玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用.pdf

玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开 发与应用
    【技术领域】
     本发明涉及玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用。背景技术 玉米是重要的粮食、 饲料和工业原料作物， 在国民经济发展中占有重要地位。 我国 自 2007 年以来， 玉米已是播种面积上的第一大作物。氮肥是玉米产量的重要的限制因素。 然而， 氮肥施用量上升的幅度远远大于玉米增产的幅度， 我国玉米生产对氮肥的依赖强， 氮 肥利用效率低， 玉米等禾谷类作物氮利用效率平均仅约为 33％。 大量施用氮肥， 还引起地下 水硝酸盐含量超标、 地表水体富营养化等面源污染。 因此， 玉米氮利用效率与耐低氮相关的 基础与应用研究是我国当前农业科研领域的重大需求， 具有十分重要的意义。 当前， 玉米品 种增产的主要途径是进一步增加播种密度， 随着密度的上升， 玉米植株之间对环境养分的 竞争将进一步加剧。因此， 氮高效与耐低氮玉米品种选育是未来商业玉米育种中品种培育 与遗传改良的重要方向。
     由于氮高效利用等复杂农艺性状往往受多基因位点控制和环境影响等原因， 常规 筛选很难收到理想效果。谷氨酰胺合成酶是玉米等禾谷类作物氮利用效率相关的氮同化、 活化、 转运与再同化途径的代谢中枢酶， 是氮同化及氮利用效率的关键基因， 也是了解玉米 等禾谷类作物氮利用效率的重要切入点。研究也表明， 低氮情况下籽粒数的高低对产量的 影响最大， 因此， 提高低氮逆境下玉米穗部籽粒数， 是耐低氮品种改良与选择的重要方向。
     育种材料选育过程中， 杂交、 回交或自交过程中均是人工授粉， 授粉质量直接决定 了籽粒数与结实性， 待选育材料的籽粒数并不是基因效应的体现。 同时， 籽粒数还受复杂的 环境效应影响。因此， 材料选择过程中， 常规育种方法无法对玉米籽粒数性状进行选择。也 即通常所说的， 育种过程中性状对选择不会响应。 此外， 研究低氮逆境下育种材料的产量对 低氮处理的表现， 需要建立贫瘠试验条件。发展一种普通条件下依据基因型选择的技术可 以有效的解决上述两个问题， 具有重要的开发与利用价值。
     发明内容
     本发明的目的是提供玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开 发与应用， 具体设计一种 12bp 的标记， 基于该标记的引物对及其在辅助鉴别在低氮环境下 具有不同单株籽粒数目性状的玉米中的应用。
     本发明提供了辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的引物对， 是序列表的序列 2 所示 DNA 和序列表的序列 3 所示 DNA 组成的引物对。
     所述引物对可用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米。
     本发明还保护一种辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的方 法， 包括如下步骤 ： 以待测玉米的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对进行 PCR 扩增 ； 如果 PCR 扩增产物为一种， 且大小为 329bp， 待测玉米为插入纯合型 ； 如果 PCR 扩增产物为一种， 且大小为 317bp， 待测玉米为缺失纯合型 ； 缺失纯合型 ( 优良基因型 ) 玉米在低氮环境下的单株 籽粒数目高于插入纯合型 ( 非优良基因型 ) 玉米在低氮环境下的单株籽粒数目。如果 PCR 扩增产物为两种， 大小分别为 329bp 和 317bp， 待测玉米为插入 / 缺失杂合型， 可以其后代 中， 分离得到缺失纯合型 ( 优良基因型 )。
     本发明还保护一种玉米育种方法， 是选择所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米进行 育种。
     本发明还保护另一种玉米育种方法， 包括如下步骤 ： 将供体亲本与受体亲本杂交 得到 F1 代， 将 F1 代自交， 得到 F2 代 ； 以 F2 代玉米的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对进行 PCR 扩增 ； PCR 扩增产物为一种且大小为 317bp 的 F2 代玉米为选育得到的玉米 ； 所述供体亲 本为采用所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米， 所述受体亲本为采用所述方法鉴别出的插入 纯合型玉米。
     所述供体亲本具体可为玉米品种 CA156， 所述受体亲本具体可为玉米品种武 314。
     PCR 扩增产物可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法或琼脂糖凝胶电脉溴化乙锭 (EB) 进行检测。
     所述引物对可用于制备辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米 的试剂盒。 本发明还保护序列表的序列 4 所示的 DNA， 即 12bp 的缺失区域， 该区域可以作为分 子标记， 用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米， 进而用于玉米育 种。
     以上所述低氮环境均指全氮量低于 0.4％ ( 质量百分含量 ) 的土壤。
     耐氮贫瘠稳产品种是发展方向， 选择低氮逆境下高籽粒数是重要的选择性状。本 发明的方法可用于选择低氮逆境下具有高籽粒数性状的玉米品种， 将其用于育种。本发明 的方法可以在早期种子 ( 取部分胚乳不影响播种后种子活力 ) 或幼苗阶段筛选， 受体可以 是已知的常用的玉米育种亲本， 也可以是未知材料， 如自交系、 杂交种、 地方品种、 开放授粉 群体等种质资源， 获得含有目标基因型的个体， 对培育高产、 稳产、 抗逆的玉米品种具有重 要指导作用， 是针对基因的选择， 加快育种速度， 降低育种成本， 并具有操作简单， 成本低 廉， 周期短的优点， 适于推广应用， 为玉米种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法， 具有很 高的开发价值。
     附图说明 图 1 为两年低氮环境下各性状对产量性状及性状之间的作用的通径分析 ； 叶绿素 含量 ： 以 SPAD 计测定大喇叭口期相对叶绿素含量值 ； 生物量 ： 以 GreenSeeker 测定的大喇 叭口期相对生物量 NDVI 值 ； ** ： p ＝ 0.01 水平显著 ； ns ： 不显著。
     图 2 为 实 施 例 5 中 F2 代 植 株 的 鉴 定 电 泳 图 ； size ： 分 子 量 marker ； I： 纯合插 入 (Insertion) 基因型 ； D： 纯合缺失 (Deletion) 基因型 ； C： 插入 / 缺失杂合的共显性 (Co-dominant) 基因型。
     具体实施方式
     以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。
     实施例 1 中用于优异等位基因鉴定的 180 个玉米自交系 ( 见表 1) 均为我国玉米 育种当前经常应用的亲本自交系 ； 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。各个自 交系的遗传背景分析结果参见 (Chuanxiao Xie， Shihuang Zhang， Minshun Li， Xinhai Li， Zhuanfang Hao， Li Bai， Degui Zhang， Yehong Liang.(2007)Inferring genome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbredlines. J.Genet.& Genomics 34(8) ： 738-748)， 并作为主要遗传类群的依据。
     表 1 关联性分析自然群体自交系及其系谱来源
     实施例 1、 玉米籽粒数的遗传分析
     一、 田间试验设计与考种
     180 个玉米自交系， 采用 α-lattice 设计， 设施氮肥与不施氮肥 2 个处理， 每个处 理设三次重复。小区行长 3.6m， 行距 0.6m， 株距 0.2m。施氮肥处理 (NP) 播种时各分别施 2 2 60kg/hm P2O5 和 45kg/hm K2O 作为底肥， 3 叶期施 69kg/hm2 纯氮， 大喇叭口期追施 172.5kg/
     hm2 纯氮 ； 不施氮肥 (NDP) 处理， 磷钾肥的施用量与施氮区相同， 其他时期不再施肥。 成熟后 以小区为单位进行收获， 每小区去行头行尾各 2 株， 以避免边际效应的影响， 挑取中间连续 10 株， 以避免缺苗处留空给相邻植株带来更大的地上地下空间优势。 风干后室内常规考种， 本专利分析中主要采用单株籽粒数。结果见表 2。
     表 2 各性状联合方差分析 F 值表
     注： * 和料分别表示显著性水平为 0.05 和 0.01。
     结论 ： 玉米籽粒数主要受遗传控制， 并显著受环境影响 ； 低氮处理是玉米的籽粒 数变异的主要来源， 对玉米籽粒数的影响巨大。
     二、 籽粒数与其它重要农艺性状的关系
     考察 180 个自交系低氮逆境下与正常供氮条件下籽粒数 (EKN) 与叶绿素含量 (SPAD1 ： 大喇叭口期 ； SPAD2 ： 开花期 )、 大喇叭口期均一化植被指数 (NDVI)、 株高 (PH)、 雌 雄开花间隔期 (ASI)、 氮利用农学效率 (AE)、 籽粒氮含量 (GN)、 结实株数百分率 (ESP)、 秃尖 (BT) 与百粒重 (HKW) 等可能有关的重要农艺性状之间的相关性， 两年两点结果见表 3。
     表 3 低氮与正常氮条件下遗传相关 ( 上对角线区 ) 表型相关性 ( 下对角线区 ) 结 果
     结论 ： 缺氮条件与正常供氮条件下， 籽粒数 (EKN) 与产量 (GY) 和氮的农学利用效 率 (AE) 均有较高的遗传相关性与表型相关性， 表明籽粒数性状对产量性状与氮利用效率 的表型有贡献， 且遗传上有较重要的相关性。 诸多考察性状中， 籽粒数对低氮与正常氮条件 下的产量与氮利用效率非常重要。
     180 个自交系两年低氮环境下各性状对产量性状及性状之间的作用的通径分 析 见 图 1。 单 箭 头 ： 通 径 系 数 (path coefficients) ； 双箭头 ： 相 关 系 数 (correlation coefficients) ； 产量， grain yield ； 氮农学效率， agronomic efficiency(kg kg-1N) ； 籽粒 数， ear kernel number ； 百粒重 (g)， hundred kernels weight ； N％ ： 籽粒氮含量， N content in dry grains ； 生物量 ： 归一化植被指数， Normalized difference vegetation index ； SPAD ： 大喇叭口期叶绿相对含量 SPAD 计值 ； ** 显著 p ＝ 0.01 水平 ； ns ： 不显著， p ＝ 0.05 水平。
     产量 (GY) 通径分析结果表明 ： 低氮情况下的籽粒数对产量直接效应高， 是考察项 目中最重要的表型因素之一。因此， 玉米低氮情况的籽粒数与玉米产量最为相关。
     实施例 2、 分子标记的发现和特异引物对的设计
     一、 分子标记的发现
     分析 180 个自交系谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 的测序结果， 发现一个 12bp 的插 入 / 缺失 (Indels) 位点， 位于该基因上游调控区 -274 至 -285 位， 序列如下 ：
     5’ -CCGCGTCGAGGA-3’ 。
     具有上述序列的基因为野生型， 缺失上述序列的基因为突变型。
     二、 特异引物对的设计
     根据序列设计特异引物对如下 ：
     正向引物 ： 5’ -ATGTAACTGACAGGTGGGCCT-3’ ( 序列表的序列 2) ；
     反向引物 ： 5’ -TTGAGATTGAGGACGAAGGGA-3’ ( 序列表的序列 3)。
     以野生型谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 为模板， 用上述引物对 PCR 扩增得到序列 表的序列 1 所示的 DNA 片段， 该 DNA 片段为谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 上游调控区 -60 至 -388 位， 共 329bp。以突变型谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 为模板， 用上述引物对 PCR 扩
     增得到将序列表的序列 1 缺失自 5’ 末端 104 至 115 位核苷酸所示的 DNA 片段， 共 317bp。
     由于大小差异为 12bp， 为方便 PCR 检测， 可以选用基于聚丙烯酰胺凝胶电泳结合 银染方法检测扩增片段。插入纯合型样本电泳显示一条 329bp 的条带， 缺失纯合型样本电 泳显示一条 317bp 的条带， 杂合型样本电泳显示 329bp 和 317bp 的两条带。因此， 该检测的 标记是一个共显性标记， 不仅可以区分不同的基因型， 还可以区分该基因不同等位基因的 杂合个体与纯合个体。
     实施例 3、 12bp 的插入 / 缺失与低氮环境下玉米籽粒数的关联分析
     一、 低氮逆境下与正常条件下的表型鉴定
     1、 试验地点与土壤养分含量分析
     于 2007、 2008 年冬在海南崖城中国农科院作物科学研究所试验基地 ( 水南村 ) 进 行， 试验地为砂壤土， 为达到低氮逆境， 经过 3 年 6 个生长季节的氮耗竭处理。处理方法是 每季种植玉米杂交种， 不施肥， 玉米成熟后全株移除。
     土壤在施肥前取样进行养分含量测定， 按常规的五点取样法取 5 个土壤样本， 取 各测定值的平均值代表该地块的土壤养分含量。 用凯氏蒸馏法测全氮 (Bremner， J.M.1996. Nitrogen-total.p.1085-112.In D.L.Sparks(ed)Methods of soil analysis.Part 3.Chemical methods.SSSA Book Ser.5.SSSA and ASA， Madison， WI.) ；用 HClO4-H2SO4 消 煮 - 钼 锑 抗 比 色 法 测 全 磷 含 量 (Olsen， S.R.and Sommers， L.E.(1982)Phosphorus. In A.L.Page， R.H.Miller， and D.R.Keeney(ed.) ： Methods of Soil Analysis(part2) ： Chemical and Microbiological Properties ， 2nd end.ASA SSSA ， Madision ， WI ， p.403-440) ； 用 碳 酸 氢 钠 提 取 - 钼 锑 抗 比 色 法 (Olsen 法 ) 测 有 效 磷 (Olsen， S.R.， C.V.Cole， F.S.Watanabe， and L.A.Dean.1954.Estimation of available phosphorus in soils by extraction with sodium bicarbonate.USDA Circ.939.U.S.Gov.Print. Office， Washington， DC.) ； 用油浴加热重铬酸钾氧化 - 容量法测有机质 (GB 9834-88) ； 用乙酸铵浸提 - 原子吸收分光光度计法测速效钾 (Van Reeuwijk， L.P.1992.Procedures for soil analysis， 3rd ed.ISRIC， Wageningen， The Netherlands.) ； 用硝酸提取 - 原子 吸收分光光度法测缓效钾 (Van Reeuwijk， L.P.1992.Procedures for soil analysis， 3rd ed.ISRIC， Wageningen， The Netherlands.) ； 用电位法 ( 水土比为 2.5 ∶ 1) 测 pH 值 (GB7859-57)。氮耗竭地块与正常地块土壤养分含量及差异分析见表 4。低氮地块 ( 又称氮 耗竭地块， NDP， Nitrogen depleted pool) 与正常地块 (NP， Applied nitrogen field) 除 氮养分差异很大之外， 其它养分基本持平。
     表 4 低氮地块与正常地块养分及对比 .
     全氮 (g.kg1) NDP NP t-Test Pr ＞ t 0.49±0.04 0.68±0.03 11.45 0 总磷 (g.kg-1) 0.52±0.04 0.56±0.09 1.45 0.21 有机质 (g.kg-1) 速效磷 (mg.kg-1) 8.93±0.88 9.23±0.85 1.18 0.29 30.04±6.44 36.81±14.56 0.97 0.38 速效钾 (mg.kg-1) 179.13±26.83 176.69±39.03 0.13 0.9 总钾 K(mg.kg-1) 432.79±70.84 402.98±34.64 0.73 0.5 pH 6.31±0.09 6.23±0.19 0.74 0.49连续进行两年实验 ： 180 个玉米自交系分别种质于低氮地块与正常地块， 每个株 系每个地块种植 3 行， 行长 3.6m， 行距 0.6m， 株距 0.2m， 收获后统计各个自交系的单株籽粒 数。
     二、 应用实施例 2 设计的特异引物对进行分型
     分别对 180 个玉米自交系进行基因分型， 步骤如下 ：
     1、 提取基因 DNA。
     2、 以基因组 DNA 为模板， 用实施例 2 设计的特异引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩 增产物。
     PCR 反应体系 (10μL) 见表 5。
     表 5PCR 反应体系
     组分 ddH2O 10×Buffer( 含 20mmol/L Mg2+) dNTP(25mmol/L each) 引物 (20μmol/L each) Taq 酶 (2U/μL)( 鼎国公司 ) DNA(10ng/μL)
     终浓度 1× 均为 250μmol/L 0.26μmol/L each 0.5U 25ng加入体积 6.02μL 1μL 0.1μL 0.13μL 0.25μL 2.5μL反应液上加盖 15μL 矿物油 (Sigma)， 以防止反应过程中水分蒸发。
     PCR 反应程序 (PTC-200PCR 仪 ； MJ Research， Waterson， MA) ： 94℃， 4 分钟， 预变性 ； 94℃变性 45 秒， 52℃退火 30 秒， 72℃延伸 30 秒， 35 个循环 ； 72℃终延伸 8 分种 ； 4℃保存。
     3、 将 PCR 扩增产物进行 4.5％聚丙烯酰胺电泳。
     在 10μLPCR 扩增产物中加入 5μL3×Loading Buffer， 混匀后， 在 95℃变性 5min， 立即放至冰上冷却 10min 以上， 得到样品。每一个加样孔点入 4μL 样品 ( 分子量标准为 pBR322DNA/MspI)， 在 70W 恒功率下电泳约 40-60min。
     电泳结束后， 进行银染显色。
     染 色 液 由 1g AgNO3 和 1.5mL 37 ％ ( 体 积 百 分 含 量 ) 甲 醛 水 溶 液 组 成， 染色 10-15min。
     显影液由 30g 无水 Na2CO3、 200μL 1％ Na2S2O3 水溶液和 1.5mL 37％ ( 体积百分含 量 ) 甲醛水溶液组成， 至带纹出现。
     定影液为 10％ ( 体积百分含量 ) 醋酸水溶液， 定影 2min。
     三、 各个样本的基因型和单株籽粒数
     根据 Pritchard 等 2000 的方法获得了供试材料的群体结构数据 ( 即 Q 数据 )， 根据 Yu 等 2005 年在 《Nature Genetics》 上发表的分别利用群体结构 (Q) 与成对家系指数 (k) 数据结合多环境 (e) 条件下的一般线性模型 (GLM) 与复合线性模型 (MLM) 模型计算性 状与标记之间的关联性。使用 TASSEL2.0 软件 ( 美国康奈尔大学开发 ) 进行基于候选基因 的关联性分析。供试材料的群体结构数据 (Q) 与亲缘关系辅助计算数据等已公开发表数 据 (Chuanxiao Xie， Marilyn Warburton， Mingshun Li， Xinhai Li， Muji Xiao， Zhuanfang Hao， Qi Zhao and Shihuang Zhang.(2008)An analysis ofpopulation structure and linkage disequilibrium using multilocus data in 187maize inbred lines.Mol. Breeding 21(4) ： 407-418)。 目 标 基 因 的 基 因 型 数 据 ： (Gln1-3 180lines alignment rusults.phy)( 注 ： 本文件需要 PHYLIP 等软件方可打开， 有所有材料的该基因全长序列数 据， 不仅含有本标记开发区间的 )。表型鉴定数据 ： 谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 基因与低 氮逆境下单株籽粒数关联性分析结果见表 6。
     表 6 谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 基因与低氮逆境下籽粒数关联性分析结果
     位点 -285 2581 396 3265 -111 1422 2934
     位置 5’ 调控区 第 9 外显子 第 1 内含子 3’ 调控区 5’ 调控区 第 4 内含子 第 10 外显子类型 Indels SNP Indels Indels SNP SNP SNP序列 5’ -3’ CCGCGTCGAGGA C/G CCTCTTGTTT GGCCG C/G T/C C/Gp Marker 0.003 0.852 0.218 0.060 0.005 0.000 0.404单位点解释表型 (％ ) 16.85 3.86 3.52 2.53 2.36 2.13 1.17位于该基因 -285 上游调控区一个 12bp 的插入 / 缺失 (Indels) 位点与低氮逆境 下单株籽粒数关联性强， 单位点可解释的表型变异高达 16.85％ (p ＜ 0.05)， 具有很高的标 记开发与利用价值。
     该 12bp 的插入 / 缺失 (Indels) 位点与低氮逆境下单株籽粒数关联性强， 其中缺 失的等位基因型是优异等位基因型 ( 缺失型单株籽粒数高于插入型单株籽粒数 )， 单位点 可解释的表型变异高达 16.85％ (p ＜ 0.05)， 具有很高的标记开发与利用价值。
     实施例 4、 12bp 的插入 / 缺失与低氮环境下玉米单株籽粒数的关联分析
     127 个玉米自交系 ： 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得 ； 参考文献 ： Chuanxiao Xie， Shihuang Zhang， Minshun Li， Xinhai Li， Zhuanfang Hao， Li Bai， Degui Zhang， Yehong Liang.(2007)Inferring genome ancestry and estimatingmolecular relatedness among 187 Chinese maize inbred lines.J.Genet.&Genomics 34(8) ： 738-748。一、 低氮逆境下与正常条件下的表型鉴定
     表型鉴定年份与地点分别为 ： 北京 (2007 年春播 )、 公主岭 (2007 年吉林公主岭春 播 )、 三亚 (2007 年冬播、 2008 年冬播 )。
     设施氮肥与不施氮肥 2 个处理， 每个处理设三次重复。小区行长 3.6m， 行距 0.6m， 2 2 株距 0.2m。 施氮肥处理 ： 播种时施 60kg/hm P2O5 和 45kg/hm K2O 作为底肥， 3 叶期施 69kg/hm2 纯氮， 大喇叭口期追施 172.5kg/hm2 纯氮 ； 不施氮肥处理 ： 播种时施 60kg/hm2P2O5 和 45kg/ hm2K2O 作为底肥， 整个实验阶段不施氮肥。成熟后以小区为单位进行收获， 每小区去行头行 尾各 2 株， 以避免边际效应的影响， 挑取中间连续 10 株， 以避免缺苗处留空给相邻植株带来 更大的地上地下空间优势。 风干后室内常规考种， 本分析中主要采用单株籽粒数平均数。 结 果见表 7。 考察低氮 (LN) 与正常氮 (HN) 情况下单株籽粒数， 计算低氮与正常氮情况下平均 单株籽粒数的系数和指数。
     系数＝ LN 单株籽粒数 /HN 单株籽粒数 ×100％ ；
     指数＝ (HN 单株籽粒数 -LN 单株籽粒数 )/HN 单株籽粒数 ×100％。
     结果见表 7。
     二、 应用实施例 2 设计的特异引物对进行分型 分别对 127 个玉米自交系进行基因分型， 步骤同实施例 3 的步骤二。
     电泳显示一条 329bp 的条带的为插入纯合型样本， 显示一条 317bp 的条带的为缺 失纯合型样本。
     分型结果见表 7。
     表 7 供体与推荐受体目标标记基因型与两年 3 个地点 6 个环境的单株籽粒数表型
     具有缺失基因型的玉米自交系 CA156、 合 344 或齐 205 型在低氮下正常氮情况下单 株籽粒数差异小， 系数高， 指数低， 育种时可作为供体亲本。 124 个插入基因型的玉米自交系 在低氮下正常氮情况下单株籽粒数差异大， 系数低， 指数高， 育种时可作为受体亲本。育种 方法可有如下几种 ： 1) 回交改良 ： 通过回交的方法改良表 7 中受体自交系， 以表 6 中供体自 交系为轮回亲本， 杂交与回交的过程中利用本发明的特异引物对， 选择低氮逆境下高玉米 籽粒数谷氨酰胺合成酶 Gln1-3 基因优异等位基因 ； 2) 系谱法选系 ： 通过杂交的方法， 选择 自交系 CA156、 合 344 或齐 205 与表 6 中供体自交系杂交或三交后选择含谷氨酰胺合成酶 Gln1-3 基因优异等位基因开展系谱法选系 ； 3) 其它未知材料的改良 ： 通过杂交或回交的方 法， 以玉米自交系 CA156、 合 344 或齐 205 为优异等位基因供体， 通过杂交或回交等过程中， 选择改良其它未知材料中， 筛选含有低氮逆境下高玉米籽粒数谷氨酰胺合成酶 Gln1-3 基 因优异等位基因育种材料或中间材料。
     实施例 5、 特异引物对在育种中的应用
     以缺失 (D) 优良基因型 CA156 为供体， 插入 (I) 基因型武 314 为受体， 获得 F1 代 ； 将 F1 代自交， 获得 32 株 F2 代群体。对 F2 代群体其中 32 株个体分别提取基因组 DNA， 用实 施例 2 设计的特异引物对进行 PCR， 通过电泳检测 PCR 扩增产物， 方法同实施例 3 的步骤二。
     结果见图 2。得到 6 株纯合缺失 (Deletion) 基因型个体 (D)， 12 株插入 / 缺失杂 合的共显性 (Co-dominant) 基因型个体 (C)， 14 株纯合插入 (Insertion) 基因型个体 (I)。 其中， 上述 6 株纯合缺失个体可以作为该基因型优良纯合个体直接进入育种应用， 12 株插 入 / 缺失杂合的共显性个体后代可以在后代中应用本方法检测纯合缺失个体再加以育种
     应用。 将 F2 代群体种植于实施例 3 的低氮地块， 收获后统计各个基因型群体的平均单株 籽粒数。 基因型为 I 的群体的平均单株籽粒数为 125.2， 基因型为 D 的群体的平均单株籽粒 数为 324.5， 基因型为 C 的群体的平均单株籽粒数为 308.4。
     本发明涉及玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用。背景技术 玉米是重要的粮食、 饲料和工业原料作物， 在国民经济发展中占有重要地位。 我国 自 2007 年以来， 玉米已是播种面积上的第一大作物。氮肥是玉米产量的重要的限制因素。 然而， 氮肥施用量上升的幅度远远大于玉米增产的幅度， 我国玉米生产对氮肥的依赖强， 氮 肥利用效率低， 玉米等禾谷类作物氮利用效率平均仅约为 33％。 大量施用氮肥， 还引起地下 水硝酸盐含量超标、 地表水体富营养化等面源污染。 因此， 玉米氮利用效率与耐低氮相关的 基础与应用研究是我国当前农业科研领域的重大需求， 具有十分重要的意义。 当前， 玉米品 种增产的主要途径是进一步增加播种密度， 随着密度的上升， 玉米植株之间对环境养分的 竞争将进一步加剧。因此， 氮高效与耐低氮玉米品种选育是未来商业玉米育种中品种培育 与遗传改良的重要方向。
     由于氮高效利用等复杂农艺性状往往受多基因位点控制和环境影响等原因， 常规 筛选很难收到理想效果。谷氨酰胺合成酶是玉米等禾谷类作物氮利用效率相关的氮同化、 活化、 转运与再同化途径的代谢中枢酶， 是氮同化及氮利用效率的关键基因， 也是了解玉米 等禾谷类作物氮利用效率的重要切入点。研究也表明， 低氮情况下籽粒数的高低对产量的 影响最大， 因此， 提高低氮逆境下玉米穗部籽粒数， 是耐低氮品种改良与选择的重要方向。
     育种材料选育过程中， 杂交、 回交或自交过程中均是人工授粉， 授粉质量直接决定 了籽粒数与结实性， 待选育材料的籽粒数并不是基因效应的体现。 同时， 籽粒数还受复杂的 环境效应影响。因此， 材料选择过程中， 常规育种方法无法对玉米籽粒数性状进行选择。也 即通常所说的， 育种过程中性状对选择不会响应。 此外， 研究低氮逆境下育种材料的产量对 低氮处理的表现， 需要建立贫瘠试验条件。发展一种普通条件下依据基因型选择的技术可 以有效的解决上述两个问题， 具有重要的开发与利用价值。
     发明内容
     本发明的目的是提供玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开 发与应用， 具体设计一种 12bp 的标记， 基于该标记的引物对及其在辅助鉴别在低氮环境下 具有不同单株籽粒数目性状的玉米中的应用。
     本发明提供了辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的引物对， 是序列表的序列 2 所示 DNA 和序列表的序列 3 所示 DNA 组成的引物对。
     所述引物对可用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米。
     本发明还保护一种辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的方 法， 包括如下步骤 ： 以待测玉米的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对进行 PCR 扩增 ； 如果 PCR 扩增产物为一种， 且大小为 329bp， 待测玉米为插入纯合型 ； 如果 PCR 扩增产物为一种， 且大小为 317bp， 待测玉米为缺失纯合型 ； 缺失纯合型 ( 优良基因型 ) 玉米在低氮环境下的单株 籽粒数目高于插入纯合型 ( 非优良基因型 ) 玉米在低氮环境下的单株籽粒数目。如果 PCR 扩增产物为两种， 大小分别为 329bp 和 317bp， 待测玉米为插入 / 缺失杂合型， 可以其后代 中， 分离得到缺失纯合型 ( 优良基因型 )。
     本发明还保护一种玉米育种方法， 是选择所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米进行 育种。
     本发明还保护另一种玉米育种方法， 包括如下步骤 ： 将供体亲本与受体亲本杂交 得到 F1 代， 将 F1 代自交， 得到 F2 代 ； 以 F2 代玉米的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对进行 PCR 扩增 ； PCR 扩增产物为一种且大小为 317bp 的 F2 代玉米为选育得到的玉米 ； 所述供体亲 本为采用所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米， 所述受体亲本为采用所述方法鉴别出的插入 纯合型玉米。
     所述供体亲本具体可为玉米品种 CA156， 所述受体亲本具体可为玉米品种武 314。
     PCR 扩增产物可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法或琼脂糖凝胶电脉溴化乙锭 (EB) 进行检测。
     所述引物对可用于制备辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米 的试剂盒。 本发明还保护序列表的序列 4 所示的 DNA， 即 12bp 的缺失区域， 该区域可以作为分 子标记， 用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米， 进而用于玉米育 种。
     以上所述低氮环境均指全氮量低于 0.4％ ( 质量百分含量 ) 的土壤。
     耐氮贫瘠稳产品种是发展方向， 选择低氮逆境下高籽粒数是重要的选择性状。本 发明的方法可用于选择低氮逆境下具有高籽粒数性状的玉米品种， 将其用于育种。本发明 的方法可以在早期种子 ( 取部分胚乳不影响播种后种子活力 ) 或幼苗阶段筛选， 受体可以 是已知的常用的玉米育种亲本， 也可以是未知材料， 如自交系、 杂交种、 地方品种、 开放授粉 群体等种质资源， 获得含有目标基因型的个体， 对培育高产、 稳产、 抗逆的玉米品种具有重 要指导作用， 是针对基因的选择， 加快育种速度， 降低育种成本， 并具有操作简单， 成本低 廉， 周期短的优点， 适于推广应用， 为玉米种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法， 具有很 高的开发价值。
    附图说明 图 1 为两年低氮环境下各性状对产量性状及性状之间的作用的通径分析 ； 叶绿素 含量 ： 以 SPAD 计测定大喇叭口期相对叶绿素含量值 ； 生物量 ： 以 GreenSeeker 测定的大喇 叭口期相对生物量 NDVI 值 ； ** ： p ＝ 0.01 水平显著 ； ns ： 不显著。
     图 2 为 实 施 例 5 中 F2 代 植 株 的 鉴 定 电 泳 图 ； size ： 分 子 量 marker ； I： 纯合插 入 (Insertion) 基因型 ； D： 纯合缺失 (Deletion) 基因型 ； C： 插入 / 缺失杂合的共显性 (Co-dominant) 基因型。
    具体实施方式
     以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。
     实施例 1 中用于优异等位基因鉴定的 180 个玉米自交系 ( 见表 1) 均为我国玉米 育种当前经常应用的亲本自交系 ； 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。各个自 交系的遗传背景分析结果参见 (Chuanxiao Xie， Shihuang Zhang， Minshun Li， Xinhai Li， Zhuanfang Hao， Li Bai， Degui Zhang， Yehong Liang.(2007)Inferring genome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbredlines. J.Genet.& Genomics 34(8) ： 738-748)， 并作为主要遗传类群的依据。
     表 1 关联性分析自然群体自交系及其系谱来源
    
    
    实施例 1、 玉米籽粒数的遗传分析
     一、 田间试验设计与考种
     180 个玉米自交系， 采用 α-lattice 设计， 设施氮肥与不施氮肥 2 个处理， 每个处 理设三次重复。小区行长 3.6m， 行距 0.6m， 株距 0.2m。施氮肥处理 (NP) 播种时各分别施 2 2 60kg/hm P2O5 和 45kg/hm K2O 作为底肥， 3 叶期施 69kg/hm2 纯氮， 大喇叭口期追施 172.5kg/
     hm2 纯氮 ； 不施氮肥 (NDP) 处理， 磷钾肥的施用量与施氮区相同， 其他时期不再施肥。 成熟后 以小区为单位进行收获， 每小区去行头行尾各 2 株， 以避免边际效应的影响， 挑取中间连续 10 株， 以避免缺苗处留空给相邻植株带来更大的地上地下空间优势。 风干后室内常规考种， 本专利分析中主要采用单株籽粒数。结果见表 2。
     表 2 各性状联合方差分析 F 值表
    注： * 和料分别表示显著性水平为 0.05 和 0.01。
     结论 ： 玉米籽粒数主要受遗传控制， 并显著受环境影响 ； 低氮处理是玉米的籽粒 数变异的主要来源， 对玉米籽粒数的影响巨大。
     二、 籽粒数与其它重要农艺性状的关系
     考察 180 个自交系低氮逆境下与正常供氮条件下籽粒数 (EKN) 与叶绿素含量 (SPAD1 ： 大喇叭口期 ； SPAD2 ： 开花期 )、 大喇叭口期均一化植被指数 (NDVI)、 株高 (PH)、 雌 雄开花间隔期 (ASI)、 氮利用农学效率 (AE)、 籽粒氮含量 (GN)、 结实株数百分率 (ESP)、 秃尖 (BT) 与百粒重 (HKW) 等可能有关的重要农艺性状之间的相关性， 两年两点结果见表 3。
     表 3 低氮与正常氮条件下遗传相关 ( 上对角线区 ) 表型相关性 ( 下对角线区 ) 结 果
    
    结论 ： 缺氮条件与正常供氮条件下， 籽粒数 (EKN) 与产量 (GY) 和氮的农学利用效 率 (AE) 均有较高的遗传相关性与表型相关性， 表明籽粒数性状对产量性状与氮利用效率 的表型有贡献， 且遗传上有较重要的相关性。 诸多考察性状中， 籽粒数对低氮与正常氮条件 下的产量与氮利用效率非常重要。
     180 个自交系两年低氮环境下各性状对产量性状及性状之间的作用的通径分 析 见 图 1。 单 箭 头 ： 通 径 系 数 (path coefficients) ； 双箭头 ： 相 关 系 数 (correlation coefficients) ； 产量， grain yield ； 氮农学效率， agronomic efficiency(kg kg-1N) ； 籽粒 数， ear kernel number ； 百粒重 (g)， hundred kernels weight ； N％ ： 籽粒氮含量， N content in dry grains ； 生物量 ： 归一化植被指数， Normalized difference vegetation index ； SPAD ： 大喇叭口期叶绿相对含量 SPAD 计值 ； ** 显著 p ＝ 0.01 水平 ； ns ： 不显著， p ＝ 0.05 水平。
     产量 (GY) 通径分析结果表明 ： 低氮情况下的籽粒数对产量直接效应高， 是考察项 目中最重要的表型因素之一。因此， 玉米低氮情况的籽粒数与玉米产量最为相关。
     实施例 2、 分子标记的发现和特异引物对的设计
     一、 分子标记的发现
     分析 180 个自交系谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 的测序结果， 发现一个 12bp 的插 入 / 缺失 (Indels) 位点， 位于该基因上游调控区 -274 至 -285 位， 序列如下 ：
     5’ -CCGCGTCGAGGA-3’ 。
     具有上述序列的基因为野生型， 缺失上述序列的基因为突变型。
     二、 特异引物对的设计
     根据序列设计特异引物对如下 ：
     正向引物 ： 5’ -ATGTAACTGACAGGTGGGCCT-3’ ( 序列表的序列 2) ；
     反向引物 ： 5’ -TTGAGATTGAGGACGAAGGGA-3’ ( 序列表的序列 3)。
     以野生型谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 为模板， 用上述引物对 PCR 扩增得到序列 表的序列 1 所示的 DNA 片段， 该 DNA 片段为谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 上游调控区 -60 至 -388 位， 共 329bp。以突变型谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 为模板， 用上述引物对 PCR 扩
     增得到将序列表的序列 1 缺失自 5’ 末端 104 至 115 位核苷酸所示的 DNA 片段， 共 317bp。
     由于大小差异为 12bp， 为方便 PCR 检测， 可以选用基于聚丙烯酰胺凝胶电泳结合 银染方法检测扩增片段。插入纯合型样本电泳显示一条 329bp 的条带， 缺失纯合型样本电 泳显示一条 317bp 的条带， 杂合型样本电泳显示 329bp 和 317bp 的两条带。因此， 该检测的 标记是一个共显性标记， 不仅可以区分不同的基因型， 还可以区分该基因不同等位基因的 杂合个体与纯合个体。
     实施例 3、 12bp 的插入 / 缺失与低氮环境下玉米籽粒数的关联分析
     一、 低氮逆境下与正常条件下的表型鉴定
     1、 试验地点与土壤养分含量分析
     于 2007、 2008 年冬在海南崖城中国农科院作物科学研究所试验基地 ( 水南村 ) 进 行， 试验地为砂壤土， 为达到低氮逆境， 经过 3 年 6 个生长季节的氮耗竭处理。处理方法是 每季种植玉米杂交种， 不施肥， 玉米成熟后全株移除。
     土壤在施肥前取样进行养分含量测定， 按常规的五点取样法取 5 个土壤样本， 取 各测定值的平均值代表该地块的土壤养分含量。 用凯氏蒸馏法测全氮 (Bremner， J.M.1996. Nitrogen-total.p.1085-112.In D.L.Sparks(ed)Methods of soil analysis.Part 3.Chemical methods.SSSA Book Ser.5.SSSA and ASA， Madison， WI.) ；用 HClO4-H2SO4 消 煮 - 钼 锑 抗 比 色 法 测 全 磷 含 量 (Olsen， S.R.and Sommers， L.E.(1982)Phosphorus. In A.L.Page， R.H.Miller， and D.R.Keeney(ed.) ： Methods of Soil Analysis(part2) ： Chemical and Microbiological Properties ， 2nd end.ASA SSSA ， Madision ， WI ， p.403-440) ； 用 碳 酸 氢 钠 提 取 - 钼 锑 抗 比 色 法 (Olsen 法 ) 测 有 效 磷 (Olsen， S.R.， C.V.Cole， F.S.Watanabe， and L.A.Dean.1954.Estimation of available phosphorus in soils by extraction with sodium bicarbonate.USDA Circ.939.U.S.Gov.Print. Office， Washington， DC.) ； 用油浴加热重铬酸钾氧化 - 容量法测有机质 (GB 9834-88) ； 用乙酸铵浸提 - 原子吸收分光光度计法测速效钾 (Van Reeuwijk， L.P.1992.Procedures for soil analysis， 3rd ed.ISRIC， Wageningen， The Netherlands.) ； 用硝酸提取 - 原子 吸收分光光度法测缓效钾 (Van Reeuwijk， L.P.1992.Procedures for soil analysis， 3rd ed.ISRIC， Wageningen， The Netherlands.) ； 用电位法 ( 水土比为 2.5 ∶ 1) 测 pH 值 (GB7859-57)。氮耗竭地块与正常地块土壤养分含量及差异分析见表 4。低氮地块 ( 又称氮 耗竭地块， NDP， Nitrogen depleted pool) 与正常地块 (NP， Applied nitrogen field) 除 氮养分差异很大之外， 其它养分基本持平。
     表 4 低氮地块与正常地块养分及对比 .
    全氮 (g.kg1) NDP NP t-Test Pr ＞ t 0.49±0.04 0.68±0.03 11.45 0 总磷 (g.kg-1) 0.52±0.04 0.56±0.09 1.45 0.21 有机质 (g.kg-1) 速效磷 (mg.kg-1) 8.93±0.88 9.23±0.85 1.18 0.29 30.04±6.44 36.81±14.56 0.97 0.38 速效钾 (mg.kg-1) 179.13±26.83 176.69±39.03 0.13 0.9 总钾 K(mg.kg-1) 432.79±70.84 402.98±34.64 0.73 0.5 pH 6.31±0.09 6.23±0.19 0.74 0.49连续进行两年实验 ： 180 个玉米自交系分别种质于低氮地块与正常地块， 每个株 系每个地块种植 3 行， 行长 3.6m， 行距 0.6m， 株距 0.2m， 收获后统计各个自交系的单株籽粒 数。
     二、 应用实施例 2 设计的特异引物对进行分型
     分别对 180 个玉米自交系进行基因分型， 步骤如下 ：
     1、 提取基因 DNA。
     2、 以基因组 DNA 为模板， 用实施例 2 设计的特异引物对进行 PCR 扩增， 得到 PCR 扩 增产物。
     PCR 反应体系 (10μL) 见表 5。
     表 5PCR 反应体系
    组分 ddH2O 10×Buffer( 含 20mmol/L Mg2+) dNTP(25mmol/L each) 引物 (20μmol/L each) Taq 酶 (2U/μL)( 鼎国公司 ) DNA(10ng/μL)
    终浓度 1× 均为 250μmol/L 0.26μmol/L each 0.5U 25ng加入体积 6.02μL 1μL 0.1μL 0.13μL 0.25μL 2.5μL反应液上加盖 15μL 矿物油 (Sigma)， 以防止反应过程中水分蒸发。
     PCR 反应程序 (PTC-200PCR 仪 ； MJ Research， Waterson， MA) ： 94℃， 4 分钟， 预变性 ； 94℃变性 45 秒， 52℃退火 30 秒， 72℃延伸 30 秒， 35 个循环 ； 72℃终延伸 8 分种 ； 4℃保存。
     3、 将 PCR 扩增产物进行 4.5％聚丙烯酰胺电泳。
     在 10μLPCR 扩增产物中加入 5μL3×Loading Buffer， 混匀后， 在 95℃变性 5min， 立即放至冰上冷却 10min 以上， 得到样品。每一个加样孔点入 4μL 样品 ( 分子量标准为 pBR322DNA/MspI)， 在 70W 恒功率下电泳约 40-60min。
     电泳结束后， 进行银染显色。
     染 色 液 由 1g AgNO3 和 1.5mL 37 ％ ( 体 积 百 分 含 量 ) 甲 醛 水 溶 液 组 成， 染色 10-15min。
     显影液由 30g 无水 Na2CO3、 200μL 1％ Na2S2O3 水溶液和 1.5mL 37％ ( 体积百分含 量 ) 甲醛水溶液组成， 至带纹出现。
     定影液为 10％ ( 体积百分含量 ) 醋酸水溶液， 定影 2min。
     三、 各个样本的基因型和单株籽粒数
     根据 Pritchard 等 2000 的方法获得了供试材料的群体结构数据 ( 即 Q 数据 )， 根据 Yu 等 2005 年在 《Nature Genetics》 上发表的分别利用群体结构 (Q) 与成对家系指数 (k) 数据结合多环境 (e) 条件下的一般线性模型 (GLM) 与复合线性模型 (MLM) 模型计算性 状与标记之间的关联性。使用 TASSEL2.0 软件 ( 美国康奈尔大学开发 ) 进行基于候选基因 的关联性分析。供试材料的群体结构数据 (Q) 与亲缘关系辅助计算数据等已公开发表数 据 (Chuanxiao Xie， Marilyn Warburton， Mingshun Li， Xinhai Li， Muji Xiao， Zhuanfang Hao， Qi Zhao and Shihuang Zhang.(2008)An analysis ofpopulation structure and linkage disequilibrium using multilocus data in 187maize inbred lines.Mol. Breeding 21(4) ： 407-418)。 目 标 基 因 的 基 因 型 数 据 ： (Gln1-3 180lines alignment rusults.phy)( 注 ： 本文件需要 PHYLIP 等软件方可打开， 有所有材料的该基因全长序列数 据， 不仅含有本标记开发区间的 )。表型鉴定数据 ： 谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 基因与低 氮逆境下单株籽粒数关联性分析结果见表 6。
     表 6 谷氨酰胺合成酶基因 Gln1-3 基因与低氮逆境下籽粒数关联性分析结果
    位点 -285 2581 396 3265 -111 1422 2934
    位置 5’ 调控区 第 9 外显子 第 1 内含子 3’ 调控区 5’ 调控区 第 4 内含子 第 10 外显子类型 Indels SNP Indels Indels SNP SNP SNP序列 5’ -3’ CCGCGTCGAGGA C/G CCTCTTGTTT GGCCG C/G T/C C/Gp Marker 0.003 0.852 0.218 0.060 0.005 0.000 0.404单位点解释表型 (％ ) 16.85 3.86 3.52 2.53 2.36 2.13 1.17位于该基因 -285 上游调控区一个 12bp 的插入 / 缺失 (Indels) 位点与低氮逆境 下单株籽粒数关联性强， 单位点可解释的表型变异高达 16.85％ (p ＜ 0.05)， 具有很高的标 记开发与利用价值。
     该 12bp 的插入 / 缺失 (Indels) 位点与低氮逆境下单株籽粒数关联性强， 其中缺 失的等位基因型是优异等位基因型 ( 缺失型单株籽粒数高于插入型单株籽粒数 )， 单位点 可解释的表型变异高达 16.85％ (p ＜ 0.05)， 具有很高的标记开发与利用价值。
     实施例 4、 12bp 的插入 / 缺失与低氮环境下玉米单株籽粒数的关联分析
     127 个玉米自交系 ： 公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得 ； 参考文献 ： Chuanxiao Xie， Shihuang Zhang， Minshun Li， Xinhai Li， Zhuanfang Hao， Li Bai， Degui Zhang， Yehong Liang.(2007)Inferring genome ancestry and estimatingmolecular relatedness among 187 Chinese maize inbred lines.J.Genet.&Genomics 34(8) ： 738-748。一、 低氮逆境下与正常条件下的表型鉴定
     表型鉴定年份与地点分别为 ： 北京 (2007 年春播 )、 公主岭 (2007 年吉林公主岭春 播 )、 三亚 (2007 年冬播、 2008 年冬播 )。
     设施氮肥与不施氮肥 2 个处理， 每个处理设三次重复。小区行长 3.6m， 行距 0.6m， 2 2 株距 0.2m。 施氮肥处理 ： 播种时施 60kg/hm P2O5 和 45kg/hm K2O 作为底肥， 3 叶期施 69kg/hm2 纯氮， 大喇叭口期追施 172.5kg/hm2 纯氮 ； 不施氮肥处理 ： 播种时施 60kg/hm2P2O5 和 45kg/ hm2K2O 作为底肥， 整个实验阶段不施氮肥。成熟后以小区为单位进行收获， 每小区去行头行 尾各 2 株， 以避免边际效应的影响， 挑取中间连续 10 株， 以避免缺苗处留空给相邻植株带来 更大的地上地下空间优势。 风干后室内常规考种， 本分析中主要采用单株籽粒数平均数。 结 果见表 7。 考察低氮 (LN) 与正常氮 (HN) 情况下单株籽粒数， 计算低氮与正常氮情况下平均 单株籽粒数的系数和指数。
     系数＝ LN 单株籽粒数 /HN 单株籽粒数 ×100％ ；
     指数＝ (HN 单株籽粒数 -LN 单株籽粒数 )/HN 单株籽粒数 ×100％。
     结果见表 7。
     二、 应用实施例 2 设计的特异引物对进行分型 分别对 127 个玉米自交系进行基因分型， 步骤同实施例 3 的步骤二。
     电泳显示一条 329bp 的条带的为插入纯合型样本， 显示一条 317bp 的条带的为缺 失纯合型样本。
     分型结果见表 7。
     表 7 供体与推荐受体目标标记基因型与两年 3 个地点 6 个环境的单株籽粒数表型
    
    
    具有缺失基因型的玉米自交系 CA156、 合 344 或齐 205 型在低氮下正常氮情况下单 株籽粒数差异小， 系数高， 指数低， 育种时可作为供体亲本。 124 个插入基因型的玉米自交系 在低氮下正常氮情况下单株籽粒数差异大， 系数低， 指数高， 育种时可作为受体亲本。育种 方法可有如下几种 ： 1) 回交改良 ： 通过回交的方法改良表 7 中受体自交系， 以表 6 中供体自 交系为轮回亲本， 杂交与回交的过程中利用本发明的特异引物对， 选择低氮逆境下高玉米 籽粒数谷氨酰胺合成酶 Gln1-3 基因优异等位基因 ； 2) 系谱法选系 ： 通过杂交的方法， 选择 自交系 CA156、 合 344 或齐 205 与表 6 中供体自交系杂交或三交后选择含谷氨酰胺合成酶 Gln1-3 基因优异等位基因开展系谱法选系 ； 3) 其它未知材料的改良 ： 通过杂交或回交的方 法， 以玉米自交系 CA156、 合 344 或齐 205 为优异等位基因供体， 通过杂交或回交等过程中， 选择改良其它未知材料中， 筛选含有低氮逆境下高玉米籽粒数谷氨酰胺合成酶 Gln1-3 基 因优异等位基因育种材料或中间材料。
     实施例 5、 特异引物对在育种中的应用
     以缺失 (D) 优良基因型 CA156 为供体， 插入 (I) 基因型武 314 为受体， 获得 F1 代 ； 将 F1 代自交， 获得 32 株 F2 代群体。对 F2 代群体其中 32 株个体分别提取基因组 DNA， 用实 施例 2 设计的特异引物对进行 PCR， 通过电泳检测 PCR 扩增产物， 方法同实施例 3 的步骤二。
     结果见图 2。得到 6 株纯合缺失 (Deletion) 基因型个体 (D)， 12 株插入 / 缺失杂 合的共显性 (Co-dominant) 基因型个体 (C)， 14 株纯合插入 (Insertion) 基因型个体 (I)。 其中， 上述 6 株纯合缺失个体可以作为该基因型优良纯合个体直接进入育种应用， 12 株插 入 / 缺失杂合的共显性个体后代可以在后代中应用本方法检测纯合缺失个体再加以育种
     应用。 将 F2 代群体种植于实施例 3 的低氮地块， 收获后统计各个基因型群体的平均单株 籽粒数。 基因型为 I 的群体的平均单株籽粒数为 125.2， 基因型为 D 的群体的平均单株籽粒 数为 324.5， 基因型为 C 的群体的平均单株籽粒数为 308.4。
    19101942512 A CN 101942517
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