提高小麦纹枯病抗性的方法 【技术领域】
本发明涉及一种增加小麦的纹枯病抗性的方法， 属于小麦育种和分子生物学领域。 背景技术
小 麦 纹 枯 病， 又 称 麦 尖 眼 点 病 (Wheat sharp eyespot)， 是由禾谷丝核菌 (Rhizoctonia cerealis Vander hoeven) 和立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani Kuhn) 引 起的一种重要的世界性土传真菌病害， 早在 1934 年国外即有报道。1973 年， 我国也发现此 病。20 世纪 80 年代以来， 随着施肥水平的不断提高， 耕作制度的改变和感病品种的大面积 推广， 纹枯病已成为我国长江流域麦区的主要病害， 并逐渐蔓延到黄淮麦区， 近年来以鲁、 豫、 陕、 苏、 皖等麦区发生较为严重 ( 姚金保， 姚国才， 杨学明， 钱存鸣 . 中国小麦抗纹枯病育 种研究进展 .《江苏农业学报》 ， 2007， 23(3) ： P.248-251)。小麦纹枯病一般病田病株率为 10-20％， 重病田块可达 60-80％以上， 由此造成的产量损失严重， 轻的减产 5-10％， 重的减 产 40％， 甚至颗粒无收， 并且小麦纹枯病发病越早， 损失越重 ( 张会云， 陈荣振， 冯国华， 刘 东涛， 王静， 王晓军， 楼辰军， 张凤 . 中国小麦纹枯病的研究现状与展望 .《麦类作物学报》 ， 2007， 27(6) ： P.1150-1153)。
目前， 我国小麦纹枯病的防治依然以化学防治为主， 化学防治不仅增加农本， 而且 会造成环境污染， 化防的效果还直接受到施药的时期、 天气等诸多环境因素的影响。 培育并 推广小麦纹枯病抗病品种无疑是控制该病害最经济和最有效的途径。 但多年的种质材料鉴 定研究也发现， 在已经筛选的近千份材料中， 没有发现对该病害免疫的小麦品种 ( 系 )， 高 抗的材料也较少。对主要纹枯病抗源的抗性遗传和抗病 QTL( 数量性状位点 ) 分析结果表 明， 小麦纹枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的数量性状， 并且存在复杂的基因互 作 ( 汤颋， 任丽娟， 蔡士宾， 吴纪中， 陆维忠， 陈建民， 马鸿翔 . 小麦 ARz 抗纹枯病的 QTL 定位 研究 . 《麦类作物学报》 ， 2004， 24(4) ： P.11-16 ； 吴纪中， 颜伟， 蔡士宾， 任丽娟， 汤颋 . 小麦纹 枯病抗性的主基因 + 多基因遗传分析 . 《江苏农业学报》 ， 2005， 21(1) ： P.6-11 ； 张小村， 李斯 深， 赵新华， 范玉顶， 李瑞军 . 小麦纹枯病抗性的 QTL 分析和抗病基因的分子标记 . 《植物遗 传资源学报》 ， 2005， 6(3) ： P.276-279 ； 任丽娟， 张旭， 周淼平， 陆维忠， 马鸿翔 . 小麦抗纹枯 病和赤霉病 QTL 定位研究， 麦类作物学报， 2007， 27(3) ： P.416-420)。 由于遗传方式的复杂， 给常规育种带来诸多困难， 如周期性强、 预见性差等， 直接影响了小麦纹枯病抗性改良的进 度。
近年来， 转基因技术由于周期短、 可用的抗性基因多、 针对性强等优点， 已经成为 来自于小麦近缘种中间偃麦草的乙烯反应 提高作物抗病能力的新手段。采用这一方法， 因子 (ERF) 基因已经被导入小麦并获得纹枯病抗性显著提高的转基因小麦植株 (Chen L， Zhang Z-Y， Liang H-X， Du L-P， Xu H-J and Xin Z-Y.Overexpression of TiERF1 enhances resistance to sharp eyespot in transgenic wheat.Journal of Experimental Botany， 2008， 59 ： P.4195-4204)。NPR1 基因 (nonexpressor of pathogenesis-related genes) 是植物普遍存在 的系统获得抗性 (systemic acquired resistance， SAR) 途径中的主要调控基因， 其功能 定位在 SAR 信号转导级联反应中的水杨酸 (salicylic acid， SA) 积累和随后的 SAR 基因 表达之间。研究表明， 拟南芥 AtNPR1 基因编码一个锚蛋白重复序列 ANK(Ankyrin Rpeat Domain) 和一个 BTB/POZ(Broad-Complex， Tramtrack， and Bric-a-brac/Pox virus and Zinc Finger) 结构域， 这两个结构域参与蛋白质之间的相互作用 (Cao H， Glazebrook J， Clarke JD， Volko S and Dong X.The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats， Cell， 1997， 88 ： P.57-63)。在非诱导状态下， AtNPR1 蛋白通过分子间二硫键形成寡聚体， 位于细 胞质内。一旦发生 SAR 诱导， SA 的积累使细胞内还原势增加， NPR1 寡聚体中的二硫键被还 原形成单体， 并通过位于 NPR1 蛋白 C- 末端的核定位序列的作用， 使 NPR1 单体转移到细胞 核内， 进而激活 PR( 如 PR-1， PR-2 等 ) 基因， 最后导致 SAR， 使植物产生广谱抗性。除 SA 途 径外， NPR1 在茉莉酮酸 (Jasmonic acid， JA)、 乙烯 (Ethylene， ET) 等信号传导途径以及不 依赖 SA 但依赖 ET 和 JA 介导 ISR(induced systemic resistance) 中也起着重要作用， 是 调节和平衡不同抗病信号传导途径的关键因子。 研究发现， 过量表达 NPR1 能提高植物对多种病原菌的抗性， (Lin W-C， Lu C-F， Wu J-W， Cheng M-L， Lin Y-M， Yang N-S， Black L， Green SK， Wang J-F and Cheng C-P. Transgenic tomato plants expressing the Arabidopsis NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacterial diseases.Transgenic Res， 2004， 13 ： P.567-581) 将拟南芥 AtNPR1 基因导入番茄发现， 转基因番茄具有广谱抗性， 不仅抗 番茄花叶病毒 (tomato mosaic virus， ToMV)， 而且对其他 8 种重要的热带细菌和真菌病 害也产生很高的抗性。转 NPR1 基因的水稻植株也可以提高对白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.Oryzae) 的抗性 (Chern M， Fitzgerald HA， Canlas PE， Navarre DA and Ronald PC.Overexpression of a Rice NPR1 Homolog Leads to Constitutive Activation of Defense Response and Hypersensitivity to Light.MPMI， 2005， 18(6) ： P.511-520)。
在上述诸多文献中， 并没有涉及采用基因工程方法将拟南芥 NPR1 基因导入普通 小麦， 提高了小麦的纹枯病抗性。
发明内容 本发明目的在于 ： 针对目前小麦纹枯病抗性种质资源贫乏状况， 提供一种采用转 基因方法将抗小麦纹枯病病原菌的拟南芥 NPR1 基因导入感纹枯病的小麦品种， 从而提高 小麦的纹枯病抗性。
本发明目的是这样实现的 ： 一种提高小麦纹枯病抗性的方法， 是通过 PCR 方法由 拟南芥基因组 DNA 克隆出拟南芥 NPR1 基因， 其特征在于 ：
a) 利用一对引物 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 通过 PCR 方法由拟南芥基因组 DNA 克隆出拟南芥 NPR1 基因的克隆片段 SEQ ID NO ： 1， 并构建拟南芥 NPR1 基因的表达载体 ；
b) 通过基因枪法将拟南芥 NPR1 基因的表达载体导入受体小麦幼胚细胞 ； 对所述 的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、 植株再生， 获得转基因待选植株 ；
c) 对转基因待选植株进行分子检测， 获得阳性转基因植株 ；
d) 阳性转基因植株通过自交和 PCR 筛选， 获得 T2 代转基因纯合株系 ；
e) 对 T2 代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选， 获得纹枯病抗性提高的转基 因植株。
在本发明中 ： 构建拟南芥 NPR1 基因的表达载体是指 ： 将上、 下游分别附加限制性 内切酶 SmaI 和 SacI 酶切识别 DNA 序列的克隆片段 SEQ ID NO ： 1 采用 SmaI 和 SacI 酶切 后， 回收 2010bp 片段 ； 以 pAHC25 为基础质粒， 采用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 对 pAHC25 质 粒 DNA 进行酶切， 回收 7.8Kb 左右 DNA 酶切大片段， 以 T4DNA 连接酶与回收的附加 SmaI 和 SacI 酶切位点的 SEQ ID NO ： 1 的 2010bp 片段连接， 转化大肠杆菌， 对抗 100mg/L 氨苄青霉 素的阳性克隆进行扩增并提取质粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质 粒命名为 pAC-NPR1 即为拟南芥 NPR1 基因的表达载体。
在本发明中 ： 对转基因待选植株进行分子检测， 获得阳性转基因植株是指 ： 对待 选植株通过一对引物 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 进行 PCR 筛选获得大小为 745bp 的扩增 片段， 通过另一对引物 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7 进行 PCR 筛选获得大小为 721bp 的扩 增片段， 对所述的两个扩增片段通过电泳图检测， 同时含有拟南芥 NPR1 基因的这两条扩增 片段的植株被确定为阳性转基因植株。
在本发明中 ： 对 T2 代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选是指 ： 在小麦拔节 期对被测后代采用牙签接菌法接种纹枯病致病菌株 R46， 于小麦乳熟期调查纹枯病发病情 况， 计算株系平均病情指数， 根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。
在本发明中 ： 纹枯病发病情况的分级标准是 ：
0级： 无病症 ；
1级： 叶鞘有典型的纹枯病病斑， 但不侵茎 ；
2级： 病菌侵人茎秆， 病斑宽度环茎不超过茎秆周长的 1/2 ；
3级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑环茎宽度在 1/2-3/4 茎秆周长之间 ；
4级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑绕茎秆 3/4 以上， 或茎秆已软腐 ；
5级： 枯孕穗或枯白穗
病情指数按以下公式计算 ：
病情指数＝ [( ∑各级病株数 × 各级代表值 )/( 总株数 × 最高级代表值 )]×100
纹枯病抗性判定标准 ： 病情指数≤ 20 为 “高抗” ； 20 ＜病情指数≤ 50 为 “抗病” ； 50 ＜病情指数≤ 80 为 “感病” ； 80 ＜病情指数≤ 100 为 “高感” 。
本发明的优点在于 ： 与常规的种质培育方法相比， 选取的目的基因对纹枯病病原 菌的生长有抑制作用， 针对性强 ； 由转化植株到纯合的转基因株系时间短并且对受体亲本 的重要农艺性状影响小， 培育的周期短、 减少对重要农艺性状选育所需的人工经验的依赖 性。 附图说明
图 1pAHC25 的示意图 ； 图 2 拟南芥 NPR1 基因的表达载体的示意图 ； 图 3 部分转基因待选植株 NPR1 基因的 PCR 检测的电泳图。具体实施方式
实施例 1 ：
表达载体的构建 ：
(1) 以 GenBank U76707.1 中的拟南芥 NPR1 基因的 mRNA 序列为基础， 设计一对引 物 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3：
上游引物 SEQ ID NO ： 2 为 5’ ACCCGGGATGGACACCACCATTGAT 3’ ；
下游引物 SEQ ID NO ： 3 为 5’ AGAGCTCTCACCGACGATGAGAGA 3’ 。
通过 PCR 方法由拟南芥基因组 DNA 克隆出 NPR1 基因克隆片段 SEQ ID NO ： 1， 该基 因全长 2002bp ：
atggacacca ccattgatgg attcgccgat tcttatgaaa tcagcagcac tagtttcgtc 60
gctaccgata acaccgactc ctctattgtt tatctggccg ccgaacaagt actcaccgga 120
cctgatgtat ctgctctgca attgctctcc aacagcttcg aatccgtctt tgactcgccg 180
gatgatttct acagcgacgc taagcttgtt ctctccgacg gccgggaagt ttctttccac 240
cggtgcgttt tgtcagcgag aagctctttc ttcaagagcg ctttagccgc cgctaagaag 300
gagaaagact ccaacaacac cgccgccgtg aagctcgagc ttaaggagat tgccaaggat 360
tacgaagtcg agaccgccgc cggccggcgg gaattaatta aaaaacaaaa tttatcatca ttatactcaa aagagattat agcttgttaa agaaacatgt tgcttttgaa catattgcaa ataggaatcc tgatactatc ccgcactcat aatgcaagca gagaacaaat tgacgctgct cacaagctgc tcgagcctga tcagaatcct ctcacccact gttttgttac cttcccgcgcgtttcgattc ctaaaggagt tggatttcat ctctctatca ctaaatgatc gaggcactta gcttgctaat tgtcaagtct agagataatt ctcgaatgta agaggatcae tgtgaagacc gaggggatat tctattggaa gatcgcaaaa ttctctcaaa tcctagagat cgatcttgaa aatggagatc ccgtctcact agaagagcat tcatcggact ttgctgtctg tgttcggcagggttgtgact ttctgaatgc gttggaggtt ggtatggatt tttaaacatg ttggacgttg atatgtggta aatgtagata gatagacgta cataaggcac accaatctag gcaacagatc acggtgcttc aaaggtgcaa caagccacta ggccgactat gttcctccct aatagagttg gccgaaatga ggtacgaaga caaagtagac ccttatcaca accttgtttt tgctcgacca6gttttggctt atgtttacag cagcagagtg gcagacgaga attgctgcca cgtggcttgc ctctatttgg ctttcatctt caagatccct ctcacccact tcatcggact ccttatcaca gttttgttac ttgctgtctg accttgtttt tagacaaagt tgttatagag gacacattgg aagcttgtat gaagctattg gatagatgta tggttagtct tgaaaagtca ttgccggaag aagagcttgg tttggaggta cctaaagtaa ttgactcgga tgatattgag ttagtcaagt atgatgcgtg tgctcttcat ttcgctgttg ttttaaaact tgatcttgcc gatgtcaacc atgttgctgc gatgcggaag gagccacaat gtgcatcaga agcaactttg gaaggtagaa tggcggttga atgtaataat atcccggagc gtgtagaaat actagagcaa gaagacaaac cttttgcagt ggcggccgat gaattgaaga cacttgctca acgtcttttt ccaacggaag agggaacatg tgagttcata gtgactagcc gaacatcacc gggtgtaaag atagcacctt taaaagcgct ttctaaaacc ggtatggatt aaaaacaaaa ctaaatgatc tttaaacatg tttatcatca gtggaactcg ggaaacgatt gattatgaac tgtgaggact tgactcaact420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 ggcttgcgga gaagacgaca ctgctgagaa acgactacaa aagaagcaaa ggtacatgga 1860
aatacaagag acactaaaga aggcctttag tgaggacaat ttggaattag gaaattcgtc 1920
cctgacagat tcgacttctt ccacatcgaa atcaaccggt ggaaagaggt ctaaccgtaa 1980
actctctcat cgtcgtcggt ga 2002
与拟南芥 NPR1 基因的 mRNA 序列相比， 含 2 个内含子， 分别位于 NPR1 基因核苷酸 序列的 562-671 位和 1612-1721 位， 克隆片段采用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 酶切后， 回收 2010bp 片段。
(2) 以 pAHC25( 图 1) 为基础质粒， 采用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 对 pAHC25 质粒 DNA 进行酶切， 切除质粒含有的 GUS 基因， 0.8％琼脂糖电泳， 回收 7.8Kb 左右 DNA 酶切大片段。
(3) 将步骤 (1) 和 (2) 回收的片段采用 T4DNA 连接酶 16℃连接过夜 (25ul 反应体 系含 1×T4DNA 连接酶缓冲液， 质粒大片段 0.3pmol， NPR1 基因片段 0.03pmol， 350uT4DNA 连 接酶， 连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞 ( 转化方法参照 《分子克隆实验指南》 第二 版， P55-56 页， 科学出版社， 1992)， 转化后的大肠杆菌 DH5α 细胞悬液涂布含 100mg/L 氨苄 青霉素的平板， 对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒， 采用测序和酶切的方法 验证连接的正确性， 获得的质粒即为 pAC-NPR1 表达载体 ( 见图 2)。 实施例 2
表达载体的转化 ：
以扬麦 12 为受体， 采用基因枪转基因方法将构建的表达载体导入受体小麦幼胚 细胞， 通过愈伤诱导、 植株再生获得转基因待选植株 ( 参照周淼平等， 小麦基因枪法转化技 术的改进， 江苏农业学报， 1999， 15(1) ： 62-64)。
待选植株进行分子检测 ： 对待选植株进行 PCR 筛选， 拟南芥 NPR1 基因的 PCR 检测 分别采用两对引物检测， 一对引物 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 为 5’ GAAGGTAGAACCGCACTC 3’ 和 5’ GTCGAATCTGTCAGGGAC 3’ ， 扩增条件 ： 95℃ 3 分钟 ； 94℃ 1 分钟， 55℃ 45 秒， 72℃ 45 秒， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 5 分钟， 扩增片段大小为 745bp ； 另一对引物 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7 为 5’ CGATTCGGTTGTGACTGTTT3’ 和 5’ CCCTCGGATTCCTATGGTTG 3’ ， 扩增条 件： 95℃ 3 分钟 ； 94℃ 1 分钟， 55℃ 45 秒， 72℃ 45 秒， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 5 分钟。 扩增片段大小为 721bp， 检测电泳图见附图 3。获得整合并表达拟南芥 NPR1 基因的阳性转 基因植株。
在图 3 中，
1 道为 M ： DNA 分子量标准， 条带从上到下分别为 2000bp、 1000bp、 750bp 和 500bp。
在 2-9 道中 ：
CK+ ： 质粒 pAC-NPR1 ；
CK- ： 未转基因扬麦 12 对照 ；
94 和 95 ： 均为转基因扬麦 12 的待选植株。
其中 ： 2-5 道为引物 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 扩增结果 ；
6-9 道为引物 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID № ： 7 扩增结果。
通过自交和进一步 PCR 筛选 ( 重复本实施例的 PCR 筛选 )， 获得 T2 代转基因纯合 株系。
实施例 3
纹枯病抗性筛选 ：
纹枯病致病力菌株 R46， 江苏省农业科学院植物保护研究所提供。
接种方法 ： 采用牙签接菌法 ( 具体鉴定方法参照蔡士宾等， 小麦抗纹枯病种质创 新及 QTL 定位的初步研究， 《中国农业科学》 ， 2006， 39(5) ： P.928-934)。
接种前的准备 ： 将长 1.0cM 左右的牙签水浸 30 分钟后， 铺于烧杯底部， 加入适量 PDA 培养基， 经高温湿热灭菌后， 接种具有较强致病力的纹枯菌菌丝块， 25 ℃恒温培养 30 天， 待菌丝密集布满短牙签表面。
筛选过程
小麦拔节期将经上述方法处理的牙签嵌入到小麦植株贴近地面的基部第 1 ～ 2 叶 鞘之间， 每株系接种 15 个茎秆， 喷雾保湿 7 天。于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况， 计算株 系平均病情指数， 根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。
病情严重度判定标准如下 ： 0级： 无病症 ； 1级： 叶鞘有典型的纹枯病病斑， 但不侵 茎； 2级： 病菌侵人茎秆， 病斑宽度环茎不超过茎秆周长的 1/2 ； 3级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上 病斑环茎宽度在 1/2-3/4 茎秆周长之间 ； 4级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑绕茎秆 3/4 以上， 或茎秆已软腐 ； 5级： 枯孕穗或枯白穗。 病情指数按以下公式计算 ：
病情指数＝ [( ∑各级病株数 × 各级代表值 )/( 总株数 × 最高级代表值 )]×100
纹枯病抗性判定标准 ： 病情指数≤ 20 为 “高抗” ； 20 ＜病情指数≤ 50 为 “抗病” ； 50 ＜病情指数≤ 80 为 “感病” ； 80 ＜病情指数≤ 100 为 “高感” 。
纹枯病抗性鉴定结果见表 1， ， 在表 1 中， NPR-3、 NPR-5、 NPR-6、 NPR-7、 NPR-11、 NPR-16、 NPR-19、 NPR-26、 NPR-31、 NPR-35、 NPR-36、 NPR-37 为导入拟南芥 NPR1 基因的 12 个 T2 代纯合株系。受体对照亲本扬麦 12 的病情指数为 56.4， 属感病类型， 12 个导入拟南芥 NPR1 基因的 T2 代纯合株系的平均病情指数在 28.2-48.2 之间， 都属于抗病类型， 表明由于 拟南芥 NPR1 基因的导入， 使转基因植株的纹枯病抗性得到提高。
表 1 扬麦 12 转基因 T2 代纯合株系的纹枯病抗性鉴定结果
本发明涉及一种增加小麦的纹枯病抗性的方法， 属于小麦育种和分子生物学领域。 背景技术
小 麦 纹 枯 病， 又 称 麦 尖 眼 点 病 (Wheat sharp eyespot)， 是由禾谷丝核菌 (Rhizoctonia cerealis Vander hoeven) 和立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani Kuhn) 引 起的一种重要的世界性土传真菌病害， 早在 1934 年国外即有报道。1973 年， 我国也发现此 病。20 世纪 80 年代以来， 随着施肥水平的不断提高， 耕作制度的改变和感病品种的大面积 推广， 纹枯病已成为我国长江流域麦区的主要病害， 并逐渐蔓延到黄淮麦区， 近年来以鲁、 豫、 陕、 苏、 皖等麦区发生较为严重 ( 姚金保， 姚国才， 杨学明， 钱存鸣 . 中国小麦抗纹枯病育 种研究进展 .《江苏农业学报》 ， 2007， 23(3) ： P.248-251)。小麦纹枯病一般病田病株率为 10-20％， 重病田块可达 60-80％以上， 由此造成的产量损失严重， 轻的减产 5-10％， 重的减 产 40％， 甚至颗粒无收， 并且小麦纹枯病发病越早， 损失越重 ( 张会云， 陈荣振， 冯国华， 刘 东涛， 王静， 王晓军， 楼辰军， 张凤 . 中国小麦纹枯病的研究现状与展望 .《麦类作物学报》 ， 2007， 27(6) ： P.1150-1153)。
目前， 我国小麦纹枯病的防治依然以化学防治为主， 化学防治不仅增加农本， 而且 会造成环境污染， 化防的效果还直接受到施药的时期、 天气等诸多环境因素的影响。 培育并 推广小麦纹枯病抗病品种无疑是控制该病害最经济和最有效的途径。 但多年的种质材料鉴 定研究也发现， 在已经筛选的近千份材料中， 没有发现对该病害免疫的小麦品种 ( 系 )， 高 抗的材料也较少。对主要纹枯病抗源的抗性遗传和抗病 QTL( 数量性状位点 ) 分析结果表 明， 小麦纹枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的数量性状， 并且存在复杂的基因互 作 ( 汤颋， 任丽娟， 蔡士宾， 吴纪中， 陆维忠， 陈建民， 马鸿翔 . 小麦 ARz 抗纹枯病的 QTL 定位 研究 . 《麦类作物学报》 ， 2004， 24(4) ： P.11-16 ； 吴纪中， 颜伟， 蔡士宾， 任丽娟， 汤颋 . 小麦纹 枯病抗性的主基因 + 多基因遗传分析 . 《江苏农业学报》 ， 2005， 21(1) ： P.6-11 ； 张小村， 李斯 深， 赵新华， 范玉顶， 李瑞军 . 小麦纹枯病抗性的 QTL 分析和抗病基因的分子标记 . 《植物遗 传资源学报》 ， 2005， 6(3) ： P.276-279 ； 任丽娟， 张旭， 周淼平， 陆维忠， 马鸿翔 . 小麦抗纹枯 病和赤霉病 QTL 定位研究， 麦类作物学报， 2007， 27(3) ： P.416-420)。 由于遗传方式的复杂， 给常规育种带来诸多困难， 如周期性强、 预见性差等， 直接影响了小麦纹枯病抗性改良的进 度。
近年来， 转基因技术由于周期短、 可用的抗性基因多、 针对性强等优点， 已经成为 来自于小麦近缘种中间偃麦草的乙烯反应 提高作物抗病能力的新手段。采用这一方法， 因子 (ERF) 基因已经被导入小麦并获得纹枯病抗性显著提高的转基因小麦植株 (Chen L， Zhang Z-Y， Liang H-X， Du L-P， Xu H-J and Xin Z-Y.Overexpression of TiERF1 enhances resistance to sharp eyespot in transgenic wheat.Journal of Experimental Botany， 2008， 59 ： P.4195-4204)。NPR1 基因 (nonexpressor of pathogenesis-related genes) 是植物普遍存在 的系统获得抗性 (systemic acquired resistance， SAR) 途径中的主要调控基因， 其功能 定位在 SAR 信号转导级联反应中的水杨酸 (salicylic acid， SA) 积累和随后的 SAR 基因 表达之间。研究表明， 拟南芥 AtNPR1 基因编码一个锚蛋白重复序列 ANK(Ankyrin Rpeat Domain) 和一个 BTB/POZ(Broad-Complex， Tramtrack， and Bric-a-brac/Pox virus and Zinc Finger) 结构域， 这两个结构域参与蛋白质之间的相互作用 (Cao H， Glazebrook J， Clarke JD， Volko S and Dong X.The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats， Cell， 1997， 88 ： P.57-63)。在非诱导状态下， AtNPR1 蛋白通过分子间二硫键形成寡聚体， 位于细 胞质内。一旦发生 SAR 诱导， SA 的积累使细胞内还原势增加， NPR1 寡聚体中的二硫键被还 原形成单体， 并通过位于 NPR1 蛋白 C- 末端的核定位序列的作用， 使 NPR1 单体转移到细胞 核内， 进而激活 PR( 如 PR-1， PR-2 等 ) 基因， 最后导致 SAR， 使植物产生广谱抗性。除 SA 途 径外， NPR1 在茉莉酮酸 (Jasmonic acid， JA)、 乙烯 (Ethylene， ET) 等信号传导途径以及不 依赖 SA 但依赖 ET 和 JA 介导 ISR(induced systemic resistance) 中也起着重要作用， 是 调节和平衡不同抗病信号传导途径的关键因子。 研究发现， 过量表达 NPR1 能提高植物对多种病原菌的抗性， (Lin W-C， Lu C-F， Wu J-W， Cheng M-L， Lin Y-M， Yang N-S， Black L， Green SK， Wang J-F and Cheng C-P. Transgenic tomato plants expressing the Arabidopsis NPR1 gene display enhanced resistance to a spectrum of fungal and bacterial diseases.Transgenic Res， 2004， 13 ： P.567-581) 将拟南芥 AtNPR1 基因导入番茄发现， 转基因番茄具有广谱抗性， 不仅抗 番茄花叶病毒 (tomato mosaic virus， ToMV)， 而且对其他 8 种重要的热带细菌和真菌病 害也产生很高的抗性。转 NPR1 基因的水稻植株也可以提高对白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.Oryzae) 的抗性 (Chern M， Fitzgerald HA， Canlas PE， Navarre DA and Ronald PC.Overexpression of a Rice NPR1 Homolog Leads to Constitutive Activation of Defense Response and Hypersensitivity to Light.MPMI， 2005， 18(6) ： P.511-520)。
在上述诸多文献中， 并没有涉及采用基因工程方法将拟南芥 NPR1 基因导入普通 小麦， 提高了小麦的纹枯病抗性。
发明内容 本发明目的在于 ： 针对目前小麦纹枯病抗性种质资源贫乏状况， 提供一种采用转 基因方法将抗小麦纹枯病病原菌的拟南芥 NPR1 基因导入感纹枯病的小麦品种， 从而提高 小麦的纹枯病抗性。
本发明目的是这样实现的 ： 一种提高小麦纹枯病抗性的方法， 是通过 PCR 方法由 拟南芥基因组 DNA 克隆出拟南芥 NPR1 基因， 其特征在于 ：
a) 利用一对引物 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 通过 PCR 方法由拟南芥基因组 DNA 克隆出拟南芥 NPR1 基因的克隆片段 SEQ ID NO ： 1， 并构建拟南芥 NPR1 基因的表达载体 ；
b) 通过基因枪法将拟南芥 NPR1 基因的表达载体导入受体小麦幼胚细胞 ； 对所述 的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、 植株再生， 获得转基因待选植株 ；
c) 对转基因待选植株进行分子检测， 获得阳性转基因植株 ；
d) 阳性转基因植株通过自交和 PCR 筛选， 获得 T2 代转基因纯合株系 ；
e) 对 T2 代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选， 获得纹枯病抗性提高的转基 因植株。
在本发明中 ： 构建拟南芥 NPR1 基因的表达载体是指 ： 将上、 下游分别附加限制性 内切酶 SmaI 和 SacI 酶切识别 DNA 序列的克隆片段 SEQ ID NO ： 1 采用 SmaI 和 SacI 酶切 后， 回收 2010bp 片段 ； 以 pAHC25 为基础质粒， 采用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 对 pAHC25 质 粒 DNA 进行酶切， 回收 7.8Kb 左右 DNA 酶切大片段， 以 T4DNA 连接酶与回收的附加 SmaI 和 SacI 酶切位点的 SEQ ID NO ： 1 的 2010bp 片段连接， 转化大肠杆菌， 对抗 100mg/L 氨苄青霉 素的阳性克隆进行扩增并提取质粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质 粒命名为 pAC-NPR1 即为拟南芥 NPR1 基因的表达载体。
在本发明中 ： 对转基因待选植株进行分子检测， 获得阳性转基因植株是指 ： 对待 选植株通过一对引物 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 进行 PCR 筛选获得大小为 745bp 的扩增 片段， 通过另一对引物 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7 进行 PCR 筛选获得大小为 721bp 的扩 增片段， 对所述的两个扩增片段通过电泳图检测， 同时含有拟南芥 NPR1 基因的这两条扩增 片段的植株被确定为阳性转基因植株。
在本发明中 ： 对 T2 代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选是指 ： 在小麦拔节 期对被测后代采用牙签接菌法接种纹枯病致病菌株 R46， 于小麦乳熟期调查纹枯病发病情 况， 计算株系平均病情指数， 根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。
在本发明中 ： 纹枯病发病情况的分级标准是 ：
0级： 无病症 ；
1级： 叶鞘有典型的纹枯病病斑， 但不侵茎 ；
2级： 病菌侵人茎秆， 病斑宽度环茎不超过茎秆周长的 1/2 ；
3级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑环茎宽度在 1/2-3/4 茎秆周长之间 ；
4级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑绕茎秆 3/4 以上， 或茎秆已软腐 ；
5级： 枯孕穗或枯白穗
病情指数按以下公式计算 ：
病情指数＝ [( ∑各级病株数 × 各级代表值 )/( 总株数 × 最高级代表值 )]×100
纹枯病抗性判定标准 ： 病情指数≤ 20 为 “高抗” ； 20 ＜病情指数≤ 50 为 “抗病” ； 50 ＜病情指数≤ 80 为 “感病” ； 80 ＜病情指数≤ 100 为 “高感” 。
本发明的优点在于 ： 与常规的种质培育方法相比， 选取的目的基因对纹枯病病原 菌的生长有抑制作用， 针对性强 ； 由转化植株到纯合的转基因株系时间短并且对受体亲本 的重要农艺性状影响小， 培育的周期短、 减少对重要农艺性状选育所需的人工经验的依赖 性。 附图说明
图 1pAHC25 的示意图 ； 图 2 拟南芥 NPR1 基因的表达载体的示意图 ； 图 3 部分转基因待选植株 NPR1 基因的 PCR 检测的电泳图。具体实施方式
实施例 1 ：
表达载体的构建 ：
(1) 以 GenBank U76707.1 中的拟南芥 NPR1 基因的 mRNA 序列为基础， 设计一对引 物 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3：
上游引物 SEQ ID NO ： 2 为 5’ ACCCGGGATGGACACCACCATTGAT 3’ ；
下游引物 SEQ ID NO ： 3 为 5’ AGAGCTCTCACCGACGATGAGAGA 3’ 。
通过 PCR 方法由拟南芥基因组 DNA 克隆出 NPR1 基因克隆片段 SEQ ID NO ： 1， 该基 因全长 2002bp ：
atggacacca ccattgatgg attcgccgat tcttatgaaa tcagcagcac tagtttcgtc 60
gctaccgata acaccgactc ctctattgtt tatctggccg ccgaacaagt actcaccgga 120
cctgatgtat ctgctctgca attgctctcc aacagcttcg aatccgtctt tgactcgccg 180
gatgatttct acagcgacgc taagcttgtt ctctccgacg gccgggaagt ttctttccac 240
cggtgcgttt tgtcagcgag aagctctttc ttcaagagcg ctttagccgc cgctaagaag 300
gagaaagact ccaacaacac cgccgccgtg aagctcgagc ttaaggagat tgccaaggat 360
tacgaagtcg agaccgccgc cggccggcgg gaattaatta aaaaacaaaa tttatcatca ttatactcaa aagagattat agcttgttaa agaaacatgt tgcttttgaa catattgcaa ataggaatcc tgatactatc ccgcactcat aatgcaagca gagaacaaat tgacgctgct cacaagctgc tcgagcctga tcagaatcct ctcacccact gttttgttac cttcccgcgcgtttcgattc ctaaaggagt tggatttcat ctctctatca ctaaatgatc gaggcactta gcttgctaat tgtcaagtct agagataatt ctcgaatgta agaggatcae tgtgaagacc gaggggatat tctattggaa gatcgcaaaa ttctctcaaa tcctagagat cgatcttgaa aatggagatc ccgtctcact agaagagcat tcatcggact ttgctgtctg tgttcggcagggttgtgact ttctgaatgc gttggaggtt ggtatggatt tttaaacatg ttggacgttg atatgtggta aatgtagata gatagacgta cataaggcac accaatctag gcaacagatc acggtgcttc aaaggtgcaa caagccacta ggccgactat gttcctccct aatagagttg gccgaaatga ggtacgaaga caaagtagac ccttatcaca accttgtttt tgctcgacca6gttttggctt atgtttacag cagcagagtg gcagacgaga attgctgcca cgtggcttgc ctctatttgg ctttcatctt caagatccct ctcacccact tcatcggact ccttatcaca gttttgttac ttgctgtctg accttgtttt tagacaaagt tgttatagag gacacattgg aagcttgtat gaagctattg gatagatgta tggttagtct tgaaaagtca ttgccggaag aagagcttgg tttggaggta cctaaagtaa ttgactcgga tgatattgag ttagtcaagt atgatgcgtg tgctcttcat ttcgctgttg ttttaaaact tgatcttgcc gatgtcaacc atgttgctgc gatgcggaag gagccacaat gtgcatcaga agcaactttg gaaggtagaa tggcggttga atgtaataat atcccggagc gtgtagaaat actagagcaa gaagacaaac cttttgcagt ggcggccgat gaattgaaga cacttgctca acgtcttttt ccaacggaag agggaacatg tgagttcata gtgactagcc gaacatcacc gggtgtaaag atagcacctt taaaagcgct ttctaaaacc ggtatggatt aaaaacaaaa ctaaatgatc tttaaacatg tttatcatca gtggaactcg ggaaacgatt gattatgaac tgtgaggact tgactcaact420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 ggcttgcgga gaagacgaca ctgctgagaa acgactacaa aagaagcaaa ggtacatgga 1860
aatacaagag acactaaaga aggcctttag tgaggacaat ttggaattag gaaattcgtc 1920
cctgacagat tcgacttctt ccacatcgaa atcaaccggt ggaaagaggt ctaaccgtaa 1980
actctctcat cgtcgtcggt ga 2002
与拟南芥 NPR1 基因的 mRNA 序列相比， 含 2 个内含子， 分别位于 NPR1 基因核苷酸 序列的 562-671 位和 1612-1721 位， 克隆片段采用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 酶切后， 回收 2010bp 片段。
(2) 以 pAHC25( 图 1) 为基础质粒， 采用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 对 pAHC25 质粒 DNA 进行酶切， 切除质粒含有的 GUS 基因， 0.8％琼脂糖电泳， 回收 7.8Kb 左右 DNA 酶切大片段。
(3) 将步骤 (1) 和 (2) 回收的片段采用 T4DNA 连接酶 16℃连接过夜 (25ul 反应体 系含 1×T4DNA 连接酶缓冲液， 质粒大片段 0.3pmol， NPR1 基因片段 0.03pmol， 350uT4DNA 连 接酶， 连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞 ( 转化方法参照 《分子克隆实验指南》 第二 版， P55-56 页， 科学出版社， 1992)， 转化后的大肠杆菌 DH5α 细胞悬液涂布含 100mg/L 氨苄 青霉素的平板， 对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒， 采用测序和酶切的方法 验证连接的正确性， 获得的质粒即为 pAC-NPR1 表达载体 ( 见图 2)。 实施例 2
表达载体的转化 ：
以扬麦 12 为受体， 采用基因枪转基因方法将构建的表达载体导入受体小麦幼胚 细胞， 通过愈伤诱导、 植株再生获得转基因待选植株 ( 参照周淼平等， 小麦基因枪法转化技 术的改进， 江苏农业学报， 1999， 15(1) ： 62-64)。
待选植株进行分子检测 ： 对待选植株进行 PCR 筛选， 拟南芥 NPR1 基因的 PCR 检测 分别采用两对引物检测， 一对引物 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 为 5’ GAAGGTAGAACCGCACTC 3’ 和 5’ GTCGAATCTGTCAGGGAC 3’ ， 扩增条件 ： 95℃ 3 分钟 ； 94℃ 1 分钟， 55℃ 45 秒， 72℃ 45 秒， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 5 分钟， 扩增片段大小为 745bp ； 另一对引物 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID NO ： 7 为 5’ CGATTCGGTTGTGACTGTTT3’ 和 5’ CCCTCGGATTCCTATGGTTG 3’ ， 扩增条 件： 95℃ 3 分钟 ； 94℃ 1 分钟， 55℃ 45 秒， 72℃ 45 秒， 共 30 个循环 ； 最后 72℃延伸 5 分钟。 扩增片段大小为 721bp， 检测电泳图见附图 3。获得整合并表达拟南芥 NPR1 基因的阳性转 基因植株。
在图 3 中，
1 道为 M ： DNA 分子量标准， 条带从上到下分别为 2000bp、 1000bp、 750bp 和 500bp。
在 2-9 道中 ：
CK+ ： 质粒 pAC-NPR1 ；
CK- ： 未转基因扬麦 12 对照 ；
94 和 95 ： 均为转基因扬麦 12 的待选植株。
其中 ： 2-5 道为引物 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 扩增结果 ；
6-9 道为引物 SEQ ID NO ： 6 和 SEQ ID № ： 7 扩增结果。
通过自交和进一步 PCR 筛选 ( 重复本实施例的 PCR 筛选 )， 获得 T2 代转基因纯合 株系。
实施例 3
纹枯病抗性筛选 ：
纹枯病致病力菌株 R46， 江苏省农业科学院植物保护研究所提供。
接种方法 ： 采用牙签接菌法 ( 具体鉴定方法参照蔡士宾等， 小麦抗纹枯病种质创 新及 QTL 定位的初步研究， 《中国农业科学》 ， 2006， 39(5) ： P.928-934)。
接种前的准备 ： 将长 1.0cM 左右的牙签水浸 30 分钟后， 铺于烧杯底部， 加入适量 PDA 培养基， 经高温湿热灭菌后， 接种具有较强致病力的纹枯菌菌丝块， 25 ℃恒温培养 30 天， 待菌丝密集布满短牙签表面。
筛选过程
小麦拔节期将经上述方法处理的牙签嵌入到小麦植株贴近地面的基部第 1 ～ 2 叶 鞘之间， 每株系接种 15 个茎秆， 喷雾保湿 7 天。于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况， 计算株 系平均病情指数， 根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。
病情严重度判定标准如下 ： 0级： 无病症 ； 1级： 叶鞘有典型的纹枯病病斑， 但不侵 茎； 2级： 病菌侵人茎秆， 病斑宽度环茎不超过茎秆周长的 1/2 ； 3级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上 病斑环茎宽度在 1/2-3/4 茎秆周长之间 ； 4级： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑绕茎秆 3/4 以上， 或茎秆已软腐 ； 5级： 枯孕穗或枯白穗。 病情指数按以下公式计算 ：
病情指数＝ [( ∑各级病株数 × 各级代表值 )/( 总株数 × 最高级代表值 )]×100
纹枯病抗性判定标准 ： 病情指数≤ 20 为 “高抗” ； 20 ＜病情指数≤ 50 为 “抗病” ； 50 ＜病情指数≤ 80 为 “感病” ； 80 ＜病情指数≤ 100 为 “高感” 。
纹枯病抗性鉴定结果见表 1， ， 在表 1 中， NPR-3、 NPR-5、 NPR-6、 NPR-7、 NPR-11、 NPR-16、 NPR-19、 NPR-26、 NPR-31、 NPR-35、 NPR-36、 NPR-37 为导入拟南芥 NPR1 基因的 12 个 T2 代纯合株系。受体对照亲本扬麦 12 的病情指数为 56.4， 属感病类型， 12 个导入拟南芥 NPR1 基因的 T2 代纯合株系的平均病情指数在 28.2-48.2 之间， 都属于抗病类型， 表明由于 拟南芥 NPR1 基因的导入， 使转基因植株的纹枯病抗性得到提高。
表 1 扬麦 12 转基因 T2 代纯合株系的纹枯病抗性鉴定结果
以上各实施例不是对本发明的具体限制。8101942452 A CN 101942457
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