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1、10申请公布号CN101940616A43申请公布日20110112CN101940616ACN101940616A21申请号201010267636422申请日20100831A61K36/53200601A61P3/06200601A61P3/10200601A61P9/0020060171申请人中国药科大学地址210009江苏省南京市中央路童家巷24号72发明人吴斐华梁敬钰刘洋任燕利54发明名称一种防治糖尿病的风轮菜有效部位的制备方法与药物用途57摘要本发明公开了一种防治糖尿病的风轮菜有效部位提取物的制备方法和应用。该有效部位提取物以风轮菜CLINOPODIUMCHINENSEBENTH。
2、OKUNTZE为原料，经粉碎、醇提取、减压回收后碍到浓缩物，浓缩物经石油醚、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取物，再经大孔树脂纯化而得到。该有效部位提取物主要由总黄酮和萜类组成，具有明显的降低链脲佐菌素糖尿病小鼠的血糖，降低血清胆固醇含量，保护胰岛细胞，抑制葡萄糖苷酶活性，和保护血管内皮细胞的作用。可见，风轮菜有效部位提取物具有良好的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能，可用于防治糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱及糖尿病性心脑血管方面并发症。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN101940620A1/1页21一种防治糖尿病的风轮。
3、菜有效部位提取物，其特征在于该有效部位提取物是以风轮菜为原料，经粉碎、提取、减压回收后得浓缩物，浓缩物经萃取后得乙酸乙酯提取物，再经大孔树脂柱进行柱层析而得到提取物粉末。2权利要求1所述的风轮菜有效部位提取物的制备方法，其特征在于取干燥风轮菜，粉碎，乙醇或甲醇或丙醇及它们的含水物回流提取，或浸渍提取，提取液减压浓缩，将浓缩的提取物分散在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取34次，乙酸乙酯提取物用大孔树脂柱进行柱层析，水洗脱杂质后，乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得提取物。3根据权利要求2所述的风轮菜有效部位提取物的制备方法，其特征在于A提取方法为回流、浸渍B纯化的柱材料为大孔树脂，乙醇。
4、梯度洗脱范围为2080。4权利要求1所述的风轮菜有效部位提取物，其特征在于该提取物主要由总黄酮和萜类组成，黄酮的主要成分为香蜂草苷、柚皮素、芹菜素、异樱花素、木犀草素、金合欢素等；熊果酸为萜类的主要成分，采用紫外分光光度法，以NANO2ALNO33NAOH显色测定总黄酮含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低于50。5一种治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于含有权利要求4的植物提取物，与一种或多种辅助剂和/或赋形剂混合。6根据权利要求5的药物组合物，其特征在于其被制备成各种剂型，针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等都为可供选择的药物剂型。7根据权利要求2和3所述的风轮菜有效部位提取物的。
5、制备方法，其所得到的风轮菜有效部位提取物能显著降低糖尿病高血糖、降血脂，保护胰岛细胞，抑制葡萄糖苷酶活性，保护血管内皮细胞。8根据权利要求7所述的风轮菜有效部位提取物的作用，其特征在于所述药物用于预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱及糖尿病性心脑血管方面并发症。权利要求书CN101940616ACN101940620A1/5页3一种防治糖尿病的风轮菜有效部位的制备方法与药物用途一、技术领域0001本发明涉及中药风轮菜有效部位提取物的制备方法，以及该有效部位提取物的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能，及其在防治糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱及糖尿病性心脑血管并发症方面的应用。二、。
6、背景技术0002糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一组代谢异常综合症。据WHO估计19952025年，全球糖尿病发病率将增至35，预计达3亿患者，患者年龄则从65岁以上趋向4554岁。糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病INSULINDEPENDENTDIABETESMELLITUS，IDDM又称1型和非胰岛素依赖型糖尿病NOINSULINDEPENDENTDIABETESMELLITUS，NIDDM又称2型。糖尿病的主要危害在于它的血管并发症，包括大血管病变和微血管病变。糖尿病大血管并发症主要是指脑血管、心血管和下肢血管的病变。糖尿病患者并发心脑血管病的几率要远远高于非糖尿病患者。目前的研究。
7、认为糖尿病引起的大血管病变是糖尿病患者致死致残的主要原因。0003目前治疗糖尿病的药物主要有磺脲类，双胍类、胰岛素、葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷酮类等。这些药会引起一些副作用如低血糖，肝毒性，乳酸性酸中毒及腹泻。中药治疗糖尿病具有明显的优势，其治疗糖尿病是多环节、多途径、多靶点的综合协调作用，其药源丰富、价格低廉、毒副作用小，所以从中药筛选具有抗糖尿病药物的前景是十分广阔的。0004风轮菜为唇形科风轮菜属植物风轮菜CLINOPODIUMCHINENSEBENTHOKUNTZE的全草，风轮菜微苦、涩，凉。归肝经。风轮菜为中华人民共和国药典收载中药断血流的原植物，具有清热解毒、止血活血的功效。风轮菜在。
8、福建民间用于治疗糖尿病。本实验室前期研究发现风轮菜具有降血糖作用，但尚未有针对风轮菜有效部位提取物的制备工艺、以及该有效部位提取物的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能，及其在防治糖尿病及糖尿病性心脑血管并发症方面的报道。三、发明内容0005本发明提供了一种从中药风轮菜中制备有效部位提取物的方法，以及该有效部位提取物的降血糖、降血脂、保护胰岛细胞和血管内皮细胞功能，及其在防治糖尿病及糖尿病性心脑血管并发症方面的应用。00061、风轮菜有效部位提取物的制备方法00071风轮菜全草干燥粉碎；00082乙醇或甲醇或丙醇及它们的含水物回流提取，或浸渍提取，提取液减压浓缩；00093将浓缩的提。
9、取物依次用石油醚、乙酸乙酯萃取34次；00104乙酸乙酯提取物用大孔树脂柱进行柱层析；00115水洗脱杂质后，乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得提取物。0012上述制备方法的条件范围为步骤2中乙醇或甲醇或丙醇的浓度为1090，说明书CN101940616ACN101940620A2/5页4提取方法为回流、浸渍；步骤5中乙醇梯度洗脱范围为2080。00132、风轮菜有效部位提取物主要由总黄酮和萜类组成，黄酮的主要成分为香蜂草苷、柚皮素、芹菜素、异樱花素、木犀草素、金合欢素等；熊果酸为萜类的主要成分。其中总黄酮含量的测定采用紫外分光光度法，以NANO2ALNO33NAOH显色测定总黄酮。
10、含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低于50。0014本发明所述风轮菜有效部位提取物可与常规辅助剂和/或赋型剂混合，制备成各种剂型，用于预防或治疗。针剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等都为可供选择的药物剂型。0015胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂等剂型可以含有一种或多种常用赋型剂一填料和增容剂如淀粉，微晶纤维等；粘合剂如羧甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等；致湿剂如甘油；崩解剂如碳酸钙等；吸收剂如高岭土等；润滑剂如滑石粉等。0016药用赋型剂可以是固体、半固体、液体等各种形态的，配方辅助剂可以是各种类型的。0017溶液剂可以含有一般的溶剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂等，如水、乙醇、甘油、聚乙。
11、二醇、苯甲酸苄酯等。0018胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖衣丸剂、溶液剂等剂型可以用已知的常规方法制备，可以将风轮菜有效部位提取物与一种或多种赋型剂混合，制备剂型。00193、风轮菜有效部位提取物降血糖、降血脂和保护血管内皮细胞活性002031风轮菜有效部位提取物CCE对链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖、胆固醇TC、血清胰岛素及胰岛组织的影响0021随机取出小鼠10只作为正常组，其余小鼠禁食1617H后，尾静脉注射链脲佐菌素160MG/KG，注射后72H后眼眶后静脉丛取血，分离血清，测定血糖，选空腹血糖11MMOL/L的小鼠40只，随机分为4组，分别按10ML/KG体重经口给予CCE50、100MG/KG，。
12、二甲双胍METFORMIN200MG/KG以及等体积的02CMCNA，每日一次，连续12天给药。第6天末次给药后15H禁食5H，小鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清，以葡萄糟氧化酶法测定血糖。末次给药后15H禁食5H，小鼠摘眼球取血，分离血清，以试剂盒方法测定血糖、TC、血清胰岛素。分离小鼠胰腺，将胰腺浸泡在10福尔马林中固定、石蜡包埋，制片，HE染色，作组织病理学检查。0022血糖实验结果如图1所示，与正常组比较，模型组链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖极显著升高P001。与模型组比较，CCE100MG/KG和二甲双胍200MG/KG均可明显降低第6天糖尿病小鼠血糖P005；CCE50MG/KG剂量组明显降。
13、低第12天糖尿病小鼠的血糖P005，CCE100MG/KG和二甲双胍200MG/KG剂量组均可极明显降低第12天糖尿病小鼠的血糖P001。0023TC实验结果如图2所示，与正常组相比，链脲佐菌素糖尿病小鼠的TC含量极明显升高P001。与模型组相比，CCE50MG/KG和二甲双胍200MG/KG剂量组均明显地降低糖尿病小鼠的血清TC含量P005，CCE100MG/KG剂量组极明显地降低糖尿病小鼠的血清TC含量P001。0024胰岛素的实验结果如图3所示，与正常组相比，模型组链脲佐菌素糖尿病小鼠的血清胰岛素含量极明显降低P001。与模型组相比，CCE100MG/KG剂量组和二甲双胍说明书CN101。
14、940616ACN101940620A3/5页5200MG/KG剂量组均明显地回升糖尿病小鼠低下的胰岛素含量P005。0025链脲佐菌素糖尿病小鼠胰腺的组织病理学改变主要为内分泌部胰岛数量较正常减少，体积缩小，存留的胰岛组织结构较正常松散，其内细胞体积增大，胞界欠清，部分小鼠胰腺外分泌部腺泡细胞有空泡变。CCE50、100MG/KG和二甲双胍200MG/KG能减轻胰岛的病变，具体表现药物应用后胰岛数量增多、胰岛体积增大，每个胰岛内细胞数量有明显改善，提示药物能改善链脲佐菌素所致的胰岛病变。002632风轮菜有效部位提取物CCE对葡萄糖苷酶的抑制作用0027以4硝基酚D呋喃葡萄糖苷PNPG为底物。
15、测定葡萄糖苷酶的活性。将CCE终浓度为10，30，60，90，120MG/L或阿卡波糖终浓度为100，300，600，900，1200，1500MG/L40L与葡萄糖苷酶035MG/ML30L共同加500LKH2PO4缓冲液67MMOL/L，PH68中，在37水浴中孵育10MIN后，加入底物PNPG001MOL/L30L以启动反应。37反应10MIN后，加入01MOL/LNA2CO31ML终止反应。于405NM波长下测定在酶作用下从PNPG中释放的对硝基苯PNP的OD值。酶活力单位定义为在37，PH68的条件下，1MIN内水解PNPG释放1MOLPNP所需的酶量，计算抑制率。酶抑制试验重复3次。
16、，每次3个复管。对葡萄糖苷酶的抑制率用以下公式计算抑制率对照组OD值药物组OD值/对照组OD值100。0028结果如表1所示与对照组相比，CCE30、60、90、120MG/L、阿卡波糖100、300、600、900、1200、1500MG/L均对葡萄糖苷酶有极显著的抑制作用P001。CCE、阿卡波糖抑制葡萄糖苷酶的IC50分别为623、6666MG/L。0029表1风轮菜有效部位提取物CCE对葡萄糖苷酶的抑制作用00300031P005，P001VS对照组003233、风轮菜有效部位提取物CCE对高糖损伤的内皮细胞的保护作用0033取对数生长期HUVEC消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板。
17、1104CELL/说明书CN101940616ACN101940620A4/5页6WCLL，培养24H后更换RPMI1640培养基含10胎牛血清，将细胞分为6组，正常组为HUVEC的自然培养，模型组为CCE与33MMOL/L葡萄糖共培养，其余组为CCE1、3、10、30MG/L与HUVEC及葡萄糖共培养，培养72H后，加入含05MTT的培养基20L，再培养4H后，弃培养液，加入150LDMSO原液，振荡10MIN，待结晶完全溶解后，用酶联免疫仪于570NM波长处测定OD值。实验重复3次，每次3个复孔。0034结果如图4所示，与正常组比较，模型组HUVEC细胞A570值极明显降低P001。与模型。
18、组相比，CCE3、10、30MG/L组的A570值明显高于模型组P001。可见CCE3、10、30MG/L明显提高高糖损伤的内皮细胞的存活率，对高糖所致的内皮细胞损伤具有保护作用。0035本发明所述，风轮菜中有效部位提取物可用于制备预防和治疗糖尿病、糖尿病引起的脂代谢紊乱及糖尿病性心脑血管方面并发症。四、附图说明0036图1风轮菜有效部位提取物CCE对链脲佐菌素糖尿病小鼠血糖的影响0037随机取出小鼠10只作为正常组，其余小鼠禁食1617H后，尾静脉注射链脲佐菌素160MG/KG，注射后72H后，选空腹血糖11MMOL/L的小鼠，随机分为模型组、CCE50、100MG/KG，二甲双胍200MG。
19、/KG，连续12天经口给药，每日一次。第6天和第12天，末次给药后15H禁食5H分别取血，测定空腹血糖，结果以表示。P001VSNORMAL；P005，P001VSCONTROLSTUDENTSTTEST0038图2风轮菜有效部位提取物CCE对链脲佐菌素糖尿病小鼠总胆固醇的影响0039随机取出小鼠10只作为正常组，其余小鼠禁食1617H后，尾静脉注射链脲佐菌素160MG/KG，注射后72H后，选空腹血糖11MMOL/L的小鼠，随机分为模型组、CCE50、100MG/KG，二甲双胍200MG/KG，连续12天经口给药，每日一次。第12天，末次给药后15H禁食5H取血，测定血清总胆固醇，结果以表示。
20、。P001VSNORMAL；P005，P001VSCONTROLSTUDENTSTTEST0040图3风轮菜有效部位提取物CCE对链脲佐菌素糖尿病小鼠血清胰岛素含量的影响0041随机取出小鼠10只作为正常组，其余小鼠禁食1617H后，尾静脉注射链脲佐菌素160MG/KG，注射后72H后，选空腹血糖11MMOL/L的小鼠，随机分为模型组、CCE50、100MG/KG，二甲双胍200MG/KG，连续12天经口给药，每日一次。第12天，末次给药后15H禁食5H取血，用放射免疫法测定血清胰岛素，结果以表示。P001VSNORMAL；P005VSCONTROLSTUDENTSTTEST0042图4CCE。
21、对高糖损伤的内皮细胞的保护作用0043HUVEC单细胞悬液1104个/孔接种于96孔细胞培养板，培养24H后更换培养基，将细胞分组正常组为HUVEC的自然培养，模型组为HUVEC与33MMOL/L葡萄糖共培养，其余组为CCE1、3、10、30MG/L与HUVEC及葡萄糖共培养，培养72H后，加入含05MTT的培养基20L，再培养4H后，弃培养液，加入150LDMSO原液，振荡，待结晶完全溶解后，测定OD值。图中数据为3次实验的平均值，每次实验为3复孔。结果以表示。P001VSNORMAL；P001VSCONTROLSTUDENTSTTEST说明书CN101940616ACN101940620A。
22、5/5页7五、具体实施方式0044下面结合实例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实例。0045实施例1风轮菜有效部位提取物的制备0046取10KG干燥风轮菜全草，粉碎成粗粉，加6倍体积的80乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩，将浓缩液，依次用3倍量的石油醚、乙酸乙酯萃取4次，将乙酸乙酯提取物用大孔树脂柱进行柱层析，水洗脱杂质后，乙醇梯度洗脱洗脱范围为2080，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得风轮菜有效部位提取物，得率为15。0047实施例2胶囊剂的制备0048实施例1中的风轮菜有效部位提取物65G，微晶纤维素135G，研磨混合1030分钟，至均匀。将混匀的药粉，灌装于1。
23、号胶囊中，随机抽样每粒装量控制在02G，含风轮菜有效部位提取物为65MG。0049实施例3片剂的制备0050实施例1中的风轮菜有效部位提取物25G，微晶纤维素49G，研磨混合1030分钟，至均匀止；加入硬脂酸镁1G，充分混合；混合物用单冲压片机压成直径6MM，重300MG的片剂，每片含风轮菜有效部位提取物为100MG。0051实施例4颗粒剂的制备0052实施例1中的风轮菜有效部位提取物20G，加玉米淀粉180克，混匀后，加适量乙醇60制成软材，过12目筛，经干燥后得颗粒剂，每1克颗粒剂含风轮菜有效部位提取物为100MG。说明书CN101940616ACN101940620A1/2页8图1图2说明书附图CN101940616ACN101940620A2/2页9图3图4说明书附图CN101940616A。