/m2 的量， 包括 2 2 2 2 2 2 约 20mg/m 、 约 50mg/m 、 约 100mg/m 、 约 150mg/m 、 约 200mg/m 和约 250mg/m 。在其中将免 疫缀合物与细胞毒性剂组合施用的某些实施方式中， 免疫缀合物的剂量可以较低。可以一 次性合适地施用免疫缀合物， 或将其在一系列的治疗中施用。 在多次剂量方案中， 可以将这 些量每天一次、 每周一次、 每两周一次、 每四周一次、 每五周一次、 每六周一次地施用。具有 单次高剂量的负荷剂量， 或作为另一种选择的施用一次较低剂量之后不久施用另一次较低 剂量、 继以较长的时间间隔施用的剂量， 构成了本发明的优选实施方式。在优选实施方式 中， 针对受试对象调整给药时机， 以使在第二次和 / 或任何后续治疗之前经过足够的时间， 从而使此前的剂量已经基本代谢， 但是在受试对象的系统中存在的免疫缀合物的量仍然抑 制、 延迟和 / 或预防肿瘤生长。示例性的 “反复单剂量” 方案包括每三周一次施用起始剂量 2 为约 200mg/m 的免疫缀合物。作为另一种选择， 高起始剂量之后可以进行每两周一次的维 2 持剂量， 维持剂量为约 150μg/m 。然而， 也可使用其它给药方案。通过已知技术和测试易 于监测该治疗的进展。剂量可以根据它们是否为了预防或治疗目的而施用、 任何之前治疗 的疗程、 患者的临床史和对靶向剂 / 免疫缀合物的响应、 以及主治医师的判断而变化。
     在一个实施方式中， 将免疫缀合物与一种或多种其它细胞毒性剂一起施用， 所述 细胞毒性剂对于治疗相同的疾病是有效的， 但是当不与免疫缀合物一起施用时， 考虑到 CAM-DR 其有效性通常会受限 ； 例如 CD138 特异性免疫缀合物能够与地塞米松组合施用。特 别地， 在已经施用免疫缀合物后两小时， 对有需要的患者施用有效量的地塞米松。
     因此， 本发明的免疫缀合物还可以特别在使用以下的治疗方案中施用 ： 高剂量的 化学治疗 ( 优选美法仑、 美法仑 / 泼尼松 (MP)、 长春新碱 / 多柔比星 / 地塞米松 (VAD)、 脂质 体多柔比星 / 长春新碱、 地塞米松 (DVd)、 环磷酰胺、 足叶乙甙 / 地塞米松 / 阿糖胞苷、 顺铂 (EDAP))、 干细胞移植 ( 例如， 自体干细胞移植或异体干细胞移植， 和 / 或迷你异体 ( 非清髓 性 ) 干细胞移植 )、 甾体 ( 例如， 糖皮质激素、 地塞米松、 沙利度胺 / 地塞米松、 泼尼松、 美法 仑 / 泼尼松 )、 支持性治疗 ( 例如， 双膦酸盐类、 生长因子、 抗生素、 静脉内免疫球蛋白、 低剂 量放射治疗、 和 / 或矫形外科介入 )、 THALOMID( 沙利度胺， Celgene)、 VELCADE( 硼替佐米， Millennium) 和 / 或 REVLIMID( 来那度胺 )(Chelgene Corporation) 和 / 或其它多发性骨 髓瘤治疗 ( 包括放射治疗 )。
     如果本发明的免疫缀合物与细胞毒性剂组合施用， 通常维持上述剂量和治疗方 案。 然而， 如果免疫缀合物与细胞毒性剂共施用， 在某些实施方式中优选低剂量的各种所述 治疗性成分。在此类情况下， 免疫缀合物可以以约 5mg/m2 ～约 100mg/m2( 包括约 20mg/m2、 约 50mg/m2) 的剂量施用， 而细胞毒性剂的施用剂量为单独施用时所推荐的剂量。使用进一步支持这些发现的实验来确认在基于细胞培养的实验 ( 图 7) 和小鼠实 验 ( 图 8 ～ 11) 中获得的实验数据。
     多发性骨髓瘤的发病机理涉及骨髓瘤细胞经由细胞表面粘着分子不仅与骨髓基 质细胞 (BMSC) 结合， 还与细胞外基质 (ECM) 结合。该结合触发并最终造成多发性骨髓瘤细 胞生长、 药物抗性和 MM 细胞在骨髓环境中的迁移 (Munshi 等 2008)。 具体而言， 多发性骨髓 瘤细胞经由粘结蛋白聚糖 -1(CD138) 粘着至 I 型胶原蛋白， 诱导基质金属蛋白酶 1 表达， 从 而促进骨再吸收和肿瘤侵袭 (Hideshima 等， 2007)。多发性骨髓瘤细胞和骨髓微环境之间 的相互作用导致多效性增生 (pleiotropic proliferative) 级联和抗凋亡级联。
     在多发性骨髓瘤细胞自导引 (homing) 至骨髓基质腔之后， 多发性骨髓瘤细胞和 BMSC 之间的粘着使许多细胞因子上调， 如具有血管生成和肿瘤生长促进活性的白细胞介素 (IL-6) 和胰岛素样生长因子 (IGF-1)(Hideshima 等， 2007)。 由这些细胞因子启动的信号传 导级联最终导致 MM 细胞对常规治疗产生抗性 (Anderson 等， 2000 ； Hideshima 等， 2006)。
     在小鼠模型中分析了在存在人类骨髓时 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抵 抗 CD138 阳性肿瘤细胞的体内效力， 该分析的结果如图 12 所示。该图显示 HICL 和 UICL 在该环境中都表现良好。这些免疫缀合物抑制了可在该模型中用作 MM 细胞生长参数的 shulL-6R 水平的增加。 根据本发明， 使用 BT062 作为实例， 如下处理 MM。 该实例并非旨在以任何方式限制 本发明， 并且技术人员可以容易地确定属于本发明范围内的其它免疫缀合物或基于 nBT062 的系统， 以及可用于治疗例如 MM 等疾病的其它治疗方案。
     由于 CD138 在患者 MM 细胞上和在可经由血流获取的细胞上的选择性表达、 nBT062 的特异性和血流中 nBT062 的稳定性， BT062 消除 DM4 的系统性毒性， 并且提供靶向输送 DM4- 效应分子的机会。本发明的免疫缀合物提供将效应分子有效施用至细胞位点的手段， 在该细胞位点处效应分子能够从免疫缀合物释放。
     将一种或多种细胞毒性剂， 以一定剂量和剂型以及根据对这些细胞毒性剂建立的 治疗策略， 施用至还用本发明的免疫缀合物治疗的个体。
     具体而言， 使用根据本发明的合适剂量的 BT062( 例如 100mg/m2) 以一定的时间间 隔 ( 例如起初每天， 然后每周 ) 对患者进行治疗方案。每一次每周免疫缀合物治疗后 12 小 时， 还用美法仑治疗该患者， 例如根据制造商说明以口服剂型 ( 例如商标名为 ALKERAN 的丸 剂 ) 施用至患者。
     根据本发明， 使用 BT062 作为实例， 还可以如下治疗特别是实体肿瘤。该实例并非 旨在以任何方式限制本发明， 并且技术人员可以容易地确定可用于治疗实体肿瘤的本发明 的其它免疫缀合物和其它治疗方案。 首先治疗该肿瘤以降低肿瘤的尺寸， 例如通过放射。 随 后施用的 BT062 后其后施用的一剂细胞毒性剂 ( 例如以 ALKERAN 丸剂的形式 )， 提供对于消 除残留癌细胞的高度有效的手段。施用免疫缀合物允许特异性靶向这些残留的细胞， 并且 在靶点处释放效应分子。免疫缀合物不仅克服或减少关于其自身活性方面的 CAM-DR， 还由 于事实上其抑制多发性骨髓瘤细胞粘着至基质细胞， 免疫缀合物还克服或减少其它细胞毒 性剂的 CAM-DR。在优选实施方式中该免疫缀合物的高效力允许了单剂量方案。
     通过参考以下实施例进一步描述本发明， 提供这些实施例的目的在于示例说明而 并非旨在以任何方式限制本发明。使用本领域公知的标准技术或下文具体描述的技术。
     材料和方法
     嵌合抗体构建 (cB-B4 ： nBT062)
     B-B4
     将此前所表征的小鼠抗体 B-B4(Wijdenes 等， Br J Haematol.， 94(1996)， 318) 用 于这些实验中。
     B-B4 和 cB-B4/nBT062 的克隆和表达
     如 例 如 J.Sambrook ； Molecular Cloning， 实验室手册； 第 二 版 (1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press， USA 等教课中中所详述， 或在使用试剂盒的情况下如制 造商说明书所推荐， 进行标准重组 DNA 技术。使用标准 PCR 方法进行小鼠可变区的 PCR 克 隆和修饰。使用了在各结果部分中指定的引物。
     cB-B4/nBT062 的表达
     通过胰蛋白酶消化和离心收获在 DMEM( 补充有 10％ FCS、 580μg/mlL- 谷氨酰胺、 50 单位 /ml 青霉素和 50μg/ml 链霉素 ) 中培养的指数生长的 COS 细胞、 并将其在 PBS 中 7 洗涤。将细胞重悬于 PBS 中至终浓度 1×10 细胞 /ml。将 700μl 的 COS 细胞悬浮液转 移至 Gene Pulser 皿中， 并与重链和 κ 轻链表达载体 DNA( 各 10μg 或 13μg 超级载体 (Supervector)) 混合。使用 Bio-Rad Gene Pulser 将细胞在 1900V、 25μF 电穿孔。在补充 有 10％无 γ- 球蛋白的 FBS、 580μg/ml L- 谷氨酰胺、 50 单位 /ml 青霉素和 50μg/ml 链霉 素的 DMEM 中培养转移的细胞 72h， 然后收获含有抗体的细胞培养上清液。
     测定 cB-B4/nBT062 表达水平的捕获 ELISA(capture ELISA)
     用在 PBS 中稀释的 0.4μg/ml 山羊抗人 IgG 抗体的 100μl 等分试样涂布 96 孔板 (4℃过夜 )。用 200μl/ 孔洗涤缓冲液 (PBS+0.1％ Tween-20) 洗涤板 3 次。用在 PBS 中的 0.2％ BSA、 0.02％ Tween-20 将孔封闭 ( 在 37℃温育 1 小时 )， 其后添加 200μl 含有所分泌 抗体的细胞培养上清液。用洗涤缓冲液将孔洗涤 6 次， 然后检测具有山羊抗人 κ 轻链过氧 化物酶缀合物的结合抗体。
     来自细胞培养上清液的 cB-B4/nBT062 的纯化
     使用 Protein A ImmunoPure Plus 试剂盒 (Pierce， Rockford， IL)， 根据制造商推 荐从经转化的 COS 7 细胞中纯化 cB-B4 抗体。
     cB-B4 结合和竞争测试
     使用 Diaclone(Besancon， 法国 )sCD138 试剂盒， 根据制造商推荐， 考虑在结果部 分所述的变化， 进行 B-B4 和 cB-B4 与 CD138 的结合活性的分析。
     RNA 制备和 cDNA 合成
     使杂交瘤 B-B4 细胞生长并使用 Qiagen Midi 试剂盒 (Hilden， 德国 ) 按照制造商 的程序处理， 以分离 RNA。使用 Amersham Biosciences(Piscataway， NJ) 第 1 链合成试剂 盒， 按照制造商的程序， 将约 5μg 的 B-B4RNA 进行逆转录以产生 B-B4cDNA。
     B-B4 免疫球蛋白 cDNA 的克隆
     使用 IgH 引物 MHV7(5′ -ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGA-CCCAGG-3′ )[SEQ ID NO ： 3] 和 IgG1 恒定区引物 MHCG1(5 ′ -CAG-TGGATAGACAGATGGGGG-3 ′ )[SEQ ID NO ： 4]， 通过 PCR 扩增免疫球蛋白重链 (IgH)cDNA。类似地， 使用三种不同的 Igκ 引物 MKV2(5′ -ATG-G AGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG-3′ )[SEQ ID NO ： 5]、 MKV4(5′ -ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3′ )[SEQ ID NO ： 6] 和 MKV9(5′ -ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG-3′ )[SEQ ID NO ： 7]， 并且每个引物都与引物 MKC(5′ -ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3′ )[SEQ ID NO ： 8] 组 合， 以扩增免疫球蛋白轻链 (IgL)。使用 TOPO-TA 克隆试剂盒 (Invitrogen， Carlsbad， CA)， 根据制造商说明， 将所有扩增产物直接与 pCR2.1-TOPO 载体连接。
     在 LB- 氨苄青霉素 -Xgal 琼脂板上筛选用经连接的 pCR2.1 载体构建体转化的大 肠杆菌 (E.coli)TOP10 细菌 (Invitrogen)。将小规模培养物用单独的白色集落接种， 生长 过夜， 并使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒根据制造商说明分离质粒。
     cDNA 序列确定
     使 用 BigDye Termination v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction 试 剂 盒 (ABI， Foster City， CA) 将质粒测序。使用在 GeneAmp9600 PCR 仪上循环的 1210 和 1233 引物将每个所选质粒进行双向测序。在 ABI 毛细管测序仪上完成电泳序列分析。
     反复进行完整的 RT-PCR、 克隆和 DNA 序列分析的循环， 以获得各免疫球蛋白链的 三个完全独立的序列信息组。
     B-B4VκDNA 序列
     在三个独立反应中进行第 1 链合成。根据制造商说明， 将通过使用引物 MKC 和 MKV2( 序列于上文中给出 ) 产生的 PCR 产物连接至 pCR2.1-TOPO 载体。 将来自各独立 RT-PCR 反应组的克隆体双向测序。以 MKV2 为引物的产物序列与源自 MOPC-21、 SP2 和 Ag8 等骨髓 瘤融合伴侣的不育 κ 转录物高度相似 (Carroll 等， Mol Immunol.， 25(1988)， 991 ； Cabilly 等， Gene， 40(1985) ； 157)， 因此将其忽视。
     使用 MKC 连同 MKV4 和 MKV9 引物的 PCR 产物相互类似， 区别仅在于前导序列引物 内的摆动位置 (wobble position)。
     B-B4VH DNA 序列
     在三个独立反应中进行第 1 链合成， 从各第 1 链产物中将 PCR 产物克隆和测序。 对 来自各第 1 链的 5 个克隆体进行测序。
     嵌合 cB-B4 表达载体的构建
     嵌合表达载体的构建需要向 VH 和 Vκ 添加合适的前导序列， 该前导序列位于 BamHI 限制位点和 Kozak 序列之后。Kozak 共享序列 (consensus sequence) 对于可变区序 列的有效翻译至关重要。 它定义了正确的 AUG 密码子 ( 核糖体能从其开始翻译 )， 并且最重 要的单个关键碱基为位于 AUG 起点上游的 3 位处的腺嘌呤 ( 或次佳地， 鸟嘌呤 )。该前导序 列被选作 Kabat 数据库中最相似的序列 (Kabat 等， NIH National Technical Information Service， 1991)。所述添加序列在正向 (For) 引物 ( 都具有序列 5′ -AGAGAAGCTTGCCGCCAC CATGATTGCCTCTGCTCAGTT-CCTTGGTCTCC-3′ [SEQ ID NO ： 9] ； 限制位点用下划线标出 ； Kozak 序列为粗体 ) 内编码。 此外， 嵌合表达载体的构建需要将人类 γ1 恒定区的 5′片段导入天 然 ApaI 限制性位点的上游并与 B-B4 的 J 区的 3′末端相邻， 而对于轻链而言， 需要添加剪 接供体位点和 HindIII 位点。该剪接供体序列对于将可变区在框架内正确连接至其合适的 恒定区从而剪接下 V:C 内含子而言是重要的。κ 内含子 +CK 在 B-B4Vκ 序列下游的表达构 建体中编码。类似地， γ-4CH 在 B-B4VH 序列下游的表达构建体中编码。
     首先仔细地分析 B-B4VH 和 Vκ 基因， 以鉴定任何不合需要的剪接供体位点、 剪接 受体位点、 Kozak 序列， 以及鉴定此后会干扰功能性全抗体的亚克隆和 / 或表达的任何额外的亚克隆限制位点的存在。在 Vκ 序列中发现不合需要的 HindIII 位点， 需要在不改变氨 基酸序列的情况下利用 PCR 通过定点突变技术将其除去。 对于该反应， 使用寡核苷酸引物 B T03(5′ -CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG-3′ )[SEQ ID NO ： 10] 和 BT04(5′ -CCA CCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTG-TTG-3′ )[SEQ ID NO ： 11]， 根据 Stratagene(La Jolla， CA)Quickchange Mutagenesis 试剂盒程序进行诱变。
     κ 链嵌合引物
     将 不 依 赖 于 PCR 引 物 序 列 的 不 引 起 歧 义 (non-ambiguous) 的 B-B4Vκ 前 导 序列与 Kabat 数据库中的小鼠前导序列比对。对于 B-B4VH 前导序列最接近的匹配是 VK-10ARS-A(Sanz 等， PNAS， 84(1987)， 1085)。据 SignalP 算法预测该前导序列会被正确地 切割 (Nielsen 等， Protein Eng， 10(1997) ； 1)。设计引物 CBB4Kfor( 参见上文 ) 和 g2258 (5′ -CGCGGGATC-CACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3′ [SEQ ID NO ： 12] ； 限制位点用 下划线标出 )， 从而产生含有该完全前导序列、 B-B4Vκ 区和 HindIII 以及 BamHI 末端限制 位点的 PCR 产物， 以克隆至 pKN100 表达载体内。正向引物 CBB4K 导入 HindIII 限制位点、 Kozak 翻译起始位点和 VK-10ARS-A 前导序列。反向引物 g2258 导入剪接供体位点和 BamHI 限制性位点。将所得的片段克隆至 pKN100 的 HindIII/BamHI 限制位点。
     重链嵌合引物
     将不依赖于 PCR 引物序列的不引起歧义的 B-B4VH 前导序列与 Kabat 数据库中的 小鼠前导序列比对。B-B4VK 前导序列的最接近匹配为 VH17-1A(Sun 等， PNAS， 84(1987)， 214)。据 SignalP 算法预测该前导序列会被正确地切割。设计引物 CBB4Kfor( 参见上文 ) 和 g22949(5 ′ -CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGA-GGTTCC-3 ′ [SEQ ID NO ： 13] ； 限制位点用下划线标出 )， 从而产生含有 VH17-1A 前导序列、 B-B4VH 区和末端 HindIII 以及 ApaI 限制位点的 PCR 产物， 以克隆至 pG4D200 表达载体内。正向引物 cBBHFor 导入 HindIII 限制位点、 Kozak 翻译起始位点和 VH17-1A 前导序列。反向引物 g22949 导入 γ4C 区的 5′末端和天然 ApaI 限制位点。将所得的片段克隆至 pG4D200 的 HindIII/ApaI 限制 位点， 产生载体 pG4D200cBB4。
     cBB4 抗体的产生
     将一瓶 COS7 细胞解冻， 并在补充有 10％ Fetal clone I 血清以及抗生素的 DMEM 中生长。一周后， 将细胞 (0.7ml， 107 细胞 /ml) 与 pG4D200cBB4 加上 pKN100cBB4( 各 10μg DNA) 一起电穿孔， 或不和 DNA 一起电穿孔。将这些细胞平板接种至 8ml 生长培养基中 4 天。 重复电穿孔 7 次。
     嵌合抗体的检测
     将夹心 ELISA 用于测定 COS 7 上清液中的抗体浓度。瞬时转化的 COS 7 细胞分泌 约 6956ng/ml 的抗体 ( 数据未示出 )。
     cB-B4 的结合活性
     为了检测 COS 7 培养上清液中 cB-B4 的结合活性， 使用 Diaclone sCD138 试剂盒， 其是一种固相夹心 ELISA。 已将对 sCD138 特异的单克隆抗体涂布在所提供的微量滴定条的 孔上。首次温育期间， 将 sCD138 和生物素化的 B-B4(bio-B-B4) 抗体同时与未标记的测试 抗体 (B-B4 或 cB-B4) 的连续稀释液一起温育。
     为了获得与低浓度未标记抗体的竞争， 降低该测试中 bio-B-B4 的浓度 ( 否则cB-B4 在 COS 7 细胞培养上清液中的浓度太低， 不能获得足够的竞争 )。来自该测试的结果 表明， 两种抗体对 CD138 具有相同的特异性 ( 数据未示出 )。
     cB-B4 的纯化
     使用 Protein A ImmunoPure Plus 试剂盒 (Pierce)， 根据制造商推荐从 COS 7 细 胞上清液中纯化嵌合 cB-B4( 数据未示出 )。
     KD 确定 ： 比较 nBT062/BB4
     可溶性 CD138 的纯化
     使用 1mL 偶联有 B-B4 的 “HiTrap NHS 激活的 HP” 柱， 通过 FPLC 纯化来自 U-266 细 胞培养上清液的可溶性 CD138 抗原。将在 pH7.4 的 PBS 缓冲液中的细胞培养上清液加样至 所述柱上， 稍后用 pH11 的 50mM 三乙胺将 CD138 抗原洗脱至 2mL 的组分中。洗脱出的 CD138 立即用 375μL 的 pH3 的 1M Tris-HCl 中和， 以防止结构和 / 或功能损害。
     CD138 的生物素化
     Sulfo-NHS-LC(Pierce) 用于标记 CD138。在 pH 为 7 ～ 9 的缓冲液中 NHS 激活的 生物素有效地与伯胺基 ( 例如赖氨酸残基 ) 反应， 形成稳定的酰胺键。
     为将 CD138 生物素化， 使用蛋白脱盐离心柱 (spin column)(Pierce) 将 50μl 的 CD138 脱盐。将生物素化试剂 (EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin， Pierce) 溶于冰冷却的去 离子 H2O 至最终浓度为 0.5mg/mL。将生物素化试剂和捕获试剂溶液混合， 生物素化试剂的 摩尔数与捕获试剂相比过量 12 倍 (50pmol CD138 与 600pmol 生物素化试剂 )， 在室温下温 育 1h， 同时轻轻地摇动小瓶。使用蛋白脱盐柱除去未结合的生物素化试剂。
     bCD138 的固定
     将用于 BIACORE 测试的传感芯片 (SENSOR CHIP SA， BIACORE AB) 设计来与生物素 化分子结合以便在 BIACORE 系统中进行相互作用分析。其表面由羧甲基化右旋葡萄糖苷基 质构成， 所述基质用抗生物素链霉亲和蛋白预先固定并且已准备好用于高亲和力捕获生物 素化配体。利用 10μL/ 分钟的流速通过手动注射在 SENSOR CHIP SA 上进行 bCD138 的固 定。用三次连续的 1 分钟注射 50mM NaOH 中的 1M NaCl 调节该芯片表面条件。然后进行 1 分钟的生物素化 CD138 注射。
     使用 BIACORE 确定不同抗体的 KD
     对 于 不 同 的 实 验， 软 件 BIACORE 使 用 预 定 义 的 掩 膜 (masks)， 即所谓的 “向 导 (Wizards)” ， 其中仅改变某些设定。由于最初开发 BIACORE C 来测定浓度， 所以不存在设 计用于进行亲和力测定的向导。然而， 使用适当的设定， “非特异性结合” 的向导可用于测 定亲和速率常数并由此用于确定 KD。使用该向导， 通过执行 “再生 1(Regeneration 1)” 用 BIACORE 运行缓冲液测定两种流动细胞， 将解离相设定为 90 秒。使用 pH2.5 的 10mM 甘氨 酸 -HCl 进行等效于实际再生的 “再生 2” 。该步骤后， 配体 CD138 再次处于其结合感受态。 在整个过程中， HBS-EP 被用作运行和稀释缓冲液。 为了确定不同抗体 ( ～ 150kDa) 与 CD138 的结合， 在不同浓度 (100nM、 50nM、 25nM、 12.5nM、 6.25nM 和 3.13nM) 分析结合和解离。通过 计算速率常数 ka 和 kd 确定解离平衡常数。其后， 使用 BIAevaluation 软件通过 kd 与 ka 之商来计算分析物的 KD 值。结果如表 4 所示。
     表4： nBT062 和 B-B4 的 KD 值的比较分析。对于平均 KD 值给出标准偏差。 讨论从三个独立实验计算各抗体的平均 KD 值。 结果表明， 在所有测定中， 与 B-B4 相比， nBT062 显示稍低的 KD 值 ( 平均 KD 值分别为 1.6nM 和 1.4nM)。
     免疫缀合物的制备
     nBT062-DM1 和 huC242-DM1
     如此前 Chari(Chari 等， Cancer Res.1(1992)， 127) 所述， 从微生物发酵产物安丝 菌素 P-3 合成含巯基类美登素 DM1。此前对于人源化 C242(huC242) 的制备 (Roguska 等， PNAS， 91(1994)， 969) 已有描述。如此前所述 (Liu 等， PNAS， 93(1996)， 8618) 制备抗体 - 药 物缀合物。每个抗体分子平均连接 3.5 个 DM1 分子。
     nBT062-DM4
     BT062 为一种抗体 - 药物缀合物， 其由经由二硫键通过连接子连接至 nBT062 嵌合 单克隆抗体的细胞毒性类美登素药物 DM4 构成。类美登素为抗有丝分裂剂， 其抑制微管蛋 白聚合和微管组装 (Remillard 等， Science189(1977)， 1002)。BT062(nBT062-DM4) 的化学 示意图如图 1 和 2 所示。
     DM4 的合成 从公知衍生物美登醇制备 DM4(Kupchan 等， J.Med.Chem.， 21(1978)， 31)。美登醇 通过用氢化三甲氧基铝锂还原性裂解微生物发酵产物安丝菌素 P3 的酯部分而制备 ( 参见 图 3)。
     DM4 如下合成 ： 在二环己基碳二亚胺 (DCC) 和氯化锌的存在下用 N- 甲基 -N-(4- 甲 基 二 硫 代 戊 酰 基 )-L- 丙 氨 酸 (DM4 侧 链 ) 乙 酰 化 美 登 醇， 获得含二硫键的类美登素 DM4-SMe。 用二硫代苏糖醇 (DTT) 还原 DM4-SMe， 以获得所期望的含巯基类美登素 DM4( 参见 图 4， DM4 工艺流程图 )。
     免疫缀合物 BT062
     制 备 nBT062-DM4 的 过 程 如 图 5 所 概 述。 将 nBT062 抗 体 用 N- 丁 二 酰 亚 胺 基 -4-(2- 吡啶基二硫代 ) 丁酸酯 (SPDB 连接子 ) 修饰， 以引入二硫代吡啶基。将 DM4 与经
     修饰的抗体混合， 其浓度超过二硫代吡啶基的当量。 BT062 缀合物通过 DM4 的巯基和经由连 接子引入所述抗体的二硫代吡啶基之间的二硫键交换反应而形成。 通过色谱的纯化和渗滤 除去低分子量反应物 (DM4) 和反应产物 ( 硫代吡啶 ) 以及缀合抗体的团聚体， 从而产生原 料药 (bulk drug substance)。
     FACS 分析和 WST 细胞毒性检验
     FACS 分析
     OPM-2 细胞为显示高度表达 CD138 的血浆细胞白细胞系。将 OPM-2 细胞与不同浓 度的 nBT062、 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或 nBT062-SMCC-DM1 一起温育 ( 示于图 6)。洗涤所述细胞， 并且在 FACS 分析中使用荧光标记的二抗检测经 CD138 结合的抗体或缀 合物。将在这些实验中测定的平均荧光相对于抗体浓度作图。
     细胞活力测试
     将 CD138+MOLP-8 细胞以 3000 细胞 / 孔接种于平底板中。将 CD138-BJAB 对照细 胞 以 1000 细 胞 / 孔 接 种。 将 细 胞 用 不 同 浓 度 的 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或 nBT062-SMCC-DM1 处理 ( 如图 7 所示 )5 天。添加 WST 试剂 ( 水溶性四唑盐 ROCHE) 以便根 据制造商说明 (ROCHE) 测定细胞活力。将该试剂在 MOLP-8 细胞上温育 7.5 小时， 并在 BJAB 细胞上温育 2 小时。基于使用标准方法在微孔板读取器上测定的光密度计算存活细胞的分 数。 讨论
     通 过 FACS 分 析 BT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1、 nBT062-SMCC-DM1 或 nBT062 + 的结合。作为靶细胞的 CD138 OPM-2 与 nBT062 或免疫缀合物一起温育， 使用荧光标记 的二抗检测细胞结合的分子。图 6 中， 将作为细胞结合抗体的量的量度的平均荧光值相 对于不同的抗体或缀合物浓度作图。结果表明， nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 和 nBT062-SMCC-DM1 显示非常相似的结合特性。此外， 结果强烈地表明， 未结合抗体的结合特 性不受缀合毒素影响。
     在细胞活力测试中， 分析抗体对 CD138+MOLP-8 靶细胞和对 CD138-BJAB B 淋巴母 细胞瘤对照细胞的细胞毒性活性。将两种细胞系都接种于平底板中， 并与渐增浓度的免疫 缀合物一起温育。未缀合抗体用作对照。为了测定细胞活力， 通过使用 WST 试剂在添加免 疫缀合物后 5 天分析细胞毒性活性。图 7(A) ～ (C) 中， 将存活细胞相对于用运载剂对照 处理的对照细胞的分数对于渐增浓度的免疫缀合物作图。结果表明， nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM 1 和 nBT062-SMCC-DM1 对 MOLP-8 细胞的细胞毒性活性非常相似。正如预 表明所有免疫缀合物经由与 CD138 的细胞特 期， CD138-BJAB 对照细胞未被免疫缀合物杀死， 异性结合而起作用。在竞争实验中， MOLP-8 细胞与过量摩尔数的未缀合 nBT062 一起预温 育。预温育基本上阻断了 nBT062-SPDB-DM4 的细胞毒性， 从而提供了进一步证据表明免疫 缀合物经由与细胞表面上的 CD138 的特异性结合而杀死细胞 ( 图 7(D))。
     异种移植物小鼠实验
     为了评价 CD138 靶向对于人类嵌合形式的 B-B4 抗体 (nBT062) 的抗体 - 类美登素 缀合物的抗肿瘤活性的重要性， 进行异种移植物小鼠实验。制备两种形式的 nBT062- 类美 登素缀合物 (nBT062-SPP-DM1 和 nBT062-SPDB-DM4)， 它们可能在其二硫键的化学稳定性上 有所不同。 将这些抗体 - 药物缀合物的抗肿瘤活性与 B-B4-SPP-DM1 缀合物 ( 包含小鼠亲本
     抗体 )、 以及未缀合的游离类美登素 (DM4)、 天然未经修饰的 nBT062 抗体和非靶向 ( 无关 ) IgG1- 类美登素缀合物的活性进行比较。 在严重联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠中的人类多发性 骨髓瘤的 CD138 阳性异种移植物模型 (MOLP-8) 中评价缀合物。
     在这些小鼠中， 通过用 MOLP-8 细胞悬浮液接种建立皮下肿瘤 ( 雌性 CB.17SCID 小 鼠 )。当肿瘤体积达到平均 113mm3 时， 进行使用单次静脉内团注的治疗。每周两次监测肿 瘤体积和体重的变化。肿瘤细胞接种后， 实验进行了超过 68 天。
     异种移植物小鼠实验 A
     小鼠
     5 周龄雌性 CB.17SCID 小鼠获自 Charles River Laboratories。
     人类肿瘤细胞系
     人类多发性骨髓瘤细胞系 MOLP-8 由 ATCC 提供。将在其细胞表面表达 CD138 抗 原并且在 SCID 小鼠中发育异种移植肿瘤的 MOLP-8 细胞， 保持在 37 ℃、 含有 5 ％ CO2 的 润湿气氛中的 RPMI-1640 培养基中， 该培养基补充有 4mM L- 谷氨酰胺 (Biowhittaker， Walkersville， MD)、 10％胎牛血清 (Hyclone， Logan， Utah) 和 1％链霉素 / 青霉素。
     第 I 部分
     小鼠中的肿瘤生长
     将 1×107 的 MOLP-8 细胞于皮下接种于每只小鼠右肩下的区域。总体积为 0.2ml/ 小 鼠， 其 中 无 血 清 培 养 基 与 基 质 胶 (matrigel)(BD Bioscience， Bedford， MA) 的 比 为 1/1( 体积 / 体积 )。处理前， 每天监测异种移植物肿瘤， 使其逐渐建立。接种肿瘤细胞后约 3 11 天， 肿瘤体积达到约 113mm 。CB.17SCID 小鼠的肿瘤携带率为 100％。
     接 种 肿 瘤 细 胞 后 11 天， 基 于 肿 瘤 体 积 和 体 重 选 择 42 只 小 鼠。 肿 瘤 体 积 为 3 3 68.2mm ～ 135.9mm 。基于肿瘤体积将 42 只小鼠随机分成 7 组 (A ～ G)， 每组 6 只动物。
     组 A 中 6 只小鼠中每一只接受 200μl PBS 作为运载剂对照。组 B 中每只小鼠接 受 13.8mg/kg 的 nBT062 裸抗体。该剂量等效于 250μg/kg 的连接类美登素中的 nBT062 抗 体组分的量。缀合分子中类美登素与 nBT062 抗体的分子量之比约为 1/55。组 C 中每只小 鼠接受 250μg/kg 的 DM4。组 D 中每只小鼠接受 250μg/kg 的 huC242-DM4。组 E、 F和G中 的小鼠每只分别接受 250μg/kg 的 nBT062-SPDB-DM4、 B-B4-SPP-DM1 和 nBT062-SPP-DM1。
     使用配置有 27 号规格、 1/2 英寸针头的 1ml 注射器， 通过横向尾静脉 (lateral tail vein) 以单次团注于静脉内施用所有试剂。 施用前， 将 nBT062 抗体、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 的母液用无菌 PBS 分别稀释至浓度 2mg/ml、 28.1μg/ml 和 28.1μg/ml， 以使对于每只小鼠的注射体积为 120μl ～ 220μl。
     第 II 部分
     在第二组实验中， 将悬浮于无血清培养基和基质胶的 50 ∶ 50 混合物中的 MOLP-8 7 细胞 (1.5×10 细胞每只小鼠 ) 以 100μl 皮下注射于右肩下的区域。接种后， 在第 11 3 3 天肿瘤体积达到约 80mm ， 而在第 25 天对照的平均值为约 750mm 。肿瘤倍增时间经估算 为 4.58 天。对照组 (n ＝ 6) 中的每只小鼠接受 0.2ml 的无菌 PBS， 其以团注施用于横向 尾静脉 ( 静脉内 )。所有处理剂量基于缀合的类美登素。9 组 (n ＝ 6) 用单次静脉内注 射 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1 来 处 理， 每种处理的剂量为 450μg/kg、 250μg/kg 和 100μg/kg。 另 一 组 (n ＝ 6) 以 反 复 给 药 方 式 接 受 250μg/kgnBT062-SMCC-DM1( 每周一次， 持续 5 周 )。使用 LabCat Program 根据肿瘤体积将小鼠随机 分成 11 组 (n ＝ 6)。肿瘤体积为 40.0mm3 ～ 152.5mm3。基于个体体重对小鼠给药。
     使 用 LabCat System(Tumor Measurement and Tracking ，Innovative Programming Associated， Inc.， Princeton， NJ) 每周 2 次测定肿瘤的三维尺寸。使用 Tomayko 等， Cancer Chemother.Pharmacol， 24(1989)， 148 中所述的方法计算肿瘤体积 ( 单 3 位为 mm ) ：
     体积＝长 × 宽 × 高 ×1/2
     使用 Bissery 等， Cancer Res.， 51(1991)， 4845 中所述的公式计算 Log10 细胞杀 伤：
     Log10 细胞杀伤＝ (T-C)/Td×3.32
     其 中 (T-C) 或 肿 瘤 生 长 延 迟 为 处 理 组 (T) 和 对 照 组 (C) 肿 瘤 达 到 预 定 体 积 3 (600mm ) 所需天数的中值时间 (median time)。Td 为肿瘤倍增时间， 基于对照小鼠中的平 均肿瘤体积， 并且 3.32 为每单位细胞生长对数的细胞倍增数。
     结果
     个体小鼠中的肿瘤生长如图 8 和图 9 所示。各组的平均值 (+/-SD) 如图 10 所示。
     与 PBS 处理的动物中的肿瘤生长相比， 用 nBT062 抗体、 未缀合的游离 DM4 或无关 的非靶向缀合物 huC242-DM4 处理不引起对肿瘤生长的任何显著抑制。
     所 有 三 种 靶 向 CD138 的 缀 合 物， nBT062-SPDB-DM4、 B-B4-SPP-DM1 和 nBT062-SPP-DM1 在剂量为 250μg/kg 时都引起肿瘤生长的显著延迟。 基于在处理组中测定 的中值肿瘤体积， DM4 缀合物 nBT062-SPDB-DM4 的活性最强， 而 nBT062-SPP-DM1 与其小鼠 对应物 B-B4-SPP-DM1 相比显示出活性稍微增加 ( 图 10)。另外， 在个体小鼠中获得的结果 显示， 用 B-B4-SPP-DM1 获得的抗肿瘤活性更不均匀， 因此比在用 nBT062-SPP-DM1 处理的小 鼠中测定的活性更难预测。在抗肿瘤活性的均匀性方面， 使用 nBT062 作为靶向抗体的另一 缀合物 nBT062-SPDB-DM4 与 nBT062-SPP-DM1 表现相似。
     在任何处理组中未观察到体重下降， 表明该治疗耐受良好。
     讨论
     在实验动物中对三种靶向 CD138 的缀合物的分析结果证明靶向输送对于抗肿瘤 活性的重要性。尽管人类嵌合 nBT062 和小鼠 B-B4 抗体的类美登素缀合物显示出显著活性 ( 如对数细胞杀伤所测定 )， 用未缀合的 DM4、 未经修饰的天然 huBT062 抗体或非靶向对照缀 合物 (huC242-DM4) 处理对肿瘤生长无显著影响。
     从 人 类 嵌 合 抗 体 制 备 的 免 疫 缀 合 物 nBT062-SPP-DM1 比 从 其 小 鼠 对 应 物 制 备 的 B-B4-SPP-DM1 提 供 稍 高 的 抗 肿 瘤 活 性。 此 外 与 用 B-B4-SPP-DM1 处 理 相 比， 用 nBT062-SPP-DM1 和 nBT062-SPDB-DM4 处理引起个体小鼠中更均匀的响应。B-B4-SPP-DM1 的高结合变化说明， 对于在接种后对 CB.17SCID 小鼠中的 MOLP-8 人类多发性骨髓瘤异种移 植物的中值肿瘤体积 (+/-SD) 随时间推移 ( 天数 ) 的测定而言， 实际上 B-B4-SPP-DM1 比 nBT062-SPP-DM1 提供了相对更好的结果 ( 数据未示出 )。使用 nBT062 作为靶向抗体的免 疫缀合物的该特征似乎对于缀合物的治疗应用特别有益。
     最后， 对 SCID 小鼠中的 MOLP-8 异种移植物模型单次静脉内施用后， 最强效的类美 登素缀合物为 nBT062-SPDB-DM4。旁观者杀伤 ( 细胞活力测试 )
     将 CD138+OPM2 细胞和 CD138-Namalwa 细胞接种至圆底板， 使二者处于分开的孔中 -8 -9 或者共培养。用浓度为 1×10 M ～ 1×10 M 的 nBT062-SPDB-DM4 处理细胞。使用 WST 试剂 ( 水溶性四唑盐， ROCHE)， 根据制造商说明 (ROCHE) 检测活细胞的分数。基于使用标准方法 在微孔板读取器上测定的光密度计算存活细胞的分数。
     讨论
     在将 CD138 阳性 OPM2 细胞与 CD138 阴性 Namawla 细胞共培养的体外研究中， 分析 在 nBT062-SPDB-DM4 处理的情况下紧邻多发性骨髓瘤细胞 ( 存在于圆底孔中 ) 的非靶细胞 的旁观者杀伤 ( 图 13)。通常， 尽管 CD138 阳性细胞被 nBT062-SPDB-DM4 有效地杀伤， CD138 阴性细胞不受该缀合物影响。 然而在圆底孔的共培养中， nBT062-SPDB-DM4 还杀伤紧邻抗原 阳性细胞的抗原阴性细胞 ( 该效应通常被称为旁观者杀伤 )。 Kovtun 等 (2006) 论述了通过 类美登素缀合物介导的旁观者杀伤仅发生在紧邻抗原阳性细胞的附近。Kovtun 等 (2006) ( 本文通过参考并入其全部内容 ) 还讨论了免疫缀合物的连接子的重要性。 在体内， 旁观者 杀伤可能有助于 ： 1) 根除不均匀表达 CD138 的肿瘤细胞， 2) 通过杀死肿瘤基质细胞破坏肿 瘤微环境， 和 3) 预防 CD138 阴性的抗 nBT062-SPDB-DM4 细胞的选择。
     如果肿瘤中以不均匀方式表达的靶抗原削弱了免疫缀合物的活性， 则旁观者效应 特别重要。如果存在这种情况， 特定的肿瘤细胞表达 ( 如果表达的话 ) 的抗原的量不足以 使各自的免疫缀合物有效的直接靶向和杀死所述细胞。nBT062-SPDB-DM4 对与 CD138 阳性 细胞共培养的 CD138 阴性细胞的抗肿瘤效力明确表明， 在合适的情况下， 靶细胞的存在影 响 nBT062-SPDB-DM4 对非靶细胞的细胞毒性活性。
     异种移植物小鼠实验 B
     在该组实验中， 用 MOLP-8 细胞 (1.5×107 细胞 / 小鼠 ) 皮下接种于 85 只小鼠的右 肩。肿瘤携带率为 100％。将携带平均肿瘤体积为约 80mm3 的大体积 MOLP-8 肿瘤的 66 只 SCID 小鼠随机地分成 11 个治疗组 (n ＝ 6)。用单剂量的三种缀合物 (nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1) 中的一种治疗小鼠。额外的一组在 5 周中每周接受 一次 nBT062-SMCC-DM1 给药， 而对照组接受单剂量的 PBS。平均肿瘤体积如图 11A 所示。对 于各缀合物建立剂量响应曲线。 在 PBS 治疗的动物中， 中值肿瘤体积在第 25 天达到 750mm3。 根据在对照肿瘤生长的对数线性图上拟合的最佳拟合线性回归曲线测定的肿瘤倍增时间 为 4.58 天。用 450μg/kg 的 nBT062-SPDB-DM4 治疗的动物具有最高的对数细胞杀伤 (LCK ＝ 2.89)， 仅次于其的是用 250μg/kg nBT062-SMCC-DM1 每周一次用药治疗的动物 (LCK ＝ 2.1 ； 参见表 5)。通过反复测定进行 Dunnett 多重比较测试的 ANOVA 来比较治疗组平均 肿瘤生长曲线， 显示出 PBS 对照组与 450μg/kg nBT062-SPDB-DM4(p ＜ 0.01)、 250μg/kg nBT062-SPDB-DM4(p ＜ 0.05) 和 5 周每周一次给药 250μg/kg nBT062-SMCC-DM1(p ＜ 0.05) 之间的显著差异。在任何治疗组中未发生肿瘤的部分或全部消退， 唯一例外是一只接受 450μg/kg nBT062-SPDB-DM4 的动物， 其在接种后第 85 天肿瘤部分消退。
     表 5. 不同给药方案中作为不同 nBT062-DMx 缀合物的抗肿瘤活性的量度的对数细 胞杀伤 (LCK) 值。对于 LCK 值的计算方面的信息， 参见材料和方法部分。
     36101945892 A CN 101945900说明书LCK 给药 单剂量35/49 页测试材料 PBS nBT062-SMCC-DM1 nBT062-SMCC-DM1 nBT062-SMCC-DM1 nBT062-SPDB-DM4 nBT062-SPDB-DM4 nBT062-SPDB-DM4 nBT062-SPP-DM1 nBT062-SPP-DM1 nBT062-SPP-DM1 nBT062-SMCC-DM1
     剂量 (μg/kg)450 250 100 450 250 100 450 250 100 2500.85 0.53 0 2.89 1.05 0.39 0.8 0.39 0.2 2.1单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 每周一次， 持续 5 周nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 在骨髓环境中的体内效力
     具有人类胎骨植入物的 SCID 小鼠的制备
     如 此 前 所 述 (Urashima 等， 1997)， 将人类胚胎长骨 ( 人类胎骨碎片 ) 植入 CB17SCID 小鼠 (SCID-hu) 的上半身， 从而为人类 MM 细胞自导引至人类 BM 细胞提供小鼠模 型。
     治疗方案 (SCID-hu/INA-6 小鼠 )
     骨植入 4 周后， 将最终体积为 100μL 的 RPMI-1640 细胞培养基中的 2.5×106INA-6 细胞直接注入上述 SCID-hu 小鼠中的人类骨髓腔中。将由 INA-6 细胞释放的可溶性人类 IL-6 受体 (shuIL-6R) 的水平的增加用作 MM 细胞生长和疾病负荷的参数。
     INA-6 细胞注射后约 4 周， 小鼠发展出可测定的血清 shuIL-6R， 然后每周一次地经 由尾静脉注射接受 0.176mg 缀合物或运载剂对照， 持续 7 周。每次治疗后， 收集血液样品， 并通过酶联免疫吸附测试 (ELISA， R&D Systems， Minneapolis， MN) 就 shuIL-6R 水平进行 测定。结果如表 12 所示。
     讨论
     白细胞介素 (IL-6) 为多发性骨髓瘤细胞的生长和存活因子。 INA-6 为 IL-6- 依赖 性人类骨髓瘤细胞系， 其也需要骨髓瘤基质细胞 (BMSC) 以增殖。INA-6 细胞系产生可溶性 IL-6 受体 (shuIL-6R)。shuIL-6R 水平的增加可用作 MM 细胞生长和疾病负荷的参数。因此， sCID-hu/INA-6 小鼠提供在其正常骨髓环境中生长的多发性骨髓瘤细胞模 型。该模型的肿瘤细胞与人类骨髓直接相互作用， 这与其中基质细胞的存在也会促进肿瘤 细胞生长的患者中的情况极其相似。由于 INA-6 细胞释放可溶性人类白细胞介素 -6 受体 (shuIL-6R)， 该蛋白的血清浓度可用作这些小鼠中肿瘤细胞负荷的量度。在该环境中测试 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 的体内效力。
     根据所检测的相对于对照的血清 shuIL-6R 水平的下降， 使用每周一次持续 7 周的 静脉内施用 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1 治疗 SCIDhu/INA-6 小鼠诱导了有效的肿 瘤消退， 表明即使在反映出患者中相关情况的人类骨髓环境中所述缀合物也具有良好效力 ( 图 12)。
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 在体外和在实验动物体 内的效力的分析
     材料和方法
     细胞培养
     Dex 敏 感 性 (MM.1S) 和 抗 Dex(MM.1R) 人 类 MM 细 胞 系 由 Steven Rosen 博 士 (Northwestern University， Chicago， IL) 友情提供。RPMI8226 和 U266 人类 MM 细胞系 获自美国标准培养物收藏所 (American Type Culture Collection， Manassas， VA)。抗 多柔比星 (Dox) 细胞 (RPMI-Dox40) 和抗美法仑细胞 (LR5) 由 William Dalton 博士 (Lee Moffitt Cancer Center， Tampa， FL) 友情提供。 OPM1 和 OPM2 血浆细胞白血病细胞由 Edward Thompson 博士 (University of Texas Medical Branch， Galveston) 友情提供。 在含有 10 ％胎牛血清、 2mM L- 谷氨酰胺 (Life Technologies)、 100U/mL 青霉素 和 100Ag/mL 链霉素 (Life Technologies) 的达尔伯克氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco’ s modification of Eagle’ s medium)DMEM(Sigma) 中培养所有 MM 和骨髓 (BM) 基质细胞系。 通过 Ficoll Paque 密度梯度液处理收集自健康志愿者的血液样品， 从而获得外周血单核细 胞 (PBMC)。在根据赫尔辛基宣言获得知情同意和被 Institutional Review Board of the Dana-Farber Cancer Institute 批准后， 从 BM 样品获得源自患者的 MM 和 BM 细胞。使用 Ficoll Paque 密度沉降分离 BM 单核细胞， 并且通过使用抗 CD138 磁性激活的细胞分离微珠 (Miltenyi Biotec Auburn， CA) 的阳性筛选来纯化血浆细胞 ( ＞ 95％ CD138+)。 如此前所述 (Hideshima， 2001)， 使用 RosetteSep 阴性筛选系统 (StemCell Technologies， Vancouver， BC， Canada) 从具有 MM 的患者的 BM 中纯化肿瘤细胞。向骨髓样品提供 RosetteSep 抗体鸡 尾酒混合物 (antibody cocktail)。用 RosetteSep 试剂使 CD138 阴性细胞与红细胞交联 ( 玫瑰花结 (rosetted))， 并在室温温育 20 分钟， 然后通过 Ficoll 密度离心而分离。
     生长抑制和增殖测试
     如 此 前 所 述 (Hideshima， 2003)， 通 过 测 定 3-(4， 5- 二 甲 基 噻 唑 -2- 基 )--2， 5- 二 苯 基 溴 化 四 唑 (MTT ； Chemicon International， Temecula， CA) 染 料 代 谢， 估算 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 和地塞米松对 MM 细胞系、 PBMC 和 BMSC 的生长抑制作用。
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 对 BM 中 MM 细胞生长的 为了评估 BM 细胞对于 MM 细胞对免疫缀合物的敏感性的生长刺激作用， 在存在或38影响
     101945892 A CN 101945900说明书37/49 页不存在药物时， 在 96 孔板 (Costar， Cambridge， MA) 中使 MM 细胞 (2×104 细胞 / 孔 ) 与 骨髓基质细胞 (BMSC， 1×104 细胞 / 孔 ) 共培养 48h。通过 [3H]- 胸苷摄取测定 DNA 合成 (Perkin-Elmer， Boston， MA)。在实验的最后 8 个小时期间添加 [3H]- 胸苷 (0.5μCi/ 孔 )。 一式四份地进行所有实验。
     细胞周期分析
     将 MM 细胞 (1×106 细胞 ) 在存在或不存在免疫缀合物时温育 48 小时， 用磷酸盐 缓冲盐水 (PBS) 洗涤、 在 -20℃通过与 70％乙醇接触 30 分钟使之透性化 (permeabilized)， 在室温下与含有 20U/mL RNA 酶 A(Roche Diagnostics) 的 0.5mL PBS 中的碘化丙啶 (PI) (50μg/mL) 一起温育 30 分钟。使用流式细胞仪分析 DNA 含量。
     免疫荧光
     将 盖 玻 片 上 生 长 的 细 胞 在 冷 的 无 水 丙 酮 中 固 定 10 分 钟， 在 PBS 中 洗 涤 和 用 PBS 中 的 5 ％ FBS 阻 断 60min。 然 后 使 载 玻 片 与 抗 CD138 抗 体 (sc12765， Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， CA) 在 4℃温育 24h。 再次用 PBS 洗涤细胞， 使之与荧光标记的 山羊抗小鼠 IgG 在 4℃温育 1h， 并如此前所述 (Ikeda， 2005 ； Kiziltepe， 2007)， 使用 Nikon E800 荧光显微镜分析。
     自体荧光绿色荧光蛋白 (GFP) 阳性人类 MM 异种移植物模型和人类 MM 异种移植物 小鼠模型
     如此前所述 (Zufferey， 1998)， 使用慢病毒载体用绿色荧光蛋白 (OPM1GFP) 转染 OPM1 细胞。 CB17SCID 小鼠 (48 ～ 54 日龄 ) 购自 Charles River Laboratories(Wilmington， MA)。根据 Dana-Farber 癌症研究所动物伦理委员会批准的方案进行所有动物研究。用 100μl RPMI-1640 中的 5×106OPM1GFP MM 细胞在小鼠右胁处皮下接种。当肿瘤可触知时， 将小鼠分配至治疗组中， 在该治疗组中小鼠通过横向尾静脉注射在 4 周中每周一次接受 176μg/ 小鼠的缀合物 ( 以分子量计 )， 而将 5 只小鼠分配至仅接受运载剂的对照组。每隔 一天用游标卡尺 (caliper) 测定正交最长的肿瘤直径， 从而使用代表椭球体三维体积的以 2 下公式估算肿瘤体积 ： 4/3×( 宽 /2) ×( 长 /2)。当肿瘤达到 2cm 或小鼠表现出垂死时， 处 死动物。从治疗第一天直至死亡对存活进行评估。使用从治疗第一天直至处死那天 ( 对于 对照为第 10 天， 对于 BT062-SPDB-DM4 治疗组为第 21 天 ) 的游标卡尺测定值评价肿瘤生 长。 在将肿瘤区域皮肤除毛后， 使用 Illumatool Bright Light System LT-9900(Lightools Research， Encinitas， CA) 全身荧光成像来监测小鼠。用佳能 IXY 数码 700 相机捕获图像。 用与 LEICA DFC300FX 相机连接的 LEICA DM IL 显微镜以 40u/0.60(Leica， Heidelberg， 德 国 ) 捕获肿瘤的离体分析图像。
     凋亡细胞的检测
     将 MM 细胞 (1×106) 用 PBS 洗涤， 并且在存在或不存在免疫缀合物时温育。用 PE 缀合的 Apo 2.7 抗体 (7A6， Beckman Coulter， Inc.) 将凋亡细胞染色。使用 RXP Cytomics 软件， 在 Epics 流式细胞仪上通过流式细胞法分析所述细胞。
     免疫印迹
     如此前所述 (Yasui， 2005 ； Hayashi， 2002)， 在存在或不存在 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM1 或 BT062-SPP-DM1 时， 将 MM 培养、 收获、 洗涤， 并使用含有 2mM Na3VO4、 5mM NaF、 1mM 苯甲磺酰氟、 5mg/ml 完全蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀测试 (RIPA) 缓冲液裂解。将全细胞裂解物 (20μg/ 泳道 ) 进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离， 转移至纯硝酸纤维素膜 (Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA)， 并用抗聚 ADP( 二 磷酸腺苷 )- 核糖聚合酶 (PARP)、 半胱天冬酶 -8、 半胱天冬酶 -3、 半胱天冬酶 -9、 AKT、 和磷 (Ser 473)Akt(Cell Signaling) 的抗体， 以及抗微管蛋白和抗 CD138 抗体 (Santa CruzBiotechnology) 进行免疫印迹。
     细胞粘着测试
     在 96 孔板中， 向各孔用移液管移入 1×104BMSC， 并在 37℃在存在或不存在免疫缀 合物时温育 12h。该温育期间， 在存在或不存在药物时对 BMSC 提供 MM 细胞。因此， 将 MM 细 胞用 PBS 洗涤 3 次， 并重悬于存在或不存在药物的无血清 RPMI 培养基中， 细胞密度为 2×105 细胞 /100μL 培养基。一式三份或一式四份地运行各样品组。在 37℃共培养 2 小时后， 通 过将板反转除去未粘着的细胞、 弱粘着的细胞和培养基。随后， 用 PBS 洗涤细胞 3 次。将剩 3 下的粘着细胞在含有 10％ FBS 的 RPMI 培养基中在 [ H]- 胸苷 (0.5μCi/ 孔， Perkin Elmer， Boston， MA， USA) 的存在下再培养 8 小时， 以测定 DNA 合成。
     统计分析
     使用 Dunn 多重比较测试确定在免疫缀合物 (IC) 处理的培养物与对照培养物中观 察到的差异的统计显著性。最小程度的显著性为 P 值小于 0.5。对于体内实验， 使用 Dunn 多重比较测试的单向分析比较肿瘤体积。使用 Kaplan-Meier 曲线和对数秩 (log-rank) 分 析来估算存活。
     结果
     CD138 在 MM 细胞系上的表达
     通过使用 MM1S、 OPM1、 OPM2、 RPMI8226、 DOX40、 MM1R、 LR5 和 U266 细胞的全细胞裂 解物进行的免疫印迹， 分析 CD138 在多发性骨髓瘤细胞系中的表达水平 ( 图 14A)。
     从图 14A 中能够看出， MM1S 和 LR5 显示弱 CD138 表达， Dox40 细胞为 CD138 阴性 的。其它细胞系显示高 CD138 表达水平。据显示 CD138 在 8 个多发性骨髓瘤细胞中的 7 个 (87.5％ ) 中表达。
     图 14B 显示使用 CD138 特异性抗体使用免疫荧光染色进行的分析。进行 DOX40 细 胞 ( 上图 ) 和 OPM1 细胞 ( 下图 ) 的显微分析。CD138 表达示于左边， 核酸示于右边。图 14B 显示， DOX40 细胞展现出几乎不可检测的 CD138 表达。相反， OPM1 细胞显示出高的 CD138 免 疫反应性。
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 显示出对 CD138 阳性细 胞系具有选择性细胞毒性
     在 细 胞 活 力 测 试 中 还 测 试 了 CD138 抗 体 类 美 登 素 缀 合 物 的 效 力。 使 用 基 于 3-(4， 5- 二 甲 基 噻 唑 -2- 基 )-2， 5- 二 苯 基 溴 化 四 唑 (MTT) 的 测 试， 对免疫缀合物 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 对 CD138 阳 性 细 胞 (OPM1， RPMI8226)、 CD138 弱表达细胞 (MM1S) 和 CD138 阴性细胞 (DOX40) 的细胞毒性潜力进行分 析。图 15A 描述了分别与 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1 接触的 OPM1( ■ )、 RPMI8226( ◆ )、 DOX40( □ ) 和 MM1S 细胞 ( △ )。在 MTT 测试中测定细胞存活。 指定温育时间 (40h、 80h、 120h) 后细胞活力以未处理对照的活力的百分比 (％ ) 表示。用 浓度为 3ng/ml ～ 354ng/ml 的 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 处理细胞， 诱导了 CD138 阳性细胞中的生长抑制。该作用以时间和剂量依赖性方式出现， 并 且在表达高水平 CD138 的两种细胞系中在 120h 后最显著。在相同条件下， 几乎未测出对 CD138 阴性 DOX40 细胞的细胞毒性 ( 图 15A)。重要的是， 如在温育 48h 后所测定、 在浓度为 111ng/ml ～ 442ng/ml 时所分析， 所述三种免疫缀合物也对源自患者的阴性选择的 MM 细胞 有细胞毒性 ( 图 15B)。图 15C 显示在确定细胞活力之前与 nBT062-SPDB-DM4 一起培养 72h 的源自 3 个健康受试对象的 PBMC。在相同条件下处理的 OPM1MM 的细胞活力作为对照显示 ( 封闭方块 )。从图 15C 可以看出， 所述免疫缀合物在分离自 3 个健康志愿者的 PBMC( 外 周血单核细胞 ) 中没有诱导细胞毒性作用 ( 图 15C)。这些结果证明， nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 选择性地杀伤 CD138 阳性 MM 细胞 ( 在该图中示出的 所有数据代表三个平行实验的平均值。标准偏差用误差条表示。)
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 诱导 OPM1 细胞中 G2/M 细 胞周期停滞
     由于类美登素通过抑制微管蛋白聚合而起作用， 此前已经显示 DM1 和 DM4 诱 导 肿 瘤 细 胞 中 的 G2/M 细 胞 周 期 停 滞 (Erickson， 2006)。 因 此， 用 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 处理后检验 OPM1 细胞的细胞周期曲线。将细胞与免 疫缀合物一起温育 0 ～ 72 小时， 用 PI 标记， 并通过流式细胞仪分析。图 16A 显示用免疫缀 合物处理 0、 12h 或 24h 的 OPM1 细胞， 以及对通过 PI 染色的细胞周期曲线的分析。从图 16A 可以看出， 与未处理细胞相比， 这些化合物对 G2/M 期细胞的比例具有显著影响。与用其它 两种药物处理的细胞相比， 将 OPM1 细胞暴露至 nBT062-SPDB-DM4 诱导更快更强的响应。
     nBT062-SPDB-DM4 诱导 OPM1 细胞中的凋亡
     接下来， 确定 nBT062-SPDB-DM4 是否诱导靶细胞中的凋亡。图 16(B) 显示在存在 或不存在免疫缀合物下培养 24h、 48h 或 72h 的 OPM1 细胞。通过 Apo 2.7 抗体染色和流式 细胞仪分析估算凋亡细胞百分比。如图 16B 所示， 用 Apo2.7 抗体对细胞的染色证明了用免 疫缀合物处理的细胞的凋亡诱导。
     图 16(C) 显示在 885μg/ml nBT062-SPDB-DM4 存在下培养指定时间的 OPM1 细胞 ( 左图 )， 或用不同浓度的免疫缀合物 ( 中图 ) 培养的 OPM1 细胞。在该图中， FL 表示对应 于全长形式半胱天冬酶和 PARP 的条带 ； CL 表示对应于切割产物的条带。在用指定剂量的 nBT062-SPDB-DM4 处理 24h 之前， 将 OPM1 细胞与 zVAD-fmk(50μmol/L) 一起预温育 60 分 钟。使用半胱天冬酶 -3、 -8、 -9、 PARP 和微管蛋白特异性抗体对全部细胞裂解物进行免疫印 迹。从图 16C 可以看出， 用 nBT062-SPDB-DM4 处理 OPM1 细胞以剂量依赖性和时间依赖性方 式 ( 左图和中图 ) 诱导了半胱天冬酶 -8、 -9、 和 -3 以及 PARP 的切割。泛半胱天冬酶抑制 剂 zVAD-fmk 阻断了经 nBT062-SPDB-DM4 诱导的半胱天冬酶 -3、 -8 和 -9 以及 PARP 在 OPM1 细胞中的切割 ( 图 16C， 右图 )。这些结果表明在靶细胞中 BT062-SPDB-DM4 激活半胱天冬 酶和诱导凋亡。
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抑制 BMSC 的保护性作用
     在多发性骨髓瘤患者中， 骨髓微环境经由至少两种不同的机制诱导 MM 细胞中 的生长、 存活和药物抗性 ： MM 细胞与纤连蛋白的粘着为细胞赋予粘着介导的药物抗性 (CAM-DR) ； 和骨髓环境中如白细胞介素 -6(IL-6) 和胰岛素样生长因子 1(IGF-1) 等细胞因 子诱导最后介导 MM 细胞对传统治疗产生抗性的重要的信号传导级联。在 IL-6 或 IL-6 的存在下， 或在骨髓基质细胞 (BMSC) 的存在下， 分析免疫缀合物对与 BMSC 共培养的 MM 细胞 的细胞毒性。
     在 图 17A ～ 17C 中， 将 OPM1 细 胞 与 对 照 培 养 基 ( 黑 色 条 ) 或 用 渐 增 浓 度 的 * ** nBT062-SPDB-DM4 ： 55ng/ml( 深 灰 色 条 ； )、 111ng/ml( 灰 色 条 ； )、 221ng/ml( 淡 灰 色 条 ； *** **** ***** )、 442ng/ml( 极淡灰色条 ； )、 885ng/ml( 白色条 ； ) 一起培养。用对照培养基 ( 黑 色条 ) 或用渐增浓度的地塞米松 ： 250nM( 灰色条 ： +)、 500nM( 淡灰色条 ； ++)、 1000nM( 白色 条； +++) 处理图 17D 中的细胞 72h。IL-6 以 1ng/ml 或 10ng/ml 的浓度存在于某些培养物 中 ( 图 17A)。以 10ng/ml 或 50ng/ml 的浓度使用 IGF-1( 图 17B)。这些细胞因子均未诱导 细胞对免疫缀合物的抗性。
     为了分析 BM 微环境对 OPM1 的生长和 OPM1 对免疫缀合物抗性方面的影响， 如上所 述在 BMSC 的存在或不存在下培养细胞。
     在存在或不存在时 BMSC 共培养 OPM1 细胞如图 17 的 (C) 和 (D) 图中所示。在所 有实验中， 通过测定培养最后 8h 期间引入的 [3H]- 胸苷来确定 DNA 合成。OPM1 细胞对 BMSC 的粘着触发了 [3H]- 胸苷摄取增加。重要的是， 免疫缀合物的细胞毒性不受 BMSC 存在的影 响 ( 图 17C)。相反， 作为对照的地塞米松， 不能克服 BMSC 触发的保护性作用 ( 图 17D)。
     nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抑制 MM1 细胞对 BMSC 的粘着
     分析免疫缀合物是否抑制多发性骨髓瘤细胞对 BMSC 的粘着。将仅表达中度 水 平 CD138 且 仅 显 示 对 BT062 的 弱 敏 感 性 的 MM1S 细 胞 ( 图 14A 和 图 15A)， 与或不与 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1(885ng/ml) 一起培养 2h。该处理 后， 将 MM1S 细胞与 BMSC 一起再共培养 2 小时。在某些样品中， 在共培养之前还用免疫缀合 物 (885ng/ml) 处理 BMSC 12 小时 ( 基质处理 )。用 PBS 进行 3 次洗涤步骤后， 通过 [3H]- 胸 苷摄取测定粘着细胞。
     图 17E 显示在存在或不存在免疫缀合物时在 96 孔平底板中培养 24 小时的 BMSC。 用 PBS 洗涤 BMSC 3 次。对 BMSC 提供与免疫缀合物一起温育 2 小时的 MM1S 细胞。通过 [3H]- 胸苷摄取测定 DNA 合成。
     如 图 17E 所 示， 与 其 中 仅 处 理 基 质 细 胞 的 样 品 相 比， nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抑 制 多 发 性 骨 髓 瘤 细 胞 粘 着 至 BMSC( 分 别 为 3.6 倍 和 2.5 倍 )。 nBT062-SMCC-DM1 对 细 胞 粘 着 几 乎 未 显 示 影 响。 该 结 果 表 明， nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 能够干扰 MM 细胞粘着至 BMSC， 且这些免疫缀合物还能够克服细胞粘着介 导的药物抗性 (CAM-DR)。
     nBT062-SPDB-DM4 抑制 SCID 小鼠的人类 MM 异种移植物模型中的肿瘤生长
     在 SCID 小 鼠 的 GFP 阳 性 人 类 MM 异 种 移 植 物 中 确 定 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 的体内活性。
     图 18A 显示对 OPM1GFP 细胞的 GFP 表达的分析。 如该图所示， 建立了 OPM1MM 细胞的 GFP 高度荧光集落 (OPM1 )， 并且检查免疫缀合物在实验动物体内对这些细胞的抗肿瘤活性。 6 GFP 图 18B 中， 用 5×10 OPM1 细胞注射每组 5 只小鼠。用在 100μl RPMI-1640 培养基中的 6 5×10 OPM1GFP 细胞对小鼠皮下接种。当肿瘤建立时， 开始用 nBT062-SPDB-DM4( 正方形 )、 nBT062-SPP-DM1( 三角形 ) 或缓冲对照进行处理。通过连续游标卡尺测定正交直径以确定 肿瘤尺寸。误差条表示标准偏差。注射肿瘤细胞后 14 天， 所有小鼠发育出可测定的肿瘤，然后随机地每周一次接受 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或对照运载剂 (PBS) 的处理。 每隔一天进行连续游标卡尺测定正交直径， 以计算肿瘤体积。用 nBT062-SPDB-DM4( 基于缀 合物的分子量为 176μg/ 小鼠， 每周一次持续 4 周 ) 对携带肿瘤的小鼠的处理， 与用 PBS 载 体处理的对照动物相比， 显著地抑制了 MM 肿瘤生长 (Dunn 多重比较测试 ； 对照运载剂相比 于 nBT062-SPDB-DM4 ： P ＜ 0.01， 图 16B)。
     nBT062-SPP-DM1 缀合物比 nBT062-SPDB-DM4 效力更低低 (Dunn 多重比较测试 ； nBT062-SPP-DM1 相比于 BT062-SPDB-DM4 ： P ＜ 0.05， 图 5B)。 由于肿瘤尺寸较大而必须在处 理开始后第 19 天处死所有对照小鼠。 使用 Kaplan-Meier 曲线和对数秩分析， 对照组的平均 OS 为 13.6 天 (95％置信区间 [CI]， 10 ～ 19 天 )， 使用 nBT062-SPDB-DM4 的处理组为 26 天 (95％置信区间， 23 ～ 42 天 )。从图 18C 可以看出， 与仅用运载剂处理 ( 实线 ； 正常盐水， n ＝ 5) 的对照组相比， nBT062-SPDB-DM4 显著地增加存活 (P ＜ 0.0023， 虚线， n ＝ 5)。杀死 小鼠， 并且切下来自 nBT062-SPDB-DM4 处理的小鼠和缓冲液处理的对照小鼠的肿瘤， 以用 GFP 于 TUNEL 分析。从携带 OPM1 的小鼠切下的肿瘤的离体分析显示， 与对照小鼠相比， BT062 处理的动物中的凋亡显著增加 ( 图 18D)。因此， nBT062-SPDB-DM4 诱导体内凋亡。在该研 究中施用的化合物中都未对体重显示出任何影响。 讨论
     以上， 证明了在体外和在实验动物体内的 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 针对表达 CD138 的 MM 细胞的选择性抗肿瘤活性。使用免疫印迹和免疫荧 光分析， 我们发现大多数所分析的 MM 细胞系表达了 CD138。 然而， DOX40 不表达 CD138 蛋白， 并且 MM1S 和 LR5 细胞显示出对该蛋白的弱表达。剩下的 5 只显示出高水平的 CD138 表达。 免疫缀合物 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 显示对 MM 细胞系的显 著的细胞毒性， 其中 nBT062-SPDB-DM4 为这三种试剂中最强效的化合物。 表达高水平 CD138 的 OPM1 和 RPMI8226 细胞比 CD138 低表达 MM1s 细胞或 CD138 阴性 Dox40 细胞对免疫缀合物 更敏感。重要的是， 这些试剂对分离自罹患 MM 的患者的肿瘤细胞也具有细胞毒性。重要的 是， 未观察到对于来自健康志愿者的外周单核细胞或骨髓单核细胞的细胞毒性。这些结果 表明， 免疫缀合物具有针对 MM 肿瘤细胞的抗原选择性活性。可以证明， nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 通过诱导 G2/M 细胞周期停滞以导致凋亡性细胞死亡， 从而抑制 MM 细胞的细胞增殖。在用免疫缀合物处理的 OPM1 细胞中， 可以检测到半胱天冬 酶 -3、 -8、 -9 和半胱天冬酶 -3 下游的靶标 PARP 的切割断裂。此外， 与这些药物一起温育 24 小时后， APO2.7 抗原阳性细胞增加。
     此前报道了 IL-6 经由 PI3-K/Akt、 MEK/ERK 和 JAK2/STAT3 信号传导级联的激活而 触发多发性骨髓瘤细胞的增殖。已据描述 IGF-1 也使用相同的途径促进多发性骨髓瘤细胞 增殖和存活。IL-6 经由诱导 PI3-K/Akt 信号传导而保护免遭地塞米松诱导的凋亡。检验了 外源性 IL-6 和 IGF-1 是否抑制多发性骨髓瘤细胞中的免疫缀合物诱导的细胞毒性。尽管 在用 IL-6 或 IGF-1 处理的细胞中注意到增殖增加， 但这些细胞因子不能抑制 OPM1 细胞中 的 nBT062-SPDB-DM4 诱导的凋亡， 表明这些试剂能够克服这些细胞因子的保护性作用。重 要的是， 免疫缀合物抑制了粘着至 BMSC 的 MM1S 细胞的生长和粘着， 进一步确认它们能够克 服细胞粘着介导的药物抗性 (CAM-DR)。在实验动物中， nBT062-SPDB-DM4 诱导已经建立的 MM 异种移植物的显著的生长延迟， 而不影响小鼠体重。
     测试的所有缀合物均显示出对 MM 细胞系和对源自患者的 MM 原代细胞具有高的细 胞毒性活性， 而来自健康志愿者的外周血单核细胞对所述缀合物不显示敏感性。
     CD138 特异性免疫缀合物触发 G2/M 细胞周期停滞和诱导靶细胞中的凋亡， 所述凋 亡与半胱天冬酶 -8/-9/ 和 -3 的切割以及半胱天冬酶 -3 下游的靶标 PARP 的切割有关。重 要的是， 白细胞介素 -6、 胰岛素样生长因子 -I 或骨髓基质细胞的存在不会保护 MM 细胞免受 免疫缀合物介导的细胞毒性。
     nBT062-SPDB-DM4 缀合物显著地抑制 MM 肿瘤生长 (p ＜ 0.01) 和延长小鼠的存活。
     应该意识到， 本发明的方法和组合物可以包含各种形式的实施方式， 本文仅公开 了其中一些。对本领域技术人员而言显而易见的是， 存在未背离本发明精神的其它实施方 式。因此， 描述的实施方式是说明性的， 不应解释为限制。
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     本申请要求于 2007 年 12 月 26 日提交的美国临时申请 61/016,614、 2008 年 8 月 8 日提交的临时申请 61/087,466 和同样于 2008 年 8 月 8 日提交的临时申请 61/087,590 的 权益， 本文通过参考并入其全部内容。
    技术领域 本发明涉及抵抗抗原 CD138 的免疫缀合物和包含所述免疫缀合物的组合物在减 少基质细胞粘着至表达 CD138 的靶细胞上的应用， 从而更有效地治疗涉及表达 CD138 的细 胞的疾病状态。
     背景技术 作为细胞外基质的受体的 CD138 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞上过表达， 并且已经表 现出影响 MM 细胞发育和 / 或增殖。 举例而言， CD138 还在卵巢癌、 肾癌、 胆囊癌、 乳腺癌、 前列 腺癌、 肺癌、 结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、 慢性淋巴性白血病 (CLL) 等的细胞上表达。
     在此用于说明本发明， 特别是提供关于实施的额外详细说明的出版物和包括专利 等的其它材料， 均通过参考并入。方便起见， 所述出版物在下文中按照作者和日期引用， 和 / 或按照所附目录中的作者依照字母顺序列出。
     Tassone 等 (2004) 已 经 报 道 了 鼠 IgG1 抗 体 B-B4 对 在 MM 细 胞 表 面 上 表 达 的 CD138 抗原的良好结合。Tassone 还报道了包含类美登素 (maytansinoid)DM1 作为效应分 子的免疫缀合物 B-B4-DM1 对多发性骨髓瘤细胞的高细胞毒性活性 ( 还参见美国专利公开 20070183971)。
     Tassone 还指出其 B-B4 缀合物即使在骨髓微环境中也有效， 所述骨髓微环境诱导 多发性骨髓瘤 (MM) 细胞对通常施用至 MM 患者的许多药物 ( 包括例如地塞米松 ) 产生抗性。 Tassone 的免疫缀合物能够有效地破坏骨髓基质环境中的 MM 肿瘤细胞。
     尽管 Tassone 等已经为提供 MM 的有效治疗和可以在此类治疗中使用的物质的组 成作为贡献， 但本领域仍然存在许多需要。
     仍然存在对改进使用基于 B-B4 的免疫缀合物的治疗的需要。还存在对使用显示 一种或多种有利性质的基于 B-B4 的免疫缀合物的有效治疗的需要。免疫缀合物的性质优 选包括改进的抗原结合、 改进的肿瘤细胞 ( 特别是表达 CD138 的肿瘤细胞以及其附属细胞 ) 杀伤或对靶标更均匀的结合， 但特别是更有效地抗击与表达 CD138 的细胞有关的疾病状态 的能力。
     在此用于说明本发明， 特别是提供关于实施的额外详细说明的出版物和包括专利 等的其它材料， 均通过参考并入。方便起见， 所述出版物在下文中按照作者和日期引用， 和 / 或按照所附目录中的作者依照字母顺序列出。
     Tassone 等 (2004) 已 经 报 道 了 鼠 IgG1 抗 体 B-B4 对 在 MM 细 胞 表 面 上 表 达 的 CD138 抗原的良好结合。Tassone 还报道了包含类美登素 (maytansinoid)DM1 作为效应分 子的免疫缀合物 B-B4-DM1 对多发性骨髓瘤细胞的高细胞毒性活性 ( 还参见美国专利公开 20070183971)。
     Tassone 还指出其 B-B4 缀合物即使在骨髓微环境中也有效， 所述骨髓微环境诱导 多发性骨髓瘤 (MM) 细胞对通常施用至 MM 患者的许多药物 ( 包括例如地塞米松 ) 产生抗性。 Tassone 的免疫缀合物能够有效地破坏骨髓基质环境中的 MM 肿瘤细胞。
     尽管 Tassone 等已经为提供 MM 的有效治疗和可以在此类治疗中使用的物质的组 成作为贡献， 但本领域仍然存在许多需要。
     仍然存在对改进使用基于 B-B4 的免疫缀合物的治疗的需要。还存在对使用显示 一种或多种有利性质的基于 B-B4 的免疫缀合物的有效治疗的需要。免疫缀合物的性质优 选包括改进的抗原结合、 改进的肿瘤细胞 ( 特别是表达 CD138 的肿瘤细胞以及其附属细胞 ) 杀伤或对靶标更均匀的结合， 但特别是更有效地抗击与表达 CD138 的细胞有关的疾病状态 的能力。
    发明内容 本发明涉及一种用于减少有需要的受试对象的肿瘤细胞中基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞的方法， 所述方法包括 ：
     以对于减少基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞而言有效的量对所述肿瘤细 胞施用靶向所述表达 CD138 的肿瘤细胞 ( 特别是含有如本文所公开的可切割连接子和效应 子的表达 CD138 的肿瘤细胞 ) 的免疫缀合物， 以及可选地以抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤细胞 生长的量对所述肿瘤细胞施用其它细胞毒性剂。
     所述粘着可以减少至少约 10 ％、 约 20 ％、 约 30 ％、 约 40 ％、 约 50 ％、 约 60 ％、 约 70％、 约 80％以上， 和 / 或可以导致对粘着介导的药物抗性的缓解， 所述抗性包括粘着介导 的抵抗其它细胞毒性剂 ( 其不是上述免疫缀合物中的一种 ) 的药物抗性， 并且其中以抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤细胞生长的量施用所述其它细胞毒性剂。可以依次地施用所述免疫缀 合物和该细胞毒性剂， 其中所述细胞毒性剂可以在施用所述免疫缀合物之后施用， 或可以 同时施用。
     本发明的免疫缀合物特别地包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 和
     (b) 效应分子，
     其中所述免疫缀合物均匀地靶向表达 CD138 的靶细胞。
     本发明的基因工程靶向抗体可以 (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区 (ABR)， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体。
     所述 ABR 可以分别包含 ：
     (a) 包含 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸残基 99 ～ 111 的重链可变区 CDR3 和
     (b) 包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 89 ～ 97 的轻链可变区 CDR3。
     所述 ABR 还可以分别包含 ：
     (a) 包含 SEQ ID NO ： 1 的氨基酸残基 31 ～ 35 和 51 ～ 68 的重链可变区 CDR1 和 CDR2， 和/或
     (b) 包含 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 24 ～ 34 和 50 ～ 56 的轻链可变区 CDR1 和 CDR2。
     所述另外的抗体区可以分别包含 ：
     (a)SEQ ID NO ： 1 的氨基酸残基 123 ～ 448， 和/或
     (b)SEQ ID NO ： 2 的氨基酸残基 108 ～ 214，
     以及其突变体， 所述突变体
     (i) 维持或降低所述基因工程靶向抗体的抗体依赖性细胞毒性和 / 或补体依赖性 细胞毒性， 和/或
     (ii) 稳定所述基因工程靶向抗体。
     效应分子可以经由连接子连接至所述基因工程靶向抗体。 所述连接子可以包含二 硫键。效应分子 ( 例如 DM4) 可以在靶向抗体和该效应分子之间提供空间位阻。效应分子 可以为至少一种类美登素 (maytansinoid)( 例如 DM1、 DM3 或 DM4)、 紫杉烷或 CC1065， 或其 类似物。
     所述免疫缀合物可以结合 CD138， 靶向变异 (targeting variation) 小于 150％、 140％、 130％、 120％、 110％、 100％、 90％、 80％、 70％、 60％或 50％。
     本发明还涉及一种免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。所述免疫球蛋白 重链或其一部分的恒定区可以为 IgG4 同型的恒定区。
     本发明还涉及一种治疗受试对象中的 MM 的方法， 所述方法包括 ：
     提供一种或多种本文指定的免疫缀合物， 和
     以对治疗多发性骨髓瘤而言有效的量对所述受试对象施用所述免疫缀合物。
     所述免疫缀合物的靶向剂可以包含与 SEQ ID NO ： 2 具有至少约 70％序列同一性 的轻链序列。所述免疫缀合物的靶向剂还可以包含与 SEQ IDNO ： 1 具有至少约 70％序列同 一性的重链序列。
     本发明还涉及一种用于免疫缀合物介导的药物输送的方法， 所述方法包括 ：
     提供一种或多种本文指定的免疫缀合物， 和
     以治疗有效量施用所述免疫缀合物， 其中所述 IgG4 同型缓解 ADCC、 补体依赖性细 胞毒性和 / 或 Fc- 介导的肝 FcR 的靶向。
     本发明还涉及一种抑制、 延缓和 / 或预防细胞培养物中的肿瘤细胞生长的方法， 所述方法包括 ：
     以抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤细胞生长有效的量对所述细胞培养物施用一种或多 种本文指定的一种或多种免疫缀合物。所述有效的量可以诱导表达 CD138 的肿瘤细胞和可 选的不表达 CD138 的辅助细胞 ( 特别是肿瘤基质细胞 ) 中的细胞死亡或连续细胞周期的停 滞。所述细胞培养物中的细胞可以获自癌症患者， 并且在施用所述有效量的所述免疫缀合 物后， 可以将所述细胞培养物的细胞再植入所述癌症患者。
     本发明还涉及一种用于在有需要的患者中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤 细胞的肿瘤生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的方法， 所述方法包括 ：
     以抑制或降低所述肿瘤生长和 / 或所述肿瘤细胞扩散的量， 对所述患者施用至少 一种或多种上述免疫缀合物，
     其中所述免疫缀合物抑制、 延缓或预防所述肿瘤细胞的生长和 / 或扩散。
     所述免疫缀合物的效应分子可以为毒素、 细胞毒性酶、 低分子量细胞毒性药物、 成 孔剂、 生物响应修饰剂、 前药激活酶、 抗体、 细胞因子或放射性核素。 2 2
     可以以 5mg/m ～约 300mg/m 的单次剂量可选地以每小时、 每天、 每周或其组合施 用本发明的免疫缀合物。
     包括每小时、 每天和每周方案等的多剂量方案为本发明的一部分， 并且特别包括 间隔为 5 小时、 6 小时、 7 小时、 8 小时、 9 小时、 10 小时、 11 小时、 12 小时、 13 小时、 14 小时、 15 小时、 16 小时、 17 小时、 18 小时、 19 小时、 20 小时、 21 小时、 22 小时、 23 小时、 1 天、 2 天、 3 天、 4 天、 5 天、 6 天、 7 天、 1 周、 2 周、 3 周、 4 周、 5 周、 6 周、 7 周或 8 周的施用。
     本发明还涉及一种用于在有需要的患者中抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤的生长和 / 或恶性肿瘤细胞的扩散的方法， 所述方法包括 ：
     (a) 以对于降低肿瘤负荷而言有效的量对所述患者施用一种或多种细胞毒性剂和 / 或放射 ； 和(b) 以对于抑制、 延缓或预防肿瘤的生长和 / 或肿瘤细胞的扩散而言有效的量， 对 所述患者施用至少一种本文指定的免疫缀合物，
     其中所述免疫缀合物抑制、 延缓或预防包含表达 CD138 的细胞的肿瘤细胞的生长 和 / 或扩散。
     特别地， 本发明任何实施方式的细胞毒性剂可以为美法仑 (mephalan)、 长春新 碱 (vincristine)、 多 柔 比 星 (doxorubicin)、 地 塞 米 松 (dexamethasone)、 环 磷 酰 胺、 足 叶 乙 甙 (etoposide)、 阿 糖 胞 苷 (cytarabine)、 顺 铂、 沙 利 度 胺 (thalidomide)、 泼尼松 (prednisone)、 沙利度胺、 硼替佐米 (bortezomib)、 来那度胺 (lenalidomide)、 索拉非尼 (sorafenib)、 罗明待辛 (romidepsin) 或其组合， 或可以为基于抗体的细胞毒性剂。
     本发明还涉及一种用于治疗患有会从抑制骨髓瘤细胞存活受益的疾病的受试对 象的方法， 所述方法包括 ：
     (a) 提供至少一种本文指定的任何免疫缀合物， 和
     (b) 对所述受试对象施用所述免疫缀合物， 从而选择性地降低所述受试对象的骨 髓瘤细胞的存活或生长。
     本发明还涉及一种药物组合物， 所述药物组合物包含用于抑制、 延缓和 / 或预防 肿瘤的生长和 / 或肿瘤细胞的扩散的本文指定的任何免疫缀合物， 以及一种或多种药物可 接受赋形剂。 所述药物组合物可以包含本文所指定的细胞毒性剂。
     本发明还涉及一种试剂盒， 所述试剂盒在分开的容器中包含组合使用以抑制、 延 缓和 / 或预防肿瘤的生长和 / 或肿瘤细胞的扩散的药物组合物， 其中一个容器包含有效量 的上述药物组合物， 和其中另一容器包含含有有效量的用于抑制、 延缓和 / 或预防肿瘤的 生长和 / 或肿瘤细胞的扩散的试剂 ( 优选细胞毒性剂 ) 的第二药物组合物， 以及一种或多 种药物可接受赋形剂。
     本发明还涉及一种用于在有需要的受试对象中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞的肿瘤生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的方法， 所述方法包括 ：
     (a) 提供免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含 ：
     经由可切割连接子连接至效应分子的抗 CD138 的基因工程靶向抗体， 其中所述效 应分子是空间位阻性的， 和
     (b) 以抑制、 延缓和 / 或预防所述肿瘤的生长和 / 或所述肿瘤细胞的扩散的量， 对 所述受试对象施用所述 (a) 的免疫缀合物， 其中所述 (a) 的免疫缀合物提供的肿瘤生长抑 制活性比其无位阻对应物 (counterpart) 的活性高出约 10％、 约 20％、 约 30％、 约 40％以 上。
     包含非可切割连接子的无位阻对应物的肿瘤生长抑制活性可以高于其包含可切 割连接子的无位阻对应物的肿瘤生长抑制活性， 例如可以高出至少约 5％、 至少约 10％、 至 多约 15％。
     所述抗 CD138 的基因工程靶向抗体可以基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合 区构成， 或可以包含非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区和另外的抗体区， 其中所述另外的 抗体区的至少一部分出自人类抗体。
     所述可切割连接子可以包含二硫键。所述效应分子可以为 DM4。所述免疫缀合物
     可以是药物组合物的一部分， 并且可以以至少一次量为约 5mg/m2 ～约 300mg/m2 的剂量施用 至所述受试对象。
     本发明提供一种用作药物的免疫缀合物， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     本发明提供另一种用作药物的免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     特别地， 在本发明的一个方面， 将上述段落的免疫缀合物用于治疗多发性骨髓瘤。 特别地， 所述免疫缀合物能够用于制造多发性骨髓瘤治疗用药物。 本发明还提供一种免疫缀合物， 所述免疫缀合物用于将免疫缀合物介导的药物 输送至患者， 特别是用于缓解 ADCC、 补体依赖性细胞毒性和 / 或 Fc- 介导的肝 FcR 靶向， 其中所述免疫缀合物包含靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含分离的多肽， 所述多肽包 含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ IDNO ： 1 具有至少 70％序列同一性， 并且所述免疫球蛋白重链或其一部分的恒定区为 IgG4 同型的恒定区。
     本发明还提供用于治疗患者中癌症的肿瘤细胞， 其中所述肿瘤细胞已经在细胞培 养中用免疫缀合物处理， 所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     本发明还提供用于治疗患者中癌症的肿瘤细胞， 其中所述肿瘤细胞已经在细胞培 养中用免疫缀合物处理， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     本发明提供一种用于在患者中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞的肿瘤 生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的免疫缀合物， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     作为另一种选择， 本发明提供在患者中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞 的肿瘤生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散的免疫缀合物， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     此外， 本发明提供一种药物， 所述药物包含免疫缀合物和一种或多种癌症药物作 为组合制剂， 以用于同时、 分开或依次地用于治疗包含表达 CD138 的细胞的肿瘤细胞， 其中 所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及 (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138，
     并且其中所述一种或多种癌症药物能够降低肿瘤负荷。
     作为另一种选择， 本发明提供一种药物， 所述药物包含免疫缀合物和一种或多种 癌症药物作为组合制剂， 以用于同时、 分开或依次地用于治疗包含表达 CD138 的细胞的肿 瘤细胞， 其中所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性，
     并且其中所述一种或多种癌症药物能够降低肿瘤负荷。
     在上两段应用的另一方面， 将所述组合制剂施用至已经采用放射治疗的患者。
     在一个替代性方面， 本发明提供免疫缀合物在制备用于治疗包含表达 CD138 的细 胞的患者中的肿瘤细胞的药物中的应用， 所述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     以及其中将所述药物施用至已用放射治疗的患者， 以降低肿瘤负荷。
     此外， 本发明提供免疫缀合物在制备用于治疗包含表达 CD138 的细胞的患者中的 肿瘤细胞的药物中的应用， 所述免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述
     免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性，
     以及其中将所述药物施用至已用放射治疗的患者， 以降低肿瘤负荷。
     在上述段落中， 所述药物能够抑制、 延缓和 / 或预防患者中肿瘤的生长和 / 或恶性 肿瘤细胞的扩散。
     此外， 本发明还提供一种用于抑制个体中骨髓瘤细胞存活的免疫缀合物， 其中所 述免疫缀合物包含 ：
     (a) 基因工程靶向抗体， 所述基因工程靶向抗体
     (i) 基本上由非人类抗体的抗 CD138 抗原结合区构成， 或
     (ii) 包含抗 CD138 抗原结合区， 其中所述抗原结合区出自非人类抗体， 和
     另外的抗体区， 其中所述另外的抗体区的至少一部分出自人类抗体， 以及
     (b) 效应分子
     其中所述免疫缀合物均匀地结合至 CD138。
     此外， 本发明提供一种用于抑制个体中骨髓瘤细胞存活的免疫缀合物， 其中所述 免疫缀合物包含 ：
     靶向 CD138 的靶向剂， 所述靶向剂包含
     分离的多肽， 所述多肽包含免疫球蛋白重链或其一部分的氨基酸序列， 其中所述 免疫球蛋白重链或其一部分与 SEQ ID NO ： 1 具有至少 70％序列同一性。
     特别地， 在上两段中所述免疫缀合物能够选择性地降低个体中所述骨髓瘤细胞的 存活或生长。
     此外， 本发明提供一种免疫缀合物， 所述免疫缀合物用于在个体中抑制、 延缓和 / 或预防包含 CD138 肿瘤细胞的肿瘤的生长和 / 或此类肿瘤的肿瘤细胞的扩散， 其中所述免 疫缀合物包含经由可切割连接子连接至效应分子的抗 CD138 基因工程靶向抗体， 其中所述 效应分子为空间位阻性的。
     特别地， 在上段中， 所述免疫缀合物能够提供的抑制肿瘤生长的活性比其无位阻 对应物活性高出约 10％、 约 20％、 约 30％、 约 40％以上。
     本发明还提供一种 CD138 靶向剂， 所述 CD138 靶向剂用于减少受试对象的肿瘤细 胞中的基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞的方法。
     本发明还提供一种药物， 所述药物包含 CD138 靶向剂和其它试剂 ( 例如靶向免疫 缀合物或细胞生长抑制剂 ) 作为组合制剂以用于同时 ( 共施用 )、 分开或依次地用于减少受 试对象的肿瘤细胞中的基质细胞粘着至表达 CD138 的肿瘤细胞的方法。
     特别地， 在上段中， 所述组合制剂能够抑制、 延缓和 / 或预防受试对象中肿瘤细胞 的生长。 附图说明
     图 1 提供连接有效应分子的 nBT062 的示意图。
     图 2 为 BT062 的化学示意图。
     图 3 显示安丝菌素 P-3 向美登醇 (maytansinol) 的转换 ( 简化起见省略立体化 学 )。
     图 4 显示 DM4 的代表性合成图。图 5 为抗体缀合 (nBT062 至 DM4) 的示意图。
     图 6 显示对 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1、 nBT062-SMCC-DM1 和 nBT062 抗体 与 OPM-2 细胞的结合的分析。将不同浓度的 nBT062 和缀合物给予所述细胞， 并通过 FACS 分析测定平均荧光。
     图 7(A)-(D) 描述 nBT062-DMx 缀合物对 MOLP-8(CD138+) 和 BJAB(CD138-) 细胞的 体外细胞毒性。 在平底板中培养所述细胞， 并且与指定浓度的免疫缀合物一起温育 5 天。 加 入 WST 试剂， 过 3 个小时估算细胞活力。 在 (D) 中， 在存在或不存在阻断抗体 (1μM nBT062) 时分析 nBT062-SPDB-DM4 的细胞毒性活性。
     图 8 显 示 用 (A)PBS、 (B)nBT062 抗 体、 (C) 游 离 DM4 或 (D) 非 靶 向 缀 合 物 huC242-DM4 处理的个体小鼠， 在用 MOLP-8 肿瘤细胞接种后随时间 ( 天 ) 的肿瘤体积。
     图 9 显 示 用 (A)PBS 、 (B)nBT062-SPDB-DM4 、 (C)B-B4-SPP-DM1 或 (D) nBT062-SPP-DM1 处理的个体小鼠在用 MOLP-8 肿瘤细胞接种后随时间 ( 天 ) 推移的肿瘤体 积。
     图 10 描述 CB.17SCID 小鼠中 MOLP-8 人类多发性骨髓瘤异种移植物在接种后随时 间 ( 天 ) 推移的平均肿瘤体积 (+/-SD)。
    +图 11A 和 B 显示在 SCID 小鼠的大体积 (bulky)MOLP-8 肿瘤模型中， nBT062-DMx 针 对 CD138 MOLP-8 肿瘤细胞的抗肿瘤活性。对于各组， 肿瘤体积以平均值 (+/-SD) 给出。
     图 12 为反映在人类骨髓的环境中的 SCIDhu/INA-6 模型中含有 DMx 缀合物的 nBT062 对多发性骨髓瘤细胞的抗肿瘤效力的图。将由多发性骨髓瘤细胞产生的可溶性 人类 IL-6 受体 (shuIL-6R) 用作肿瘤负荷的指示物。三角形 ： nBT062-SPP-DM1， 正方形 ： nBT062-SPDB-DM4 ； 菱形 ： 运载剂对照。
     图 13 显示体外 nBT062-SPDB-DM4 介导的旁观者杀伤 (bystander killing)。将 CD138 阳性 OPM2 细胞和 CD138 阴性 Namawla 细胞与不同浓度的 nBT062-SPDB-DM4 一起培 养， 并测定细胞活力。OD450 值代表细胞活力的测定值。
     图 14 在 (A) 中显示通过不同 MM 细胞的 CD138 表达， 在 (B) 中显示 DOX40 细胞 ( 上 图 ) 和 OPM1 细胞 ( 下图 ) 的显微分析。CD138 显示在右侧， 核酸显示在左侧。
     图 15(A) 描述 40 小时、 80 小时和 120 小时后 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 对 MM 细胞的细胞毒性。图 15(B) 描述从三个不同的患者分离的 MM 细胞用 nBT062-SPDB-DM4 处理 2 天后的细胞活力。图 15(C) 显示在确定细胞活力前与 nBT062-SPDB-DM4 一起培养 72h 的源自 3 个健康受试对象的外周血单核细胞 (PBMC)。
     图 16(A) 显示其中 OPM1 细胞已经用免疫缀合物处理 0h、 12h 或 24h 的细胞周期 分析， 并通过 PI 染色分析细胞周期曲线。图 16(B) 中， 在存在或不存在免疫缀合物时培养 OPM1 细胞 24h、 48h 或 72h。 通过 Apo 2.7 抗体染色和流式细胞仪分析估算凋亡细胞百分比。 图 16(C) 中， 在存在 885μg/ml nBT062-SPDB-DM4 时培养 OPM1 细胞指定的时间 ( 左图 )， 或 用不同浓度的免疫缀合物 ( 中图 ) 培养 OPM1 细胞。泛半胱天冬酶 (pan-caspase) 抑制剂 zVAD-fmk 阻断的 nBT062-SPDB-DM4 诱导半胱天冬酶 -8、 -9 和 -3 以及聚 (ADP- 核糖 ) 聚合 酶 (PARP) 在 OPM1 细胞中的切割 ( 右图 )。
     图 17 在 (A) ～ (C) 中显示 IL-6、 IGF-1 和 BMSC 对 MM 细胞生长和 MM 细胞对免疫 缀合物的敏感性的影响。图 17(D) 显示使用地塞米松代替免疫缀合物的实验。图 17(E) 显示在存在或不存在免疫缀合物时， 采用肿瘤细胞和 BMSC 共培养物的细胞粘着实验结果。
     图 18(A) 描 述 对 通 过 OPM1GFP 细 胞 的 GFP 表 达 的 分 析。 图 18(B) 显 示 在 用 5×106OPM1GFP 细 胞 注 射 的 SCID 组 中， nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或 缓 冲 液 对 照对肿瘤尺寸的影响。图 18(C) 中与仅用运载剂处理的对照组 ( 实线 ； 正常盐水， n＝ 5) 相比， nBT062-SPDB-DM4 显著地增加存活 (P ＜ 0.0023， 虚线， n ＝ 5)。图 18(D) 证明 nBT062-SPDB-DM4 诱导体内凋亡。 具体实施方式
     本发明涉及一种包含 CD138 靶向剂的免疫缀合物， 和所述免疫缀合物的效应分子 向靶点的输送， 以及所述效应分子在靶细胞、 组织和器官中、 其上或其附近的位点特异性释 放。可以通过在靶点处从免疫缀合物的靶向剂部分切割 / 分离而激活所述效应分子。本发 明特别涉及这些免疫缀合物在抗击体内肿瘤生长中的应用， 和这些免疫缀合物克服或减少 在骨髓微环境中遭遇的保护性机制的能力的应用。
     可以对需要治疗性治疗的受试对象或分离自需要治疗性治疗的此类受试对象的 细胞施用本发明的免疫缀合物。可以通过在靶细胞、 组织或器官中、 其上或其附近切割 / 分 离而从所述免疫缀合物释放效应分子。 在一实例中， 对患有癌症的患者施用所述免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含靶向 表达 CD138 的细胞的抗体 nBT062， 以及至少一种作为效应分子的高细胞毒性药物或毒素。 在该实例中， 对患者静脉内施用治疗有效量的免疫缀合物， 以使所述免疫缀合物在癌细胞 中富集。 然后通过自然手段使所述效应分子从所述抗体释放。 在切割之后或期间， 可以通过 烷基化稳定所述效应分子， 并且使所述效应分子扩散到周围的不表达 CD138 的辅助细胞， 例如基质细胞。
     在第二实例中， 对患有癌症的患者施用所述免疫缀合物， 所述免疫缀合物包含靶 向表达 CD138 的细胞的抗体 nBT062， 和作为效应分子的至少一种高细胞毒性药物或毒素， 以及另外的细胞毒性剂。 在该实例中， 依次施用治疗有效量的免疫缀合物和细胞毒性剂。 首 先对患者静脉内施用所述免疫缀合物， 以使所述免疫缀合物在骨髓微环境中的癌细胞中富 集。所述免疫缀合物基本上克服了细胞粘着介导的药物抗性 (CAM-DR)， 并且破坏了骨髓微 环境中相当大部分的表达 CD138 的肿瘤细胞。特别地， 所述效应分子通过天然手段从所述 抗体释放并且破坏肿瘤细胞。所述免疫缀合物至少部分地避免肿瘤细胞粘着至基质细胞， 某些所述基质细胞可能被扩散的效应分子破坏。12 小时的时间间隔后， 施用所述细胞毒性 剂。细胞毒性剂 ( 其活性通常被 CAM-DR 至少降低 ) 能够作用于不与基质细胞相粘连的肿 瘤细胞上并且破坏逃过免疫缀合物作用的表达 CD138 的肿瘤细胞。
     CD138 或粘结蛋白聚糖 -1(syndecan-1)( 也称 SYND1 ； SYNDECAN ； SDC ； SCD1 ； CD138 抗原， SwissProt 登录号 ： P18827 人类 ) 为一种膜糖蛋白， 最初记载其存在于源自上皮的细 胞上， 随后发现于造血细胞上 (Sanderson， 1989)。CD138 具有长的细胞外结构域， 该细胞外 结构域与可溶性分子 ( 例如生长因子 EGF、 FGF、 HGF) 和不溶性分子 ( 例如细胞外基质成分 胶原蛋白和纤连蛋白 ) 通过硫酸乙酰肝素链结合 (Langford， 1998 ； Yang， 2007)， 并且充当 细胞外基质的受体。 CD138 还通过由粘附细胞表达的肝素结合分子介导细胞与细胞的粘着。 已经显示 CD138 起骨髓瘤细胞的生长因子的共受体的作用 (Bisping， 2006)。 血浆细胞分化
     的研究表明， CD138 也必须被视为一种分化抗原 (Bataille， 2006)。
     在恶性造血中， CD138 在大多数的以下细胞上高度表达 ： MM 细胞、 卵巢癌、 肾癌、 胆 囊癌、 乳腺癌、 前列腺癌、 肺癌、 结肠癌细胞和霍奇金氏淋巴瘤与非霍奇金氏淋巴瘤、 慢性淋 巴性白血病 (CLL)(Horvathova， 1995)、 急性淋巴性白血病 (ALL)、 急性髓细胞白血病 (AML) (Seftalioglu， 2003(a) ； Seftalioglu， 2003(b))、 实体组织肉瘤、 结肠癌以及表达 CD138 的 其它恶性血液病和实体肿瘤的细胞 (Carbone 等， 1999 ； Sebestyen 等， 1999 ； Han 等， 2004 ； Charnaux 等， 2004 ； O’ Connell 等， 2004 ； Oroszh 和 Kopper， 2001)。
     已经对 CD138 表达显示为阳性的其它癌症为多种卵巢腺癌、 膀胱移行细胞癌、 肾 透明细胞癌、 肺鳞状细胞癌、 乳腺癌和子宫癌 ( 参见， 例如， Davies 等， 2004 ； Barbareschi 等， 2003 ； Mennerich 等， 2004 ； Anttonen 等， 2001 ； Wijdenes， 2002)。
     在正常人类造血腔中， CD138 表达局限于血浆细胞 (Wijdenes， 1996 ； Chilosi， 1999)， 并且 CD138 不在外周血淋巴细胞、 单核细胞、 粒细胞和红细胞上表达。特别地， CD34+ 干细胞和祖细胞 (progenitor cell) 不表达 CD138， 并且抗 CD138mAb 不影响造血干细胞培 养物中集落形成单位的数量 (Wijdenes， 1996)。在非造血腔中， CD138 主要在肺、 肝、 皮肤、 肾和肠内的单层上皮和复层上皮上表达。 在内皮细胞上仅看到弱的染色 (Bernfield， 1992 ； Vooijs， 1996)。据报道， CD138 以多态性形式存在于人类淋巴瘤细胞中 (Gattei， 1999)。 已经报道单克隆抗体 B-B4、 BC/B-B4、 B-B2、 DL-101、 1D4、 MI15、 1.BB.210、 2Q1484、 5F7、 104-9、 281-2， 特别是 B-B4 对 CD138 有特异性。其中 B-B4、 1D4 和 MI15 既识别 CD138 的完整分子也识别其核心蛋白， 并且据显示识别相同或密切相关的表位 (Gattei， 1999)。 此 前的研究报道， B-B4 不识别可溶性 CD138， 但仅识别膜结合形式的 CD138(Wijdenes， 2002)。
     B-B4， 一种鼠 IgG1mAb， 与人类粘结蛋白聚糖 -1(CD138) 上的核心蛋白的 90 ～ 95 位残基之间的线性表位结合 (Wijdenes， 1996 ； Dore， 1998)。 与 CD138 的表达模式一致， 据显 示 B-B4 与血浆细胞系 RPMI8226 强烈地反应， 但不与内皮细胞反应。 同样与 CD138 的表达模 式一致， B-B4 还与上皮细胞系 A431( 源自角质形成细胞源 ) 和 HepG2( 源自肝细胞 ) 反应。 免疫毒素 B-B4- 皂草素对血浆细胞系 RPMI8226 也是高度毒性的， 事实上比游离皂草素的毒 性明显更强。然而， 从两个受测的上皮细胞系看出， B-B4- 皂草素仅对细胞系 A431 显示毒 性， 但在集落形成测试中皂草素对 A431 细胞的生长晕未显示出抑制作用 (Vooijs， 1996)。 其它研究者报道了 MM 相关抗原抗肿瘤缺少特异性 (Couturier， 1999)。
     在本发明的背景下， 抗体 / 免疫缀合物 “基本上由特定成分组成” 是指抗体 / 免疫 缀合物由指定的成分和任何不会在实质上影响所述抗体的基本特性的其它材料或成分组 成。
     本发明使用术语 “肿瘤细胞” 来包括癌细胞以及可能形成或可能不形成实体肿瘤 的部分的癌前细胞。
     本发明的 “靶向剂” 能够与由靶细胞表达的分子相连， 并且包括肽和非肽类。特别 地， 本发明的靶向剂包括靶向抗体和非免疫球蛋白靶向分子， 所述非免疫球蛋白靶向分子 可以基于包括但不限于 AFFILIN 分子、 ANTICALINS 和 AFFIBODIES 的非免疫球蛋白蛋 白。 非免疫球蛋白靶向分子还包括非肽靶向分子 ( 例如靶向 DNA 和 RNA 寡核苷酸 ( 适体 ))， 以及生理学配体， 特别是所关注的抗原的配体， 例如 CD138。
     本发明的 “靶向抗体” 为天然抗体或基于天然抗体， 或通过合成或通过基因工程而
     产生， 并且与目的细胞 ( 靶细胞 ) 上的抗原结合。本发明的靶向抗体包括单克隆抗体、 多克 隆抗体、 多特异性抗体 ( 例如双特异性抗体 )、 或抗体片段。所述靶向抗体可以被基因工程 化以便例如提高其与靶细胞的亲和性 (Ross， 2003)， 或减少其免疫原性。 所述靶向抗体可以 与包括效应分子的脂质体制剂相连 (Carter， 2003)。 抗体片段包含完整抗体的一部分， 优选 完整抗体的抗原结合区或可变区。本发明的抗体片段的实例包括 Fab、 Fab′、 F(ab′ )2 和 Fv 片段以及双链抗体 (diabody) ； 结构域抗体 (domain antibody)(dAb)(Ward， 1989 ； 美国 专利 6,005,079) ； 线性抗体 ； 单链抗体分子 ； 和由抗体片段形成的多特异性抗体。 在单链可 变片段抗体 (scFv) 中， 重链和轻链 (VH 和 VL) 可以通过短的氨基酸连接子连接， 所述连接 子具有例如 (Gly4Ser)n 的序列并且具有足够的柔性而使两个结构域能装配成功能性抗原 结合袋。 添加各种信号序列可以使得靶向抗体具有更精确的靶向性。 添加轻链恒定区 (CL) 可以允许经由二硫键的二聚化， 从而提供更高的稳定性和亲合力。如果可获得针对所关注 的靶标的 mAb， 可以通过 RT-PCR 获得用于构建 scFv 的可变区， 所述 RT-PCR 从提取自亲本杂 交瘤的 mRNA 克隆出该可变区。作为另一种选择， 所述 scFv 可以通过噬菌体展示技术从头 产生 (Smith， 2001)。如本文所用， 当参照靶向抗体使用时， 术语 “功能片段” 是指能够特异 性结合抗原的靶向抗体的一部分， 所述抗原与所参照的抗体特异性地结合。本发明的双特 异性抗体可以例如具有对靶组织有反应性的至少一条臂， 以及对连接子部分有反应性的一 条臂 ( 美国专利公开 20020006379)。 本发明的双特异性抗体还可以与靶细胞上的超过一种 抗原结合 (Carter， 2003)。本发明的抗体可以通过例如引入半胱氨酸残基来引入巯基来修 饰 (Olafsen， 2004)。
     根据本发明， 所述靶向抗体可以源自任何来源， 并且可以为但不限于骆驼抗体、 小 鼠抗体、 嵌合人类 / 小鼠抗体或嵌合人类 / 猴抗体， 特别是例如 nBT062 等的嵌合人类 / 小 鼠抗体。
     人源化抗体为含有源自人类抗体和源自非人类抗体的序列的抗体， 其也在本 发明范围内。用于将抗体人源化的合适方法包括 CDR 移植 ( 互补决定区移植 )(EP 0 239 400 ； WO 91/09967 ； 美 国 专 利 5,530,101 ； 和 5,585,089)、 表 面 修 饰 (veneering) 或 表 面 重 塑 (resurfacing)(EP 0 592 106 ； EP 0 519 596 ； Padlan， 199 ； Studnicka 等， 1994 ； Roguska 等， 1994)、 链 改 组 (chain shuffling)( 美 国 专 利 5,565,332) 以 及 TM DeImmunosation (Biovation， LTD)。在 CDR 移植中， 将来自例如 mAb B-B4 等的小鼠互补 决定区 (CDR) 移植至人类可变框架， 然后将该人类可变框架与人类恒定区连接， 从而形成 人类 B-B4 抗体 (hB-B4)。现在已经将几种通过 CDR- 移植人源化的抗体用于临床， 包括 MYLOTARG(Sievers 等， 2001) 和 HECEPTIN(Pegram 等， 1998)。
     表面重塑技术使用分子模塑、 统计分析和诱变的组合来将抗体可变区的非 CDR 表面改变成与靶标宿主的已知抗体表面类似。在例如美国专利 5,639,641 中公开了用于 将抗体表面重塑的策略和方法， 以及用于降低不同宿主内抗体免疫原性的其它方法。可 以通过包括噬菌体展示方法的本领域已知的各种方法来制备人类抗体。还参见美国专利 4,444,887、 4,716,111、 5,545,806 和 5,814,318 ； 以及国际专利申请公开 WO 98/46645、 WO 98/50433、 WO 98/24893、 WO 98/16654、 WO 96/34096、 WO 96/33735 和 WO 91/10741。
     经受任何非天然修饰的靶向抗体， 例如， 嵌合人类 / 小鼠抗体或嵌合人类 / 猴抗 体、 人源化抗体或经基因工程化以便例如提高与靶细胞的亲和性或减少其免疫原性的抗体， 以及抗体片段、 特别是已经经受任何非天然修饰的此类靶向抗体的功能片段、 双链抗 体； 结构域抗体 ； 线性抗体 ； 单链抗体分子 ； 和多特异性抗体在本文也称为基因工程靶向抗 体。
     嵌合抗体， 保留非人类抗体 ( 例如它们所基于的小鼠抗体 ) 的抗体结合区 (ABR 或 Fab 区 )， 同时可以由例如人类抗体提供任何恒定区。通常， 抗体恒定区的嵌合和 / 或交换 不会影响抗体的亲和力， 这是因为有助于抗原结合的抗体区不受交换的影响。在本发明的 优选实施方式中， 本发明的基因工程抗体， 特别是嵌合抗体可以比其所基于的对应非人类 抗体具有更高的结合亲和力 ( 通过 KD 值表达 )。具体地， nBT062 抗体和基于该抗体的抗体 可以比小鼠 B-B4 具有更高的抗体亲和性。在本发明的另一实施方式中， 包含这些基因工程 抗体 / 嵌合抗体的免疫缀合物也显示出这种更高的抗体亲和性。在某些实施方式中这些免 疫缀合物也可以显示其它有利性质， 例如比其含有 B-B4 的对应物使肿瘤负荷降低得更多。 在优选实施方式中， 基因工程化、 特别是嵌合的靶向抗体显示出特征为解离常数 KD(nM) 小 于 1.6、 小于 1.5 或为 1.4 或约小于 1.4 的结合亲和力， 而其小鼠对应物的特征在于解离常 数 KD(nM) 为约 1.6 或大于 1.6。优选包含靶向抗体等靶向剂的免疫缀合物的特征在于， 解 离常数 KD(nM) 小于 2.6、 小于 2.5、 小于 2.4、 小于 2.3、 小于 2.2、 小于 2.1、 小于 2.0、 小于 1.9 或为约 1.9， 而包含小鼠对应物抗体的免疫缀合物的特征可以在于解离常数 KD(nM) 为 约 2.6 或大于 2.6( 比较表 3、 材料和方法 )。
     也可以使用完全人类抗体。可以通过噬菌体展示方法筛选这些抗体， 其中 CD138 或其抗原性决定子用于选择性地与表达例如 B-B4 可变区的噬菌体结合 ( 参见， Krebs， 2001)。有利的是， 该方法可以与亲和力成熟技术联合， 来提高抗体的亲和力。本文涉及的 所有抗体均为分离的抗体。
     在一个实施方式中， 未缀合形式的靶向抗体被中等或较弱地内化。在 37℃下温育 3 小时后， 中等内化构成约 30％～约 75％的抗体内化， 弱内化构成约 0.01％～最大约 30％ 内化。在另一优选实施方式中， 所述靶向抗体结合 CD138， 例如抗体 B-B4、 BC/B-B4、 B-B2、 DL-101、 1D4、 MI15、 1.BB.210、 2Q1484、 5F7、 104-9、 281-2， 特别是 B-B4。通过将 SP02/0 骨髓 瘤细胞与 Balb/c 小鼠的脾细胞杂交产生的杂交瘤细胞， 已经于 2007 年 12 月 11 日保藏在 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Mascheroder Weg 1， D-38124Braunschweig。这些表达 B-B4 的杂交瘤细胞的识别号为 DSM ACC2874。在 另一实施方式中， 所述靶向抗体基本上不结合非细胞表面表达的 CD138。在本发明的背景 下， 当特异性抗体的名称与术语 “靶向抗体” 结合 ( 例如 “nBT062 靶向抗体” ) 时， 这是指该 靶向抗体具有抗体 nBT062 的结合特异性。如果说靶向抗体 “基于” 一种特异性抗体， 这是 指该靶向抗体具有该抗体的结合特异性， 但可以采用与上述对靶向抗体的描述一致的任何 形式。在本发明的背景下， 当特异性抗原的名称与术语 “靶向抗体” 结合 ( 例如 “CD138 靶 向抗体” ) 时， 这是指该靶向抗体具有对 CD138 的结合特异性。在本发明的背景下， 如果例 如描述靶向抗体 “选择性地” 进行某事， 例如 “选择性地靶向细胞表面表达的 CD138” ， 或对 某事是 “选择性的” ， 这是指在所提供的实例的情况下， 与任何其它抗原相比， 对细胞表面表 达的 CD138 存在显著的选择性 ( 即， 对 CD138 阳性细胞比对于 CD138 阴性细胞更高的亲和 性 )。由于该选择性， 显著减少了甚至避免给定环境中不利的副作用。
     本发明的 “非免疫球蛋白靶向分子” 包括源自非免疫球蛋白蛋白的靶向分子以及非肽靶向分子。将包括在该定义中的小的非免疫球蛋白蛋白设计成对特别是表面表达的 CD138 具有特异性亲和性。 这些小的非免疫球蛋白蛋白包括基于支架的基因工程分子， 例如 具有相对低分子量 ( 例如 10kDa ～ 20kDa) 的 Affilin 分子。合适的支架包括例如 γ 晶 体。这些分子在其自然状态对靶标分子无特异性结合活性。通过对蛋白表面经由溶剂暴露 的氨基酸的局部限定随机化而进行基因工程化， 形成全新的结合位点。由此将此前的非结 合蛋白转变成特异性结合蛋白。可以将此类分子特异地设计成结合例如 CD138 等的靶标， 并允许特异性输送一种或多种效应分子 ( 参见， www.scilproteins.com 的 scil Proteins GmbH， 2004)。另一种非免疫球蛋白靶向分子源自脂钙蛋白 (lipocalin)， 并且包括例如 ANTICALINS ， 所述 ANTICALINS 与免疫球蛋白在结构上具有某种程度的相似性。 然而脂钙 蛋白由具有 160 ～ 180 个氨基酸残基的单链多肽构成。可以将脂钙蛋白的结合袋改造以便 以高亲和性和特异性来识别所关注分子 ( 参见， 例如， Beste 等， 1999)。人工细菌受体 ( 例 如商标为 Affibody (Affibody AB) 的受体 ) 也在本发明范围内。这些人工细菌受体分子 为较小的简单蛋白， 并且可以由基于蛋白 A( 金黄色葡萄球菌 ) 的一种 IgG 结合结构域的支 架的三螺旋束构成。 这些分子具有与许多免疫球蛋白类似的结合性质， 但是明显更小， 分子 量通常不超过 10kDa， 并且相对稳定。合适的人工细菌受体分子例如美国专利 5,831,012 ； 6,534,628 和 6,740,734 中所述。 其它 “非免疫球蛋白靶向分子” 为正讨论的抗原的生理学配体。CD138 的生理学 配体包括但不限于例如 ADAMTS4( 聚蛋白多糖酶 -1)、 抗凝血酶 -3、 bFGF、 组织蛋白酶 G、 CCL5(RANTES)、 CCL7、 CCL11、 CCL17、 CD44、 胶原蛋白 (1 型胶原蛋白、 2 型胶原蛋白、 3 型胶原 蛋白、 4 型胶原蛋白、 5 型胶原蛋白、 6 型胶原蛋白 )、 CXCL1、 弹性蛋白酶、 gp120、 HGF[ 肝细胞 生长因子 ]、 层粘连蛋白 -1、 层粘连蛋白 -2、 层粘连蛋白 -5、 中期因子 (midkine)、 MMP-7、 嗜 中性粒细胞弹性蛋白酶和多效生长因子 (pleiotrophin)(HBNF， HBGF-8)。非肽靶向分子包 括但不限于与 CD138 结合的 DNA 和 RNA 寡核苷酸 ( 适体 )。
     本发明的 “效应分子” 为如下的分子或衍生物或其类似物 ： 所述分子连接至靶向 剂、 特别是靶向抗体和 / 或基因工程靶向抗体， 并且对靶细胞发挥所期望的作用， 例如凋 亡、 或另一类型的细胞死亡、 或连续的细胞周期停滞。本发明的效应分子包括在靶细胞中 能够发挥所期望作用的分子， 并且包括， 但不限于， 毒素、 药物 ( 特别是低分子量细胞毒性 药物 )、 放射性核素、 生物响应修饰剂、 成孔剂、 核糖核酸酶、 具有凋亡诱导活性的凋亡信号 传导级联的蛋白、 细胞毒性酶、 前药激活酶、 反义寡核苷酸、 抗体或细胞因子以及其功能衍 生物或类似物 / 片段。毒素可以包括细菌性毒素， 例如但不限于白喉毒素或外毒素 A ； 植物 毒素， 例如但不限于蓖麻毒蛋白。具有凋亡诱导活性的凋亡信号传导级联的蛋白包括但不 限于粒酶 B、 粒酶 A、 半胱天冬酶 -3、 半胱天冬酶 -7、 半胱天冬酶 -8、 半胱天冬酶 -9、 截短的 Bid(tBid)、 Bax 和 Bak。
     在优选实施方式中， 所述效应子增加免疫缀合物的内部效应子输送， 尤其当免疫 缀合物的靶向抗体所基于的抗体的天然形式可被较弱地内在化时。在另一优选实施方式 中， 所述效应子的天然形式是非选择性的。在某些实施方式中， 当处于天然形式时， 所述效 应子具有高度的非选择性毒性， 包括系统毒性。本发明效应分子的 “天然形式” 为在与靶向 剂连接而形成免疫缀合物之前的效应分子。在另一优选实施方式中， 与靶向剂缀合后基本 上消除了效应分子的非选择性毒性。在另一优选实施方式中， 当到达靶细胞时， 所述效应
     分子在靶细胞中引起死亡或连续的细胞周期停滞。本发明的药物效应分子包括但不限于 如下的药物 ： 包括例如充当微管蛋白聚合的抑制剂的小型高细胞毒性药物 ( 例如类美登素 类、 多拉司他汀 (dolastatins)、 奥雷司他汀 (auristatin) 和念珠藻环肽 (cryptophycin)) 的药物 ； DNA 烷基化剂， 如 CC-1065 类似物或衍生物 ( 美国专利 5,475,092 ； 5,585,499 ； 6,716,821) 和倍癌霉素 (duocarmycin) ； 烯二炔类 (enediyne) 抗生物例如卡里奇霉素 (calicheamicin) 和埃斯培拉霉素 (esperamicin) ； 以及强效类紫杉烷 (taxoid)( 紫杉烷 ) 药物 (Payne， 2003)。特别优选类美登素类和卡里奇霉素类。效应子类美登素包括任何 来源的类美登素， 包括但不限于合成的美登醇和美登醇类似物和衍生物。多柔比星、 道诺 霉素、 甲氨蝶呤、 长春碱、 新制癌菌素、 大分子霉素、 三亚胺醌 (trenimon) 和 α- 鹅膏菌素 (amanitin) 为本发明范围内的一些其它效应分子。 作为效应分子的反义 DNA 分子也在本发 明范围内。当特定药物或药物种类的名称与术语 “效应子” 或 “效应分子” 结合时， 是指基 于该特定药物或该药物种类的本发明的免疫缀合物的效应子。
     美登素是最初源自埃塞俄比亚灌木齿叶美登木 (Maytenus serrata) 的一种天然 产物 (Remillard， 1975 ； 美国专利 3,896,111)。该药物抑制微管蛋白聚合， 从而导致阻断 有丝分裂和细胞死亡 (Remillard， 1975 ； Bhattacharyya， 1977 ； Kupchan， 1978)。美登素的 细胞毒性比临床使用的影响微管蛋白聚合的抗癌药 ( 例如长春花生物碱类或紫杉醇 ) 高 200 ～ 1000 倍。然而， 美登素的临床试验表明， 其由于高的系统毒性而缺少治疗窗。美登素 和类美登素类是高度细胞毒性的， 但是其在癌症治疗中的临床应用受其严重的系统性副作 用限制， 该副作用主要归因于其对肿瘤的不良选择性。使用美登素的临床试验显示出对中 枢神经系统和胃肠系统的严重副作用。
     类美登素类也已经从其它植物、 包括滑桃树 (Trewia nudiflora) 的种子组织分离 出 ( 美国专利 4,418,064)。
     某些微生物也产生类美登素， 例如美登醇和 C-3 美登醇酯 ( 美国专利 4,151,042)。
     本发明还涉及任何来源的类美登素， 包括合成的美登醇和美登醇类似物， 其公开 于 例 如 美 国 专 利 4,137,230、 4,248,870、 4,256,746、 4,260,608、 4,265,814、 4,294,757、 4,307,016 、 4,308,268 、 4,308,269 、 4,309,428 、 4,313,946 、 4,315,929 、 4,317,821 、 4,322,348 、 4,331,598 、 4,361,650 、 4,362,663 、 4,364,866 、 4,371,533 、 4,424,219 和 4,151,042 中。
     在一个优选实施方式中， 类美登素为含巯基的类美登素， 并且更优选根据 Chari 等的美国专利 6,333,410 或 Chari 等 (Chari， 1992) 中公开的方法产生。 2
     在本发明的背景下， DM-1(N - 脱乙酰基 -N2-(3- 巯基 -1- 氧代丙基 ) 美登素 ) 为 一种优选的效应分子。DM1 比美登素的细胞毒性高 3 倍～ 10 倍， 并且通过借助于二硫键将 其连接至针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体而已被转化成前药。某些此类缀合物 ( 有时称为 “肿瘤激活的前药” (TAP)) 在血液腔中无细胞毒性， 因为它们在与靶细胞连接时被激活并内 化， 由此释放药物 ( ， 2001)。已经开发出几种抗体 -DM1 缀合物 (Payne， 2003)， 并 且在临床试验中评价。例如， 在结直肠癌患者中 huC242-DM1 治疗被良好耐受， 不会诱导任 何可检测的免疫响应， 并且具有长循环时间 (Tolcher， 2003)。
     其它特别优选的类美登素包含含有空间位阻巯基键的侧链， 该类美登素例如但不 2’ 2’ 限于类美登素 N - 脱乙酰基 -N -(4- 巯基 -1- 氧代戊基 ) 美登素 ( 也称为 “DM3” ) 和 N2’ -脱乙酰基 -N2’-(4- 甲基 -4- 巯基 -1- 氧代戊基 ) 美登素 ( 也称为 “DM4” )。DM4 的合成如图 3 和图 4 所示并且在本文其它部分有所描述。DM4 与 DM1 和 DM3 的不同之处在于其在 αC 处携带有甲基。当将 DM4 经由连接子 ( 具体为但不限于包含二硫键的连接子 ) 连接至例如 nBT062 等靶向剂时， 会导致空间位阻。携带有空间位阻巯基的各种类美登素 ( 拥有一个或 两个取代基、 特别是烷基取代基， 例如 DM4 的甲基取代基 ) 公开于 2004 年 11 月 25 日公布 的美国专利申请 2004/0235840， 本文通过参考并入其全部内容。由与 DM3 和 DM4 的硫原子 相邻的碳上的例如甲基等烷基赋予的空间位阻可以影响免疫缀合物细胞内切割的速率。 因 此可变的烷基单元可以影响体外和体内潜力、 效力和安全性 / 毒性。
     如 Goldmahker 等在美国专利公开 2006/0233814 中所报道， 一旦在靶标处释放药 物， 此类空间位阻诱导游离药物的烷基化 ( 例如， 甲基化 )。烷基化可以增加该药物的稳定 性， 从而提供所谓的旁观者效应。然而， 本领域技术人员将意识到， 当将效应子经由连接子 连接至靶向剂时， 其它包含处在导致空间位阻的位置的例如烷基等取代基的效应分子也是 本发明的一部分 ( 美国专利公开 2004/0235840)。 优选的是， 这种位阻诱导游离药物的化学 修饰 ( 例如烷基化 ) 从而增加其总体稳定性， 这使得该药物在表达 CD138 的肿瘤细胞中不 仅诱导细胞死亡或连续的细胞周期停滞， 而且在必要时还影响例如支持或保护肿瘤免受药 物影响且通常不表达 CD138 的辅助细胞 ( 特别是肿瘤基质的细胞和肿瘤血管的细胞 ) 以致 减少或丧失其支持或保护功能。
     还特别优选 DNA 烷基化剂作为效应分子， 并且所述 DNA 烷基化剂包括但不限于 CC-1065 类似物或衍生物。 CC-1065 为分离自泽耳链霉菌 (Streptomyces zelensis) 的培养 物的强效抗肿瘤抗生物， 并且在体外已经显示出特殊的细胞毒性 ( 美国专利 4,169,888)。 例如美国专利 5,475,092、 5,585,499 和 5,739,350 所述的 CC-1065 类似物或衍生物落在本 发明范围内。 本领域技术人员会容易地意识到， 美国专利 5,846,545 所述的修饰的 CC-1065 类似物或衍生物， 和例如美国专利 6,756,397 所述的 CC-1065 类似物或衍生物的前药也 在本发明范围内。在本发明的某些实施方式中， CC-1065 类似物或衍生物可以如美国专利 6,534,660 中所述而合成。
     作为优选效应分子的另一组化合物为紫杉烷， 特别是高强效紫衫烷和含有巯基或 二硫基的紫杉烷。 紫杉烷为抑制微管蛋白解聚从而导致维管组装和细胞死亡速率增加的有 丝分裂纺锤体毒剂。 在本发明范围内的紫杉烷公开于例如美国专利 6,436,931、 6,340,701、 6,706,708 和美国专利公开 20040087649、 20040024049 和 20030004210 中。其它紫杉烷 公开于例如美国专利 6,002,023、 美国专利 5,998,656、 美国专利 5,892,063、 美国专利 5,763,477、 美国专利 5,705,508、 美国专利 5,703,247 和美国专利 5,367,086 中。 本领域技 术人员可以理解， PEG 化 (PEGylated) 的紫杉烷 ( 例如美国专利 6,596,757 中所述的紫杉 烷 ) 也在本发明范围内。
     本发明的卡里奇霉素效应分子包括 γ1I、 N- 乙酰基卡里奇霉素和卡里奇霉素的 其它衍生物。卡里奇霉素以序列特异性方式与 DNA 的小槽结合， 进行重排并使自由基暴露， 从而引起双链 DNA 的断裂， 进而导致细胞凋亡和死亡。可用于本发明背景下的卡里奇霉素 效应分子的一个实例描述于美国专利 5,053,394 中。
     本发明的免疫缀合物包含至少一种靶向剂 ( 特别是靶向抗体 ) 和一种效应分子。 所述免疫缀合物可以包含例如用于稳定化的其它分子。对于免疫缀合物， 术语 “缀合物”通常用于定义靶向剂与一种或多种效应分子的有效结合， 并不旨在仅指任一类有效结合， 特别是不限于化学 “缀合” 。只要所述靶向剂能够与靶点结合， 并且连接的效应子 ( 特别 是当输送至靶点时 ) 如预期地充分起作用， 任何连接模式都是适合的。本发明的缀合方法 包括但不限于在将效应分子和 / 或靶向抗体事先修饰或未事先修饰时将效应分子直接连 接至靶向抗体， 或经由连接子连接。连接子可以在功能上分类成例如 ： 酸不稳定性连接子、 光不稳定性连接子、 酶可切割连接子， 例如可以被肽酶切割的连接子。在本发明许多实施 方式中优选可切割连接子。可以在细胞环境、 特别是细胞内环境中存在的条件下切割此类 可切割连接子， 当切割时所述环境对药物释放无有害作用。如存在于特定的细胞内区室的 pH4 ～ 5 等低 pH 会切割酸不稳定连接子， 而光不稳定连接子可以通过例如红外光切割。然 而， 优选被大多数细胞中存在的生理条件切割或者在该生理条件下切割的连接子， 本文将 之称为生理性可切割连接子。因此， 在本发明许多实施方式中优选二硫键连接子。这些连 接子可通过能在生理条件下发生的二硫键交换而切割。 优选的异双官能二硫键连接子包括 但不限于 N- 丁二酰亚胺基 3-(2- 吡啶基二硫代 ) 丙酸酯 (SPDP)( 参见， 例如 Carlsson 等 (1978))、 N- 丁二酰亚胺基 4-(2- 吡啶基二硫代 ) 丁酸酯 (SPDB)( 参见， 例如美国专利号 4,563,304)、 N- 丁二酰亚胺基 4-(2- 吡啶基二硫代 ) 戊酸酯 (SPP)( 参见， 例如 CAS 登记号 341498-08-6)、 N- 丁二酰亚胺基 4-(N- 马来酰亚胺基甲基 ) 环己烷 -1- 甲酸酯 (SMCC)( 参 见， 例如 Yoshitake 等， (1979)) 和 N- 丁二酰亚胺基 4- 甲基 -4-[2-(5- 硝基吡啶基 ) 二硫 代 ] 戊酸酯 (SMNP)( 参见， 例如美国专利号 4,563,304)。用于本发明组合物的最优选的连 接子分子为 SPP、 SMCC 和 SPDB。
     其它合适的连接子可以包括 “非可切割性” 键， 例如但不限于磺酸丁二酰亚胺基 马来酰亚胺基甲基环己烷甲酸酯 (SMCC)， 其为能够将化合物与含 SH 化合物连接的异双官 能连接子。双官能连接子分子和异双官能连接子分子， 例如针对糖的异双官能连接子分子 ( 例如 S-(2- 硫代吡啶基 )-L- 半胱氨酸酰肼 (TPCH))， 也在本发明范围内 (Vogel， 2004)。 例 如类美登素等效应分子可以经由两步反应法缀合至靶向抗体， 所述两步反应法包括 ： 第一 步， 将靶向抗体用交联剂 ( 例如 N- 丁二酰亚胺基吡啶基二硫代丙酸酯 (SPDP)) 修饰， 以向 所述靶向抗体引入二硫代吡啶基。在第二步中， 可以将具有巯基的反应性类美登素 ( 例如 DM1) 加入经修饰的抗体， 从而引起在所述经修饰的抗体中硫代吡啶基的置换和二硫键连接 的细胞毒性类美登素 / 抗体缀合物的产生 ( 美国专利 5,208,020)。 然而， 一步缀合法， 例如 在 Chari 等的美国专利公开 20030055226 中描述的方法， 也在本发明范围内。在本发明的 一种实施方式中， 将同类或不同类的多种效应分子与靶向抗体相连。 如本文别处所讨论， 所 用连接子的性质可能影响旁观者杀伤 (Kovtun 等， 2006)。也参见图 13 的讨论。
     可以经由例如美国专利 6,716,821 中所述的 PEG 连接基团， 将 CC-1065 类似物或 衍生物缀合至所述靶向剂。
     卡里奇霉素可以经由连接子缀合至靶向抗体 ( 美国专利 5,877,296 和美国专利 5,773,001)， 或根据美国专利 5,712,374 和美国专利 5,714,586 中公开的缀合方法缀合至 靶向抗体。 用于制备卡里奇霉素缀合物的另一优选方法记载于美国专利公开 20040082764。 本发明的免疫缀合物可以采用重组融合蛋白的形式。
     术语 “细胞毒性剂” 包含 “细胞毒性药物 / 癌症药物” ， 包括化疗剂， 例如美法仑、 环 磷酰胺、 长春新碱、 多柔比星和脂质体多柔比星 (DOXIL)、 环磷酰胺、 足叶乙甙、 阿糖胞苷和顺铂， 例如泼尼松 (prednisone) 和地塞米松等糖皮质激素类和例如沙利度胺、 硼替佐米、 来那度胺 (lenalidomide) 等试剂， 以及例如索拉非尼 (sorafenib) 等激酶抑制剂或例如罗 明待辛 (romidepsin) 等 HDAC( 组蛋白脱乙酰酶 ) 抑制剂， 以及生长抑制剂、 抗激素剂、 抗血 管生成剂、 保心剂、 免疫刺激剂、 免疫抑制剂、 血管生成抑制剂、 蛋白酪氨酸激酶 (PTK) 抑制 剂。该定义还包括抗体类细胞毒性剂， 包括具有在本领域内了解的细胞毒性作用的免疫缀 合物和抗体。Anti-CD40 为优选的抗体。其它抗体包括但不限于例如 AVASTIN( 贝伐单抗 (bevacizuab)) 或 MYELOMACIDE( 米拉珠单抗 (milatuzumab))。
     THALOMID(α-(N- 邻苯二甲酰亚氨基 ) 戊二酰亚胺 ； 沙利度胺 ) 是免疫调节剂。 沙利度胺的经验式为 C13H10N2O4， 克分子量为 258.2。沙利度胺的 CAS 号为 50-35-1。其似乎 具有多种作用， 包括以各种方式抑制骨髓瘤细胞生长和存活的能力和抑制新血管生长的能 力。
     VELCADE 是用于治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂。据信 VELCADE 作用在骨髓 瘤细胞上而引起细胞死亡， 和 / 或通过作用于骨微环境而间接作用， 从而抑制骨髓瘤细胞 生长和存活。在不受特定理论或作用模式的限制下， VELCADE 因而破坏正常细胞过程， 导致 促进凋亡的蛋白酶体抑制。
     REVLIMID 是免疫调节剂。 认为 REVLIMID 影响骨髓瘤细胞中的多种途径， 从而诱导 凋亡、 抑制骨髓瘤细胞生长、 抑制血管内皮生长因子 (VEGF)， 由此抑制血管生成和降低骨髓 瘤细胞粘着至骨髓基质细胞。
     地塞米松为充当消炎剂和免疫抑制剂的合成糖皮质激素甾体。 当施用至癌症患者 时， 地塞米松能够对抗癌症治疗的副作用。 地塞米松还能够单独给药或与包括沙利度胺、 阿 霉素或长春新碱等的其它抗癌剂一起给药。
     术语 “与…组合” 不限于在精确地同一时间施用。相反， 该术语涵盖依次或以一定 的时间间隔施用本发明的免疫缀合物与其它治疗方案 ( 例如放射治疗 ) 或试剂 ( 特别是上 述的细胞毒性剂 )， 以使它们可以共同起作用， 从而提供与仅使用本发明的免疫缀合物或例 如其它试剂的治疗相比更大的益处。优选所述免疫缀合物和其它试剂累加地起作用， 特别 优选它们协同地起作用。以对于预期目的有效的量合适地提供此类分子。熟练的医学从业 者能够根据经验， 或通过考虑试剂的药代动力学和作用模式来确定各治疗剂的合适剂量、 以及施用的合适时机和方法。如本发明的背景下所用， “共施用” 是指与免疫缀合物同时施 用， 通常是以组合剂型施用。
     术语 “序列同一性” 是指对核苷酸序列或氨基酸序列同一性的量度。通常， 比对所 述序列， 从而获得最高量级的匹配。 “同一性” 本身在本领域具有公知的含义， 并且可以使用 已公开的技术计算 ( 参见， 例如 ： Computational Molecular Biology， Lesk， A.M. 编， Oxford University Press， New York， 1988 ； Biocomputing ： Informatics and Genome Projects， Smith， D.W. 编， Academic Press， New York， 1993 ； Computer Analysis of Sequence Data， Part I， Griffin， A.M. 和 Griffin， H.G. 编， Humana Press， New Jersey， 1994 ； Sequence Analysis in Molecular Biology， von Heinje， G， Academic Press， 1987 ； 和 Sequence Analysis Primer， Gribskov， M.and Devereux， J. 编， M Stockton Press， New York， 1991)。 尽管存在许多测定两个多核苷酸或多肽序列之间同一性的方法， 术语 “同一性” 对本领域技 术人员而言是公知的 (Carillo， H.& Lipton， D.， SIAM J Applied Math 48 ： 1073(1988))。任何特定的核酸分子是否与例如 nBT062 核酸序列或其一部分具有至少 50 ％、 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 96％、 97％、 98％或 99％的同一性， 可以如下常规 确定 ： 使用已知的计算机程序例如 DNAsis 软件 (Hitachi Software， San Bruno， Calif.) 进 行初始序列比对， 然后使用 ESEE3.0 版 DNA/ 蛋白质序列软件 (cabot@trog.mbb.sfu.ca) 进 行多重序列比对。
     氨基酸序列是否与例如 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 或其一部分具有至少 50％、 60％、 70％、 75％、 80％、 85％、 90％、 95％， 96％、 97％、 98％或 99％的同一性， 能够使用已知 的计算机程序例如 BESTFIT 程序 (Wisconsin Sequence Analysis Package， Unix 用第 8 版， Genetics Computer Group， University Research Park， 575 Science Drive， Madison， Wis.53711) 而 常 规 地 确 定。BESTFIT 使 用 Smith 和 Waterman， Advances in Applied Mathematics 2 ： 482-489(1981) 的局部同源性算法， 来寻找两个序列之间同源性最高的片 段。
     当使用 DNAsis、 ESEE、 BESTFIT 或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与 本发明的参照序列具有例如 95％同一性时， 将参数设置如下 ： 在参照核酸或氨基酸序列的 全长上计算同一性百分比， 允许同源性中的间隔 (gap) 至多为参照序列中核苷酸总数的 5％。
     在本发明的背景下， 如果提及与特定序列的残基组合的序列同一性， 则该序列同 一性涉及所指定的所有残基的总和。
     基本抗体分子为双官能结构， 其中可变区与抗原结合， 而剩下的恒定区可以引起 非抗原依赖性响应。大多数抗体类型 (IgA、 IgD、 IgE、 IgG 和 IgM) 由恒定区确定。这些类 型可以进一步分成亚类 ( 同型 )。例如， IgG 类具有四种同型， 即根据恒定区确定的 IgG1、 IgG2、 IgG3、 和 IgG4。各种人类抗体类型中， 已知仅人类 IgG1、 IgG2、 IgG3 和 IgM 有效地激 活补体系统。尽管恒定区不形成抗原结合位点， 恒定区和铰链区的排布可以对所述分子赋 予片段柔性， 这使其可与抗原结合。
     不同的 IgG 同型能够与例如单核细胞、 B 细胞和 NK 细胞等细胞上的 Fc 受体结合， 从而激活细胞以释放细胞因子。 不同的同型还可以激活补体， 导致局部或系统性炎症。 特别 是， 不同的 IgG 同型可以以不同的程度结合 FcγR。 FcγR 为一组属于 Ig 超家族的表面糖蛋 白， 主要在白细胞上表达。 将 FcγR 糖蛋白分成三类， 称为 FcγRI(CD64)、 FcγRII(CD32) 和 FcγRIII(CD16)。尽管 IgG1、 IgG2 和 IgG3 与各种此类 FcγR 糖蛋白强烈地结合， IgG4 显 示出弱得多的结合。具体而言， IgG4 为 FcγRI 的中间体结合剂， 其产生相对低的 ADCC( 抗 体依赖性细胞毒性 ) 甚至不产生 ADCC， 并且不与 FcγRIIIA 或 FcγRIIA 结合。IgG4 也是 FcγRIIB 的弱结合剂， 所述 FcγRIIB 为抑制性受体。此外， IgG4 仅介导微弱的补体固定或 不介导补体固定， 具有微弱的补体依赖性细胞毒性 (CDC) 或不具有 CDC。在本发明的背景 下， IgG4 可以具体用于预防 Fc 介导的肝 FcR 靶向， 这是因为其没有显示出与 LSEC( 肝窦状 内皮细胞 ) 上的 FcRγII 的相互作用， 还显示出与 Kupffer 细胞 ( 巨噬细胞 ) 上的 FcRγI ～ III 无相互作用或具有弱相互作用， 并且与肝 NK 细胞上的 FcRγIII 无相互作用。 进一步降 低任何 CDC 的某些突变也是本发明的一部分。例如在 327、 330 和 331 位的 IgG4 残基显示 出 ADCC( 抗体依赖性细胞毒性 ) 和 CDC 的降低 (Amour， 1999 ； Shields， 2001)。使抗体稳定 化的多种突变之一也是本发明的一部分 ( 本文也称为 “稳定化突变” )。这些突变特别包括IgG4 的 CH2 区中的亮氨酸突变成谷氨酸， 和 IgG4 铰链核心中的丝氨酸交换为脯氨酸。在 本发明的某些实施方式中， 这些突变使半分子 (half-molecule) 的量减少至小于 10％、 小 于 5％且优选小于 2％或 1％。此外， 如此稳定化的抗体的体内半衰期可以增加几天， 包括 1 天、 2 天、 3 天、 4 天和超过 5 天 (Schuurman， 1999)。
     本文所述的包括靶向抗体等靶向剂， 还可以根据它们与抗原、 特别是 CD138 的结 合亲和性来描述或说明。例如靶向抗体等靶向剂的优选结合亲和性的特征在于， 解离常数 KD(nM) 小于 1.6、 小于 1.5 或约为 1.4 或小于 1.4。对于包含如靶向抗体等所述靶向剂的免 疫缀合物而言， 解离常数 KD(nM) 优选小于 1.6、 小于 1.5 或小于 2.5、 小于 2.4、 小于 2.3、 小 于 2.2、 小于 2.1、 小于 2.0、 小于 1.9 或约为 1.9。
     本发明的抗原结合区 (ABR) 会基于所用的靶向抗体或基因工程靶向抗体的类型 而变化。在天然存在的抗体中和在大多数嵌合抗体和人源化抗体中， 抗原结合区由重链的 前两个结构域和轻链组成。然而， 在没有轻链的重链抗体中， 抗原结合区仅由例如重链的 前两个结构域组成， 而在将抗体分子的轻链和重链可变区合并于单个多肽链中的轻链抗体 (ScFv) 中， ABR 仅由一个多肽分子提供。FAB 片段通常通过木瓜蛋白酶消化而获得， 并且具 有一条轻链和重链的一部分， 因此包含仅具有一个抗原结合位点的 ABR。另一方面， 双链抗 体为具有两个抗原结合区的小的抗体片段。 然而， 在本发明的背景下， 靶向抗体或基因工程 靶向抗体的抗原结合区为任何主要决定靶向抗体或基因工程靶向抗体的结合特异性的区 域。
     如果据称 ABR 或另一靶向抗体区 “出自某种抗体” ， 例如人类或非人类抗体， 这是 指在本发明的背景下 ABR 或者与相应的天然存在的 ABR 相同， 或者基于该相应的天然存在 的 ABR。如果 ABR 具有天然存在的 ABR 的结合特异性， 则该 ABR 基于天然存在的 ABR。然而， 此类 ABR 可以包含例如点突变、 添加、 缺失或例如糖基化等翻译后修饰。 特别地， 此类 ABR 可 以与天然存在的 ABR 的序列具有超过 70％、 超过 80％、 超过 90％、 优选超过 95％、 超过 98％ 或超过 99％的序列同一性。
     在本发明的背景下， 靶向剂 ( 例如靶向抗体， 特别是包含靶向抗体的免疫缀合物 ) 的均匀靶向 (homogenous targeting) 是对与用该靶向剂获得所述靶向的期望结果相关的 差异的量度。在本发明的某些实施方式中， 所期望的结果通过与靶标的简单结合而获得。 即， 例如， 其中某种靶向剂提供抵抗随后结合的防护的实施方式的情况。然而， 靶向剂的均 匀性 (homogeneity) 可以通过例如包含所述靶向剂的免疫缀合物的效力而容易地估算。例 如， 所述免疫缀合物针对例如 CD138 等肿瘤抗原 ( 该肿瘤抗原包含旨在破坏肿瘤细胞和 / 或使肿瘤生长停滞的效应子 ) 的效力可以通过包含表达 CD138 抗原的细胞的肿瘤的生长抑 制程度而确定。 此类免疫缀合物可以在其效力方面显示出较高的差异。 例如， 有时其可以以 高效力使肿瘤生长停滞， 但其它时候该效力很难超过对照的效力。 另一方面， 免疫缀合物在 效力方面的较低差异， 显示出免疫缀合物和 / 或靶向剂分别一致地提供所期望的结果。一 种靶向均匀性定量方法为计算靶向差异 (targeting variation)。在包含某种靶向剂的免 疫缀合物使肿瘤生长停滞的情况下， 靶向差异可以如下计算 ： 首先确定肿瘤达到预定体积 3 ( 例如 300mm ) 的时间。优选地， 选择预定体积从而使在达到所述预定体积之前和之后的任 何肿瘤生长均以大致相同的速率稳定地增加。在对于一组受试对象已经确定所述时间后， 计算受试对象组 ( 例如， SCID 小鼠或显示均匀肿瘤生长的另一合适的模型 ) 中这些时间的平均值 (Tm)。然后将 Tm 与观察值相关联， 所述观察值获自显示出最低靶向效力并因此与达 到所述预定体积所需时间 (Tf) 最少的肿瘤相关的组内受试对象， 并在另一方面， 获自显示 出最低靶向效力并因此与达到所述预定体积所需时间 (Ts) 最多的肿瘤有关的组内受试对 象， 所述相关性通过根据下式计算预定体积的靶向差异而获得 ：
     靶向差异 [％ ] ＝ Ts-Tf/Tm×100
     在一个优选实施方式中， 本发明的包含基因工程靶向抗体的免疫缀合物的靶向差 异小于 150％、 小于 140％、 小于 130％、 小于 120％、 小于 110％、 小于 100％、 小于 90％、 小于 80％、 小于 70％、 小于 60％或小于 50％， 在某些实施方式中甚至小于 45％。优选地， 所述靶 向差异为约 10％～约 150％， 优选约 10％～约 100％、 约 10％～约 80％、 约 10％～约 70％、 约 10％～约 60％、 约 10％～约 50％。
     靶向的均匀性还可以通过其它手段 ( 例如确定肿瘤生长延迟 ) 而定量。另外， 本 领域技术人员易于理解， 特定尺寸的肿瘤体积仅仅是一个可以基于其而确定靶向差异的参 数。根据所期望的结果， 可以使用其它参数， 包括时间 ( 例如衡量肿瘤生长延迟的时间 ) 或 结合百分比 (％ )。本领域技术人员能够容易地确定这些其它参数。
     图 9(C) 和 (D) 中显示包含小鼠抗体 BB4 的免疫缀合物 (BB4-SPP-DM1 ； 图 9C) 和包 含基于该抗体的基因工程靶向抗体 nBT062 的免疫缀合物 (nBT062-SPP-DM1 ； 图 9D) 之间， 靶向 / 结合的均匀性的差异。从这些图可以看出， 使用包含基因工程靶向抗体的免疫缀合 物获得的结果比使用包含上述小鼠抗体的免疫缀合物获得的结果明显更均匀。这由于 BB4 的抗体结合区在 nBT062 中未经修饰而特别显著。由此， 包含小鼠抗体的抗体结合区而不是 小鼠抗体其它部分的免疫缀合物显示出远超出本领域技术人员预期结果的性质。 nBT062( 也参见图 1) 为小鼠人类嵌合 IgG4mAb， 为 B-B4 的一种嵌合形式。创造 该嵌合形式的 B-B4 来降低 HAMA( 人类抗小鼠抗体 ) 响应， 同时维持 B-B4 的抗体结合区 对 CD138 的功能。令人惊奇的是， 使用包含该基因工程靶向抗体的免疫缀合物获得的结果 明显更加均匀 ( 结果中的差异降低 )。以下说明用于产生 nBT062 的方案。表达 nBT062 的 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 已 经 于 2007 年 12 月 11 日 保 藏 于 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Mascheroder Weg 1， D-38124Braunschweig。 识别号为 DSM ACC2875。基于 B-B4 的 CD138 特异性嵌合抗体在本文通称为 c-B-B4。
     已从 nBT062 用核苷酸序列的翻译物预测了重链和轻链的氨基酸序列。重链和轻 链的预测氨基酸序列如表 1 所示。预测的可变区用粗体标出， 预测的 CDR 用下划线标出。
     表 1.nBT062 的预测的氨基酸序列
     nBT062 重链预测序列 (SEQ ID NO ： 1) ：
    
    C 端赖氨酸易于剪切， 并且可以由于不完全切割而在某种程度上存在。括号中的 (K) 不是 SEQ ID NO ： 1 的一部分。
     nBT062 轻链预测序列 (SEQ ID NO ： 2) ：
    
    表 2 显示 Krabat 和 Chothia 的一般 CDR 定义与对于 BT062 预测的 CDR 的比较。BT062 为一种包含靶向 CD138 的嵌合抗体 nBT062 的免疫缀合物， 所述嵌合抗体 nBT062 经由连接子 ( 此处为 SPDB) 连接至细胞生长抑制性类美登素衍生物 DM4。BT062 的 化学式在图 1 和 2 中提供。 包含 nBT062 和类美登素效应分子的免疫缀合物经常根据它们的 连接子和类美登素效应子来表征， 例如 nBT062-SMCC-DM1 为包含 nBT062、 SMCC( 一种 “非可 切割” 连接子， 含有硫酯键 ) 和作为效应子的 DM1 的免疫缀合物。更通常的是， 含有 nBT062 和效应分子的免疫缀合物还可以描述为 nBT062- 连接子 - 效应子或仅描述为 nBT062- 效应 子 (nBT062N， 其中 N 为本文所述的任何效应子 )。
     本文提到包含抗 CD138 的基因工程靶向抗体 ( 该抗体经由可切割连接子 (CL) 连 接至效应分子 ) 的免疫缀合物的无位阻对应物 (UI ： 无位阻免疫缀合物 )， 在此称为 UICL， UICL 与其中所述效应分子具有空间位阻并且含有可切割连接子的免疫缀合物 (HICL- 位 阻缀合物， 可切割连接子 ) 相反。UICL 为一种与包含基因工程靶向抗体的然而其中所述
     效应分子不是空间位阻的 HICL 等效的免疫缀合物。一对 HICL/UICL 的实例为 BT062 和 nBT062-SPP-DM1。 此类包含非可切割连接子的免疫缀合物的无位阻对应物 (UINCL)， 是指包 含基因工程靶向抗体的等效免疫缀合物， 在该等效免疫缀合物中效应分子不是空间位阻性 的并且包含非可切割连接子。对于 BT062 而言， nBT062-SMCC-DM1 会组成此类包含非可切 割连接子的无位阻对应物 (UNICL) 的实例。
     免疫缀合物的抑制肿瘤生长的活性 ( ＝肿瘤生长抑制活性 ) 是一个相对量度。其 描述一种缀合物相对于最高性能的免疫缀合物 ( 其活性设定为 100％ ) 的活性的肿瘤生长 抑制活性。例如， 如果将最高性能的免疫缀合物 ( 假设为引起 32 天的肿瘤生长延迟 (TGD) 的 BT062) 的活性设定为 100％， 如下计算例如 nBT062-DM1( 其显示 18 天的肿瘤生长延迟 (TGD)) 的活性 ：
     肿瘤生长抑制活性＝ 100×(TGDnBT062-DM1/TGDBT062)，
     更通常的 ：
     肿瘤生长抑制活性＝ 100×(TGD 样品 /TGD 对照 )。
     表 3 提供来自图 11B 中所述结果的合适实例 ：
    TGD*( 天 ) PBS nBT062-SMCC-DM1 BT062 nBT062-SPP-DM1
    ％活性 ** 0 56 100 400 18 32 13表3： 基于接受 450μg/kg 剂量的治疗组的抵抗 SCID 小鼠中的 MOLP-8 肿瘤异种 移植物的 nBT062-DMx 的肿瘤生长延迟 (TGD) 和％活性。
     (*) 肿瘤生长延迟 (TGD)( 以天为单位 )， 为治疗组达到预定尺寸 (160mm3) 的平均 时间 ( 以天为单位 ) 减去对照组达到该预定尺寸的平均时间。
     (**) 肿瘤生长抑制活性＝ 100×(TGDSample/TGDBT062)。 将 BT062 的活性定义为 100％。 在 表 2 提 供 的 实 例 中， BT062 提 供 的 肿 瘤 生 长 抑 制 活 性 比 其 无 位 阻 对 应 物 (nBT062-SPP-DM1) 的活性高出 60％， 并且肿瘤生长抑制活性比其包含非可切割连接子的 无位阻对应免疫缀合物 (nBT062-SMCC-DM1) 的活性高出 44％。
     此前报道了在例如 huC242- 类美登素免疫缀合物中的可切割连接子可以提供所 谓的旁观者效应。Goldmahker 等 ( 美国专利公开 2006/0233814) 也描述了在从靶向剂 切割的情况下， 当对效应分子进行进一步修饰、 特别是烷基化时， 旁观者效应特别明显。 Goldmahker 等也指出 UICL 比相应的 UINCL 显示出更好的 TGD( 参见， 例如美国专利公开 2006/0233814 的图 6)。
     然而， HICL/UICL/UINCL 免疫缀合物的总体有效性似乎在不同免疫缀合物与免 疫缀合物和 / 或靶标与靶标之间有所不同。例如在减小肿瘤尺寸的能力方面 UINCL 曲
     妥 珠 单 抗 -SMCC-DM1 明 显 地 胜 过 HICL 曲 妥 珠 单 抗 -SPP-DM4， 而 UICL 免 疫 缀 合 物 曲 妥 珠 单 抗 -SPP-DM1 的 性 能 基 本 上 与 相 应 的 HICL 类 似 ( 参 见 Eberts 等 的 美 国 专 利 公 开 2008/0171040)， 从而使得所获得的结果为免疫缀合物和靶标的函数。
     图 11A 显示 HICL 胜过 UICL 和 UNICL， 还令人惊奇的发现高的单剂量方案 (250μg/ kg) 中的 UICL 实际上没有比 UINCL 显示出任何更好的结果。事实上， 在此类方案的 UICL 中 观察到的 TGD( 以天为单位 ) 实际上低于 UINCL 的 TGD。随着剂量增加 (450μg/kg)， 该观 察结果变得更明显。总之， 如图 11A 中所示， 在单剂量实验中 HICL 以出乎意料的程度胜过 UICL。与这些结果一致的是， 在反复剂量实验中， HICL 显著地胜过 UICL， 后者提供了仅勉强 超过对照的结果。此外， 在更高剂量下 UINCL 胜过 UICL。
     多发性骨髓瘤细胞对基质细胞、 特别是骨髓基质细胞的粘着， 已经归因于多发性 骨髓瘤患者中观察到的粘着介导的药物抗性 (CAM-DR)。在某些实施方式中， 本发明的免疫 缀合物可以缓解 CAM-DR。 具体而言， 在本发明的某些实施方式中， 通过将免疫缀合物施用至 所述多发性骨髓瘤细胞， 该粘着减少例如至少约 10％、 约 20％、 约 30％、 约 40％、 约 50％、 约 60％、 约 70％、 约 80％以上。如图 17E 所示， 在其中仅基质细胞经过处理的样品中 ( 以及在 其中基质细胞未经处理的样品中 )， 特别是 UICL 和 HICL 能够抑制多发性骨髓瘤细胞粘着至 BMSC( 骨髓基质细胞 )， 而 UINCL 对应物不具有该作用。这些结果表明， 粘着减少作用取决 于免疫缀合物的连接子的性质， 优选具有允许效应分子更容易解离的可切割连接子的免疫 缀合物。事实上当使多发性骨髓瘤细胞至少部分避免粘着至 BMSC 时， 这也使得它们更容易 受到其它细胞毒性剂 ( 包括通常由于 CAM-DR 而对多发性骨髓瘤细胞的作用受抑制 ( 至少 其完全功效受到抑制 ) 的细胞毒性剂 ) 的作用。因此， 免疫缀合物的施用优选组合有同时 或依次施用细胞毒性剂。施用免疫缀合物和细胞毒性剂之间的时间间隔可以包括 12 天～ 6 天， 包括 12 小时、 24 小时、 2 天、 3 天、 4 天或 5 天。
     本文所述的免疫缀合物可以通过任何途径施用， 包括静脉内施用、 胃肠外施用、 口 服施用、 肌内施用、 鞘内施用或作为气雾剂施用。输送模式取决于所期望的效果。根据本发 明本领域技术人员易于了解对于特定的治疗的最佳施用途径。 合适的剂量取决于施用途径 和指定的治疗， 并且考虑到当前的治疗策略可由本领域技术人员容易地确定。
     可以根据常规的药物配混技术制备含有本发明免疫缀合物和 / 或任何其它细胞 毒性剂作为活性成分的药物组合物。 参见， 例如， Remington′ sPharmaceutical Sciences， 第 17 版 (1985， Mack Publishing Co.， Easton， Pa.)。典型地， 将有效量的活性成分与药物 可接受载剂混合。根据所期望用于施用 ( 例如静脉内、 口服、 胃肠外、 鞘内、 透皮或作为气雾 剂 ) 的剂型， 所述载体可以采用各种形式。
     对于口服施用， 可以将所述免疫缀合物和 / 或细胞毒性剂配成固体或液体制剂， 例如胶囊剂、 丸剂、 片剂、 锭剂、 熔融剂 (melts)、 粉剂、 悬浮剂或乳化剂。在制备口服剂型的 组合物中， 可以使用任何常用的药物介质， 例如在口服液体制剂 ( 例如悬浮剂、 酏剂和溶液 剂 ) 的情况下使用水、 二醇、 油、 醇、 调味剂、 防腐剂、 着色剂和助悬剂等 ； 或在口服固体制剂 ( 例如粉末剂、 胶囊剂和片剂 ) 的情况下使用例如淀粉、 糖、 稀释剂、 成粒剂、 润滑剂、 粘合 剂和崩解剂等载剂。由于易于施用， 片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式， 在 该情况下显然使用固体药物载剂。必要时， 可以通过标准技术将片剂包覆糖衣或肠溶衣。 活性剂必须稳定， 以便通过胃肠道。必要时， 可以使用适用于稳定通过的试剂， 此类试剂可以包括在文献中描述的磷脂或卵磷脂衍生物， 以及脂质体、 微粒 ( 包括微球体和巨球体 (macrosphere))。
     对于胃肠外施用， 可以将免疫缀合物和 / 或细胞毒性剂溶解于药物载剂， 并且作 为溶液剂或悬浮剂施用。 例举的合适的载体为水、 盐水、 磷酸盐缓冲液 (PBS)、 右旋葡萄糖溶 液、 果糖溶液、 乙醇、 或者动物油、 植物油或源自合成的油。所述载剂还可以含有其它成分， 例如防腐剂、 助悬剂、 增溶剂和缓冲剂等。当在脑室内或鞘内施用未缀合的靶向剂和 / 或免 疫缀合物和 / 或细胞毒性剂时， 还可将它们溶于脑脊液中。
     施用至受试对象的剂量可以根据受试对象 ( 包括人类以及非人类动物 ) 表面积而 指定。施用至此类受试对象的剂量可以优选但不限于约 5mg/m2 ～约 300mg/m2 的量， 包括 2 2 2 2 2 2 约 20mg/m 、 约 50mg/m 、 约 100mg/m 、 约 150mg/m 、 约 200mg/m 和约 250mg/m 。在其中将免 疫缀合物与细胞毒性剂组合施用的某些实施方式中， 免疫缀合物的剂量可以较低。可以一 次性合适地施用免疫缀合物， 或将其在一系列的治疗中施用。 在多次剂量方案中， 可以将这 些量每天一次、 每周一次、 每两周一次、 每四周一次、 每五周一次、 每六周一次地施用。具有 单次高剂量的负荷剂量， 或作为另一种选择的施用一次较低剂量之后不久施用另一次较低 剂量、 继以较长的时间间隔施用的剂量， 构成了本发明的优选实施方式。在优选实施方式 中， 针对受试对象调整给药时机， 以使在第二次和 / 或任何后续治疗之前经过足够的时间， 从而使此前的剂量已经基本代谢， 但是在受试对象的系统中存在的免疫缀合物的量仍然抑 制、 延迟和 / 或预防肿瘤生长。示例性的 “反复单剂量” 方案包括每三周一次施用起始剂量 2 为约 200mg/m 的免疫缀合物。作为另一种选择， 高起始剂量之后可以进行每两周一次的维 2 持剂量， 维持剂量为约 150μg/m 。然而， 也可使用其它给药方案。通过已知技术和测试易 于监测该治疗的进展。剂量可以根据它们是否为了预防或治疗目的而施用、 任何之前治疗 的疗程、 患者的临床史和对靶向剂 / 免疫缀合物的响应、 以及主治医师的判断而变化。
     在一个实施方式中， 将免疫缀合物与一种或多种其它细胞毒性剂一起施用， 所述 细胞毒性剂对于治疗相同的疾病是有效的， 但是当不与免疫缀合物一起施用时， 考虑到 CAM-DR 其有效性通常会受限 ； 例如 CD138 特异性免疫缀合物能够与地塞米松组合施用。特 别地， 在已经施用免疫缀合物后两小时， 对有需要的患者施用有效量的地塞米松。
     因此， 本发明的免疫缀合物还可以特别在使用以下的治疗方案中施用 ： 高剂量的 化学治疗 ( 优选美法仑、 美法仑 / 泼尼松 (MP)、 长春新碱 / 多柔比星 / 地塞米松 (VAD)、 脂质 体多柔比星 / 长春新碱、 地塞米松 (DVd)、 环磷酰胺、 足叶乙甙 / 地塞米松 / 阿糖胞苷、 顺铂 (EDAP))、 干细胞移植 ( 例如， 自体干细胞移植或异体干细胞移植， 和 / 或迷你异体 ( 非清髓 性 ) 干细胞移植 )、 甾体 ( 例如， 糖皮质激素、 地塞米松、 沙利度胺 / 地塞米松、 泼尼松、 美法 仑 / 泼尼松 )、 支持性治疗 ( 例如， 双膦酸盐类、 生长因子、 抗生素、 静脉内免疫球蛋白、 低剂 量放射治疗、 和 / 或矫形外科介入 )、 THALOMID( 沙利度胺， Celgene)、 VELCADE( 硼替佐米， Millennium) 和 / 或 REVLIMID( 来那度胺 )(Chelgene Corporation) 和 / 或其它多发性骨 髓瘤治疗 ( 包括放射治疗 )。
     如果本发明的免疫缀合物与细胞毒性剂组合施用， 通常维持上述剂量和治疗方 案。 然而， 如果免疫缀合物与细胞毒性剂共施用， 在某些实施方式中优选低剂量的各种所述 治疗性成分。在此类情况下， 免疫缀合物可以以约 5mg/m2 ～约 100mg/m2( 包括约 20mg/m2、 约 50mg/m2) 的剂量施用， 而细胞毒性剂的施用剂量为单独施用时所推荐的剂量。使用进一步支持这些发现的实验来确认在基于细胞培养的实验 ( 图 7) 和小鼠实 验 ( 图 8 ～ 11) 中获得的实验数据。
     多发性骨髓瘤的发病机理涉及骨髓瘤细胞经由细胞表面粘着分子不仅与骨髓基 质细胞 (BMSC) 结合， 还与细胞外基质 (ECM) 结合。该结合触发并最终造成多发性骨髓瘤细 胞生长、 药物抗性和 MM 细胞在骨髓环境中的迁移 (Munshi 等 2008)。 具体而言， 多发性骨髓 瘤细胞经由粘结蛋白聚糖 -1(CD138) 粘着至 I 型胶原蛋白， 诱导基质金属蛋白酶 1 表达， 从 而促进骨再吸收和肿瘤侵袭 (Hideshima 等， 2007)。多发性骨髓瘤细胞和骨髓微环境之间 的相互作用导致多效性增生 (pleiotropic proliferative) 级联和抗凋亡级联。
     在多发性骨髓瘤细胞自导引 (homing) 至骨髓基质腔之后， 多发性骨髓瘤细胞和 BMSC 之间的粘着使许多细胞因子上调， 如具有血管生成和肿瘤生长促进活性的白细胞介素 (IL-6) 和胰岛素样生长因子 (IGF-1)(Hideshima 等， 2007)。 由这些细胞因子启动的信号传 导级联最终导致 MM 细胞对常规治疗产生抗性 (Anderson 等， 2000 ； Hideshima 等， 2006)。
     在小鼠模型中分析了在存在人类骨髓时 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抵 抗 CD138 阳性肿瘤细胞的体内效力， 该分析的结果如图 12 所示。该图显示 HICL 和 UICL 在该环境中都表现良好。这些免疫缀合物抑制了可在该模型中用作 MM 细胞生长参数的 shulL-6R 水平的增加。 根据本发明， 使用 BT062 作为实例， 如下处理 MM。 该实例并非旨在以任何方式限制 本发明， 并且技术人员可以容易地确定属于本发明范围内的其它免疫缀合物或基于 nBT062 的系统， 以及可用于治疗例如 MM 等疾病的其它治疗方案。
     由于 CD138 在患者 MM 细胞上和在可经由血流获取的细胞上的选择性表达、 nBT062 的特异性和血流中 nBT062 的稳定性， BT062 消除 DM4 的系统性毒性， 并且提供靶向输送 DM4- 效应分子的机会。本发明的免疫缀合物提供将效应分子有效施用至细胞位点的手段， 在该细胞位点处效应分子能够从免疫缀合物释放。
     将一种或多种细胞毒性剂， 以一定剂量和剂型以及根据对这些细胞毒性剂建立的 治疗策略， 施用至还用本发明的免疫缀合物治疗的个体。
     具体而言， 使用根据本发明的合适剂量的 BT062( 例如 100mg/m2) 以一定的时间间 隔 ( 例如起初每天， 然后每周 ) 对患者进行治疗方案。每一次每周免疫缀合物治疗后 12 小 时， 还用美法仑治疗该患者， 例如根据制造商说明以口服剂型 ( 例如商标名为 ALKERAN 的丸 剂 ) 施用至患者。
     根据本发明， 使用 BT062 作为实例， 还可以如下治疗特别是实体肿瘤。该实例并非 旨在以任何方式限制本发明， 并且技术人员可以容易地确定可用于治疗实体肿瘤的本发明 的其它免疫缀合物和其它治疗方案。 首先治疗该肿瘤以降低肿瘤的尺寸， 例如通过放射。 随 后施用的 BT062 后其后施用的一剂细胞毒性剂 ( 例如以 ALKERAN 丸剂的形式 )， 提供对于消 除残留癌细胞的高度有效的手段。施用免疫缀合物允许特异性靶向这些残留的细胞， 并且 在靶点处释放效应分子。免疫缀合物不仅克服或减少关于其自身活性方面的 CAM-DR， 还由 于事实上其抑制多发性骨髓瘤细胞粘着至基质细胞， 免疫缀合物还克服或减少其它细胞毒 性剂的 CAM-DR。在优选实施方式中该免疫缀合物的高效力允许了单剂量方案。
     通过参考以下实施例进一步描述本发明， 提供这些实施例的目的在于示例说明而 并非旨在以任何方式限制本发明。使用本领域公知的标准技术或下文具体描述的技术。
     材料和方法
     嵌合抗体构建 (cB-B4 ： nBT062)
     B-B4
     将此前所表征的小鼠抗体 B-B4(Wijdenes 等， Br J Haematol.， 94(1996)， 318) 用 于这些实验中。
     B-B4 和 cB-B4/nBT062 的克隆和表达
     如 例 如 J.Sambrook ； Molecular Cloning， 实验室手册； 第 二 版 (1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press， USA 等教课中中所详述， 或在使用试剂盒的情况下如制 造商说明书所推荐， 进行标准重组 DNA 技术。使用标准 PCR 方法进行小鼠可变区的 PCR 克 隆和修饰。使用了在各结果部分中指定的引物。
     cB-B4/nBT062 的表达
     通过胰蛋白酶消化和离心收获在 DMEM( 补充有 10％ FCS、 580μg/mlL- 谷氨酰胺、 50 单位 /ml 青霉素和 50μg/ml 链霉素 ) 中培养的指数生长的 COS 细胞、 并将其在 PBS 中 7 洗涤。将细胞重悬于 PBS 中至终浓度 1×10 细胞 /ml。将 700μl 的 COS 细胞悬浮液转 移至 Gene Pulser 皿中， 并与重链和 κ 轻链表达载体 DNA( 各 10μg 或 13μg 超级载体 (Supervector)) 混合。使用 Bio-Rad Gene Pulser 将细胞在 1900V、 25μF 电穿孔。在补充 有 10％无 γ- 球蛋白的 FBS、 580μg/ml L- 谷氨酰胺、 50 单位 /ml 青霉素和 50μg/ml 链霉 素的 DMEM 中培养转移的细胞 72h， 然后收获含有抗体的细胞培养上清液。
     测定 cB-B4/nBT062 表达水平的捕获 ELISA(capture ELISA)
     用在 PBS 中稀释的 0.4μg/ml 山羊抗人 IgG 抗体的 100μl 等分试样涂布 96 孔板 (4℃过夜 )。用 200μl/ 孔洗涤缓冲液 (PBS+0.1％ Tween-20) 洗涤板 3 次。用在 PBS 中的 0.2％ BSA、 0.02％ Tween-20 将孔封闭 ( 在 37℃温育 1 小时 )， 其后添加 200μl 含有所分泌 抗体的细胞培养上清液。用洗涤缓冲液将孔洗涤 6 次， 然后检测具有山羊抗人 κ 轻链过氧 化物酶缀合物的结合抗体。
     来自细胞培养上清液的 cB-B4/nBT062 的纯化
     使用 Protein A ImmunoPure Plus 试剂盒 (Pierce， Rockford， IL)， 根据制造商推 荐从经转化的 COS 7 细胞中纯化 cB-B4 抗体。
     cB-B4 结合和竞争测试
     使用 Diaclone(Besancon， 法国 )sCD138 试剂盒， 根据制造商推荐， 考虑在结果部 分所述的变化， 进行 B-B4 和 cB-B4 与 CD138 的结合活性的分析。
     RNA 制备和 cDNA 合成
     使杂交瘤 B-B4 细胞生长并使用 Qiagen Midi 试剂盒 (Hilden， 德国 ) 按照制造商 的程序处理， 以分离 RNA。使用 Amersham Biosciences(Piscataway， NJ) 第 1 链合成试剂 盒， 按照制造商的程序， 将约 5μg 的 B-B4RNA 进行逆转录以产生 B-B4cDNA。
     B-B4 免疫球蛋白 cDNA 的克隆
     使用 IgH 引物 MHV7(5′ -ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGA-CCCAGG-3′ )[SEQ ID NO ： 3] 和 IgG1 恒定区引物 MHCG1(5 ′ -CAG-TGGATAGACAGATGGGGG-3 ′ )[SEQ ID NO ： 4]， 通过 PCR 扩增免疫球蛋白重链 (IgH)cDNA。类似地， 使用三种不同的 Igκ 引物 MKV2(5′ -ATG-G AGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG-3′ )[SEQ ID NO ： 5]、 MKV4(5′ -ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG-3′ )[SEQ ID NO ： 6] 和 MKV9(5′ -ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG-3′ )[SEQ ID NO ： 7]， 并且每个引物都与引物 MKC(5′ -ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3′ )[SEQ ID NO ： 8] 组 合， 以扩增免疫球蛋白轻链 (IgL)。使用 TOPO-TA 克隆试剂盒 (Invitrogen， Carlsbad， CA)， 根据制造商说明， 将所有扩增产物直接与 pCR2.1-TOPO 载体连接。
     在 LB- 氨苄青霉素 -Xgal 琼脂板上筛选用经连接的 pCR2.1 载体构建体转化的大 肠杆菌 (E.coli)TOP10 细菌 (Invitrogen)。将小规模培养物用单独的白色集落接种， 生长 过夜， 并使用 QIAprep Spin Miniprep 试剂盒根据制造商说明分离质粒。
     cDNA 序列确定
     使 用 BigDye Termination v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction 试 剂 盒 (ABI， Foster City， CA) 将质粒测序。使用在 GeneAmp9600 PCR 仪上循环的 1210 和 1233 引物将每个所选质粒进行双向测序。在 ABI 毛细管测序仪上完成电泳序列分析。
     反复进行完整的 RT-PCR、 克隆和 DNA 序列分析的循环， 以获得各免疫球蛋白链的 三个完全独立的序列信息组。
     B-B4VκDNA 序列
     在三个独立反应中进行第 1 链合成。根据制造商说明， 将通过使用引物 MKC 和 MKV2( 序列于上文中给出 ) 产生的 PCR 产物连接至 pCR2.1-TOPO 载体。 将来自各独立 RT-PCR 反应组的克隆体双向测序。以 MKV2 为引物的产物序列与源自 MOPC-21、 SP2 和 Ag8 等骨髓 瘤融合伴侣的不育 κ 转录物高度相似 (Carroll 等， Mol Immunol.， 25(1988)， 991 ； Cabilly 等， Gene， 40(1985) ； 157)， 因此将其忽视。
     使用 MKC 连同 MKV4 和 MKV9 引物的 PCR 产物相互类似， 区别仅在于前导序列引物 内的摆动位置 (wobble position)。
     B-B4VH DNA 序列
     在三个独立反应中进行第 1 链合成， 从各第 1 链产物中将 PCR 产物克隆和测序。 对 来自各第 1 链的 5 个克隆体进行测序。
     嵌合 cB-B4 表达载体的构建
     嵌合表达载体的构建需要向 VH 和 Vκ 添加合适的前导序列， 该前导序列位于 BamHI 限制位点和 Kozak 序列之后。Kozak 共享序列 (consensus sequence) 对于可变区序 列的有效翻译至关重要。 它定义了正确的 AUG 密码子 ( 核糖体能从其开始翻译 )， 并且最重 要的单个关键碱基为位于 AUG 起点上游的 3 位处的腺嘌呤 ( 或次佳地， 鸟嘌呤 )。该前导序 列被选作 Kabat 数据库中最相似的序列 (Kabat 等， NIH National Technical Information Service， 1991)。所述添加序列在正向 (For) 引物 ( 都具有序列 5′ -AGAGAAGCTTGCCGCCAC CATGATTGCCTCTGCTCAGTT-CCTTGGTCTCC-3′ [SEQ ID NO ： 9] ； 限制位点用下划线标出 ； Kozak 序列为粗体 ) 内编码。 此外， 嵌合表达载体的构建需要将人类 γ1 恒定区的 5′片段导入天 然 ApaI 限制性位点的上游并与 B-B4 的 J 区的 3′末端相邻， 而对于轻链而言， 需要添加剪 接供体位点和 HindIII 位点。该剪接供体序列对于将可变区在框架内正确连接至其合适的 恒定区从而剪接下 V:C 内含子而言是重要的。κ 内含子 +CK 在 B-B4Vκ 序列下游的表达构 建体中编码。类似地， γ-4CH 在 B-B4VH 序列下游的表达构建体中编码。
     首先仔细地分析 B-B4VH 和 Vκ 基因， 以鉴定任何不合需要的剪接供体位点、 剪接 受体位点、 Kozak 序列， 以及鉴定此后会干扰功能性全抗体的亚克隆和 / 或表达的任何额外的亚克隆限制位点的存在。在 Vκ 序列中发现不合需要的 HindIII 位点， 需要在不改变氨 基酸序列的情况下利用 PCR 通过定点突变技术将其除去。 对于该反应， 使用寡核苷酸引物 B T03(5′ -CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG-3′ )[SEQ ID NO ： 10] 和 BT04(5′ -CCA CCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTG-TTG-3′ )[SEQ ID NO ： 11]， 根据 Stratagene(La Jolla， CA)Quickchange Mutagenesis 试剂盒程序进行诱变。
     κ 链嵌合引物
     将 不 依 赖 于 PCR 引 物 序 列 的 不 引 起 歧 义 (non-ambiguous) 的 B-B4Vκ 前 导 序列与 Kabat 数据库中的小鼠前导序列比对。对于 B-B4VH 前导序列最接近的匹配是 VK-10ARS-A(Sanz 等， PNAS， 84(1987)， 1085)。据 SignalP 算法预测该前导序列会被正确地 切割 (Nielsen 等， Protein Eng， 10(1997) ； 1)。设计引物 CBB4Kfor( 参见上文 ) 和 g2258 (5′ -CGCGGGATC-CACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3′ [SEQ ID NO ： 12] ； 限制位点用 下划线标出 )， 从而产生含有该完全前导序列、 B-B4Vκ 区和 HindIII 以及 BamHI 末端限制 位点的 PCR 产物， 以克隆至 pKN100 表达载体内。正向引物 CBB4K 导入 HindIII 限制位点、 Kozak 翻译起始位点和 VK-10ARS-A 前导序列。反向引物 g2258 导入剪接供体位点和 BamHI 限制性位点。将所得的片段克隆至 pKN100 的 HindIII/BamHI 限制位点。
     重链嵌合引物
     将不依赖于 PCR 引物序列的不引起歧义的 B-B4VH 前导序列与 Kabat 数据库中的 小鼠前导序列比对。B-B4VK 前导序列的最接近匹配为 VH17-1A(Sun 等， PNAS， 84(1987)， 214)。据 SignalP 算法预测该前导序列会被正确地切割。设计引物 CBB4Kfor( 参见上文 ) 和 g22949(5 ′ -CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGA-GGTTCC-3 ′ [SEQ ID NO ： 13] ； 限制位点用下划线标出 )， 从而产生含有 VH17-1A 前导序列、 B-B4VH 区和末端 HindIII 以及 ApaI 限制位点的 PCR 产物， 以克隆至 pG4D200 表达载体内。正向引物 cBBHFor 导入 HindIII 限制位点、 Kozak 翻译起始位点和 VH17-1A 前导序列。反向引物 g22949 导入 γ4C 区的 5′末端和天然 ApaI 限制位点。将所得的片段克隆至 pG4D200 的 HindIII/ApaI 限制 位点， 产生载体 pG4D200cBB4。
     cBB4 抗体的产生
     将一瓶 COS7 细胞解冻， 并在补充有 10％ Fetal clone I 血清以及抗生素的 DMEM 中生长。一周后， 将细胞 (0.7ml， 107 细胞 /ml) 与 pG4D200cBB4 加上 pKN100cBB4( 各 10μg DNA) 一起电穿孔， 或不和 DNA 一起电穿孔。将这些细胞平板接种至 8ml 生长培养基中 4 天。 重复电穿孔 7 次。
     嵌合抗体的检测
     将夹心 ELISA 用于测定 COS 7 上清液中的抗体浓度。瞬时转化的 COS 7 细胞分泌 约 6956ng/ml 的抗体 ( 数据未示出 )。
     cB-B4 的结合活性
     为了检测 COS 7 培养上清液中 cB-B4 的结合活性， 使用 Diaclone sCD138 试剂盒， 其是一种固相夹心 ELISA。 已将对 sCD138 特异的单克隆抗体涂布在所提供的微量滴定条的 孔上。首次温育期间， 将 sCD138 和生物素化的 B-B4(bio-B-B4) 抗体同时与未标记的测试 抗体 (B-B4 或 cB-B4) 的连续稀释液一起温育。
     为了获得与低浓度未标记抗体的竞争， 降低该测试中 bio-B-B4 的浓度 ( 否则cB-B4 在 COS 7 细胞培养上清液中的浓度太低， 不能获得足够的竞争 )。来自该测试的结果 表明， 两种抗体对 CD138 具有相同的特异性 ( 数据未示出 )。
     cB-B4 的纯化
     使用 Protein A ImmunoPure Plus 试剂盒 (Pierce)， 根据制造商推荐从 COS 7 细 胞上清液中纯化嵌合 cB-B4( 数据未示出 )。
     KD 确定 ： 比较 nBT062/BB4
     可溶性 CD138 的纯化
     使用 1mL 偶联有 B-B4 的 “HiTrap NHS 激活的 HP” 柱， 通过 FPLC 纯化来自 U-266 细 胞培养上清液的可溶性 CD138 抗原。将在 pH7.4 的 PBS 缓冲液中的细胞培养上清液加样至 所述柱上， 稍后用 pH11 的 50mM 三乙胺将 CD138 抗原洗脱至 2mL 的组分中。洗脱出的 CD138 立即用 375μL 的 pH3 的 1M Tris-HCl 中和， 以防止结构和 / 或功能损害。
     CD138 的生物素化
     Sulfo-NHS-LC(Pierce) 用于标记 CD138。在 pH 为 7 ～ 9 的缓冲液中 NHS 激活的 生物素有效地与伯胺基 ( 例如赖氨酸残基 ) 反应， 形成稳定的酰胺键。
     为将 CD138 生物素化， 使用蛋白脱盐离心柱 (spin column)(Pierce) 将 50μl 的 CD138 脱盐。将生物素化试剂 (EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin， Pierce) 溶于冰冷却的去 离子 H2O 至最终浓度为 0.5mg/mL。将生物素化试剂和捕获试剂溶液混合， 生物素化试剂的 摩尔数与捕获试剂相比过量 12 倍 (50pmol CD138 与 600pmol 生物素化试剂 )， 在室温下温 育 1h， 同时轻轻地摇动小瓶。使用蛋白脱盐柱除去未结合的生物素化试剂。
     bCD138 的固定
     将用于 BIACORE 测试的传感芯片 (SENSOR CHIP SA， BIACORE AB) 设计来与生物素 化分子结合以便在 BIACORE 系统中进行相互作用分析。其表面由羧甲基化右旋葡萄糖苷基 质构成， 所述基质用抗生物素链霉亲和蛋白预先固定并且已准备好用于高亲和力捕获生物 素化配体。利用 10μL/ 分钟的流速通过手动注射在 SENSOR CHIP SA 上进行 bCD138 的固 定。用三次连续的 1 分钟注射 50mM NaOH 中的 1M NaCl 调节该芯片表面条件。然后进行 1 分钟的生物素化 CD138 注射。
     使用 BIACORE 确定不同抗体的 KD
     对 于 不 同 的 实 验， 软 件 BIACORE 使 用 预 定 义 的 掩 膜 (masks)， 即所谓的 “向 导 (Wizards)” ， 其中仅改变某些设定。由于最初开发 BIACORE C 来测定浓度， 所以不存在设 计用于进行亲和力测定的向导。然而， 使用适当的设定， “非特异性结合” 的向导可用于测 定亲和速率常数并由此用于确定 KD。使用该向导， 通过执行 “再生 1(Regeneration 1)” 用 BIACORE 运行缓冲液测定两种流动细胞， 将解离相设定为 90 秒。使用 pH2.5 的 10mM 甘氨 酸 -HCl 进行等效于实际再生的 “再生 2” 。该步骤后， 配体 CD138 再次处于其结合感受态。 在整个过程中， HBS-EP 被用作运行和稀释缓冲液。 为了确定不同抗体 ( ～ 150kDa) 与 CD138 的结合， 在不同浓度 (100nM、 50nM、 25nM、 12.5nM、 6.25nM 和 3.13nM) 分析结合和解离。通过 计算速率常数 ka 和 kd 确定解离平衡常数。其后， 使用 BIAevaluation 软件通过 kd 与 ka 之商来计算分析物的 KD 值。结果如表 4 所示。
    
    
    表4： nBT062 和 B-B4 的 KD 值的比较分析。对于平均 KD 值给出标准偏差。 讨论从三个独立实验计算各抗体的平均 KD 值。 结果表明， 在所有测定中， 与 B-B4 相比， nBT062 显示稍低的 KD 值 ( 平均 KD 值分别为 1.6nM 和 1.4nM)。
     免疫缀合物的制备
     nBT062-DM1 和 huC242-DM1
     如此前 Chari(Chari 等， Cancer Res.1(1992)， 127) 所述， 从微生物发酵产物安丝 菌素 P-3 合成含巯基类美登素 DM1。此前对于人源化 C242(huC242) 的制备 (Roguska 等， PNAS， 91(1994)， 969) 已有描述。如此前所述 (Liu 等， PNAS， 93(1996)， 8618) 制备抗体 - 药 物缀合物。每个抗体分子平均连接 3.5 个 DM1 分子。
     nBT062-DM4
     BT062 为一种抗体 - 药物缀合物， 其由经由二硫键通过连接子连接至 nBT062 嵌合 单克隆抗体的细胞毒性类美登素药物 DM4 构成。类美登素为抗有丝分裂剂， 其抑制微管蛋 白聚合和微管组装 (Remillard 等， Science189(1977)， 1002)。BT062(nBT062-DM4) 的化学 示意图如图 1 和 2 所示。
     DM4 的合成 从公知衍生物美登醇制备 DM4(Kupchan 等， J.Med.Chem.， 21(1978)， 31)。美登醇 通过用氢化三甲氧基铝锂还原性裂解微生物发酵产物安丝菌素 P3 的酯部分而制备 ( 参见 图 3)。
     DM4 如下合成 ： 在二环己基碳二亚胺 (DCC) 和氯化锌的存在下用 N- 甲基 -N-(4- 甲 基 二 硫 代 戊 酰 基 )-L- 丙 氨 酸 (DM4 侧 链 ) 乙 酰 化 美 登 醇， 获得含二硫键的类美登素 DM4-SMe。 用二硫代苏糖醇 (DTT) 还原 DM4-SMe， 以获得所期望的含巯基类美登素 DM4( 参见 图 4， DM4 工艺流程图 )。
     免疫缀合物 BT062
     制 备 nBT062-DM4 的 过 程 如 图 5 所 概 述。 将 nBT062 抗 体 用 N- 丁 二 酰 亚 胺 基 -4-(2- 吡啶基二硫代 ) 丁酸酯 (SPDB 连接子 ) 修饰， 以引入二硫代吡啶基。将 DM4 与经
     修饰的抗体混合， 其浓度超过二硫代吡啶基的当量。 BT062 缀合物通过 DM4 的巯基和经由连 接子引入所述抗体的二硫代吡啶基之间的二硫键交换反应而形成。 通过色谱的纯化和渗滤 除去低分子量反应物 (DM4) 和反应产物 ( 硫代吡啶 ) 以及缀合抗体的团聚体， 从而产生原 料药 (bulk drug substance)。
     FACS 分析和 WST 细胞毒性检验
     FACS 分析
     OPM-2 细胞为显示高度表达 CD138 的血浆细胞白细胞系。将 OPM-2 细胞与不同浓 度的 nBT062、 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或 nBT062-SMCC-DM1 一起温育 ( 示于图 6)。洗涤所述细胞， 并且在 FACS 分析中使用荧光标记的二抗检测经 CD138 结合的抗体或缀 合物。将在这些实验中测定的平均荧光相对于抗体浓度作图。
     细胞活力测试
     将 CD138+MOLP-8 细胞以 3000 细胞 / 孔接种于平底板中。将 CD138-BJAB 对照细 胞 以 1000 细 胞 / 孔 接 种。 将 细 胞 用 不 同 浓 度 的 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或 nBT062-SMCC-DM1 处理 ( 如图 7 所示 )5 天。添加 WST 试剂 ( 水溶性四唑盐 ROCHE) 以便根 据制造商说明 (ROCHE) 测定细胞活力。将该试剂在 MOLP-8 细胞上温育 7.5 小时， 并在 BJAB 细胞上温育 2 小时。基于使用标准方法在微孔板读取器上测定的光密度计算存活细胞的分 数。 讨论
     通 过 FACS 分 析 BT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1、 nBT062-SMCC-DM1 或 nBT062 + 的结合。作为靶细胞的 CD138 OPM-2 与 nBT062 或免疫缀合物一起温育， 使用荧光标记 的二抗检测细胞结合的分子。图 6 中， 将作为细胞结合抗体的量的量度的平均荧光值相 对于不同的抗体或缀合物浓度作图。结果表明， nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 和 nBT062-SMCC-DM1 显示非常相似的结合特性。此外， 结果强烈地表明， 未结合抗体的结合特 性不受缀合毒素影响。
     在细胞活力测试中， 分析抗体对 CD138+MOLP-8 靶细胞和对 CD138-BJAB B 淋巴母 细胞瘤对照细胞的细胞毒性活性。将两种细胞系都接种于平底板中， 并与渐增浓度的免疫 缀合物一起温育。未缀合抗体用作对照。为了测定细胞活力， 通过使用 WST 试剂在添加免 疫缀合物后 5 天分析细胞毒性活性。图 7(A) ～ (C) 中， 将存活细胞相对于用运载剂对照 处理的对照细胞的分数对于渐增浓度的免疫缀合物作图。结果表明， nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM 1 和 nBT062-SMCC-DM1 对 MOLP-8 细胞的细胞毒性活性非常相似。正如预 表明所有免疫缀合物经由与 CD138 的细胞特 期， CD138-BJAB 对照细胞未被免疫缀合物杀死， 异性结合而起作用。在竞争实验中， MOLP-8 细胞与过量摩尔数的未缀合 nBT062 一起预温 育。预温育基本上阻断了 nBT062-SPDB-DM4 的细胞毒性， 从而提供了进一步证据表明免疫 缀合物经由与细胞表面上的 CD138 的特异性结合而杀死细胞 ( 图 7(D))。
     异种移植物小鼠实验
     为了评价 CD138 靶向对于人类嵌合形式的 B-B4 抗体 (nBT062) 的抗体 - 类美登素 缀合物的抗肿瘤活性的重要性， 进行异种移植物小鼠实验。制备两种形式的 nBT062- 类美 登素缀合物 (nBT062-SPP-DM1 和 nBT062-SPDB-DM4)， 它们可能在其二硫键的化学稳定性上 有所不同。 将这些抗体 - 药物缀合物的抗肿瘤活性与 B-B4-SPP-DM1 缀合物 ( 包含小鼠亲本
     抗体 )、 以及未缀合的游离类美登素 (DM4)、 天然未经修饰的 nBT062 抗体和非靶向 ( 无关 ) IgG1- 类美登素缀合物的活性进行比较。 在严重联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠中的人类多发性 骨髓瘤的 CD138 阳性异种移植物模型 (MOLP-8) 中评价缀合物。
     在这些小鼠中， 通过用 MOLP-8 细胞悬浮液接种建立皮下肿瘤 ( 雌性 CB.17SCID 小 鼠 )。当肿瘤体积达到平均 113mm3 时， 进行使用单次静脉内团注的治疗。每周两次监测肿 瘤体积和体重的变化。肿瘤细胞接种后， 实验进行了超过 68 天。
     异种移植物小鼠实验 A
     小鼠
     5 周龄雌性 CB.17SCID 小鼠获自 Charles River Laboratories。
     人类肿瘤细胞系
     人类多发性骨髓瘤细胞系 MOLP-8 由 ATCC 提供。将在其细胞表面表达 CD138 抗 原并且在 SCID 小鼠中发育异种移植肿瘤的 MOLP-8 细胞， 保持在 37 ℃、 含有 5 ％ CO2 的 润湿气氛中的 RPMI-1640 培养基中， 该培养基补充有 4mM L- 谷氨酰胺 (Biowhittaker， Walkersville， MD)、 10％胎牛血清 (Hyclone， Logan， Utah) 和 1％链霉素 / 青霉素。
     第 I 部分
     小鼠中的肿瘤生长
     将 1×107 的 MOLP-8 细胞于皮下接种于每只小鼠右肩下的区域。总体积为 0.2ml/ 小 鼠， 其 中 无 血 清 培 养 基 与 基 质 胶 (matrigel)(BD Bioscience， Bedford， MA) 的 比 为 1/1( 体积 / 体积 )。处理前， 每天监测异种移植物肿瘤， 使其逐渐建立。接种肿瘤细胞后约 3 11 天， 肿瘤体积达到约 113mm 。CB.17SCID 小鼠的肿瘤携带率为 100％。
     接 种 肿 瘤 细 胞 后 11 天， 基 于 肿 瘤 体 积 和 体 重 选 择 42 只 小 鼠。 肿 瘤 体 积 为 3 3 68.2mm ～ 135.9mm 。基于肿瘤体积将 42 只小鼠随机分成 7 组 (A ～ G)， 每组 6 只动物。
     组 A 中 6 只小鼠中每一只接受 200μl PBS 作为运载剂对照。组 B 中每只小鼠接 受 13.8mg/kg 的 nBT062 裸抗体。该剂量等效于 250μg/kg 的连接类美登素中的 nBT062 抗 体组分的量。缀合分子中类美登素与 nBT062 抗体的分子量之比约为 1/55。组 C 中每只小 鼠接受 250μg/kg 的 DM4。组 D 中每只小鼠接受 250μg/kg 的 huC242-DM4。组 E、 F和G中 的小鼠每只分别接受 250μg/kg 的 nBT062-SPDB-DM4、 B-B4-SPP-DM1 和 nBT062-SPP-DM1。
     使用配置有 27 号规格、 1/2 英寸针头的 1ml 注射器， 通过横向尾静脉 (lateral tail vein) 以单次团注于静脉内施用所有试剂。 施用前， 将 nBT062 抗体、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 的母液用无菌 PBS 分别稀释至浓度 2mg/ml、 28.1μg/ml 和 28.1μg/ml， 以使对于每只小鼠的注射体积为 120μl ～ 220μl。
     第 II 部分
     在第二组实验中， 将悬浮于无血清培养基和基质胶的 50 ∶ 50 混合物中的 MOLP-8 7 细胞 (1.5×10 细胞每只小鼠 ) 以 100μl 皮下注射于右肩下的区域。接种后， 在第 11 3 3 天肿瘤体积达到约 80mm ， 而在第 25 天对照的平均值为约 750mm 。肿瘤倍增时间经估算 为 4.58 天。对照组 (n ＝ 6) 中的每只小鼠接受 0.2ml 的无菌 PBS， 其以团注施用于横向 尾静脉 ( 静脉内 )。所有处理剂量基于缀合的类美登素。9 组 (n ＝ 6) 用单次静脉内注 射 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1 来 处 理， 每种处理的剂量为 450μg/kg、 250μg/kg 和 100μg/kg。 另 一 组 (n ＝ 6) 以 反 复 给 药 方 式 接 受 250μg/kgnBT062-SMCC-DM1( 每周一次， 持续 5 周 )。使用 LabCat Program 根据肿瘤体积将小鼠随机 分成 11 组 (n ＝ 6)。肿瘤体积为 40.0mm3 ～ 152.5mm3。基于个体体重对小鼠给药。
     使 用 LabCat System(Tumor Measurement and Tracking ，Innovative Programming Associated， Inc.， Princeton， NJ) 每周 2 次测定肿瘤的三维尺寸。使用 Tomayko 等， Cancer Chemother.Pharmacol， 24(1989)， 148 中所述的方法计算肿瘤体积 ( 单 3 位为 mm ) ：
     体积＝长 × 宽 × 高 ×1/2
     使用 Bissery 等， Cancer Res.， 51(1991)， 4845 中所述的公式计算 Log10 细胞杀 伤：
     Log10 细胞杀伤＝ (T-C)/Td×3.32
     其 中 (T-C) 或 肿 瘤 生 长 延 迟 为 处 理 组 (T) 和 对 照 组 (C) 肿 瘤 达 到 预 定 体 积 3 (600mm ) 所需天数的中值时间 (median time)。Td 为肿瘤倍增时间， 基于对照小鼠中的平 均肿瘤体积， 并且 3.32 为每单位细胞生长对数的细胞倍增数。
     结果
     个体小鼠中的肿瘤生长如图 8 和图 9 所示。各组的平均值 (+/-SD) 如图 10 所示。
     与 PBS 处理的动物中的肿瘤生长相比， 用 nBT062 抗体、 未缀合的游离 DM4 或无关 的非靶向缀合物 huC242-DM4 处理不引起对肿瘤生长的任何显著抑制。
     所 有 三 种 靶 向 CD138 的 缀 合 物， nBT062-SPDB-DM4、 B-B4-SPP-DM1 和 nBT062-SPP-DM1 在剂量为 250μg/kg 时都引起肿瘤生长的显著延迟。 基于在处理组中测定 的中值肿瘤体积， DM4 缀合物 nBT062-SPDB-DM4 的活性最强， 而 nBT062-SPP-DM1 与其小鼠 对应物 B-B4-SPP-DM1 相比显示出活性稍微增加 ( 图 10)。另外， 在个体小鼠中获得的结果 显示， 用 B-B4-SPP-DM1 获得的抗肿瘤活性更不均匀， 因此比在用 nBT062-SPP-DM1 处理的小 鼠中测定的活性更难预测。在抗肿瘤活性的均匀性方面， 使用 nBT062 作为靶向抗体的另一 缀合物 nBT062-SPDB-DM4 与 nBT062-SPP-DM1 表现相似。
     在任何处理组中未观察到体重下降， 表明该治疗耐受良好。
     讨论
     在实验动物中对三种靶向 CD138 的缀合物的分析结果证明靶向输送对于抗肿瘤 活性的重要性。尽管人类嵌合 nBT062 和小鼠 B-B4 抗体的类美登素缀合物显示出显著活性 ( 如对数细胞杀伤所测定 )， 用未缀合的 DM4、 未经修饰的天然 huBT062 抗体或非靶向对照缀 合物 (huC242-DM4) 处理对肿瘤生长无显著影响。
     从 人 类 嵌 合 抗 体 制 备 的 免 疫 缀 合 物 nBT062-SPP-DM1 比 从 其 小 鼠 对 应 物 制 备 的 B-B4-SPP-DM1 提 供 稍 高 的 抗 肿 瘤 活 性。 此 外 与 用 B-B4-SPP-DM1 处 理 相 比， 用 nBT062-SPP-DM1 和 nBT062-SPDB-DM4 处理引起个体小鼠中更均匀的响应。B-B4-SPP-DM1 的高结合变化说明， 对于在接种后对 CB.17SCID 小鼠中的 MOLP-8 人类多发性骨髓瘤异种移 植物的中值肿瘤体积 (+/-SD) 随时间推移 ( 天数 ) 的测定而言， 实际上 B-B4-SPP-DM1 比 nBT062-SPP-DM1 提供了相对更好的结果 ( 数据未示出 )。使用 nBT062 作为靶向抗体的免 疫缀合物的该特征似乎对于缀合物的治疗应用特别有益。
     最后， 对 SCID 小鼠中的 MOLP-8 异种移植物模型单次静脉内施用后， 最强效的类美 登素缀合物为 nBT062-SPDB-DM4。旁观者杀伤 ( 细胞活力测试 )
     将 CD138+OPM2 细胞和 CD138-Namalwa 细胞接种至圆底板， 使二者处于分开的孔中 -8 -9 或者共培养。用浓度为 1×10 M ～ 1×10 M 的 nBT062-SPDB-DM4 处理细胞。使用 WST 试剂 ( 水溶性四唑盐， ROCHE)， 根据制造商说明 (ROCHE) 检测活细胞的分数。基于使用标准方法 在微孔板读取器上测定的光密度计算存活细胞的分数。
     讨论
     在将 CD138 阳性 OPM2 细胞与 CD138 阴性 Namawla 细胞共培养的体外研究中， 分析 在 nBT062-SPDB-DM4 处理的情况下紧邻多发性骨髓瘤细胞 ( 存在于圆底孔中 ) 的非靶细胞 的旁观者杀伤 ( 图 13)。通常， 尽管 CD138 阳性细胞被 nBT062-SPDB-DM4 有效地杀伤， CD138 阴性细胞不受该缀合物影响。 然而在圆底孔的共培养中， nBT062-SPDB-DM4 还杀伤紧邻抗原 阳性细胞的抗原阴性细胞 ( 该效应通常被称为旁观者杀伤 )。 Kovtun 等 (2006) 论述了通过 类美登素缀合物介导的旁观者杀伤仅发生在紧邻抗原阳性细胞的附近。Kovtun 等 (2006) ( 本文通过参考并入其全部内容 ) 还讨论了免疫缀合物的连接子的重要性。 在体内， 旁观者 杀伤可能有助于 ： 1) 根除不均匀表达 CD138 的肿瘤细胞， 2) 通过杀死肿瘤基质细胞破坏肿 瘤微环境， 和 3) 预防 CD138 阴性的抗 nBT062-SPDB-DM4 细胞的选择。
     如果肿瘤中以不均匀方式表达的靶抗原削弱了免疫缀合物的活性， 则旁观者效应 特别重要。如果存在这种情况， 特定的肿瘤细胞表达 ( 如果表达的话 ) 的抗原的量不足以 使各自的免疫缀合物有效的直接靶向和杀死所述细胞。nBT062-SPDB-DM4 对与 CD138 阳性 细胞共培养的 CD138 阴性细胞的抗肿瘤效力明确表明， 在合适的情况下， 靶细胞的存在影 响 nBT062-SPDB-DM4 对非靶细胞的细胞毒性活性。
     异种移植物小鼠实验 B
     在该组实验中， 用 MOLP-8 细胞 (1.5×107 细胞 / 小鼠 ) 皮下接种于 85 只小鼠的右 肩。肿瘤携带率为 100％。将携带平均肿瘤体积为约 80mm3 的大体积 MOLP-8 肿瘤的 66 只 SCID 小鼠随机地分成 11 个治疗组 (n ＝ 6)。用单剂量的三种缀合物 (nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1) 中的一种治疗小鼠。额外的一组在 5 周中每周接受 一次 nBT062-SMCC-DM1 给药， 而对照组接受单剂量的 PBS。平均肿瘤体积如图 11A 所示。对 于各缀合物建立剂量响应曲线。 在 PBS 治疗的动物中， 中值肿瘤体积在第 25 天达到 750mm3。 根据在对照肿瘤生长的对数线性图上拟合的最佳拟合线性回归曲线测定的肿瘤倍增时间 为 4.58 天。用 450μg/kg 的 nBT062-SPDB-DM4 治疗的动物具有最高的对数细胞杀伤 (LCK ＝ 2.89)， 仅次于其的是用 250μg/kg nBT062-SMCC-DM1 每周一次用药治疗的动物 (LCK ＝ 2.1 ； 参见表 5)。通过反复测定进行 Dunnett 多重比较测试的 ANOVA 来比较治疗组平均 肿瘤生长曲线， 显示出 PBS 对照组与 450μg/kg nBT062-SPDB-DM4(p ＜ 0.01)、 250μg/kg nBT062-SPDB-DM4(p ＜ 0.05) 和 5 周每周一次给药 250μg/kg nBT062-SMCC-DM1(p ＜ 0.05) 之间的显著差异。在任何治疗组中未发生肿瘤的部分或全部消退， 唯一例外是一只接受 450μg/kg nBT062-SPDB-DM4 的动物， 其在接种后第 85 天肿瘤部分消退。
     表 5. 不同给药方案中作为不同 nBT062-DMx 缀合物的抗肿瘤活性的量度的对数细 胞杀伤 (LCK) 值。对于 LCK 值的计算方面的信息， 参见材料和方法部分。
    36101945892 A CN 101945900说明书LCK 给药 单剂量35/49 页测试材料 PBS nBT062-SMCC-DM1 nBT062-SMCC-DM1 nBT062-SMCC-DM1 nBT062-SPDB-DM4 nBT062-SPDB-DM4 nBT062-SPDB-DM4 nBT062-SPP-DM1 nBT062-SPP-DM1 nBT062-SPP-DM1 nBT062-SMCC-DM1
    剂量 (μg/kg)450 250 100 450 250 100 450 250 100 2500.85 0.53 0 2.89 1.05 0.39 0.8 0.39 0.2 2.1单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 单剂量 每周一次， 持续 5 周nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 在骨髓环境中的体内效力
     具有人类胎骨植入物的 SCID 小鼠的制备
     如 此 前 所 述 (Urashima 等， 1997)， 将人类胚胎长骨 ( 人类胎骨碎片 ) 植入 CB17SCID 小鼠 (SCID-hu) 的上半身， 从而为人类 MM 细胞自导引至人类 BM 细胞提供小鼠模 型。
     治疗方案 (SCID-hu/INA-6 小鼠 )
     骨植入 4 周后， 将最终体积为 100μL 的 RPMI-1640 细胞培养基中的 2.5×106INA-6 细胞直接注入上述 SCID-hu 小鼠中的人类骨髓腔中。将由 INA-6 细胞释放的可溶性人类 IL-6 受体 (shuIL-6R) 的水平的增加用作 MM 细胞生长和疾病负荷的参数。
     INA-6 细胞注射后约 4 周， 小鼠发展出可测定的血清 shuIL-6R， 然后每周一次地经 由尾静脉注射接受 0.176mg 缀合物或运载剂对照， 持续 7 周。每次治疗后， 收集血液样品， 并通过酶联免疫吸附测试 (ELISA， R&D Systems， Minneapolis， MN) 就 shuIL-6R 水平进行 测定。结果如表 12 所示。
     讨论
     白细胞介素 (IL-6) 为多发性骨髓瘤细胞的生长和存活因子。 INA-6 为 IL-6- 依赖 性人类骨髓瘤细胞系， 其也需要骨髓瘤基质细胞 (BMSC) 以增殖。INA-6 细胞系产生可溶性 IL-6 受体 (shuIL-6R)。shuIL-6R 水平的增加可用作 MM 细胞生长和疾病负荷的参数。因此， sCID-hu/INA-6 小鼠提供在其正常骨髓环境中生长的多发性骨髓瘤细胞模 型。该模型的肿瘤细胞与人类骨髓直接相互作用， 这与其中基质细胞的存在也会促进肿瘤 细胞生长的患者中的情况极其相似。由于 INA-6 细胞释放可溶性人类白细胞介素 -6 受体 (shuIL-6R)， 该蛋白的血清浓度可用作这些小鼠中肿瘤细胞负荷的量度。在该环境中测试 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 的体内效力。
     根据所检测的相对于对照的血清 shuIL-6R 水平的下降， 使用每周一次持续 7 周的 静脉内施用 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1 治疗 SCIDhu/INA-6 小鼠诱导了有效的肿 瘤消退， 表明即使在反映出患者中相关情况的人类骨髓环境中所述缀合物也具有良好效力 ( 图 12)。
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 在体外和在实验动物体 内的效力的分析
     材料和方法
     细胞培养
     Dex 敏 感 性 (MM.1S) 和 抗 Dex(MM.1R) 人 类 MM 细 胞 系 由 Steven Rosen 博 士 (Northwestern University， Chicago， IL) 友情提供。RPMI8226 和 U266 人类 MM 细胞系 获自美国标准培养物收藏所 (American Type Culture Collection， Manassas， VA)。抗 多柔比星 (Dox) 细胞 (RPMI-Dox40) 和抗美法仑细胞 (LR5) 由 William Dalton 博士 (Lee Moffitt Cancer Center， Tampa， FL) 友情提供。 OPM1 和 OPM2 血浆细胞白血病细胞由 Edward Thompson 博士 (University of Texas Medical Branch， Galveston) 友情提供。 在含有 10 ％胎牛血清、 2mM L- 谷氨酰胺 (Life Technologies)、 100U/mL 青霉素 和 100Ag/mL 链霉素 (Life Technologies) 的达尔伯克氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco’ s modification of Eagle’ s medium)DMEM(Sigma) 中培养所有 MM 和骨髓 (BM) 基质细胞系。 通过 Ficoll Paque 密度梯度液处理收集自健康志愿者的血液样品， 从而获得外周血单核细 胞 (PBMC)。在根据赫尔辛基宣言获得知情同意和被 Institutional Review Board of the Dana-Farber Cancer Institute 批准后， 从 BM 样品获得源自患者的 MM 和 BM 细胞。使用 Ficoll Paque 密度沉降分离 BM 单核细胞， 并且通过使用抗 CD138 磁性激活的细胞分离微珠 (Miltenyi Biotec Auburn， CA) 的阳性筛选来纯化血浆细胞 ( ＞ 95％ CD138+)。 如此前所述 (Hideshima， 2001)， 使用 RosetteSep 阴性筛选系统 (StemCell Technologies， Vancouver， BC， Canada) 从具有 MM 的患者的 BM 中纯化肿瘤细胞。向骨髓样品提供 RosetteSep 抗体鸡 尾酒混合物 (antibody cocktail)。用 RosetteSep 试剂使 CD138 阴性细胞与红细胞交联 ( 玫瑰花结 (rosetted))， 并在室温温育 20 分钟， 然后通过 Ficoll 密度离心而分离。
     生长抑制和增殖测试
     如 此 前 所 述 (Hideshima， 2003)， 通 过 测 定 3-(4， 5- 二 甲 基 噻 唑 -2- 基 )--2， 5- 二 苯 基 溴 化 四 唑 (MTT ； Chemicon International， Temecula， CA) 染 料 代 谢， 估算 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 和地塞米松对 MM 细胞系、 PBMC 和 BMSC 的生长抑制作用。
    
    nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 对 BM 中 MM 细胞生长的 为了评估 BM 细胞对于 MM 细胞对免疫缀合物的敏感性的生长刺激作用， 在存在或38影响
    101945892 A CN 101945900说明书37/49 页不存在药物时， 在 96 孔板 (Costar， Cambridge， MA) 中使 MM 细胞 (2×104 细胞 / 孔 ) 与 骨髓基质细胞 (BMSC， 1×104 细胞 / 孔 ) 共培养 48h。通过 [3H]- 胸苷摄取测定 DNA 合成 (Perkin-Elmer， Boston， MA)。在实验的最后 8 个小时期间添加 [3H]- 胸苷 (0.5μCi/ 孔 )。 一式四份地进行所有实验。
     细胞周期分析
     将 MM 细胞 (1×106 细胞 ) 在存在或不存在免疫缀合物时温育 48 小时， 用磷酸盐 缓冲盐水 (PBS) 洗涤、 在 -20℃通过与 70％乙醇接触 30 分钟使之透性化 (permeabilized)， 在室温下与含有 20U/mL RNA 酶 A(Roche Diagnostics) 的 0.5mL PBS 中的碘化丙啶 (PI) (50μg/mL) 一起温育 30 分钟。使用流式细胞仪分析 DNA 含量。
     免疫荧光
     将 盖 玻 片 上 生 长 的 细 胞 在 冷 的 无 水 丙 酮 中 固 定 10 分 钟， 在 PBS 中 洗 涤 和 用 PBS 中 的 5 ％ FBS 阻 断 60min。 然 后 使 载 玻 片 与 抗 CD138 抗 体 (sc12765， Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， CA) 在 4℃温育 24h。 再次用 PBS 洗涤细胞， 使之与荧光标记的 山羊抗小鼠 IgG 在 4℃温育 1h， 并如此前所述 (Ikeda， 2005 ； Kiziltepe， 2007)， 使用 Nikon E800 荧光显微镜分析。
     自体荧光绿色荧光蛋白 (GFP) 阳性人类 MM 异种移植物模型和人类 MM 异种移植物 小鼠模型
     如此前所述 (Zufferey， 1998)， 使用慢病毒载体用绿色荧光蛋白 (OPM1GFP) 转染 OPM1 细胞。 CB17SCID 小鼠 (48 ～ 54 日龄 ) 购自 Charles River Laboratories(Wilmington， MA)。根据 Dana-Farber 癌症研究所动物伦理委员会批准的方案进行所有动物研究。用 100μl RPMI-1640 中的 5×106OPM1GFP MM 细胞在小鼠右胁处皮下接种。当肿瘤可触知时， 将小鼠分配至治疗组中， 在该治疗组中小鼠通过横向尾静脉注射在 4 周中每周一次接受 176μg/ 小鼠的缀合物 ( 以分子量计 )， 而将 5 只小鼠分配至仅接受运载剂的对照组。每隔 一天用游标卡尺 (caliper) 测定正交最长的肿瘤直径， 从而使用代表椭球体三维体积的以 2 下公式估算肿瘤体积 ： 4/3×( 宽 /2) ×( 长 /2)。当肿瘤达到 2cm 或小鼠表现出垂死时， 处 死动物。从治疗第一天直至死亡对存活进行评估。使用从治疗第一天直至处死那天 ( 对于 对照为第 10 天， 对于 BT062-SPDB-DM4 治疗组为第 21 天 ) 的游标卡尺测定值评价肿瘤生 长。 在将肿瘤区域皮肤除毛后， 使用 Illumatool Bright Light System LT-9900(Lightools Research， Encinitas， CA) 全身荧光成像来监测小鼠。用佳能 IXY 数码 700 相机捕获图像。 用与 LEICA DFC300FX 相机连接的 LEICA DM IL 显微镜以 40u/0.60(Leica， Heidelberg， 德 国 ) 捕获肿瘤的离体分析图像。
     凋亡细胞的检测
     将 MM 细胞 (1×106) 用 PBS 洗涤， 并且在存在或不存在免疫缀合物时温育。用 PE 缀合的 Apo 2.7 抗体 (7A6， Beckman Coulter， Inc.) 将凋亡细胞染色。使用 RXP Cytomics 软件， 在 Epics 流式细胞仪上通过流式细胞法分析所述细胞。
     免疫印迹
     如此前所述 (Yasui， 2005 ； Hayashi， 2002)， 在存在或不存在 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM1 或 BT062-SPP-DM1 时， 将 MM 培养、 收获、 洗涤， 并使用含有 2mM Na3VO4、 5mM NaF、 1mM 苯甲磺酰氟、 5mg/ml 完全蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀测试 (RIPA) 缓冲液裂解。将全细胞裂解物 (20μg/ 泳道 ) 进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离， 转移至纯硝酸纤维素膜 (Bio-Rad Laboratories， Hercules， CA)， 并用抗聚 ADP( 二 磷酸腺苷 )- 核糖聚合酶 (PARP)、 半胱天冬酶 -8、 半胱天冬酶 -3、 半胱天冬酶 -9、 AKT、 和磷 (Ser 473)Akt(Cell Signaling) 的抗体， 以及抗微管蛋白和抗 CD138 抗体 (Santa CruzBiotechnology) 进行免疫印迹。
     细胞粘着测试
     在 96 孔板中， 向各孔用移液管移入 1×104BMSC， 并在 37℃在存在或不存在免疫缀 合物时温育 12h。该温育期间， 在存在或不存在药物时对 BMSC 提供 MM 细胞。因此， 将 MM 细 胞用 PBS 洗涤 3 次， 并重悬于存在或不存在药物的无血清 RPMI 培养基中， 细胞密度为 2×105 细胞 /100μL 培养基。一式三份或一式四份地运行各样品组。在 37℃共培养 2 小时后， 通 过将板反转除去未粘着的细胞、 弱粘着的细胞和培养基。随后， 用 PBS 洗涤细胞 3 次。将剩 3 下的粘着细胞在含有 10％ FBS 的 RPMI 培养基中在 [ H]- 胸苷 (0.5μCi/ 孔， Perkin Elmer， Boston， MA， USA) 的存在下再培养 8 小时， 以测定 DNA 合成。
     统计分析
     使用 Dunn 多重比较测试确定在免疫缀合物 (IC) 处理的培养物与对照培养物中观 察到的差异的统计显著性。最小程度的显著性为 P 值小于 0.5。对于体内实验， 使用 Dunn 多重比较测试的单向分析比较肿瘤体积。使用 Kaplan-Meier 曲线和对数秩 (log-rank) 分 析来估算存活。
     结果
     CD138 在 MM 细胞系上的表达
     通过使用 MM1S、 OPM1、 OPM2、 RPMI8226、 DOX40、 MM1R、 LR5 和 U266 细胞的全细胞裂 解物进行的免疫印迹， 分析 CD138 在多发性骨髓瘤细胞系中的表达水平 ( 图 14A)。
     从图 14A 中能够看出， MM1S 和 LR5 显示弱 CD138 表达， Dox40 细胞为 CD138 阴性 的。其它细胞系显示高 CD138 表达水平。据显示 CD138 在 8 个多发性骨髓瘤细胞中的 7 个 (87.5％ ) 中表达。
     图 14B 显示使用 CD138 特异性抗体使用免疫荧光染色进行的分析。进行 DOX40 细 胞 ( 上图 ) 和 OPM1 细胞 ( 下图 ) 的显微分析。CD138 表达示于左边， 核酸示于右边。图 14B 显示， DOX40 细胞展现出几乎不可检测的 CD138 表达。相反， OPM1 细胞显示出高的 CD138 免 疫反应性。
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 显示出对 CD138 阳性细 胞系具有选择性细胞毒性
     在 细 胞 活 力 测 试 中 还 测 试 了 CD138 抗 体 类 美 登 素 缀 合 物 的 效 力。 使 用 基 于 3-(4， 5- 二 甲 基 噻 唑 -2- 基 )-2， 5- 二 苯 基 溴 化 四 唑 (MTT) 的 测 试， 对免疫缀合物 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 对 CD138 阳 性 细 胞 (OPM1， RPMI8226)、 CD138 弱表达细胞 (MM1S) 和 CD138 阴性细胞 (DOX40) 的细胞毒性潜力进行分 析。图 15A 描述了分别与 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1 接触的 OPM1( ■ )、 RPMI8226( ◆ )、 DOX40( □ ) 和 MM1S 细胞 ( △ )。在 MTT 测试中测定细胞存活。 指定温育时间 (40h、 80h、 120h) 后细胞活力以未处理对照的活力的百分比 (％ ) 表示。用 浓度为 3ng/ml ～ 354ng/ml 的 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 处理细胞， 诱导了 CD138 阳性细胞中的生长抑制。该作用以时间和剂量依赖性方式出现， 并 且在表达高水平 CD138 的两种细胞系中在 120h 后最显著。在相同条件下， 几乎未测出对 CD138 阴性 DOX40 细胞的细胞毒性 ( 图 15A)。重要的是， 如在温育 48h 后所测定、 在浓度为 111ng/ml ～ 442ng/ml 时所分析， 所述三种免疫缀合物也对源自患者的阴性选择的 MM 细胞 有细胞毒性 ( 图 15B)。图 15C 显示在确定细胞活力之前与 nBT062-SPDB-DM4 一起培养 72h 的源自 3 个健康受试对象的 PBMC。在相同条件下处理的 OPM1MM 的细胞活力作为对照显示 ( 封闭方块 )。从图 15C 可以看出， 所述免疫缀合物在分离自 3 个健康志愿者的 PBMC( 外 周血单核细胞 ) 中没有诱导细胞毒性作用 ( 图 15C)。这些结果证明， nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 选择性地杀伤 CD138 阳性 MM 细胞 ( 在该图中示出的 所有数据代表三个平行实验的平均值。标准偏差用误差条表示。)
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 诱导 OPM1 细胞中 G2/M 细 胞周期停滞
     由于类美登素通过抑制微管蛋白聚合而起作用， 此前已经显示 DM1 和 DM4 诱 导 肿 瘤 细 胞 中 的 G2/M 细 胞 周 期 停 滞 (Erickson， 2006)。 因 此， 用 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 处理后检验 OPM1 细胞的细胞周期曲线。将细胞与免 疫缀合物一起温育 0 ～ 72 小时， 用 PI 标记， 并通过流式细胞仪分析。图 16A 显示用免疫缀 合物处理 0、 12h 或 24h 的 OPM1 细胞， 以及对通过 PI 染色的细胞周期曲线的分析。从图 16A 可以看出， 与未处理细胞相比， 这些化合物对 G2/M 期细胞的比例具有显著影响。与用其它 两种药物处理的细胞相比， 将 OPM1 细胞暴露至 nBT062-SPDB-DM4 诱导更快更强的响应。
     nBT062-SPDB-DM4 诱导 OPM1 细胞中的凋亡
     接下来， 确定 nBT062-SPDB-DM4 是否诱导靶细胞中的凋亡。图 16(B) 显示在存在 或不存在免疫缀合物下培养 24h、 48h 或 72h 的 OPM1 细胞。通过 Apo 2.7 抗体染色和流式 细胞仪分析估算凋亡细胞百分比。如图 16B 所示， 用 Apo2.7 抗体对细胞的染色证明了用免 疫缀合物处理的细胞的凋亡诱导。
     图 16(C) 显示在 885μg/ml nBT062-SPDB-DM4 存在下培养指定时间的 OPM1 细胞 ( 左图 )， 或用不同浓度的免疫缀合物 ( 中图 ) 培养的 OPM1 细胞。在该图中， FL 表示对应 于全长形式半胱天冬酶和 PARP 的条带 ； CL 表示对应于切割产物的条带。在用指定剂量的 nBT062-SPDB-DM4 处理 24h 之前， 将 OPM1 细胞与 zVAD-fmk(50μmol/L) 一起预温育 60 分 钟。使用半胱天冬酶 -3、 -8、 -9、 PARP 和微管蛋白特异性抗体对全部细胞裂解物进行免疫印 迹。从图 16C 可以看出， 用 nBT062-SPDB-DM4 处理 OPM1 细胞以剂量依赖性和时间依赖性方 式 ( 左图和中图 ) 诱导了半胱天冬酶 -8、 -9、 和 -3 以及 PARP 的切割。泛半胱天冬酶抑制 剂 zVAD-fmk 阻断了经 nBT062-SPDB-DM4 诱导的半胱天冬酶 -3、 -8 和 -9 以及 PARP 在 OPM1 细胞中的切割 ( 图 16C， 右图 )。这些结果表明在靶细胞中 BT062-SPDB-DM4 激活半胱天冬 酶和诱导凋亡。
     nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抑制 BMSC 的保护性作用
     在多发性骨髓瘤患者中， 骨髓微环境经由至少两种不同的机制诱导 MM 细胞中 的生长、 存活和药物抗性 ： MM 细胞与纤连蛋白的粘着为细胞赋予粘着介导的药物抗性 (CAM-DR) ； 和骨髓环境中如白细胞介素 -6(IL-6) 和胰岛素样生长因子 1(IGF-1) 等细胞因 子诱导最后介导 MM 细胞对传统治疗产生抗性的重要的信号传导级联。在 IL-6 或 IL-6 的存在下， 或在骨髓基质细胞 (BMSC) 的存在下， 分析免疫缀合物对与 BMSC 共培养的 MM 细胞 的细胞毒性。
     在 图 17A ～ 17C 中， 将 OPM1 细 胞 与 对 照 培 养 基 ( 黑 色 条 ) 或 用 渐 增 浓 度 的 * ** nBT062-SPDB-DM4 ： 55ng/ml( 深 灰 色 条 ； )、 111ng/ml( 灰 色 条 ； )、 221ng/ml( 淡 灰 色 条 ； *** **** ***** )、 442ng/ml( 极淡灰色条 ； )、 885ng/ml( 白色条 ； ) 一起培养。用对照培养基 ( 黑 色条 ) 或用渐增浓度的地塞米松 ： 250nM( 灰色条 ： +)、 500nM( 淡灰色条 ； ++)、 1000nM( 白色 条； +++) 处理图 17D 中的细胞 72h。IL-6 以 1ng/ml 或 10ng/ml 的浓度存在于某些培养物 中 ( 图 17A)。以 10ng/ml 或 50ng/ml 的浓度使用 IGF-1( 图 17B)。这些细胞因子均未诱导 细胞对免疫缀合物的抗性。
     为了分析 BM 微环境对 OPM1 的生长和 OPM1 对免疫缀合物抗性方面的影响， 如上所 述在 BMSC 的存在或不存在下培养细胞。
     在存在或不存在时 BMSC 共培养 OPM1 细胞如图 17 的 (C) 和 (D) 图中所示。在所 有实验中， 通过测定培养最后 8h 期间引入的 [3H]- 胸苷来确定 DNA 合成。OPM1 细胞对 BMSC 的粘着触发了 [3H]- 胸苷摄取增加。重要的是， 免疫缀合物的细胞毒性不受 BMSC 存在的影 响 ( 图 17C)。相反， 作为对照的地塞米松， 不能克服 BMSC 触发的保护性作用 ( 图 17D)。
     nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抑制 MM1 细胞对 BMSC 的粘着
     分析免疫缀合物是否抑制多发性骨髓瘤细胞对 BMSC 的粘着。将仅表达中度 水 平 CD138 且 仅 显 示 对 BT062 的 弱 敏 感 性 的 MM1S 细 胞 ( 图 14A 和 图 15A)， 与或不与 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 或 nBT062-SPP-DM1(885ng/ml) 一起培养 2h。该处理 后， 将 MM1S 细胞与 BMSC 一起再共培养 2 小时。在某些样品中， 在共培养之前还用免疫缀合 物 (885ng/ml) 处理 BMSC 12 小时 ( 基质处理 )。用 PBS 进行 3 次洗涤步骤后， 通过 [3H]- 胸 苷摄取测定粘着细胞。
     图 17E 显示在存在或不存在免疫缀合物时在 96 孔平底板中培养 24 小时的 BMSC。 用 PBS 洗涤 BMSC 3 次。对 BMSC 提供与免疫缀合物一起温育 2 小时的 MM1S 细胞。通过 [3H]- 胸苷摄取测定 DNA 合成。
     如 图 17E 所 示， 与 其 中 仅 处 理 基 质 细 胞 的 样 品 相 比， nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 抑 制 多 发 性 骨 髓 瘤 细 胞 粘 着 至 BMSC( 分 别 为 3.6 倍 和 2.5 倍 )。 nBT062-SMCC-DM1 对 细 胞 粘 着 几 乎 未 显 示 影 响。 该 结 果 表 明， nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 能够干扰 MM 细胞粘着至 BMSC， 且这些免疫缀合物还能够克服细胞粘着介 导的药物抗性 (CAM-DR)。
     nBT062-SPDB-DM4 抑制 SCID 小鼠的人类 MM 异种移植物模型中的肿瘤生长
     在 SCID 小 鼠 的 GFP 阳 性 人 类 MM 异 种 移 植 物 中 确 定 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 的体内活性。
     图 18A 显示对 OPM1GFP 细胞的 GFP 表达的分析。 如该图所示， 建立了 OPM1MM 细胞的 GFP 高度荧光集落 (OPM1 )， 并且检查免疫缀合物在实验动物体内对这些细胞的抗肿瘤活性。 6 GFP 图 18B 中， 用 5×10 OPM1 细胞注射每组 5 只小鼠。用在 100μl RPMI-1640 培养基中的 6 5×10 OPM1GFP 细胞对小鼠皮下接种。当肿瘤建立时， 开始用 nBT062-SPDB-DM4( 正方形 )、 nBT062-SPP-DM1( 三角形 ) 或缓冲对照进行处理。通过连续游标卡尺测定正交直径以确定 肿瘤尺寸。误差条表示标准偏差。注射肿瘤细胞后 14 天， 所有小鼠发育出可测定的肿瘤，然后随机地每周一次接受 nBT062-SPDB-DM4、 nBT062-SPP-DM1 或对照运载剂 (PBS) 的处理。 每隔一天进行连续游标卡尺测定正交直径， 以计算肿瘤体积。用 nBT062-SPDB-DM4( 基于缀 合物的分子量为 176μg/ 小鼠， 每周一次持续 4 周 ) 对携带肿瘤的小鼠的处理， 与用 PBS 载 体处理的对照动物相比， 显著地抑制了 MM 肿瘤生长 (Dunn 多重比较测试 ； 对照运载剂相比 于 nBT062-SPDB-DM4 ： P ＜ 0.01， 图 16B)。
     nBT062-SPP-DM1 缀合物比 nBT062-SPDB-DM4 效力更低低 (Dunn 多重比较测试 ； nBT062-SPP-DM1 相比于 BT062-SPDB-DM4 ： P ＜ 0.05， 图 5B)。 由于肿瘤尺寸较大而必须在处 理开始后第 19 天处死所有对照小鼠。 使用 Kaplan-Meier 曲线和对数秩分析， 对照组的平均 OS 为 13.6 天 (95％置信区间 [CI]， 10 ～ 19 天 )， 使用 nBT062-SPDB-DM4 的处理组为 26 天 (95％置信区间， 23 ～ 42 天 )。从图 18C 可以看出， 与仅用运载剂处理 ( 实线 ； 正常盐水， n ＝ 5) 的对照组相比， nBT062-SPDB-DM4 显著地增加存活 (P ＜ 0.0023， 虚线， n ＝ 5)。杀死 小鼠， 并且切下来自 nBT062-SPDB-DM4 处理的小鼠和缓冲液处理的对照小鼠的肿瘤， 以用 GFP 于 TUNEL 分析。从携带 OPM1 的小鼠切下的肿瘤的离体分析显示， 与对照小鼠相比， BT062 处理的动物中的凋亡显著增加 ( 图 18D)。因此， nBT062-SPDB-DM4 诱导体内凋亡。在该研 究中施用的化合物中都未对体重显示出任何影响。 讨论
     以上， 证明了在体外和在实验动物体内的 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 针对表达 CD138 的 MM 细胞的选择性抗肿瘤活性。使用免疫印迹和免疫荧 光分析， 我们发现大多数所分析的 MM 细胞系表达了 CD138。 然而， DOX40 不表达 CD138 蛋白， 并且 MM1S 和 LR5 细胞显示出对该蛋白的弱表达。剩下的 5 只显示出高水平的 CD138 表达。 免疫缀合物 nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 显示对 MM 细胞系的显 著的细胞毒性， 其中 nBT062-SPDB-DM4 为这三种试剂中最强效的化合物。 表达高水平 CD138 的 OPM1 和 RPMI8226 细胞比 CD138 低表达 MM1s 细胞或 CD138 阴性 Dox40 细胞对免疫缀合物 更敏感。重要的是， 这些试剂对分离自罹患 MM 的患者的肿瘤细胞也具有细胞毒性。重要的 是， 未观察到对于来自健康志愿者的外周单核细胞或骨髓单核细胞的细胞毒性。这些结果 表明， 免疫缀合物具有针对 MM 肿瘤细胞的抗原选择性活性。可以证明， nBT062-SMCC-DM1、 nBT062-SPDB-DM4 和 nBT062-SPP-DM1 通过诱导 G2/M 细胞周期停滞以导致凋亡性细胞死亡， 从而抑制 MM 细胞的细胞增殖。在用免疫缀合物处理的 OPM1 细胞中， 可以检测到半胱天冬 酶 -3、 -8、 -9 和半胱天冬酶 -3 下游的靶标 PARP 的切割断裂。此外， 与这些药物一起温育 24 小时后， APO2.7 抗原阳性细胞增加。
     此前报道了 IL-6 经由 PI3-K/Akt、 MEK/ERK 和 JAK2/STAT3 信号传导级联的激活而 触发多发性骨髓瘤细胞的增殖。已据描述 IGF-1 也使用相同的途径促进多发性骨髓瘤细胞 增殖和存活。IL-6 经由诱导 PI3-K/Akt 信号传导而保护免遭地塞米松诱导的凋亡。检验了 外源性 IL-6 和 IGF-1 是否抑制多发性骨髓瘤细胞中的免疫缀合物诱导的细胞毒性。尽管 在用 IL-6 或 IGF-1 处理的细胞中注意到增殖增加， 但这些细胞因子不能抑制 OPM1 细胞中 的 nBT062-SPDB-DM4 诱导的凋亡， 表明这些试剂能够克服这些细胞因子的保护性作用。重 要的是， 免疫缀合物抑制了粘着至 BMSC 的 MM1S 细胞的生长和粘着， 进一步确认它们能够克 服细胞粘着介导的药物抗性 (CAM-DR)。在实验动物中， nBT062-SPDB-DM4 诱导已经建立的 MM 异种移植物的显著的生长延迟， 而不影响小鼠体重。
     测试的所有缀合物均显示出对 MM 细胞系和对源自患者的 MM 原代细胞具有高的细 胞毒性活性， 而来自健康志愿者的外周血单核细胞对所述缀合物不显示敏感性。
     CD138 特异性免疫缀合物触发 G2/M 细胞周期停滞和诱导靶细胞中的凋亡， 所述凋 亡与半胱天冬酶 -8/-9/ 和 -3 的切割以及半胱天冬酶 -3 下游的靶标 PARP 的切割有关。重 要的是， 白细胞介素 -6、 胰岛素样生长因子 -I 或骨髓基质细胞的存在不会保护 MM 细胞免受 免疫缀合物介导的细胞毒性。
     nBT062-SPDB-DM4 缀合物显著地抑制 MM 肿瘤生长 (p ＜ 0.01) 和延长小鼠的存活。
     应该意识到， 本发明的方法和组合物可以包含各种形式的实施方式， 本文仅公开 了其中一些。对本领域技术人员而言显而易见的是， 存在未背离本发明精神的其它实施方 式。因此， 描述的实施方式是说明性的， 不应解释为限制。
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