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一种由海洋镰刀霉菌属分离提取的化合物及其应用
    技术领域 ：
     本 发 明 属 于 微 生 物 制 药 领 域， 具 体 设 计 一 种 由 海 洋 镰 刀 霉 菌 (Fusarium sp.QY010) 中分离提取的抗细菌群体感应活性的化合物及其应用。 背景技术 ：
     细菌感染一直威胁着人类健康， 自 19 世纪晚期感染性疾病的细菌起源学说被证 实后， 人类对抗感染性疾病的治疗才有了相对明确的目标。抗生素的出现是医学史上的 奇迹， 特别是青霉素， 作为最早的抗菌药物， 成功地解决了临床上金黄色葡萄球菌感染的难 题， 随后问世的大环内酯类， 氨基糖苷类抗生素又使肺炎、 肺结核的死亡率降低了 80％。但 大多数抗生素是通过干扰致病菌的重要生命过程来杀死微生物或抑制微生物生长来实现 抗感染的。在这种生存压力下， 微生物极易产生耐药性。因此， 寻找利用新的靶点开发新型 抗菌药物， 是生物学和医学研究领域的紧迫课题之一。
     Fuqua 等 1994 年 首 先 提 出 细 菌 的 群 体 感 应 现 象 (Quorum Sensing， QS)(J Bacteriol.1994 ； 176 ： 269-275)。 许 多 细 菌 产 生 并 释 放 一 种 被 称 为 自 诱 导 物 (Auto Inducer， AI) 信号分子， 随着细菌密度的增加， 信号分子积累到一定浓度时则会与胞 浆受体蛋白结合， 调控细菌相关基因的表达， 使细菌形成一种群体行为来有效地抵御 环 境 压 力、 攻 击 宿 主 等 (Harvey Lect.2004 ； 100 ： 123-142)。 革 兰 氏 阴 性 菌 主 要 是 由 AHL 介导的 LuxI-LuxR 型群体感应系统， 其相关信号分子为酰化高丝氨酸内酯化合物 (acyl-homoserine lactone， AHL) ； 例如铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌， 是病人在 住院期间发生感染的第三大致病菌。 其群体感应系统 (Nature， 2000， 406 ： 959-964) 有两个 基于 AHL 信号分子的调控网络组成 ： las 系统和 rhl 系统。las 系统由 LasR 和 LasI 组成， rhl 系统由 RhlR 和 RhlI 组成。 其中 LasR 和 RhlR 为信号分子受体， 而 LasI 和 RhlI 则分别是 AHL 信号分子 3-oxododecanoyl-homoserine lactone(3-oxo-C12-HSL， 3- 氧十二烷酰高丝 氨酸内脂 ) 和 butryl-homoserine lactone(C4-HSL， 丁基高丝氨酸内脂 ) 的合成酶。 当细菌 的数量急剧上升的时候， AHL 分子的水平超过一个特定的阈值， 首先引发 las 系统的启动， 3-oxo-C12-HSL 与 LasR 结合形成复合物， 并激活一系列毒力因子基因的表达， 包括外毒素 A、 胞外酶 S、 氢氰酸、 溶血素等， 同时该复合物也能够激活 lasI 的表达， 促进 3-oxo-C12-HSL 的 合成， 形成一个正反馈。与 las 系统相似， C4-HSL 分子与 RhlR 结合形成复合物， 激活一些 毒力因子包括稳定期 σ 因子、 绿脓菌素、 凝集素等， 同时该复合物也促进 rhlI 的表达， 形成 一个正反馈。大量文献表明缺失了群体感应系统的菌株其致病能力大大降低。以细菌的群 体感应系统为靶标筛的抗菌药物， 与传统的抗生素的作用机制完全不同， 只抑制细菌群体 感应调控的致病行为， 不影响细菌的生长， 理论上不会产生细菌耐药性。因此， 细菌群体感 应系统可作为抗感染药物研发的理想靶标。
     药物筛选模型的构建是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合 物的一个关键步骤， 随着细菌群体感应机制的逐步阐明， 已有很多实验室致力于群体感应 抑制因子的研究。Thomas Bovbjerg Rasmussen 等构建了一个高通量筛选模型 QSIS2(JBacteriol， 2005， 187(5) ： 1799-1814)， 该 模 型 是 利 用 受 铜 绿 假 单 胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa) 群体感应系统调节的下游基因 lasB 的启动子， 和蔗糖致死基因 SacB 为报 告基因构建而成 ； 在有蔗糖底物存在的情况下， 信号分子 3- 氧十二烷酰高丝氨酸内酯 (3-oxo-C12-HSL) 和 LasR 受体蛋白结合， 启动 lasB 启动子下游致死基因 SacB 的表达， 若 存在群体感应抑制因子如阳性对照物 C30(furanone)， 致死作用则会得到补救。Robert J.C.McLean 等人 (BMC Microbiol.2004 ； 4： 25) 建立了一种简单快捷的可以从共培养的 细菌、 真菌和相关中草药组织中筛选群体感应抑制因子 (QuorumSensing Inhibitor QSI) 的 方 法， 这 种 方 法 主 要 利 用 了 紫 色 杆 菌 (Chromobacterium violaceum) 产 生 的 的 紫 色 菌素， 紫色菌素在紫色杆菌中是受群体感应严谨调控的 (Microbiology， 1997， 143(12) ： 3703-3711)， 紫色杆菌 CV026 为信号分子缺失菌株， 在加入信号分子 C6-HSL 后， 能够启动群 体感应调控的紫色菌素的产生， 若有群体感应抑制因子的存在， 则能抑制紫色菌素的产生， 在琼脂板加样孔上表现出浑浊但不透明的圆圈。 因此， 紫色杆菌可作为一种简便、 直观的群 体感应抑制因子筛选模式菌株。
     近年来， 随着海洋活性物质研究的深入， 已从海洋微生物中发现了大量具有新颖 化学结构和特异生理功能的化合物， 其中许多具有良好的抗菌、 抗病毒、 抗肿瘤等活性， 海洋微生物通过人工条件发酵培养， 可以提供稳定的天然产物来源。大量生物学及生 态学研究结果表明， 一些以前被认为是海洋动植物产生的生物活性物质实际上是由与之 共附生的海洋微生物产生或由两者协同产生。如河豚毒素 (Tertrodotoxin)、 海葵毒素 (Anthopleurin-A、 nthopleurin-B)、 石房蛤毒素 (Saxitoxin) 等的真正来源都是海洋微生 物。因此， 从海洋微生物中筛选具有群体感应抑制活性的次级代谢产物是十分必要且有希 望的途径。 发明内容 ：
     本发明所提供的活性化合物来源于海洋 Fusarium sp.QY010 菌株， 据文献报道该 化合物在其它 Fusarium 菌属中也能产生 (Phytopathology 47 ： 342-357.)， 海洋 Fusarium sp.QY010 经发酵分离得到对铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应系统具有双重抑制作用 的化合物式 I( 镰刀菌酸 ： Fusarium acid， FA)， 化学名称 ： 5- 丁基吡啶甲酸， 分子式为 C10H13NO2， 结构式为 ：
     式I
     本发明所述的活性化合物式 I 的获得方法 ： 海洋 Fusarium sp.QY010 发酵培养与 化合物的制备两个步骤。 先取活化后的海洋 Fusarium sp.QY010， 接种到发酵培养基中进行 发酵培养， 发酵结束后用等体积乙酸乙酯萃取， 真空低温浓缩至干， 得到发酵液浸膏 ； 将浸 膏用适量硅胶 H 拌样后， 利用真空液相色谱柱层析， Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离， 制备 型高效液相色谱仪分离， 根据紫外吸收谱得到具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应 的单体化合物式 I。
     本发明所涉及的活性化合物式 I 具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌感染的作用 ； 式 I 在 0-300mg/mL 浓度范围内不抑制紫色杆菌 CV026 的生长 ； 但能显著降低紫色杆菌紫色 菌素的生成， 且该化合物的群体感应抑制作用呈浓度依赖性， 随着浓度逐渐增加， 其群体感 应的抑制作用逐渐增强 ； 该化合物在 0-500mg/mL 的范围内对野生型铜绿假单胞菌 PAOI 的 生长不产生影响， 但能显著降低铜绿假单胞菌群体感应调控的毒力因子， 如弹性蛋白酶的 产量。
     本 发 明 的 目 的 在 于 克 服 现 有 技 术 中 存 在 的 缺 点， 提 供 一 种 由 海 洋 Fusarium sp.QY010 发酵提取物中分离的具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应系统的活性化 合物。 具有海洋镰刀霉菌株容易发酵培养， 其制取化合物的工艺过程简单易控， 化合物产量 高， 制取的化合物抑制细菌群体感应作用明显等优点。 附图说明 ：
     图 1 为本发明的活性化合物的活性筛选图。
     图 2 为本发明的化合物作用下的野生型铜绿假单胞菌 PAO1 生长曲线图。
     图 3 为本发明的化合物对野生型铜绿假单胞菌 PAO1 弹性蛋白酶活性测试图。
     图 4 为本发明不同浓度的化合物对紫色杆菌 CV026 生长和紫色菌素产量的测定 图。 具体实施方式 ：
     下面通过实例并结合附图对本发明做进一步的说明。
     实施例 1 ： 发酵海洋 Fusarium sp.QY010 制备单体化合物式 I
     一 . 发酵培养采用如下培养基： 山 梨 醇 20g， 麦 芽 糖 20g， 谷 氨 酰 胺 10g， KH2PO40.5g， MgSO4·7H2O 0.3g， 色氨酸 0.5g， 酵母提取物 3g， 用陈海水定容为 1000mL， 调 pH 2 为 6.5， 121℃， 1.05kg/cm 灭菌 20min。
     二 . 发酵工艺 ： 将海洋 Fusarium sp.QY010 平板活化后， 挑取适量菌丝块接种到内 装 150mL 上述液体培养基的三角瓶中， 温度 28℃、 震荡培养 10 天。
     三 . 发酵产物制备 ： 发酵结束后， 将发酵物菌丝体与上清混合液超声破碎， 加入等 体积乙酸乙酯， 室温搅拌过夜， 6000rpm 离心取上清液， 再加入等体积乙酸乙酯重复萃取 2 次， 将总萃取液真空低温浓缩至干， 得到褐色浸膏。
     四 . 化合物的制备方法 ： 上述浸膏用适量硅胶 H 搅拌均匀后， 用真空液相色谱柱层 析进行分离， 用不同配比的洗脱液进行梯度洗脱， 收集 50％石油醚 +50％氯仿洗脱的组分， 浓缩后用 Sephadex LH-20 凝胶柱层析进行分离， 100％甲醇为洗脱液进行分离， 合并活性流 份， 利用制备型高效液相色谱仪以不同配比的甲醇 - 水为流动相对最终的活性成分进行纯 化， 得到单体化合物式 I。
     五 . 化合物结构鉴定 ： 13
     化合物结构鉴定 ： 利用质谱 (MS)、 核磁 (1HNMR， C NMR， DEPT) 对化合物进行结 1 13 1 构鉴定， 结合该化合物 H 谱和 C 谱分析， 其分子式为 C10H13NO2 ； H NMR 和 13C NMR(DEPT) 谱 提 示 该 分 子 中 存 在 1 吡 啶 基、 1 个 丁 基 和 1 个 羧 甲 基 组 成， 将所得波谱数据与文献 (Phytopathology 47 ： 342-357.) 比较， 确定其为化合物 ： 5- 丁基吡啶甲酸。式I 1
     化合物波谱数据 ： HNMR(600MHz， CDCl3)δ ：
     8.44(s， 1H， H-6)， 8.14(d， J ＝ 7.56Hz， 1H， H-3)， 7.75(d， J ＝ 7.44Hz， 1H， H-4)， 2.73(t， J ＝ 7.20Hz， 2H， H-7)， 1.60-1.70(m， 2H， H-8)， 1.35-1.45(m， 2H， H-9)， 0.95(t， J 13 ＝ 7.30Hz， 3H， H-10) ；C NMR(CDCl3， 150MHz)δ ： 165.0(C-11)， 147.9(C-2)， 143.1(C-6)， 145.0(C-3)， 138.4(C-4)， 124.2(C-5)， 32.9(C-7)， 32.8(C-8)， 22.2(C-9)， 13.8(C-10).
     实施例 2 ： 化合物式 I 活性测试
     一 . 式 I 的群体感应抑制活性测试
     筛选模型 QSIS2 平板筛选方法 ： 13.5mL 融化的固体 LB 培养基冷却至 40℃， 加入 1.5mL 60 ％的蔗糖， 150μL 过夜培养的 QSIS2 菌液、 6μL 500μmol/L 的信号分子 3- 氧 十二烷酰高丝氨酸内酯 3-oxo-C12-HSL， 75μL 5 ％ (w/v) 的活菌染色剂红四氮唑 TTC 和 24μL 50mg/mL 的庆大霉素， 混匀后倒平板。 待平板凝固后， 用打孔器打孔， 每个孔内分别加 3μL 不同浓度的化合物， 然后 37℃培养箱培养， 观察加样孔周围菌圈生长情况， 若化合物 具有群体感应抑制活性， 则加样孔周围应有细菌生长圈出现， 菌圈直径越大即为活性越强， 检测结果如图所示 1a 所示 ： 与阳性对照 C30(6.35μg) 相比， 0.45mg、 0.3mg、 0.15mg 化合物 式 I 呈现阳性结果， 且成浓度依赖性。
     紫色杆菌平板筛选方法 ： 15mL 融化的固体 LB 培养基冷却至 40℃， 加入 150μL 过 夜培养的紫色杆菌 CV026 菌液、 15μL 500μmol/L 的信号分子己酰高丝氨酸内酯 C6-HSL 和 15μL 20mg/mL 的卡那霉素， 混匀后倒平板。待平板凝固后， 用打孔器打孔， 每个孔内 加 3μL 化合物， 于 30 ℃培养箱培养， 若该化合物为群体感应抑制因子， 则能抑制紫色菌 素的产生， 在琼脂板上表现出浑浊但不透明的圆圈， 筛选结果如图 1b 所示 ： 与阳性对照 C30(3.81μg)， 0.45mg、 0.3mg、 0.15mg 的化合物式 I 均能抑制紫色杆菌紫色菌素的产量， 并 且随浓度增加而增加。
     二 . 不同浓度的式 I 对野生型铜绿假单胞菌 PAOI 生长的影响
     挑取野生型铜绿假单胞菌 PAO1 于新鲜 LB 培养基中， 37℃、 140rpm 培养至对数期 ； 用新鲜 LB 将培养至对数期的菌液稀释至 OD600 ≈ 0.05， 分装 5 组， 每组 3 个平行 ； 每组分别 加入终浓度化合物终浓度 0mg/mL， 200mg/mL， 300mg/mL， 400mg/mL， 500mg/mL， 37 ℃、 140rpm 摇床培养 ； 每隔 1-2 小时分别测各管 OD600 直至对数后期 ； 以培养时间 Time(h) 为横坐标， 以 600nm 处的光吸光度为纵坐标， 绘制野生型铜绿假单胞菌 PAO1 在化合物式 I 作用下的生长 曲线， 从生长曲线 ( 图 2) 可以看出， 该化合物在 0-500mg/mL 浓度范围内并不抑制野生型铜 绿假单胞菌 PAO1 的生长。
     三 . 不同浓度的式 I 对铜绿假单胞菌毒力因子弹性蛋白酶活性测试
     挑取野生型铜绿假单胞菌 PAO1 单克隆接种于新鲜 LB 培养基中， 37℃、 220rpm 生 长至对数期 ； 用新鲜 LB 将培养至对数期的菌液稀释至 OD600 ≈ 0.05， 分装 4 组， 每组 3 个平 行； 每组分别加入终浓度 0mg/mL， 200mg/mL， 300mg/mL， 500mg/mL 的化合物式 I ； 阴性对照
     为 PAO MWI， PAO MWI 为 lasI rhlI 信号分子缺失菌株不产弹性蛋白酶， 在相同条件下培养 21h。将培养液在 4℃、 10000r/min 离心 15 分钟后， 吸取上清液， 用一次性滤器 (0.22μm) 过滤除菌 ； 在 15mL 振荡培养管中加入 5mg 弹性蛋白酶底物一刚果红 (EcR) 和 1mL 反应缓冲 液 (0.1M Tris-HCl/1mM CaCl2， pH 7.2)， 之后加入 0.2mL 细菌上清液， 37℃、 220rpm 恒温振 荡反应 18 小时 ； 加入 0.1mL 0.12mol/L 的 EDTA 终止反应， 将反应物置于冰上。4℃、 5000r/ min 离心， 去除不可溶的 ECR ； 上清液在 OD495nm 处读取吸光度值， 结果如图 3 所示 ： 与对照 组相比， 在不抑制铜绿假单胞菌 PAOI 生长的浓度范围内， 300mg/mL， 500mg/mL 的化合物式 I 分别对野生型铜绿假单胞菌 PAO1 弹性蛋白酶产量降低 40.8％和 66.5％。
     四 . 不同浓度的式 I 对紫色杆菌 CV026 生长的影响和对紫色杆菌紫色菌素产量测 试
     挑取紫色杆菌 CV026 于新鲜 LB 培养基中， 30℃、 140rpm 培养至对数期 ； 用新鲜 LB 将培养至对数期的菌液稀释至 OD600 ≈ 0.05， 分装 5 组， 每组 3 个平行 ； 每组分别加入化合 物至终浓度 0mg/mL， 50mg/mL， 100mg/mL， 200mg/mL， 300mg/mL， 37℃、 140rpm 摇床培养 ； 每隔 1-2 小时分别测各管 OD600 直至对数后期， 该化合物在 0-300mg/mL 浓度范围内对紫色杆菌 CV026 的生长不产生影响 ( 图 4)。挑取紫色杆菌 CV026 于新鲜 LB 培养基中， 30℃、 140rpm 培养至对数期 ； 用新鲜 LB 将培养至对数期的菌液稀释至 OD600 ≈ 0.05， 分装 6 组， 每组 3 个平行 ； 其中对照组不加信号分子 (C6HSL)， 实验组中加入信号分子 (C6HSL) 至终浓度为 500nμmol/L， 实验组设计化合物的终浓度分别为 0mg/mL， 50mg/mL， 100mg/mL、 200mg/mL， 300mg/mL， 实验组和对照组在 30℃、 140rpm 振荡培养 12h。
     紫色菌素定量方法 ： 吸取 1mL 上述培养好的菌液于 1.5mL Eppendorf 管， 14000rpm 离心 10min， 使紫色菌素和菌体充分沉淀。去掉上清液， 加入 1mL DMSO 于 Eppendorf 管中， 涡旋， 充分振荡使紫色菌素溶解于 DMSO。14000rpm 再离心 10min， 沉淀菌体及碎屑。吸取上 清测定 OD585 处的光吸收， 浓度为 200mg/mL、 300mg/mL 化合物式 I 分别对紫色杆菌紫色菌素 降低量达 75.9％、 97.8％ ( 图 4)。