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一种人鼠同源性 NMDA 受体 NR2B 的小 RNA 及其应用
    技术领域 本发明属于生物基因领域， 涉及小 RNA 干扰及其应用， 具体涉及抑制人及大鼠的 NMDA 受体 NR2B 表达的小 RNA 及其在制备治疗慢性疼痛药物中的应用。
     背景技术 慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一， 其生理学特点是痛觉的反应性增 高， 主要表现为痛觉过敏 (hyperalgesia) 和超敏反应 (allodynia)。 此类疼痛治疗困难， 主 要是由于其机制不明。 目前在治疗上， 主要是以吗啡为代表的阿片类受体阻滞剂， 但存在众 多的副作用以及成瘾、 耐受等反应， 从而限制了其长期使用。 因此， 亟需一种治疗效果良好、 作用时间长、 副作用轻的新方法， 达到长期、 有效控制慢性疼痛的目的。
     作 为 在 易 化 疼 痛 通 路 中 的 关 键 分 子， N- 甲 基 -D- 天 门 冬 氨 酸 受 体 (N-methyl-D-aspartate receptors， NMDA) 受体在慢性疼痛起重要作用， 它是一种配体门 控型阳离子通道， 为兴奋性氨基酸受体的一种。NMDA 受体由 NR1、 NR2(A、 B、 C 及 D) 和 NR3(A 及 B) 亚单位所组成， 研究表明有功能的 NMDA 受体通道， 需要基本亚单位 NR1( 形成通道的 主要亚单位 ) 及至少一个 NR2 亚单位。其中 R1 亚基是构成神经元突触后膜上离子通道的 主要成分， R2 亚基可能对 R1 亚基的功能起着一定调控作用。( 参见 ： Kalia LV， Kalia SK， Salter MW.NMDA receptors in clinical neurology ： excitatory times ahead.Lancet Neurol， 2008， 7(8) ： 742-55.) 具有 NR2B 亚基的 NMDA 受体具有如下功能 ： ①受体离子通道 2+ 具有高 Ca 的选择通透性和温度敏感性 ； ②受体介导一种缓慢兴奋效应， 能够执行长时程 突触可塑性、 长时程增强和长时程抑制等复杂的生理机制 ； ③细胞外液中的 Mg2+ 电压依赖 性地阻断受体离子通道的开放。 新近研究表明， NMDA 受体的 NR2B 亚基对 NMDA 受体药理和功 能特性起决定作用， 广泛参与学习记忆、 痛觉感知、 中枢敏化等的形成， 是一个治疗与 NMDA 受体相关疾病的潜在靶点。( 参见 ： 付艳， 江剑平， 余望 .NMDA 受体 NR2B 亚基作为镇痛靶点 的研究进展 . 青海师范大学学报， 2008， (2) ： 66-71.)
     NMDA 受体在疼痛的发生、 发展和维持中发挥重要作用。研究表明， 在神经病理条 2+ 2+ 件下， NMDA 受体过度兴奋， Ca 大量内流， 导致细胞内 Ca 超载， 从而产生一系列生化级联 反应， 包括激活蛋白酶， 促进兴奋性氨基酸释放， 激活突触后 NMDA 受体操纵的 Ca2+ 通道， 激 活星形胶质细胞合成释放大量神经递质和促炎性细胞因子。这些都造成癌痛的神经高兴 奋状态。近年来， 对 NMDA 受体的研究主要关注于 NR2B 亚单位。在脊髓上， NR2B 的表达密 度最高， 主要分布在脊髓背角 I、 II 层和第 X 层中央管周围。进一步研究发现， 脊髓背角 I 层 NR2B 选择性分布在突触前膜而不是后膜， 提示可能参与调控天冬氨酸、 谷氨酸和 P 物质 2+ 单纯上调 NR2B 即可导致异 等神经递质的释放， 增加 Ca 流入突触终端。Fan J 等的发现， 常痛的发生。各种不同 NR2B 的选择性阻断剂都可抑制不同疼痛模型动物及人体的痛觉过 敏反应。ZHANG， RX 等发现在骨癌痛中 NMDA 受体上调， IL-1 可易化 NMDA 受体的磷酸化， 引起痛觉过敏反应。( 参见 ： Zhang RX， Liu B， Li A， Wang L， Ren K， Qiao JT， Berman BM， Lao L.Interleukin 1beta facilitates bone cancer pain in rats by enhancing NMDA
     receptorNR-1subunit phosphorylation.Neuroscience， 2008， 154(4) ： 1533-8) 研究表明， NMDA 受体阻断剂如 MK801、 Ketamine 等可具有抑制疼痛的作用。( 参见 ： SaitoO， Aoe T， Kozikowski A， Sarva J， Neale JH， Yamamoto T.Ketamine andN-acetylaspartylglutamate peptidase inhibitor exert analgesia in bone cancer pain.Can J Anaesth， 2006， 53(9) ： 891-8.)NMDA 受体阻断剂通过抑制受体活性， 减弱兴奋性突触后电流， 抑制谷氨酸 2+ 受体介导的兴奋性突触传递， 减少 Ca 内流， 抑制胞内钙超载， 从而使 NOS 活性降低， NO 生成 减少 ； 抑制神经递质和促炎性细胞因子的释放， 达到镇痛和神经保护作用。因此， 采用 RNA 干扰技术抑制 NMDA 受体 NR2B 可达到治疗慢性疼痛的目的。
     RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是指当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源 的双链 RNA 时， 该 mRNA 发生降解而导致基因沉默的现象， 是生物体内抑制特定基因表达的 一种现象。 外源导入或者由转基因、 病毒感染等各种方式引入的双链 RNA 将被 RNase III 家 族中的一个能够特异性识别双链 RNA 的酶 Dicer， 以 ATP 依赖的方式逐步切割为 19 ～ 23nt 的小分子干扰 RNA 片段 (smallinterfering RNAs， siRNA)。siRNA 双链在 RISC 作用下双链 解开， 同源的靶目标 RNA 结合， 在核酸内切酶的作用下， 将靶目标 mRNA 切断， 从而阻断了基 因表达。RNA 干扰是目前最有效的基因 “沉默” 技术， 从理论上讲， 在疼痛通路中兴奋性增高 的基因都可能成为 RNA 干扰靶位， 从而降低其兴奋性， 达到治疗目的。但是， 干扰效率高， 特 异性强的小 RNA 的获得较难， 不同序列的差异即可导致有效性的丧失， 从而影响其药理学 的价值。 发明内容 本发明的目的在于提供一种人鼠同源性 NMDA 受体 NR2B 的小 RNA， 以及它在制备治 疗慢性疼痛药物中的应用。
     我们经过筛选， 获得人及大鼠同源性的 NMDA 小 RNA， 可同时对人及大鼠的 NMDA mRNA 进行降解， 从而抑制人及大鼠的 NMDA 蛋白的表达， 通过抑制细胞凋亡减轻疼痛， 可以 成为治疗慢性疼痛的一种新的药物。
     具体技术方案是 ： 人 NMDA 受体 NR2B 序列 (NM_000834) 及大鼠 NMDA 受体 NR2B 序 列 (NM_012574) 由 Gene bank 获得， 先对两者在 Pubmed 上进行序列的比对 (Blast)， 取得序 列完全相同的片段 (Identities ＝ 91％ )， 再将其相同序列中的开放读框部分输入 http:// i.cs.hku.hk/ ～ sirna/software/sima.php 网站所提供的 RNAi 设计软件进行在线筛选， 而 后选择 GC 比在 40％ -60％之间的， 逐个做 Blast 分析和 SNP 分析， 选中位于开放读框内的 3 个不同的序列， 如下 ：
     1.GGGGTTCTGTATTGACATC
     2.CAACTCCGTACCTGTGCAG
     3.GTCGCTCTACCCTGACCGG
     其对应的 RNA 序列为 ：
     1.GGGGUUCUGUAUUGACAUC (siRNA1-NMDA)
     2.CAACUCCGUACCUGUGCAG (siRNA2-NMDA)
     3.GUCGCUCUACCCUGACCGG (siRNA3-NMDA)
     我们将构建含人 NMDA 受体 NR2B 基因的 pEGFPC1 报告质粒， 用脂质体方法将上述
     序列对应的 RNA 和 pEGFPC1-hNMDA 共转染 293 细胞， 进行 RNA 干扰效率的检测， 进而筛选出 RNA 干扰效率最高的序列为 ： CAACUCCGUACCUGUGCAG。
     本发明提供了一种人鼠同源性 NMDA 受体 CAACTCCGTACCTGTGCAG 的小 RNA， 其序列 是 CAACUCCGUACCUGUGCAG( 如 SEQ ID NO ： 1 所示 )。
     本发明还提供了上述人鼠同源性的 NMDA 受体 NR2B 的小 RNA 在制备治疗慢性疼痛 药物中的应用。
     本发明通过含 NMDA 基因的 pEGFPC1 报告质粒对进行 RNA 干扰效率进行检测， 得到 干扰效率最高小 RNA ； 又通过小 RNA 作用于人神经细胞 HN， 发现小 RNA 具有良好的抑制谷氨 酸诱导的 NMDA 受体 NR2B 的上调 ； 又通过 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 蛛网膜下腔注射， 发现对神 经病理性疼痛大鼠的痛觉过敏具有抑制作用。本发明的工作原理 ： NMDA 受体 NR2B 在疼痛 的发生、 发展和维持中发挥重要作用， 在慢性疼痛中表达大量增加， 可易化痛觉过敏， 因此 下调脊髓 NMDA 受体 NR2B 表达具有抑制慢性疼痛的作用。RNA 干扰技术可降解 mRNA 从而抑 制蛋白的表达， 那么， 采用该技术抑制 NMDA 受体 NR2B 的表达就可达到治疗疼痛的目的。
     本发明的应用可采用小 RNA 经蛛网膜下腔的直接注射的方式， 可达到治疗慢性疼 痛的目的， 且给药途径方便， 效果良好。 同时， 由于本发明不是传统的阿片类受体阻滞剂， 不 存在成瘾、 耐受等反应， 可长期使用。 附图说明
     图 1 是荧光显示小 RNA 的干扰效率
     其中 A.Positive Control ； B.siRNA1-NMDA ； C.siRNA2-NMDA ； D.siRNA3-NMDA。
     图 2 是实时定量 PCR 检测人神经细胞 NMDA 受体 mRNA 的表达。
     图 3 是 western blotting 检测人神经细胞 NMDA 受体蛋白的表达。
     图 4 是 CCI 大鼠机械痛阈及热痛阈的变化
     其中 ： A 为机械痛阈的变化 ； B 为热痛阈的变化。
     图 5 是 CCI 大鼠脊髓 NMDA 受体 mRNA 表达的变化。 具体实施方式
     下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述， 但本发明的实施不仅限于此。
     实施例 1 ： 人鼠同源性的 NMDA 的小 RNA 序列的筛选过程
     一、 含人 NMDA 受体 NR2B 基因的 pEGFPC1 报告质粒的构建及鉴定据人 NMDA 受体 NR2B 序列， 设计引物 ：
     5’ -CGGAGCGAAGCCCAGAGCGGAGTGCTGTT-3’ ； ( 如 SEQ ID NO ： 2 所示 )
     5’ -CGCGTCGAC CAGGATCCCATAAATAAATT-3’ 。( 如 SEQ ID NO ： 3 所示 )
     引物两端分别含 Sac I 和 Sal I 酶切位点。 采用 RT-PCR， 获取含有干扰靶序列的人 NMDA 受体 NR2B 序列表达框内的部分序列。 将此片段与 pEGFPC1 质粒 ( 购自美国 Invitrogen 公司 ) 分别用 Sac I 和 Sal I 酶切， 而后用 T4DNA 连接酶 16℃过夜连接成 pEGFPC1-hNMDA。 转化 E.coli.DH5α 感受态细胞， 挑克隆抽提质粒 DNA， 进行 PCR 扩增出正确的条带后进一步 测序鉴定。
     1、 PCR 鉴定体系 ：cDNA 上游引物 下游引物 dNTPs(2.5mmol/L) MgCl2(25mmol/L) Taq DNA 聚合酶 (5u/μl) 10×Taq 缓冲液 ddH2O2.5μl 1μl 1μl 2μl 2μl 0.5μl 2.5μl 16μlTotal 25μl
     94℃ 5min 解链 ； 94℃ 50s， 55℃ 50s， 72℃ 90s 共 30 个循环 ； 72℃ 10min 延伸。 取 5μl， 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。用 QIAgen 公司的 PCR 回收试剂盒回收， 进行下 一步 Sac I 酶切。
     2、 PCR 产物 Sac I 酶切
     PCR 产物 22.5μl
     Sac I Buffer1 BSA ddH2O1.5μl 3μl 3μl 0μlTotal 30μl
     混匀后， 短暂离心， 37℃温育 6 小时。1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 Gel Extraction 试剂盒回收， 产物溶解于 30μl ddH2O 中， 进行下一步 Sal I 酶切。
     3、 PCR 产物 Sal I 酶切
     PCR 产物 (Sac I 酶切 22.5μl
     后)
     Sal I 1.5μl
     Buffer3 3μl
     BSA 3μl
     ddH2O 0μl
     Total 30μl
     混匀后， 短暂离心， 37℃温育 6 小时。1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 Gel Extraction 试剂盒回收， 产物溶解于 30μl ddH2O 中， -20℃保存备用。
     4、 pEGFPC1 质粒 Sac I 酶切
     pEGFPC1 30μl
     Sac I 2.5μl
     Buffer1 5μl
     BSA 5μl
     6101942444 A CN 101942449
     说明7.5μl书5/8 页ddH2OTotal 50μl
     混匀后， 短暂离心， 37℃温育 6 小时。
     5、 1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 Gel Extraction 试剂盒回收， 产物溶解 于 30μl ddH2O 中， 进行下一步 Sal I 酶切。
     6、 回收产物 Sal I 酶切
     Sac I 酶切产物 22.5μl
     Sal I 1.5μl
     Buffer3 3μl
     BSA 3μl
     ddH2O 0μl
     Total 30μl
     混匀后， 37℃温育 6 小时， 1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 GelExtraction 试剂盒回收， 产物溶解于 30μl ddH2O 中， 用于下一步与 RT-PCR 产物连接。
     7、 连接反应体系 pEGFPC1( 酶切后 ) RT-PCR 产物 ( 酶切后 ) T4DNA 连接酶 Buffer ddH2O3μl 4μl 1μl 1μl 1μlTotal 10μl
     混匀后， 16℃温育过夜。
     8、 重组质粒转化 DH5α 菌
     取连接产物 5μl 加入氯化钙法制备的大肠杆菌 E.coli.DH5α 感受态细胞 50μl 中， 冰浴 1 小时后， 42℃热休克 90 秒， 再冰浴 4 分钟后加入无抗性的 LB 培养液 200μl， 37℃ + 摇床内温和振摇 1 小时， 铺预热的卡那霉素抗性 (Kan )LB 琼脂平板。倒置于 37℃生化培养 箱内培养 12 小时后挑取平板上的单克隆菌株到 Kan+LB 中， 37℃剧烈振摇到细菌中对数期， 挑克隆抽提质粒 DNA。克隆称为 pEGFPC 1-hNMDA。
     9、 HindIII 和 Nde I 双酶切鉴定
     pEGFPC1-hNMDA 3μl
     Xbal I 0.5μl
     Xho I 0.5μl
     Buffer2 1μl
     BSA 1μl
     ddH2O 4μl
     Total 10μl 37℃温育 3 小时， 1％琼脂糖凝胶电泳。电泳条带与预计相符的克隆行 PCR 鉴定。 10、 PCR 鉴定体系 ： pEGFPC1-hNMDA 2.5μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl dNTPs(2.5mmol/L) 2μl MgCl2(25mmol/L) 2μl Taq DNA 聚合酶 0.5μl (5u/μl) 10×Taq 缓冲液 2.5μl ddH2O 16μlTotal 25μl
     94℃ 5min 解链 ； 94℃ 50s， 55℃ 50s， 72℃ 90s 共 30 个循环 ； 72℃ 10min 延伸。 取 5μl， 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。 电泳条带与预计相符的克隆送上海生工生物工 程技术公司测序鉴定。 二、 RNA 干扰效率的检测
     为了明确 3 对 siRNA-NMDA 的效果， 并得到高干扰效率的小 RNA 我们在 293 细胞中 对干扰效果进行观察。3 对小 RNA 的序列如下 ：
     1.GGGGUUCUGUAUUGACAUC (siRNA1-NMDA)
     2.CAACUCCGUACCUGUGCAG (siRNA2-NMDA)
     3.GUCGCUCUACCCUGACCGG (siRNA3-NMDA)
     用六孔板常规培养 293 细胞 ( 购自中国科学院上海细胞生物学研究所 )， 用脂 质体方法 ( 参见 ： 脂染介导的 DNA 转染 .J. 莎姆布鲁克著， 黄培堂译 . 分子克隆实验指 南 . 第 3 版 . 科学出版社出版 .2002， 1276-1288.) 将人鼠同源性的三对 siRNA-NMDA 和 pEGFPC1-hNMDA 各 2μg 共转染 293 细胞， 并设空白组为阴性对照及 pEGFPC1-hNMDA 2μg 转 染组为阳性对照。次日观察绿色荧光的强度。
     1、 siRNA-NMDA 和 pEGFPC1-hNMDA 共转染 HEK-293 细胞株
     (1) 转染前 24h， 将处于对数生长期的细胞用 0.25％的胰酶消化后， 按一定的密度 接种于 6 孔板中， 继续培养 18-24h， 待细胞长满底面积约 80％时进行转染。
     (2) 用无血清无抗生素的 DMEM 培养液将细胞清洗两遍， 加入适量无血清无抗生素 的 DMEM 培养液培养备用。
     (3)6 孔板中的每个孔， siRNA-NMDA(siRNA1-NMDA、 siRNA2-NMDA 和 siRNA3-NMDA) 和 pEGFPC1-hNMDA 的 用 量 各 为 2μg，阳 性 对 照 只 加 2μgpEGFPC1-hNMDA 而 不 加 siRNA-NMDA， 空白组为阴性对照， 两者都不加。将 siRNA-NMDA 和 pEGFPC1-hNMDA 共同与 200μl Opti-MEM I 混合， 配成 A 液， 室温放置 5min。
     (4) 将 5μl Lipofectamin 2000 试剂在另一管中与 200μl Opti-MEM I 混合， 配 成
     B 液， 室温下温育 5min。
     (5) 把 200μl B 混合液加入到 200μl A 混合液中， 充分混匀， 室温放置 20min。
     (6) 弃六孔板中的无血清培养液。
     (7) 将 AB 混合液每孔 1ml 加入六孔板中， 培养细胞， 轻柔前后推摇培养板以混匀液 体， 使之均匀覆盖在细胞层上。
     2、 荧光相差倒置显微镜观察
     转染 24， 48， 72h 后在荧光倒置显微镜下观察 EGFP 在 HEK-293 细胞株中的表达情 况， 同时在物镜和目镜放在倍数分别为 ×100 时， 用数码摄像机 (LeicaTCS-TN， 美国 ) 拍摄 成像。
     结果如图 1 所示， 报告载体 pEGFG-hNMDA 中绿色荧光的表达强度代表了干扰的 效果， 以图 C 的绿色荧光最弱， 说明其对人 NMDA 受体 NR2B 干扰效果最佳。与阳性对照相 比， siRNA-NMDA 干预组荧光明显减弱， 以 siRNA-NMDA II 减弱最明显。说明 siRNA-NMDA 能 够较好干扰 pEGFPC1-hNMDA 的中的 NMDA 片段， 从而影响与之同时转录的 EGFP， 导致绿色 荧光的强度减弱， 从而确定 2 号小 RNA 即本发明的高干扰效率的小 RNA。(siRNA2-NMDA ： CAACUCCGUACCUGUGCAG)。
     实施例 2 ： 本发明的小 RNA 对人神经细胞 HN 中 NMDA 受体 NR2B 的抑制作用
     采用常规培养人神经细胞 HN( 购自中国科学院上海细胞生物学研究所 )， 分为 四组 ： siRNA 组 (siRNA-NMDA)、 错 配 的 RNA 组 (Mismathch RNA， MM 组 )、 生 理 盐 水 组 (NS 组 ) 及 Control 组。siRNA 组 采 用 的 是 实 施 例 1 中 得 到 的 2 号 小 RNA(siRNA2-NMDA ： CAACUCCGUACCUGUGCAG)。采用脂质体方法 ( 参见 ： 脂染介导的 DNA 转染 .J. 莎姆布鲁克著， 黄培堂译 . 分子克隆实验指南 . 第 3 版 . 科学出版社出版 .2002， 1276-1288.) 将错配的 RNA 和 NMDA 小干扰 RNA 各 5μg(20μl) 转染人神经细胞 HN， 生理盐水组加入等量生理盐水。转 染后后 12h， siRNA-NMDA 组、 错配的 RNA 组 (Mismathch RNA， MM 组 ) 及生理盐水组 (NS 组 ) 培养液中加入谷氨酸至终浓度为 5μg/ml， Control 组加入等量的生理盐水。0、 6、 12、 24、 36h 后分别行 Real time-PCR 及 Western blotting 检测 NMDA 受体的 mRNA 及蛋白的表达。
     结果发现， 加入谷氨酸后， 其它三组与 Control 组相比， NMDA 受体的 mRNA 表达大大 增加， 与 MM 组及 NS 组相比， siRNA 的 NMDA 受体 mRNA 的表达明显下降， 说明 MNDA 受体 NR2B 小 RNA 可减轻谷氨酸诱导的 NMDA 受体 mRNA 的表达 ( 图 2)。Western blotting 结果见图 3， 加入谷氨酸后， 其它三组与 Control 组相比， NMDA 受体的蛋白表达大大增加， 与 MM 组及 NS 组相比， siRNA 的 NMDA 受体的表达明显下降， 说明 MNDA 受体 NR2B 小 RNA 可减轻谷氨酸 诱导的 NMDA 受体蛋白的表达。
     实施例 3 ： 本发明的 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 蛛网膜下腔注射对该大鼠热痛阈、 机械 痛阈的影响
     采用大鼠右侧坐骨神经结扎构建神经病理性疼痛模型， 观察 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 蛛网膜下腔注射对该大鼠热痛阈的影响。大鼠采用 PE-10 导管经蛛网膜下腔置管， 大鼠分 为假手术组 (Sham 组 )、 坐骨神经结扎组 (CCI 组 )、 小 RNA 组及 MM 组， 小 RNA 在术前 1d 开 始鞘内注射， 20μg/d， 连续 7d。MM 组给错配小 RNA。假手术组不结扎坐骨神经。
     1、 CCI 模型的构建
     大鼠在动物房休养 3 天后开始模型手术。采用戊巴比妥 (40ml/kg) 腹腔注射麻醉， 需要时增加 40mg 左右。右侧大腿中后部背皮后四肢稍捆绑张开于手术台上， 碘氟消毒 后， 切开大腿中后部皮肤， 钝性分离肌肉， 暴露坐骨神经上中段， 游离神经到腓神经分叉处， 用 4-0 的羊肠线依次轻轻地捆扎 4 个结， 结的间距大约 1mm， 打结的力度为出现大腿肌肉抽 动或发生蹬腿反射为止。假手术组不捆扎坐骨神经， 其他的步骤都相同。依次缝合肌肉和 皮肤， 对合皮肤后碘氟消毒， 腹腔注射 0.3ml 氨苄青霉素 ( 浓度 100mg/ml)。麻醉醒前单独 置于塑料笼中， 笼中铺 3-6cm 的碎木屑， 水和食物应能轻易获得。
     2、 热痛阈测定
     观察大鼠在辐射热照射下出现缩爪反射的潜伏时间作为热痛阈。 大鼠放置于透明 的有机玻璃笼中， 笼子无底壁， 将笼子放在一块 3mm 厚的玻璃板上 ( 小木柜子， 上层为玻璃 板， 测定仪摆在柜中间 )， 这样动物的足底直接接触玻璃板， 而测定探头紧挨着玻璃板的下 面测定， 减少系统误差。照射源为 8v， 50w 的灯泡， 内有凹透镜聚焦， 外罩金属外壳， 上端有 一直径 5mm 的孔。这样灯泡离前端为 40mm。探头连接精确计时器， 计时期与照射源电源同 步， 记录开始照射到出现缩爪反应的时间区间。以大鼠在辐射热照射下出现缩爪反射的潜 伏时间作为热痛阈， 测定值精确到 0.1S， 所有动物照射内侧第 1 足趾的着力点， 每个时点测 定 3 次， 每次间隔 5min， 取平均值为热痛阈。单次照射时间不超过 20S， 以免损伤照射部位。 所有测定由一个不知情的实验人员在相同时间点和相同实验条件下完成。 3、 大鼠蛛网膜下腔置管及小 RNA 注射
     大鼠麻醉后， PE-10 导管延穿刺孔插入， 插入时可见动物嘶叫或甩尾或蹬腿， 置入 约 1cm， 可见脑脊液流出或注入生理盐水可见水回流， 即可封闭管口。 小 RNA 在术前 1d 开始 鞘内注射， 20μg/d， 连续 7d。NS 组只给等量的生理盐水。结果发现在坐骨神经结扎前， 注 射本发明的 NMDA 受体 NR2B 小 RNA( 由上海生工生物技术有限公司合成， 加入脂质体 1μg/ μl)， 大鼠的热痛阈及机械痛阈未见改变 (P ＞ 0.05) ； 结扎后生理盐水组的热痛阈及机械 痛阈明显下降 ( 见图 4)， 与假手术组相比具有显著差异 (P ＜ 0.05)。在小 RNA 组的第 1、 3、 7d 时间点内， siRNA 组的热痛阈明显增高， 与生理盐水组相比差异显著 (P ＜ 0.05)。而第 10d 与生理盐水组相比无显著差异 (P ＜ 0.05)， 说明 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 具有抑制坐骨 神经结扎的热痛觉过敏作用。
     为了检测 RNA 干扰是否影响脊髓 NMDA 的表达， 我们采用实时定量 PCR 的方法， 对 脊髓 L4-6NMDA 受体 NR2B mRNA 的水平进行测定， 结果显示， 在小 RNA 注射后 1d、 3d、 7d、 10d 时间点上 NMDA 受体 NR2B mRNA 的水平明显低于 MM 组 ( 见图 5)， 说明 NMDA 小 RNA 可明显抑 制 NMDA 受体 NR2BmRNA 的表达。
     背景技术 慢性疼痛是神经元可塑性变化的表现形式之一， 其生理学特点是痛觉的反应性增 高， 主要表现为痛觉过敏 (hyperalgesia) 和超敏反应 (allodynia)。 此类疼痛治疗困难， 主 要是由于其机制不明。 目前在治疗上， 主要是以吗啡为代表的阿片类受体阻滞剂， 但存在众 多的副作用以及成瘾、 耐受等反应， 从而限制了其长期使用。 因此， 亟需一种治疗效果良好、 作用时间长、 副作用轻的新方法， 达到长期、 有效控制慢性疼痛的目的。
     作 为 在 易 化 疼 痛 通 路 中 的 关 键 分 子， N- 甲 基 -D- 天 门 冬 氨 酸 受 体 (N-methyl-D-aspartate receptors， NMDA) 受体在慢性疼痛起重要作用， 它是一种配体门 控型阳离子通道， 为兴奋性氨基酸受体的一种。NMDA 受体由 NR1、 NR2(A、 B、 C 及 D) 和 NR3(A 及 B) 亚单位所组成， 研究表明有功能的 NMDA 受体通道， 需要基本亚单位 NR1( 形成通道的 主要亚单位 ) 及至少一个 NR2 亚单位。其中 R1 亚基是构成神经元突触后膜上离子通道的 主要成分， R2 亚基可能对 R1 亚基的功能起着一定调控作用。( 参见 ： Kalia LV， Kalia SK， Salter MW.NMDA receptors in clinical neurology ： excitatory times ahead.Lancet Neurol， 2008， 7(8) ： 742-55.) 具有 NR2B 亚基的 NMDA 受体具有如下功能 ： ①受体离子通道 2+ 具有高 Ca 的选择通透性和温度敏感性 ； ②受体介导一种缓慢兴奋效应， 能够执行长时程 突触可塑性、 长时程增强和长时程抑制等复杂的生理机制 ； ③细胞外液中的 Mg2+ 电压依赖 性地阻断受体离子通道的开放。 新近研究表明， NMDA 受体的 NR2B 亚基对 NMDA 受体药理和功 能特性起决定作用， 广泛参与学习记忆、 痛觉感知、 中枢敏化等的形成， 是一个治疗与 NMDA 受体相关疾病的潜在靶点。( 参见 ： 付艳， 江剑平， 余望 .NMDA 受体 NR2B 亚基作为镇痛靶点 的研究进展 . 青海师范大学学报， 2008， (2) ： 66-71.)
     NMDA 受体在疼痛的发生、 发展和维持中发挥重要作用。研究表明， 在神经病理条 2+ 2+ 件下， NMDA 受体过度兴奋， Ca 大量内流， 导致细胞内 Ca 超载， 从而产生一系列生化级联 反应， 包括激活蛋白酶， 促进兴奋性氨基酸释放， 激活突触后 NMDA 受体操纵的 Ca2+ 通道， 激 活星形胶质细胞合成释放大量神经递质和促炎性细胞因子。这些都造成癌痛的神经高兴 奋状态。近年来， 对 NMDA 受体的研究主要关注于 NR2B 亚单位。在脊髓上， NR2B 的表达密 度最高， 主要分布在脊髓背角 I、 II 层和第 X 层中央管周围。进一步研究发现， 脊髓背角 I 层 NR2B 选择性分布在突触前膜而不是后膜， 提示可能参与调控天冬氨酸、 谷氨酸和 P 物质 2+ 单纯上调 NR2B 即可导致异 等神经递质的释放， 增加 Ca 流入突触终端。Fan J 等的发现， 常痛的发生。各种不同 NR2B 的选择性阻断剂都可抑制不同疼痛模型动物及人体的痛觉过 敏反应。ZHANG， RX 等发现在骨癌痛中 NMDA 受体上调， IL-1 可易化 NMDA 受体的磷酸化， 引起痛觉过敏反应。( 参见 ： Zhang RX， Liu B， Li A， Wang L， Ren K， Qiao JT， Berman BM， Lao L.Interleukin 1beta facilitates bone cancer pain in rats by enhancing NMDA
     receptorNR-1subunit phosphorylation.Neuroscience， 2008， 154(4) ： 1533-8) 研究表明， NMDA 受体阻断剂如 MK801、 Ketamine 等可具有抑制疼痛的作用。( 参见 ： SaitoO， Aoe T， Kozikowski A， Sarva J， Neale JH， Yamamoto T.Ketamine andN-acetylaspartylglutamate peptidase inhibitor exert analgesia in bone cancer pain.Can J Anaesth， 2006， 53(9) ： 891-8.)NMDA 受体阻断剂通过抑制受体活性， 减弱兴奋性突触后电流， 抑制谷氨酸 2+ 受体介导的兴奋性突触传递， 减少 Ca 内流， 抑制胞内钙超载， 从而使 NOS 活性降低， NO 生成 减少 ； 抑制神经递质和促炎性细胞因子的释放， 达到镇痛和神经保护作用。因此， 采用 RNA 干扰技术抑制 NMDA 受体 NR2B 可达到治疗慢性疼痛的目的。
     RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是指当细胞中导入与内源性 mRNA 编码区同源 的双链 RNA 时， 该 mRNA 发生降解而导致基因沉默的现象， 是生物体内抑制特定基因表达的 一种现象。 外源导入或者由转基因、 病毒感染等各种方式引入的双链 RNA 将被 RNase III 家 族中的一个能够特异性识别双链 RNA 的酶 Dicer， 以 ATP 依赖的方式逐步切割为 19 ～ 23nt 的小分子干扰 RNA 片段 (smallinterfering RNAs， siRNA)。siRNA 双链在 RISC 作用下双链 解开， 同源的靶目标 RNA 结合， 在核酸内切酶的作用下， 将靶目标 mRNA 切断， 从而阻断了基 因表达。RNA 干扰是目前最有效的基因 “沉默” 技术， 从理论上讲， 在疼痛通路中兴奋性增高 的基因都可能成为 RNA 干扰靶位， 从而降低其兴奋性， 达到治疗目的。但是， 干扰效率高， 特 异性强的小 RNA 的获得较难， 不同序列的差异即可导致有效性的丧失， 从而影响其药理学 的价值。 发明内容 本发明的目的在于提供一种人鼠同源性 NMDA 受体 NR2B 的小 RNA， 以及它在制备治 疗慢性疼痛药物中的应用。
     我们经过筛选， 获得人及大鼠同源性的 NMDA 小 RNA， 可同时对人及大鼠的 NMDA mRNA 进行降解， 从而抑制人及大鼠的 NMDA 蛋白的表达， 通过抑制细胞凋亡减轻疼痛， 可以 成为治疗慢性疼痛的一种新的药物。
     具体技术方案是 ： 人 NMDA 受体 NR2B 序列 (NM_000834) 及大鼠 NMDA 受体 NR2B 序 列 (NM_012574) 由 Gene bank 获得， 先对两者在 Pubmed 上进行序列的比对 (Blast)， 取得序 列完全相同的片段 (Identities ＝ 91％ )， 再将其相同序列中的开放读框部分输入 http:// i.cs.hku.hk/ ～ sirna/software/sima.php 网站所提供的 RNAi 设计软件进行在线筛选， 而 后选择 GC 比在 40％ -60％之间的， 逐个做 Blast 分析和 SNP 分析， 选中位于开放读框内的 3 个不同的序列， 如下 ：
     1.GGGGTTCTGTATTGACATC
     2.CAACTCCGTACCTGTGCAG
     3.GTCGCTCTACCCTGACCGG
     其对应的 RNA 序列为 ：
     1.GGGGUUCUGUAUUGACAUC (siRNA1-NMDA)
     2.CAACUCCGUACCUGUGCAG (siRNA2-NMDA)
     3.GUCGCUCUACCCUGACCGG (siRNA3-NMDA)
     我们将构建含人 NMDA 受体 NR2B 基因的 pEGFPC1 报告质粒， 用脂质体方法将上述
     序列对应的 RNA 和 pEGFPC1-hNMDA 共转染 293 细胞， 进行 RNA 干扰效率的检测， 进而筛选出 RNA 干扰效率最高的序列为 ： CAACUCCGUACCUGUGCAG。
     本发明提供了一种人鼠同源性 NMDA 受体 CAACTCCGTACCTGTGCAG 的小 RNA， 其序列 是 CAACUCCGUACCUGUGCAG( 如 SEQ ID NO ： 1 所示 )。
     本发明还提供了上述人鼠同源性的 NMDA 受体 NR2B 的小 RNA 在制备治疗慢性疼痛 药物中的应用。
     本发明通过含 NMDA 基因的 pEGFPC1 报告质粒对进行 RNA 干扰效率进行检测， 得到 干扰效率最高小 RNA ； 又通过小 RNA 作用于人神经细胞 HN， 发现小 RNA 具有良好的抑制谷氨 酸诱导的 NMDA 受体 NR2B 的上调 ； 又通过 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 蛛网膜下腔注射， 发现对神 经病理性疼痛大鼠的痛觉过敏具有抑制作用。本发明的工作原理 ： NMDA 受体 NR2B 在疼痛 的发生、 发展和维持中发挥重要作用， 在慢性疼痛中表达大量增加， 可易化痛觉过敏， 因此 下调脊髓 NMDA 受体 NR2B 表达具有抑制慢性疼痛的作用。RNA 干扰技术可降解 mRNA 从而抑 制蛋白的表达， 那么， 采用该技术抑制 NMDA 受体 NR2B 的表达就可达到治疗疼痛的目的。
     本发明的应用可采用小 RNA 经蛛网膜下腔的直接注射的方式， 可达到治疗慢性疼 痛的目的， 且给药途径方便， 效果良好。 同时， 由于本发明不是传统的阿片类受体阻滞剂， 不 存在成瘾、 耐受等反应， 可长期使用。 附图说明
     图 1 是荧光显示小 RNA 的干扰效率
     其中 A.Positive Control ； B.siRNA1-NMDA ； C.siRNA2-NMDA ； D.siRNA3-NMDA。
     图 2 是实时定量 PCR 检测人神经细胞 NMDA 受体 mRNA 的表达。
     图 3 是 western blotting 检测人神经细胞 NMDA 受体蛋白的表达。
     图 4 是 CCI 大鼠机械痛阈及热痛阈的变化
     其中 ： A 为机械痛阈的变化 ； B 为热痛阈的变化。
     图 5 是 CCI 大鼠脊髓 NMDA 受体 mRNA 表达的变化。 具体实施方式
     下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述， 但本发明的实施不仅限于此。
     实施例 1 ： 人鼠同源性的 NMDA 的小 RNA 序列的筛选过程
     一、 含人 NMDA 受体 NR2B 基因的 pEGFPC1 报告质粒的构建及鉴定据人 NMDA 受体 NR2B 序列， 设计引物 ：
     5’ -CGGAGCGAAGCCCAGAGCGGAGTGCTGTT-3’ ； ( 如 SEQ ID NO ： 2 所示 )
     5’ -CGCGTCGAC CAGGATCCCATAAATAAATT-3’ 。( 如 SEQ ID NO ： 3 所示 )
     引物两端分别含 Sac I 和 Sal I 酶切位点。 采用 RT-PCR， 获取含有干扰靶序列的人 NMDA 受体 NR2B 序列表达框内的部分序列。 将此片段与 pEGFPC1 质粒 ( 购自美国 Invitrogen 公司 ) 分别用 Sac I 和 Sal I 酶切， 而后用 T4DNA 连接酶 16℃过夜连接成 pEGFPC1-hNMDA。 转化 E.coli.DH5α 感受态细胞， 挑克隆抽提质粒 DNA， 进行 PCR 扩增出正确的条带后进一步 测序鉴定。
     1、 PCR 鉴定体系 ：cDNA 上游引物 下游引物 dNTPs(2.5mmol/L) MgCl2(25mmol/L) Taq DNA 聚合酶 (5u/μl) 10×Taq 缓冲液 ddH2O2.5μl 1μl 1μl 2μl 2μl 0.5μl 2.5μl 16μlTotal 25μl
     94℃ 5min 解链 ； 94℃ 50s， 55℃ 50s， 72℃ 90s 共 30 个循环 ； 72℃ 10min 延伸。 取 5μl， 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。用 QIAgen 公司的 PCR 回收试剂盒回收， 进行下 一步 Sac I 酶切。
     2、 PCR 产物 Sac I 酶切
     PCR 产物 22.5μl
    
    
    
    
    
    Sac I Buffer1 BSA ddH2O1.5μl 3μl 3μl 0μlTotal 30μl
     混匀后， 短暂离心， 37℃温育 6 小时。1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 Gel Extraction 试剂盒回收， 产物溶解于 30μl ddH2O 中， 进行下一步 Sal I 酶切。
     3、 PCR 产物 Sal I 酶切
     PCR 产物 (Sac I 酶切 22.5μl
     后)
     Sal I 1.5μl
     Buffer3 3μl
     BSA 3μl
     ddH2O 0μl
    Total 30μl
     混匀后， 短暂离心， 37℃温育 6 小时。1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 Gel Extraction 试剂盒回收， 产物溶解于 30μl ddH2O 中， -20℃保存备用。
     4、 pEGFPC1 质粒 Sac I 酶切
     pEGFPC1 30μl
     Sac I 2.5μl
     Buffer1 5μl
     BSA 5μl
     6101942444 A CN 101942449
    
    
    说明7.5μl书5/8 页ddH2OTotal 50μl
     混匀后， 短暂离心， 37℃温育 6 小时。
     5、 1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 Gel Extraction 试剂盒回收， 产物溶解 于 30μl ddH2O 中， 进行下一步 Sal I 酶切。
     6、 回收产物 Sal I 酶切
     Sac I 酶切产物 22.5μl
     Sal I 1.5μl
     Buffer3 3μl
     BSA 3μl
     ddH2O 0μl
    Total 30μl
     混匀后， 37℃温育 6 小时， 1％琼脂糖凝胶电泳， 用 QIAgen 公司的 GelExtraction 试剂盒回收， 产物溶解于 30μl ddH2O 中， 用于下一步与 RT-PCR 产物连接。
    
    
    
    
    
    
    
    
    7、 连接反应体系 pEGFPC1( 酶切后 ) RT-PCR 产物 ( 酶切后 ) T4DNA 连接酶 Buffer ddH2O3μl 4μl 1μl 1μl 1μlTotal 10μl
     混匀后， 16℃温育过夜。
     8、 重组质粒转化 DH5α 菌
     取连接产物 5μl 加入氯化钙法制备的大肠杆菌 E.coli.DH5α 感受态细胞 50μl 中， 冰浴 1 小时后， 42℃热休克 90 秒， 再冰浴 4 分钟后加入无抗性的 LB 培养液 200μl， 37℃ + 摇床内温和振摇 1 小时， 铺预热的卡那霉素抗性 (Kan )LB 琼脂平板。倒置于 37℃生化培养 箱内培养 12 小时后挑取平板上的单克隆菌株到 Kan+LB 中， 37℃剧烈振摇到细菌中对数期， 挑克隆抽提质粒 DNA。克隆称为 pEGFPC 1-hNMDA。
     9、 HindIII 和 Nde I 双酶切鉴定
     pEGFPC1-hNMDA 3μl
     Xbal I 0.5μl
     Xho I 0.5μl
     Buffer2 1μl
     BSA 1μl
     ddH2O 4μl
     Total 10μl 37℃温育 3 小时， 1％琼脂糖凝胶电泳。电泳条带与预计相符的克隆行 PCR 鉴定。 10、 PCR 鉴定体系 ： pEGFPC1-hNMDA 2.5μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl dNTPs(2.5mmol/L) 2μl MgCl2(25mmol/L) 2μl Taq DNA 聚合酶 0.5μl (5u/μl) 10×Taq 缓冲液 2.5μl ddH2O 16μlTotal 25μl
     94℃ 5min 解链 ； 94℃ 50s， 55℃ 50s， 72℃ 90s 共 30 个循环 ； 72℃ 10min 延伸。 取 5μl， 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。 电泳条带与预计相符的克隆送上海生工生物工 程技术公司测序鉴定。 二、 RNA 干扰效率的检测
     为了明确 3 对 siRNA-NMDA 的效果， 并得到高干扰效率的小 RNA 我们在 293 细胞中 对干扰效果进行观察。3 对小 RNA 的序列如下 ：
     1.GGGGUUCUGUAUUGACAUC (siRNA1-NMDA)
     2.CAACUCCGUACCUGUGCAG (siRNA2-NMDA)
     3.GUCGCUCUACCCUGACCGG (siRNA3-NMDA)
     用六孔板常规培养 293 细胞 ( 购自中国科学院上海细胞生物学研究所 )， 用脂 质体方法 ( 参见 ： 脂染介导的 DNA 转染 .J. 莎姆布鲁克著， 黄培堂译 . 分子克隆实验指 南 . 第 3 版 . 科学出版社出版 .2002， 1276-1288.) 将人鼠同源性的三对 siRNA-NMDA 和 pEGFPC1-hNMDA 各 2μg 共转染 293 细胞， 并设空白组为阴性对照及 pEGFPC1-hNMDA 2μg 转 染组为阳性对照。次日观察绿色荧光的强度。
     1、 siRNA-NMDA 和 pEGFPC1-hNMDA 共转染 HEK-293 细胞株
     (1) 转染前 24h， 将处于对数生长期的细胞用 0.25％的胰酶消化后， 按一定的密度 接种于 6 孔板中， 继续培养 18-24h， 待细胞长满底面积约 80％时进行转染。
     (2) 用无血清无抗生素的 DMEM 培养液将细胞清洗两遍， 加入适量无血清无抗生素 的 DMEM 培养液培养备用。
     (3)6 孔板中的每个孔， siRNA-NMDA(siRNA1-NMDA、 siRNA2-NMDA 和 siRNA3-NMDA) 和 pEGFPC1-hNMDA 的 用 量 各 为 2μg，阳 性 对 照 只 加 2μgpEGFPC1-hNMDA 而 不 加 siRNA-NMDA， 空白组为阴性对照， 两者都不加。将 siRNA-NMDA 和 pEGFPC1-hNMDA 共同与 200μl Opti-MEM I 混合， 配成 A 液， 室温放置 5min。
     (4) 将 5μl Lipofectamin 2000 试剂在另一管中与 200μl Opti-MEM I 混合， 配 成
     B 液， 室温下温育 5min。
     (5) 把 200μl B 混合液加入到 200μl A 混合液中， 充分混匀， 室温放置 20min。
     (6) 弃六孔板中的无血清培养液。
     (7) 将 AB 混合液每孔 1ml 加入六孔板中， 培养细胞， 轻柔前后推摇培养板以混匀液 体， 使之均匀覆盖在细胞层上。
     2、 荧光相差倒置显微镜观察
     转染 24， 48， 72h 后在荧光倒置显微镜下观察 EGFP 在 HEK-293 细胞株中的表达情 况， 同时在物镜和目镜放在倍数分别为 ×100 时， 用数码摄像机 (LeicaTCS-TN， 美国 ) 拍摄 成像。
     结果如图 1 所示， 报告载体 pEGFG-hNMDA 中绿色荧光的表达强度代表了干扰的 效果， 以图 C 的绿色荧光最弱， 说明其对人 NMDA 受体 NR2B 干扰效果最佳。与阳性对照相 比， siRNA-NMDA 干预组荧光明显减弱， 以 siRNA-NMDA II 减弱最明显。说明 siRNA-NMDA 能 够较好干扰 pEGFPC1-hNMDA 的中的 NMDA 片段， 从而影响与之同时转录的 EGFP， 导致绿色 荧光的强度减弱， 从而确定 2 号小 RNA 即本发明的高干扰效率的小 RNA。(siRNA2-NMDA ： CAACUCCGUACCUGUGCAG)。
     实施例 2 ： 本发明的小 RNA 对人神经细胞 HN 中 NMDA 受体 NR2B 的抑制作用
     采用常规培养人神经细胞 HN( 购自中国科学院上海细胞生物学研究所 )， 分为 四组 ： siRNA 组 (siRNA-NMDA)、 错 配 的 RNA 组 (Mismathch RNA， MM 组 )、 生 理 盐 水 组 (NS 组 ) 及 Control 组。siRNA 组 采 用 的 是 实 施 例 1 中 得 到 的 2 号 小 RNA(siRNA2-NMDA ： CAACUCCGUACCUGUGCAG)。采用脂质体方法 ( 参见 ： 脂染介导的 DNA 转染 .J. 莎姆布鲁克著， 黄培堂译 . 分子克隆实验指南 . 第 3 版 . 科学出版社出版 .2002， 1276-1288.) 将错配的 RNA 和 NMDA 小干扰 RNA 各 5μg(20μl) 转染人神经细胞 HN， 生理盐水组加入等量生理盐水。转 染后后 12h， siRNA-NMDA 组、 错配的 RNA 组 (Mismathch RNA， MM 组 ) 及生理盐水组 (NS 组 ) 培养液中加入谷氨酸至终浓度为 5μg/ml， Control 组加入等量的生理盐水。0、 6、 12、 24、 36h 后分别行 Real time-PCR 及 Western blotting 检测 NMDA 受体的 mRNA 及蛋白的表达。
     结果发现， 加入谷氨酸后， 其它三组与 Control 组相比， NMDA 受体的 mRNA 表达大大 增加， 与 MM 组及 NS 组相比， siRNA 的 NMDA 受体 mRNA 的表达明显下降， 说明 MNDA 受体 NR2B 小 RNA 可减轻谷氨酸诱导的 NMDA 受体 mRNA 的表达 ( 图 2)。Western blotting 结果见图 3， 加入谷氨酸后， 其它三组与 Control 组相比， NMDA 受体的蛋白表达大大增加， 与 MM 组及 NS 组相比， siRNA 的 NMDA 受体的表达明显下降， 说明 MNDA 受体 NR2B 小 RNA 可减轻谷氨酸 诱导的 NMDA 受体蛋白的表达。
     实施例 3 ： 本发明的 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 蛛网膜下腔注射对该大鼠热痛阈、 机械 痛阈的影响
     采用大鼠右侧坐骨神经结扎构建神经病理性疼痛模型， 观察 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 蛛网膜下腔注射对该大鼠热痛阈的影响。大鼠采用 PE-10 导管经蛛网膜下腔置管， 大鼠分 为假手术组 (Sham 组 )、 坐骨神经结扎组 (CCI 组 )、 小 RNA 组及 MM 组， 小 RNA 在术前 1d 开 始鞘内注射， 20μg/d， 连续 7d。MM 组给错配小 RNA。假手术组不结扎坐骨神经。
     1、 CCI 模型的构建
     大鼠在动物房休养 3 天后开始模型手术。采用戊巴比妥 (40ml/kg) 腹腔注射麻醉， 需要时增加 40mg 左右。右侧大腿中后部背皮后四肢稍捆绑张开于手术台上， 碘氟消毒 后， 切开大腿中后部皮肤， 钝性分离肌肉， 暴露坐骨神经上中段， 游离神经到腓神经分叉处， 用 4-0 的羊肠线依次轻轻地捆扎 4 个结， 结的间距大约 1mm， 打结的力度为出现大腿肌肉抽 动或发生蹬腿反射为止。假手术组不捆扎坐骨神经， 其他的步骤都相同。依次缝合肌肉和 皮肤， 对合皮肤后碘氟消毒， 腹腔注射 0.3ml 氨苄青霉素 ( 浓度 100mg/ml)。麻醉醒前单独 置于塑料笼中， 笼中铺 3-6cm 的碎木屑， 水和食物应能轻易获得。
     2、 热痛阈测定
     观察大鼠在辐射热照射下出现缩爪反射的潜伏时间作为热痛阈。 大鼠放置于透明 的有机玻璃笼中， 笼子无底壁， 将笼子放在一块 3mm 厚的玻璃板上 ( 小木柜子， 上层为玻璃 板， 测定仪摆在柜中间 )， 这样动物的足底直接接触玻璃板， 而测定探头紧挨着玻璃板的下 面测定， 减少系统误差。照射源为 8v， 50w 的灯泡， 内有凹透镜聚焦， 外罩金属外壳， 上端有 一直径 5mm 的孔。这样灯泡离前端为 40mm。探头连接精确计时器， 计时期与照射源电源同 步， 记录开始照射到出现缩爪反应的时间区间。以大鼠在辐射热照射下出现缩爪反射的潜 伏时间作为热痛阈， 测定值精确到 0.1S， 所有动物照射内侧第 1 足趾的着力点， 每个时点测 定 3 次， 每次间隔 5min， 取平均值为热痛阈。单次照射时间不超过 20S， 以免损伤照射部位。 所有测定由一个不知情的实验人员在相同时间点和相同实验条件下完成。 3、 大鼠蛛网膜下腔置管及小 RNA 注射
     大鼠麻醉后， PE-10 导管延穿刺孔插入， 插入时可见动物嘶叫或甩尾或蹬腿， 置入 约 1cm， 可见脑脊液流出或注入生理盐水可见水回流， 即可封闭管口。 小 RNA 在术前 1d 开始 鞘内注射， 20μg/d， 连续 7d。NS 组只给等量的生理盐水。结果发现在坐骨神经结扎前， 注 射本发明的 NMDA 受体 NR2B 小 RNA( 由上海生工生物技术有限公司合成， 加入脂质体 1μg/ μl)， 大鼠的热痛阈及机械痛阈未见改变 (P ＞ 0.05) ； 结扎后生理盐水组的热痛阈及机械 痛阈明显下降 ( 见图 4)， 与假手术组相比具有显著差异 (P ＜ 0.05)。在小 RNA 组的第 1、 3、 7d 时间点内， siRNA 组的热痛阈明显增高， 与生理盐水组相比差异显著 (P ＜ 0.05)。而第 10d 与生理盐水组相比无显著差异 (P ＜ 0.05)， 说明 NMDA 受体 NR2B 小 RNA 具有抑制坐骨 神经结扎的热痛觉过敏作用。
     为了检测 RNA 干扰是否影响脊髓 NMDA 的表达， 我们采用实时定量 PCR 的方法， 对 脊髓 L4-6NMDA 受体 NR2B mRNA 的水平进行测定， 结果显示， 在小 RNA 注射后 1d、 3d、 7d、 10d 时间点上 NMDA 受体 NR2B mRNA 的水平明显低于 MM 组 ( 见图 5)， 说明 NMDA 小 RNA 可明显抑 制 NMDA 受体 NR2BmRNA 的表达。
    10101942444 A CN 101942449
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