玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用.pdf

1、10申请公布号CN101942512A43申请公布日20110112CN101942512ACN101942512A21申请号201010263549122申请日20100825C12Q1/68200601C12N15/11200601A01H1/0220060171申请人中国农业科学院作物科学研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号作物科学研究所72发明人谢传晓李新海陈现平吴永升张世煌郝转芳翁建峰李明顺张德贵白丽74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华54发明名称玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用57摘要本发明公开了一种玉米低

2、氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用。本发明提供分子标记是序列表的序列4所示的DNA。基于该标记，本发明提供了序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。所述分子标记和所述引物对可用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米，进而用于玉米育种。本发明的方法可以在早期种子或幼苗阶段筛选，对培育高产、稳产、抗逆的玉米品种具有重要指导作用，可以加快育种速度，降低育种成本，并具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为玉米种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法，具有很高的开发价值。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书

3、1页说明书17页序列表2页附图1页CN101942517A1/1页21辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的引物对，是序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。2权利要求1所述引物对在辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米中的应用。3一种辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的方法，包括如下步骤以待测玉米的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物为一种，且大小为329BP，待测玉米为插入纯合型；如果PCR扩增产物为一种，且大小为317BP，待测玉米为缺失纯合型；缺失纯合型玉米在低氮环境下的单株籽粒数目高于

4、插入纯合型玉米在低氮环境下的单株籽粒数目。4一种玉米育种方法，是选择权利要求3所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米进行育种。5一种玉米育种方法，包括如下步骤将供体亲本与受体亲本杂交得到F1代，将F1代自交，得到F2代；以F2代玉米的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增；PCR扩增产物为一种且大小为317BP的F2代玉米为选育得到的玉米；所述供体亲本为采用权利要求3所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米，所述受体亲本为采用权利要求3所述方法鉴别出的插入纯合型玉米。6如权利要求5所述的方法，其特征在于所述供体亲本为玉米品种CA156，所述受体亲本为玉米品种武314。7权利要求1所述引物对在制

5、备辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的试剂盒中的应用。8序列表的序列4所示的DNA。9权利要求8所述DNA在辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米中的应用。10权利要求8所述DNA在玉米育种中的应用。权利要求书CN101942512ACN101942517A1/17页3玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用技术领域0001本发明涉及玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用。背景技术0002玉米是重要的粮食、饲料和工业原料作物，在国民经济发展中占有重要地位。我国自2007年以来，玉米已是播种面积上的第一大作物。氮肥是玉米产量的重要的限

6、制因素。然而，氮肥施用量上升的幅度远远大于玉米增产的幅度，我国玉米生产对氮肥的依赖强，氮肥利用效率低，玉米等禾谷类作物氮利用效率平均仅约为33。大量施用氮肥，还引起地下水硝酸盐含量超标、地表水体富营养化等面源污染。因此，玉米氮利用效率与耐低氮相关的基础与应用研究是我国当前农业科研领域的重大需求，具有十分重要的意义。当前，玉米品种增产的主要途径是进一步增加播种密度，随着密度的上升，玉米植株之间对环境养分的竞争将进一步加剧。因此，氮高效与耐低氮玉米品种选育是未来商业玉米育种中品种培育与遗传改良的重要方向。0003由于氮高效利用等复杂农艺性状往往受多基因位点控制和环境影响等原因，常规筛选很难收到理想

7、效果。谷氨酰胺合成酶是玉米等禾谷类作物氮利用效率相关的氮同化、活化、转运与再同化途径的代谢中枢酶，是氮同化及氮利用效率的关键基因，也是了解玉米等禾谷类作物氮利用效率的重要切入点。研究也表明，低氮情况下籽粒数的高低对产量的影响最大，因此，提高低氮逆境下玉米穗部籽粒数，是耐低氮品种改良与选择的重要方向。0004育种材料选育过程中，杂交、回交或自交过程中均是人工授粉，授粉质量直接决定了籽粒数与结实性，待选育材料的籽粒数并不是基因效应的体现。同时，籽粒数还受复杂的环境效应影响。因此，材料选择过程中，常规育种方法无法对玉米籽粒数性状进行选择。也即通常所说的，育种过程中性状对选择不会响应。此外，研究低氮逆

8、境下育种材料的产量对低氮处理的表现，需要建立贫瘠试验条件。发展一种普通条件下依据基因型选择的技术可以有效的解决上述两个问题，具有重要的开发与利用价值。发明内容0005本发明的目的是提供玉米低氮逆境下高籽粒数目优异等位基因功能分子标记开发与应用，具体设计一种12BP的标记，基于该标记的引物对及其在辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米中的应用。0006本发明提供了辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的引物对，是序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。0007所述引物对可用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米。0008本发明还保护一种

9、辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的方法，包括如下步骤以待测玉米的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物为一种，且大小为329BP，待测玉米为插入纯合型；如果PCR扩增产物为一种，且大说明书CN101942512ACN101942517A2/17页4小为317BP，待测玉米为缺失纯合型；缺失纯合型优良基因型玉米在低氮环境下的单株籽粒数目高于插入纯合型非优良基因型玉米在低氮环境下的单株籽粒数目。如果PCR扩增产物为两种，大小分别为329BP和317BP，待测玉米为插入/缺失杂合型，可以其后代中，分离得到缺失纯合型优良基因型。0009本发明还保护一种玉米育

10、种方法，是选择所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米进行育种。0010本发明还保护另一种玉米育种方法，包括如下步骤将供体亲本与受体亲本杂交得到F1代，将F1代自交，得到F2代；以F2代玉米的基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增；PCR扩增产物为一种且大小为317BP的F2代玉米为选育得到的玉米；所述供体亲本为采用所述方法鉴别出的缺失纯合型玉米，所述受体亲本为采用所述方法鉴别出的插入纯合型玉米。0011所述供体亲本具体可为玉米品种CA156，所述受体亲本具体可为玉米品种武314。0012PCR扩增产物可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法或琼脂糖凝胶电脉溴化乙锭EB进行检测。0013所述引物对可用于制

11、备辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状玉米的试剂盒。0014本发明还保护序列表的序列4所示的DNA，即12BP的缺失区域，该区域可以作为分子标记，用于辅助鉴别在低氮环境下具有不同单株籽粒数目性状的玉米，进而用于玉米育种。0015以上所述低氮环境均指全氮量低于04质量百分含量的土壤。0016耐氮贫瘠稳产品种是发展方向，选择低氮逆境下高籽粒数是重要的选择性状。本发明的方法可用于选择低氮逆境下具有高籽粒数性状的玉米品种，将其用于育种。本发明的方法可以在早期种子取部分胚乳不影响播种后种子活力或幼苗阶段筛选，受体可以是已知的常用的玉米育种亲本，也可以是未知材料，如自交系、杂交种、地方品种、开放授

12、粉群体等种质资源，获得含有目标基因型的个体，对培育高产、稳产、抗逆的玉米品种具有重要指导作用，是针对基因的选择，加快育种速度，降低育种成本，并具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为玉米种质的鉴定提供了一种快捷的选择方法，具有很高的开发价值。附图说明0017图1为两年低氮环境下各性状对产量性状及性状之间的作用的通径分析；叶绿素含量以SPAD计测定大喇叭口期相对叶绿素含量值；生物量以GREENSEEKER测定的大喇叭口期相对生物量NDVI值；P001水平显著；NS不显著。0018图2为实施例5中F2代植株的鉴定电泳图；SIZE分子量MARKER；I纯合插入INSERTION基因型；

13、D纯合缺失DELETION基因型；C插入/缺失杂合的共显性CODOMINANT基因型。具体实施方式0019以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验说明书CN101942512ACN101942517A3/17页5方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。0020实施例1中用于优异等位基因鉴定的180个玉米自交系见表1均为我国玉米育种当前经常应用的亲本自交系；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。各个自交系的遗传背景分析结果参见CHUAN

14、XIAOXIE，SHIHUANGZHANG，MINSHUNLI，XINHAILI，ZHUANFANGHAO，LIBAI，DEGUIZHANG，YEHONGLIANG2007INFERRINGGENOMEANCESTRYANDESTIMATINGMOLECULARRELATEDNESSAMONG187CHINESEMAIZEINBREDLINESJGENETGENOMICS348738748，并作为主要遗传类群的依据。0021表1关联性分析自然群体自交系及其系谱来源0022说明书CN101942512ACN101942517A4/17页60023说明书CN101942512ACN10194251

15、7A5/17页70024说明书CN101942512ACN101942517A6/17页80025说明书CN101942512ACN101942517A7/17页900260027实施例1、玉米籽粒数的遗传分析0028一、田间试验设计与考种0029180个玉米自交系，采用LATTICE设计，设施氮肥与不施氮肥2个处理，每个处理设三次重复。小区行长36M，行距06M，株距02M。施氮肥处理NP播种时各分别施60KG/HM2P2O5和45KG/HM2K2O作为底肥，3叶期施69KG/HM2纯氮，大喇叭口期追施1725KG/说明书CN101942512ACN101942517A8/17页10HM2纯

16、氮；不施氮肥NDP处理，磷钾肥的施用量与施氮区相同，其他时期不再施肥。成熟后以小区为单位进行收获，每小区去行头行尾各2株，以避免边际效应的影响，挑取中间连续10株，以避免缺苗处留空给相邻植株带来更大的地上地下空间优势。风干后室内常规考种，本专利分析中主要采用单株籽粒数。结果见表2。0030表2各性状联合方差分析F值表00310032注和料分别表示显著性水平为005和001。0033结论玉米籽粒数主要受遗传控制，并显著受环境影响；低氮处理是玉米的籽粒数变异的主要来源，对玉米籽粒数的影响巨大。0034二、籽粒数与其它重要农艺性状的关系0035考察180个自交系低氮逆境下与正常供氮条件下籽粒数EKN

17、与叶绿素含量SPAD1大喇叭口期；SPAD2开花期、大喇叭口期均一化植被指数NDVI、株高PH、雌雄开花间隔期ASI、氮利用农学效率AE、籽粒氮含量GN、结实株数百分率ESP、秃尖BT与百粒重HKW等可能有关的重要农艺性状之间的相关性，两年两点结果见表3。0036表3低氮与正常氮条件下遗传相关上对角线区表型相关性下对角线区结果00370038说明书CN101942512ACN101942517A9/17页110039结论缺氮条件与正常供氮条件下，籽粒数EKN与产量GY和氮的农学利用效率AE均有较高的遗传相关性与表型相关性，表明籽粒数性状对产量性状与氮利用效率的表型有贡献，且遗传上有较重要的相关

18、性。诸多考察性状中，籽粒数对低氮与正常氮条件下的产量与氮利用效率非常重要。0040180个自交系两年低氮环境下各性状对产量性状及性状之间的作用的通径分析见图1。单箭头通径系数PATHCOEFFICIENTS；双箭头相关系数CORRELATIONCOEFFICIENTS；产量，GRAINYIELD；氮农学效率，AGRONOMICEFFICIENCYKGKG1N；籽粒数，EARKERNELNUMBER；百粒重G，HUNDREDKERNELSWEIGHT；N籽粒氮含量，NCONTENTINDRYGRAINS；生物量归一化植被指数，NORMALIZEDDIFFERENCEVEGETATIONINDEX

19、；SPAD大喇叭口期叶绿相对含量SPAD计值；显著P001水平；NS不显著，P005水平。0041产量GY通径分析结果表明低氮情况下的籽粒数对产量直接效应高，是考察项目中最重要的表型因素之一。因此，玉米低氮情况的籽粒数与玉米产量最为相关。0042实施例2、分子标记的发现和特异引物对的设计0043一、分子标记的发现0044分析180个自交系谷氨酰胺合成酶基因GLN13的测序结果，发现一个12BP的插入/缺失INDELS位点，位于该基因上游调控区274至285位，序列如下00455CCGCGTCGAGGA3。0046具有上述序列的基因为野生型，缺失上述序列的基因为突变型。0047二、特异引物对的设

20、计0048根据序列设计特异引物对如下0049正向引物5ATGTAACTGACAGGTGGGCCT3序列表的序列2；0050反向引物5TTGAGATTGAGGACGAAGGGA3序列表的序列3。0051以野生型谷氨酰胺合成酶基因GLN13为模板，用上述引物对PCR扩增得到序列表的序列1所示的DNA片段，该DNA片段为谷氨酰胺合成酶基因GLN13上游调控区60至388位，共329BP。以突变型谷氨酰胺合成酶基因GLN13为模板，用上述引物对PCR扩说明书CN101942512ACN101942517A10/17页12增得到将序列表的序列1缺失自5末端104至115位核苷酸所示的DNA片段，共317

21、BP。0052由于大小差异为12BP，为方便PCR检测，可以选用基于聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法检测扩增片段。插入纯合型样本电泳显示一条329BP的条带，缺失纯合型样本电泳显示一条317BP的条带，杂合型样本电泳显示329BP和317BP的两条带。因此，该检测的标记是一个共显性标记，不仅可以区分不同的基因型，还可以区分该基因不同等位基因的杂合个体与纯合个体。0053实施例3、12BP的插入/缺失与低氮环境下玉米籽粒数的关联分析0054一、低氮逆境下与正常条件下的表型鉴定00551、试验地点与土壤养分含量分析0056于2007、2008年冬在海南崖城中国农科院作物科学研究所试验基地水南村进行，

22、试验地为砂壤土，为达到低氮逆境，经过3年6个生长季节的氮耗竭处理。处理方法是每季种植玉米杂交种，不施肥，玉米成熟后全株移除。0057土壤在施肥前取样进行养分含量测定，按常规的五点取样法取5个土壤样本，取各测定值的平均值代表该地块的土壤养分含量。用凯氏蒸馏法测全氮BREMNER，JM1996NITROGENTOTALP1085112INDLSPARKSEDMETHODSOFSOILANALYSISPART3CHEMICALMETHODSSSSABOOKSER5SSSAANDASA，MADISON，WI；用HCLO4H2SO4消煮钼锑抗比色法测全磷含量OLSEN，SRANDSOMMERS，LE19

23、82PHOSPHORUSINALPAGE，RHMILLER，ANDDRKEENEYEDMETHODSOFSOILANALYSISPART2CHEMICALANDMICROBIOLOGICALPROPERTIES，2NDENDASASSSA，MADISION，WI，P403440；用碳酸氢钠提取钼锑抗比色法OLSEN法测有效磷OLSEN，SR，CVCOLE，FSWATANABE，ANDLADEAN1954ESTIMATIONOFAVAILABLEPHOSPHORUSINSOILSBYEXTRACTIONWITHSODIUMBICARBONATEUSDACIRC939USGOVPRINTOFFIC

24、E，WASHINGTON，DC；用油浴加热重铬酸钾氧化容量法测有机质GB983488；用乙酸铵浸提原子吸收分光光度计法测速效钾VANREEUWIJK，LP1992PROCEDURESFORSOILANALYSIS，3RDEDISRIC，WAGENINGEN，THENETHERLANDS；用硝酸提取原子吸收分光光度法测缓效钾VANREEUWIJK，LP1992PROCEDURESFORSOILANALYSIS，3RDEDISRIC，WAGENINGEN，THENETHERLANDS；用电位法水土比为251测PH值GB785957。氮耗竭地块与正常地块土壤养分含量及差异分析见表4。低氮地块又称氮耗

25、竭地块，NDP，NITROGENDEPLETEDPOOL与正常地块NP，APPLIEDNITROGENFIELD除氮养分差异很大之外，其它养分基本持平。0058表4低氮地块与正常地块养分及对比0059全氮GKG1总磷GKG1有机质GKG1速效磷MGKG1速效钾MGKG1总钾KMGKG1PHNDP0490040520048930883004644179132683432797084631009NP06800305600992308536811456176693903402983464623019TTEST1145145118097013073074PRT00210290380905049说明书C

26、N101942512ACN101942517A11/17页130060连续进行两年实验180个玉米自交系分别种质于低氮地块与正常地块，每个株系每个地块种植3行，行长36M，行距06M，株距02M，收获后统计各个自交系的单株籽粒数。0061二、应用实施例2设计的特异引物对进行分型0062分别对180个玉米自交系进行基因分型，步骤如下00631、提取基因DNA。00642、以基因组DNA为模板，用实施例2设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。0065PCR反应体系10L见表5。0066表5PCR反应体系0067组分终浓度加入体积DDH2O602L10BUFFER含20MMOL/LMG

27、211LDNTP25MMOL/LEACH均为250MOL/L01L引物20MOL/LEACH026MOL/LEACH013LTAQ酶2U/L鼎国公司05U025LDNA10NG/L25NG25L0068反应液上加盖15L矿物油SIGMA，以防止反应过程中水分蒸发。0069PCR反应程序PTC200PCR仪；MJRESEARCH，WATERSON，MA94，4分钟，预变性；94变性45秒，52退火30秒，72延伸30秒，35个循环；72终延伸8分种；4保存。00703、将PCR扩增产物进行45聚丙烯酰胺电泳。0071在10LPCR扩增产物中加入5L3LOADINGBUFFER，混匀后，在95变性

28、5MIN，立即放至冰上冷却10MIN以上，得到样品。每一个加样孔点入4L样品分子量标准为PBR322DNA/MSPI，在70W恒功率下电泳约4060MIN。0072电泳结束后，进行银染显色。0073染色液由1GAGNO3和15ML37体积百分含量甲醛水溶液组成，染色1015MIN。0074显影液由30G无水NA2CO3、200L1NA2S2O3水溶液和15ML37体积百分含量甲醛水溶液组成，至带纹出现。0075定影液为10体积百分含量醋酸水溶液，定影2MIN。0076三、各个样本的基因型和单株籽粒数0077根据PRITCHARD等2000的方法获得了供试材料的群体结构数据即Q数据，根说明书CN

29、101942512ACN101942517A12/17页14据YU等2005年在NATUREGENETICS上发表的分别利用群体结构Q与成对家系指数K数据结合多环境E条件下的一般线性模型GLM与复合线性模型MLM模型计算性状与标记之间的关联性。使用TASSEL20软件美国康奈尔大学开发进行基于候选基因的关联性分析。供试材料的群体结构数据Q与亲缘关系辅助计算数据等已公开发表数据CHUANXIAOXIE，MARILYNWARBURTON，MINGSHUNLI，XINHAILI，MUJIXIAO，ZHUANFANGHAO，QIZHAOANDSHIHUANGZHANG2008ANANALYSISOFP

30、OPULATIONSTRUCTUREANDLINKAGEDISEQUILIBRIUMUSINGMULTILOCUSDATAIN187MAIZEINBREDLINESMOLBREEDING214407418。目标基因的基因型数据GLN13180LINESALIGNMENTRUSULTSPHY注本文件需要PHYLIP等软件方可打开，有所有材料的该基因全长序列数据，不仅含有本标记开发区间的。表型鉴定数据谷氨酰胺合成酶基因GLN13基因与低氮逆境下单株籽粒数关联性分析结果见表6。0078表6谷氨酰胺合成酶基因GLN13基因与低氮逆境下籽粒数关联性分析结果0079位点位置类型序列53PMARKER单位点

31、解释表型2855调控区INDELSCCGCGTCGAGGA000316852581第9外显子SNPC/G0852386396第1内含子INDELSCCTCTTGTTT021835232653调控区INDELSGGCCG00602531115调控区SNPC/G00052361422第4内含子SNPT/C00002132934第10外显子SNPC/G04041170080位于该基因285上游调控区一个12BP的插入/缺失INDELS位点与低氮逆境下单株籽粒数关联性强，单位点可解释的表型变异高达1685P005，具有很高的标记开发与利用价值。0081该12BP的插入/缺失INDELS位点与低氮逆境下

32、单株籽粒数关联性强，其中缺失的等位基因型是优异等位基因型缺失型单株籽粒数高于插入型单株籽粒数，单位点可解释的表型变异高达1685P005，具有很高的标记开发与利用价值。0082实施例4、12BP的插入/缺失与低氮环境下玉米单株籽粒数的关联分析0083127个玉米自交系公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献CHUANXIAOXIE，SHIHUANGZHANG，MINSHUNLI，XINHAILI，ZHUANFANGHAO，LIBAI，DEGUIZHANG，YEHONGLIANG2007INFERRINGGENOMEANCESTRYANDESTIMATINGMOLECULARRELAT

33、EDNESSAMONG187CHINESEMAIZEINBREDLINESJGENETGENOMICS348738748。说明书CN101942512ACN101942517A13/17页150084一、低氮逆境下与正常条件下的表型鉴定0085表型鉴定年份与地点分别为北京2007年春播、公主岭2007年吉林公主岭春播、三亚2007年冬播、2008年冬播。0086设施氮肥与不施氮肥2个处理，每个处理设三次重复。小区行长36M，行距06M，株距02M。施氮肥处理播种时施60KG/HM2P2O5和45KG/HM2K2O作为底肥，3叶期施69KG/HM2纯氮，大喇叭口期追施1725KG/HM2纯氮；不

34、施氮肥处理播种时施60KG/HM2P2O5和45KG/HM2K2O作为底肥，整个实验阶段不施氮肥。成熟后以小区为单位进行收获，每小区去行头行尾各2株，以避免边际效应的影响，挑取中间连续10株，以避免缺苗处留空给相邻植株带来更大的地上地下空间优势。风干后室内常规考种，本分析中主要采用单株籽粒数平均数。结果见表7。考察低氮LN与正常氮HN情况下单株籽粒数，计算低氮与正常氮情况下平均单株籽粒数的系数和指数。0087系数LN单株籽粒数/HN单株籽粒数100；0088指数HN单株籽粒数LN单株籽粒数/HN单株籽粒数100。0089结果见表7。0090二、应用实施例2设计的特异引物对进行分型0091分别对

35、127个玉米自交系进行基因分型，步骤同实施例3的步骤二。0092电泳显示一条329BP的条带的为插入纯合型样本，显示一条317BP的条带的为缺失纯合型样本。0093分型结果见表7。0094表7供体与推荐受体目标标记基因型与两年3个地点6个环境的单株籽粒数表型00950096说明书CN101942512ACN101942517A14/17页16说明书CN101942512ACN101942517A15/17页1700970098说明书CN101942512ACN101942517A16/17页180099具有缺失基因型的玉米自交系CA156、合344或齐205型在低氮下正常氮情况下单株籽粒数差异

36、小，系数高，指数低，育种时可作为供体亲本。124个插入基因型的玉米自交系在低氮下正常氮情况下单株籽粒数差异大，系数低，指数高，育种时可作为受体亲本。育种方法可有如下几种1回交改良通过回交的方法改良表7中受体自交系，以表6中供体自交系为轮回亲本，杂交与回交的过程中利用本发明的特异引物对，选择低氮逆境下高玉米籽粒数谷氨酰胺合成酶GLN13基因优异等位基因；2系谱法选系通过杂交的方法，选择自交系CA156、合344或齐205与表6中供体自交系杂交或三交后选择含谷氨酰胺合成酶GLN13基因优异等位基因开展系谱法选系；3其它未知材料的改良通过杂交或回交的方法，以玉米自交系CA156、合344或齐205为

37、优异等位基因供体，通过杂交或回交等过程中，选择改良其它未知材料中，筛选含有低氮逆境下高玉米籽粒数谷氨酰胺合成酶GLN13基因优异等位基因育种材料或中间材料。0100实施例5、特异引物对在育种中的应用0101以缺失D优良基因型CA156为供体，插入I基因型武314为受体，获得F1代；将F1代自交，获得32株F2代群体。对F2代群体其中32株个体分别提取基因组DNA，用实施例2设计的特异引物对进行PCR，通过电泳检测PCR扩增产物，方法同实施例3的步骤二。0102结果见图2。得到6株纯合缺失DELETION基因型个体D，12株插入/缺失杂合的共显性CODOMINANT基因型个体C，14株纯合插入I

38、NSERTION基因型个体I。其中，上述6株纯合缺失个体可以作为该基因型优良纯合个体直接进入育种应用，12株插入/缺失杂合的共显性个体后代可以在后代中应用本方法检测纯合缺失个体再加以育种说明书CN101942512ACN101942517A17/17页19应用。0103将F2代群体种植于实施例3的低氮地块，收获后统计各个基因型群体的平均单株籽粒数。基因型为I的群体的平均单株籽粒数为1252，基因型为D的群体的平均单株籽粒数为3245，基因型为C的群体的平均单株籽粒数为3084。说明书CN101942512ACN101942517A1/2页2000010002序列表CN101942512ACN101942517A2/2页21序列表CN101942512ACN101942517A1/1页22图1图2说明书附图CN101942512A