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抗感染剂及其用途
    技术领域 本发明涉及抗感染剂组合物的用途， 特别涉及免疫刺激微粒作为抗感染剂用于增 强对抗病原体的固有和 / 或特异免疫应答的用途。
     本发明首先被开发用作具有广泛作用的抗感染剂， 其能够作用于免疫细胞以抵御 由病原体引起的疾病。下文将引入该申请来描述本明。然而， 应理解， 本发明不限于这个特 定的应用领域。
     背景技术 说明书中的任何对现有技术的描述都绝不应当理解为承认该现有技术广为人们 所知或构成了该领域的一般公知常识的部分。
     免疫系统包括 2 个主要分类 ： 固有 ( 非特异 ) 免疫系统和适应 ( 特异 ) 免疫系统。 两个系统协调产生有效的应答， 然而它们在很多方面不同。适应免疫系统需要时间来对病 原微生物作出反应、 抗原特异性和表现免疫记忆。 相比之下， 固有免疫系统提供对病原体更 快的应答， 非抗原特异性且不表现免疫记忆。
     适应 ( 特异 ) 免疫系统有 2 个分支。它们包括体液免疫和细胞介导免疫。体液免 疫涉及对外来抗原产生抗体。 抗体由 B 淋巴细胞产生。 细胞介导免疫涉及激活 T 淋巴细胞， 其或作用于带有外来抗原的感染细胞， 或刺激其它细胞对感染细胞发生作用。哺乳动物免 疫系统的两个分支在防治疾病中均具有重要意义。 体液免疫是防止细菌病原体和毒素的主 防线， 然而， 辅助性 T 淋巴细胞和细胞毒性 T 淋巴细胞的诱导似乎对于长寿命的保护性免疫 非常关键。
     固有免疫是防止感染的第一道防线， 利用对许多微生物来说常见的病原分子模式 识别受体 (PRRs) 来迅速诱导前炎症性及抗病毒细胞因子。这些途径的特定活化剂对于健 康的和免疫能力受损的宿主的病毒感染均具有潜在的治疗作用。对 PRRs 配体的辨别， 伴随 对它们的信号级联系统的了解的增加， 已致使开发出选择性 PRR 配体作为对给定的病原体 优先免疫应答的诱导剂。
     对于使用非特异免疫刺激剂或佐剂作为增强 / 诱导非特异免疫的手段的兴趣在 不断增加。术语 “佐剂” 被广泛用于描述在施加给个体或原位试验中时， 通过诱导免疫细胞 特异免疫活性的一般上调来发生作用的化合物。
     尽管很多材料已被表明具有佐剂活性， 唯一被许可用于一般医用的佐剂为 50 年 前被首次使用的明矾。仅次于明矾， 含有矿物油和灭活的结核杆菌的弗氏完全佐剂 (FCA)， 开始时被广泛使用并被视为 “金牌标准” ， 但后来由于它形成肉芽肿而被停止使用。
     对胞壁酰二肽 (MDP)- 一种革兰氏阳性和革兰氏阴性类细菌的肽聚糖 (Inohara， 2003 ； Kufer， 2006) 常见的二肽的免疫刺激 / 调节性质的确认， 引发了旨在将 MDP 作为化学 成分明确的、 全面活性的免疫佐剂应用于临床的免疫功能研究。 这些期望很快受挫， 意识到 MDP 自身不适于临床使用， 主要因为它的毒性和差的药动力学特征， 也即从 MDP 身体中迅速 清除 (Lidgate， 1995 ； Traub， 2006)。反之， 为减少或消除热源性的尝试导致衍生物的形成，
     其中的一些以可溶解的单体形式例如莫拉丁酯 (Audibert， 1984 ； Bahr， 1995 ； Vidal， 2001) 已经被使用于临床试验中。
     与上述提及的 MDP 剂形成对比， 开发出不具有 MDP 所具有的不期望的副作用且实 现了增强的免疫刺激性质的 MDP 类似物 ( 澳大利亚专利号 732809)。MDP 的该非毒性形式 起先被开发， 大多数作为佐剂来增强对天然蛋白质、 重组蛋白质、 合成肽以及其它免疫物质 的特异免疫应答， 也即将它与相关抗原联合使用作为传统的佐剂 - 抗原复合物。
     传统的细菌佐剂本身不使用于刺激非特异免疫系统以防治感染的免疫治疗。 一部 分这是因为现有技术的佐剂不能特异地激活相关免疫细胞类型和因此激活相关免疫应答。 现有技术佐剂通过不合适的细胞类型诱导细胞因子， 导致大量各种细胞因子的全身表达， 引起反过来阻止它们作为独立的免疫治疗法的严重和不期望的副作用。
     几种固有免疫应答被认为有利于控制病毒感染。这些效应机制是多面的， 包括直 接抗病毒活性和在感染宿主的免疫细胞上有助于清除这些细胞的免疫调解效应。直接抗 病毒活性可以包括可溶性因子， 例如 CD8 抗病毒因子 (CAF) 和 IFN-α， 其能够直接影响病 毒转录。由巨噬细胞和树突固有免疫细胞分泌的免疫调节 / 前炎症细胞因子， 例如 TNF( 与 IFN-γ 相配合 ) 能够作用于对由 TNF 调节的细胞裂解表现增加的敏感性的病毒感染细胞。 此外， 细胞机制例如自然杀伤细胞 (NK) 介导的对病毒感染细胞的杀害包括固有抗病毒免 疫的另一重要方面。 尽管各式各样的其它固有细胞因子能够介导控制抗病毒免疫性方面的生物功能， 高水平的 IFN-α/β 似乎在病毒感染中起主导作用并且控制其它固有应答。 IFN-α 在治疗 各种病毒紊乱例如慢性乙肝 / 丙肝以及广泛的人类癌症中的临床应用， 在于其能够诱导抗 病毒基因的显性阵列， 其驱动防止病毒复制的多效宿主防御途径。目前临床应用的 IFN-α 产品是重组蛋白或高度纯化单一异构体蛋白， 其用作药单治疗或与其它抗病毒剂共同使 用。然而这些治疗没有良好的耐受性且应答率低。这增加了对不仅能够诱导生理相关水平 的自然发生的多重 IFN-α 异构体， 而且还能够调动很有可能与 IFN-α 发生协同作用的固 有抗病毒免疫的其它方面的新方法的需要。
     NK 细胞是功能上不同的固有防御病毒感染的贡献者。 通过免疫刺激性化合物来加 强 NK 细胞的内在活性是另外一种临床上相关的抗病毒治疗方法。此外， 由于 NK 细胞能够 通过与 IFN-α 不同的机制识别和破坏病毒感染细胞， 它们能够靶向那些对 IFN-α 的直接 效应具有抗性的病毒。IFN-α 在激活 NK 杀害中起中心作用， 并进一步与其它关键的固有 免疫细胞因子例如 TNF-α 和 IL-12 协同来向上调节 NK 细胞功能和提升适应性细胞介导的 免疫性。因此， 为了充分利用 NK 抗病毒机制， 其它固有免疫细胞例如浆细胞样树突状细胞 (pDC) 和单核细胞的免疫刺激是期望的。
     对于细菌感染， 其它固有免疫功能， 特别是当吞噬病原体遭受活性氧和氮种物种 或被溶酶体酶破坏时的吞噬细胞的功能很重要。巨噬细胞然后可以将退化抗原呈递至 T 细 胞并诱导适应性免疫应答。根据致病菌在巨噬细胞中的宿命可以将它们分为二类， 胞外菌 在被吞噬后立即被杀死， 而除非吞噬细胞被免疫激活， 兼性细胞内细菌对细胞内杀害具有 抗性。胞外菌引起化脓性感染， 而兼性细胞内细菌引起肉芽肿性感染。体液免疫机制 ( 抗 体， 补充物 ) 主要处理胞外菌， 而细胞免疫机制 (T 细胞， 巨噬细胞 ) 处理兼性细胞内细菌。
     仍然有很多细菌和病菌感染难以采用目前可获得的治疗方法来治疗。例如， 结核
     (TB) 是一种最古老的人类病原， 是人由于单一细菌剂死亡的最主要的起因。据估计有将近 三分之一的人口感染结核杆菌 (Mtb)- 病原体。每年有接近 800 万新的 TB 病例和约 200 万 的死亡。多重抗药性 (MDR) 和非常耐药性 (XDR) 结核对死亡率和发病率的控制提出了严峻 的挑战。
     结核能够以不明显的小数量存在， 并且偶发性地重新激活产生甚至对于药物敏感 株都难以治疗的疾病。由于在药物治疗上的难题， 用于限制 MDR-Mtb 的预防性和治疗性疫 苗成为越来越可行的一套策略。从历史上看， 瘤型麻风的细菌的重负载能够通过 BCG 疫苗 来减少。迫切需要类似的方法来减少或消除 MDR- 结核的细菌负载。
     对结核的有效控制似乎包括二个阶段的治疗 ： 对初步接触 ( 初种 ) 后感染的建立 的预防和为预防疾病的重新激活对接种 BCG 的个体的免疫激活 ( 免疫接种 )。 MDR-Mtb 控制 中的一个主要缺口在于缺少能够满足这些免疫模式的有效疫苗。 此外， 药物对治疗 MDR-Mtb 没有效果， 因此， 需要治疗性疫苗接种。来源于野生型结核分枝杆菌的减毒活疫苗和 BCG 疫 苗的保护性一样好， 但是受到安全问题的限制。 已鉴定出很多依赖增效剂、 在较短的时间期 限内提供保护的重组抗原和 DNA 疫苗。
     很遗憾地， BCG 疫苗对儿童结核的成效不一， 而对于成人结核或再感染无效。 MDR- 结核通常是再感染的结果， 因此， BCG 疫苗对于控制这种药物敏感或 MDR-Mtb 株无能为 力。而且， Mtb 隐藏在巨噬细胞中， 暗中破坏免疫识别。甚至减毒 BCG 疫苗隔离在减少免疫 识别的巨噬细胞 (MΦs) 和树突细胞 (DCs) 的特定隔离室内。因此， BCG 具有至少二个重要 的不足。第一， 它不含所有潜在保护性抗原以及第二， 它积极地暗中破坏免疫应答。
     结核由强的 Th1 免疫性控制， Th1 免疫性同时被抗体主导的 Th2 应答和由 Mtb 衍 生产物诱导的抑制性 T- 调节细胞反调节。因此， 对 MDR 结核的疫苗介导免疫控制要求以牺 牲其它 T 细胞应答为代价， 使用优先诱导 Th1 免疫性的疫苗， 突出了将能够影响 T 细胞分化 的佐剂作为理性的疫苗设计的重要成分的作用。遗憾地， 对以最少增效剂的剂量就能诱导 长久持续的免疫性的佐剂的机制的理解还有很大的距离。
     流感感染导致了儿童和老年人群的主要发病率和死亡率。 与流感感染相关的严重 并发症包括肺炎， 呼吸衰竭， 非呼吸条件例如休克和脑病， 以及潜在慢性疾病的加重。与流 感有关的死亡能够直接与初始病毒感染相关或能够由次级的并发症导致。在某些例子中， 从疾病开始到死亡的进程能够迅速发生。虽然接种疫苗可以提供一些保护， 每年的遗传漂 变的程度意味着疫苗与循环病毒株之间错配的可能性很高。 一个优选的疫苗剂型将是不要 求每年重新形成以适应每年发生的快速流感株突变的疫苗。 虽然疫苗是控制流感的必要工 具， 当疫苗失败或流感在没有接种疫苗的个体或没有接种疫苗的人群 ( 流行病 ) 中突发时， 固有免疫治疗方法可具有特别的优势。
     鼠疫由从假结核杆菌的肠道致病菌变体而来的鼠疫杆菌引起， 其通常导致慢性和 相对轻微的疾病。 鼠疫菌自然寄生在跳蚤上， 但对于老鼠和人类也高度毒性， 导致系统性流 行病且常常为致命疾病。虽然鼠疫感染在西方世界相对稀少， 在欠发达国家它仍然威胁到 公众健康。它能够以气溶胶在人与人之间传播， 因此被列为 A 类生物恐怖剂。鼠疫病能够 导致动物发病部分是由于它能够内在地减弱对感染的正常的、 非传染性免疫应答。在没有 目前预防性接种策略下， 能够刺激固有免疫应答的治疗方法可以防止肺鼠疫。
     同样的， 期望的具有广泛作用的抗感染剂将是能够对多个免疫细胞亚群有特异作用、 诱导多种细胞因子的协调释放的抗感染剂。所需要的是该种作用模式将对于预防和 / 或治疗病毒和 / 或细菌感染 ( 特别是那些难以治疗的 )。
     本发明的目的之一是克服或减轻现有技术的不足的至少一个或提供一种有益的 替代。 发明内容 本发明一部分基于出于意料的发现即交联到微粒上的胞壁酰二肽含有免疫刺激 性的核酸序， 其可以解释为什么还发现， 如本文所描述的， MDP 微粒能够激活对很多固有抗 细菌和抗病毒免疫应答的诱导关键的几种不同的免疫细胞亚群。 下文中， 包括核酸序的 MDP 微粒将被称为 “MDP/DNA 微粒” 。
     进一步地， MDP/DNA 微粒可以被一个或更多个能够增强固有抗感染免疫应答的附 加配体和 / 或细菌或病毒抗原功能化， 以进一步刺激 / 集中免疫应答。
     根据第一方面， 本发明提供一种由病毒和 / 或细菌引起的感染的预防或治疗方 法， 其包括向需要它们的对象施加有效量的 MDP/DNA 微粒。
     优选地， MDP/DNA 微粒激活固有免疫应答。
     更优选地， 固有免疫应答包括 NK 细胞， 浆细胞样树突状细胞 (pDC) 或单核细胞的 固有免疫应答。
     优选地， MDP/DNA 微粒进一步诱导和 / 或刺激至少一种细胞因子的释放。
     细胞因子优选为免疫 / 前炎性和 / 或调节性细胞因子。
     优 选 地， 免 疫 / 前 炎 性 和 / 或 调 节 性 细 胞 因 子 为 干 扰 素 -α(IFN-α)、 干扰 素 -γ(IFN-γ)、 白细胞介素 10(IL-10)、 白细胞介素 6(IL-6)、 白细胞介素 1β(IL-1β)、 肿 瘤坏死因子 α(TNF-α)、 白细胞介素 12(IL-12) 以及 CD8 抗病毒因子等。
     优选地， MDP/DNA 微粒调动固有抗病毒和 / 或抗细菌免疫性的其它方面。
     更优选地， 上述固有抗病毒和 / 或抗细菌免疫性的其它方面能够与 IFN-α 协同作 用。
     为了增强固有抗病毒和 / 或抗细菌免疫应答的功效， 可以将 MDP/DNA 微粒与至少 一种结合在微粒上或内、 能够刺激在病毒和 / 或细菌细胞损伤和 / 或销毁中有效的特异免 疫细胞亚群的免疫刺激配体组合。优选地， 配体选自 TLR1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， NOD-1， NOD-2 等或它们的任意组合。
     能够将 MDP/DNA 微粒设计为支持优先诱导 Th1 或 Th2 型免疫性。此外， 吸收除了 进一步佐剂配体之外的一系列免疫原的能力允许建立能够优选同时输送抗原和佐剂至接 种疫苗的靶向细胞的单剂。
     在一个实施方式中， MDP/DNA 微粒包括至少一种病毒和 / 或细菌抗原。 合适的抗原 的例子包括但不限于结核杆菌抗原例如抗原 -85A， 抗原 -85B， ESAT 和 CFP-10。也可以使用 这些抗原的任意组合。优选的流感抗原来源于循环株的红血球凝集素和神经氨酸酶基因。 鼠疫抗原可从毒素成分 F1， V 或二者的组合 - 所谓的 F1-V 融合抗原中获得。其它可以与本 发明的组分一起使用的病毒和细菌抗原对于本领域所属技术人员来说是已知的。
     优选地， MDP/DNA 微粒的直径为约 0.05 至 3.0 微米。更优选直径为 0.2 至 2.0 微 米。最优选地， 直径为 0.2 至 1.0 微米或者直径为 0.5to 1.0 微米。
     优选地， MDP/DNA 微粒在包含一种或更多种制药或兽医辅料， 载体或溶剂的组合物中。 优选地， 由病毒和 / 或细菌引起的感染的预防或治疗方法进一步包括施加另外一 种有效预防或治疗由病毒和 / 或细菌引起的感染的治疗剂。
     优选地， 上述另外一种治疗剂为同时或顺序施加的疫苗和 / 或抗生素。
     对象优选为哺乳动物或更优选地为人。
     优选地， 待治疗的感染选自但不限于流感， 鼠疫和结核。
     优选地， MDP/DNA 微粒能够作为 NK 细胞的趋化剂。
     优选地， MDP/DNA 微粒能够作为 NK 细胞毒素的趋化剂。
     MDP/DNA 微粒还能够作为抑制病毒和 / 或细菌复制的可溶性因子的趋化剂。
     根据第二方面， 本发明提供具有抗感染活性的药物组合物， 包括 MDP/DNA 微粒， 其 中 MDP/DNA 微粒包括核酸和选择性的药学上可接受的载体。
     根据第三方面， 本发明提供一种具有抗感染活性的药物组合物， 包括 MDP/DNA 微 粒， 其中， MDP/DNA 微粒包括核酸， 组合一种或更多种能够刺激有效损伤和 / 或破坏和 / 或 抑制细菌和 / 或病毒的免疫细胞亚群的配体， 以及选择性的药学上可接受的载体。
     根据第四方面， 本发明提供一种具有抗感染活性的药物组合物， 包括 MDP/DNA 微 粒， 其中， MDP/DNA 微粒包括核酸， 组合一种或更多种细菌和 / 或病毒抗原， 以及选择性的药 学上可接受的载体。
     合适的药学上或兽医载体和剂型对于本领域所属技术人员是已知的。
     MDP/DNA 微粒的核酸成分优选为 DNA。更优选的是细菌非甲基化富含 CpG 的 DNA。
     根据第五方面， 本发明提供包括 MDP/DNA 微粒的组合物， 其中， MDP/DNA 微粒包括 DNA。
     优选地， MDP/DNA 微粒诱导 Th1- 型免疫应答。
     应当理解， 可以将其它治疗和 / 或抗感染剂与 MDP/DNA 微粒组合使用或结合到 MDP/DNA 微粒上。能够同时或顺序施加 MDP/DNA 微粒和 / 或其它抗感染剂。顺序施加可以 为任何合适的分钟， 小时， 天或星期的时限所隔开。
     因此， 根据本发明的第六方面， 提供包含有效量 MDP/DNA 微粒的疫苗组合物。
     还应当理解， 本文描述的 MDP/DNA 微粒组合物可以等同有效地使用于适于人类给 药的药学剂型和适于兽类应用的剂型。优选地， 剂型供人类使用。
     根据第七方面， 本发明提供 MDP/DNA 微粒在制造用于细菌和 / 或病毒感染的预防 或治疗处理药物中的用途。
     除非上下文明确要求， 说明书和权利要求书中， 词 “包括” ， “包含” 等取与排他的或 详尽的意义相对的包容性的意义， 也即是说， 具有意义 “包括但不限于” 。
     在本发明的上下文中， “胞壁酰二肽微粒” 可以与 “微粒” ， “MA” ， “MDP 微粒” ， MDP/ DNA 微粒， “MIS-416” 以及 “MIS” 可交换地使用。在图中， 术语 “MIS” ， “MIS416” 和 “MDP” 相 互交换使用， 并描述本发明的 MDP/DNA 微粒。
     本文中使用的术语 “抗感染” 旨在包括 MDP/DNA 微粒组合物的杀菌活性 ( 即杀害 细菌和 / 或病毒 ) 和抑菌活性 ( 即抑制 / 防止细菌和 / 或病毒的生长， 繁殖和 / 或复制 ) 二者。
     附图说明 图1： 被人外周血髓系树突状细胞 (mDC)， 浆细胞样树突状细胞和单核细胞内化的 荧光标记的 MDP/DNA 微粒 (MISAF488)。
     图2 ： 用 10μg/ml MDP/DNA 微粒 (MIS416) 培养后的 72h 的人 PBMC 分泌的 IFN-γ， IL-10， IL-6， IL-1β 和 TNF-α 细胞因子。
     图3： MDP/DNA 微粒 (MIS) 刺激 ( 通过内涵体 / 溶酶体抑制剂终止刺激 ) 后的 pDC 分泌物。
     图4： 通过 MDP/DNA 微粒 (MIS) 对纯化的人 CD56+CD3-NK 细胞的直接免疫刺激。
     图5： 在使用 MDP-DNA 微粒刺激后， 单核细胞的 TNF 分泌的诱导。
     图6： 在使用 MDP/DNA 微粒 (MIS) 刺激后， 人 PBMC 同步 NK 杀害活性的增强。
     图7 ： 对 HIV-1 分支 A 和 BPBMC 病毒生物负载的抑制， 由从 1， 5 或 10μg/ml 的 MDP/ DNA 微粒 (MA) 刺激后的 PBMC 培养菌中在 48h 小时收集的培养上清介导。
     图8： MDP/DNA 微粒前处理提供抗鼠疫菌气溶胶
     图9： 在感染前 10 天， 用 MDP/DNA 微粒 (MDP) 对老鼠进行抗鼠疫菌的前处理。
     图 10 ： 多种剂量的 MDP-DNA 微粒 (MDP) 的抗鼠疫菌的比较。
     图 11 ： 在感染建立后， 通过 MDP/DNA 微粒 (MIS416) 治疗对流感 A 的发病率和死亡 率的抑制。
     图 12 ： MDP/DNA 微粒 (NT-MDP) 预防法抗炭疽毒素。
     图 13 ： MDP/DNA 微粒 (MIS416) 佐剂 -OVA 免疫原结合物在 Th1 接种疫苗模式中诱 导保护性细胞免疫。
     图 14 ： 伴随 HLA-DR 下调， MDP/DNA 微粒 (MIS416) 上调免疫共刺激分子人 CD83 和 CD86 的人 PBMC mDC 和 pDC 表达。
     图 15 ： 通 过 与 未 治 疗 的 动 物 相 比 减 少 的 肺 Mtb 菌 落 数 来 衡 量 MDP/DNA 微 粒 (MIS416) 增强 Mtb ESTAT 抗原的免疫原性。
     具体实施方式
     没有安全和有效的病毒和 / 或细菌感染的预防或治疗手段激发了本发明， 本发明 部分以交联到微粒上的胞壁酰二肽 (MDP 微粒 ) 对刺激固有免疫系统的独特和有益的性质 为基础。出乎意料地发现， MDP 微粒含有可能具有细菌起源的 DNA 片段， 这可以解释它对几 种不同的、 对很多固有和适应抗感染免疫应答的诱导关键的免疫细胞亚群的选择性靶向和 激活能力。这种新型包含 DNA 片段的 MDP 微粒将在本文中称为 “MDP/DNA 微粒” 。
     虽然本发明的 MDP/DNA 微粒组合物本身能有效靶向和激活有助于细菌和 / 或病毒 的破坏的免疫系统的相关成分， 微粒组合物的功效能够通过能够被偶联到 MDP/DNA 微粒表 面或之内的配体和免疫原 / 抗原所增强。
     本发明的组合物能够杀死细菌和病毒 ( 即杀菌的 )， 但同时也能够预防细菌和病 毒生长 / 繁殖 / 复制 ( 也即抑菌的 )。二种活性类型在细菌和 / 或病毒感染的预防或治疗 中均是有利的。
     本文中描述的 MDP/DNA 微粒已被设计用于诱导高水平的 IFN-α 和与广谱固有免 疫特别是抗毒免疫的诱导临床相关的其它前炎性细胞因子。非常重要地， 调解细胞因子例如 IL-10 的同时产生意味着微粒能够诱导调解免疫应答因而避免与基于免疫的单一治疗 关联的高免疫刺激。 所有这些已通过利用能够在微粒制剂中诱导期望的广度和程度的免疫 应答的特定病原识别受体 (PRR) 配体的免疫刺激性质实现。这限制了关键固有免疫细胞亚 群的微粒吸收， 因而避免了不相关细胞类型介导的临床上不能接受的副作用。
     例如， 对 MDR-Mtb( 耐多药结核分枝杆菌 ) 的免疫性取决于 CD4 和 CD8 依赖的强 Th1 免疫的诱导， 涉及主要细胞因子 IFNγ、 IL-12 和 TNFα。这些细胞因子通过循环机制激 活感染的 MΦs 和 DCs 来借由氧化氮和超氧化物的合成准备和消除细胞内 Mtb。有趣的是， 已知 Toll 样受体 (TLRs) 对树突状细胞上的细胞因子的合成进行调节， 因而影响保护性 Th1 应答的扩增。新兴的研究表明 TLR 信号也可以影响细胞内分枝杆菌的宿命。
     然而应理解， 类似的免疫应答对于防止其它细菌和病毒感染是有益的， 因此本发 明的组合物既可以被用作固有或特异免疫刺激剂来对抗广泛的细菌和病毒感染。 本发明组 合物的抗感染活性可以杀菌活性形式 ( 即杀死细菌和病毒 ) 或抑菌活性形式 ( 预防细菌和 病毒的生长复制 ) 出现， 二种活性类型均有助于对对象的细菌或病毒感染的治疗或预防。
     为了增强固有抗病毒和 / 或抗细菌免疫应答的功效， 可以将 MDP/DNA 微粒与至少 一种结合在微粒上或内、 能够刺激在病毒和 / 或细菌细胞损伤和 / 或销毁中有效的特异免 疫细胞亚群的免疫刺激配体组合。 合适的配体可以选自描述的病原体分子模式识别受体的 已知配体， 包括 TLR1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， NOD-1， NOD-2 等。还能够使用这些配体的任意 组合。其它有用的受体在本领域中是已知的， 能够为所属领域技术人员容易辨别。
     能够被连接到和保留在 MDP/DNA 微粒骨架上的功能基团的可获得性允许高密度 耦合其它佐剂 / 免疫刺激配体， 其能够以基于它们已知的生物活性的原理方式吸收。例如， NOD-1 和 NOD-2 配体已经被表明与合成磷脂 A(TLR4 配体 )， 聚 (I:C)， (TLR3 配体 ) 以及 CpG ODN(TLR-9 配体 ) 协同， 用于诱导人树突细胞 IL-12p70 的产生和 T 细胞关联的 IFN-γ 的 产生。以类似的方式， 能够建立 MDP/DNA 微粒来支持对 Th1 或 Th2 型免疫的优先诱导。此 外， 吸收除了进一步佐剂配体之外的一系列免疫原的能力允许建立能够优选同时输送抗原 和佐剂至接种疫苗的靶向细胞的单剂。
     可快速清除或在特定条件例如细胞内体 / 溶酶体 pH 降低的条件下可逆的连接剂， 对于开发很多生物活性化合物的输送载体有用。MDP/DNA 微粒在现有的型式下被生产用于 向抗原加工 / 表现细胞提供免疫原的靶向输送， 带有 NOD 配体和抗核酸 TLR9 配体共价结合 入微粒中的。 MDP/DNA 微粒含有其它功能基团包括氨基和可氧化碳水化合物基团， 用于连接 免疫原和 TLR 配体。能够采用这些功能基团将期望的免疫原和 / 或配体连接， 使用双功能 交联反应剂例如琥珀酰亚胺、 马来酰亚胺和醛连接剂。此外， 存在可氧化碳水化合物基团， 其提供直接连接初级和次级氨基基团的化学性质， 初级和次级氨基基团可被免疫原和 TLR 配体均吸收。在药物载体的构建中以及连接药物和载体中， 乙缩醛键被广泛用作输送药物 的酸不稳定键。醛可以作为酸不稳定构件模块来交联生物活性化合物至 MDP/DNA 微粒 . 上 的自由氨基基团。
     在一个实施方式中， MDP/DNA 微粒包括至少一种病毒和 / 或细菌抗原。合适的抗 原离子包括但不限于结合杆菌抗原例如抗原 -85A、 抗原 -85AB， ESAT 以及 CFP-10。也可以 使用这些抗原的任意组合。流感抗原通常来源于红血球凝集素和神经氨酸酶基因， 与目前 循环株一致。鼠疫抗原可以来源于有毒成分 F1， V 或二者的组合即所谓的 F1-V 融合抗原。MDP/DNA 微粒优选为耐降解。优选地， MDP/DNA 微粒剂型耐胃蛋白酶、 极限 pH 和变 性状态下的处理。特别是， MDP/DNA 微粒剂型耐 a) 在 pH3.5 下用胃蛋白酶处理， b)pH， 其中 pH 小于 1(1mM HCl) 或大于 11(1mM NaOH) 以及 c) 变性状态， 例如 6M 尿素或 6M 盐酸胍。
     MDP/DNA 微粒的 DNA 组分优选耐核酸例如例子 DNAse I
     MDP/DNA 微粒组合物可以通过合适的手段给药。根据本发明， 使对象具有对某种 疾病免疫或治疗有病的对象的方法可以采用很多方法将将疫苗组合物形成的液体溶液施 加。 示例性的给药方法是肌肉注射、 皮下注射、 静脉注射、 腹腔内注射、 滴眼液、 通过饮水、 喷 雾， 或鼻腔喷雾。到施加给动物时， 任何合适的兽药剂型可以使用。除了上面描述的那些， 剂型还可以是粉或膏形式， 可以通常的方式加入到饲料或口服给药。合适的剂型和赋形剂 能够在标准文本中找到， 例如 Remington ： 科学和药学实践， 19 版本， 1995(Mack Publishing Co.Pennsylvania， 美国 )， 英国药典， 2000 等。
     虽然不希望收到任何关于本发明如何工作的理论的限制， MDP/DNA 微粒剂型的处 理广谱感染剂的能力起源于对固有杀死细胞 (NK) 和其它固有免疫细胞例如浆细胞样树突 状细胞 (pDC) 和单核细胞的激活， 以及由 MDP/DNA 微粒组分中的核酸对多重细胞因子的释 放的诱导 / 刺激。 仅是通过举例的方式， 参考附图描述本发明的优选实施方式。尽管通过举例的方 式描述本发明， 应当理解， 可以在不背离本发明范围的情况下作出变形。此外， 当特定特征 存在已知的等同特征时， 这些等同特征作为在本发明中特别提及的引入。
     实施例
     例 1-MDP/DNA 微粒的制备
     从丙酸杆菌腺胞分离出来的胞壁酰二肽 (MDP) 的多个重复形成了本例中 MDP/DNA 微粒载体复合物的核结构。优选的单体亚基的化学组分显示如下 ：
     众所周知， MDP 具有免疫刺激特性， 其已被为确定它提高免疫功能的效果而设计的 研究广泛评价。至今， 从天然来源中分离出的 MDP 以及合成 MDP 在被施加给哺乳动物时， 均 已与显著的毒性关联在一起。该毒性限制了 MDP 作为佐剂的有效性。
     本文中提供了分离 MDP 和相关的细菌 DNA 片段与有毒成分分离的方法。痤疮丙酸 杆菌生长至中期平稳生长阶段， 采用本领域公知的技术将细菌培养原的污染物清洗除去。 通过在高温下用浓度递增的乙醇 / 异丙醇 / 水 (10％∶ 10％∶ 80％， 25％∶ 25％∶ 50％ 以及 40％∶ 40％∶ 20％ ) 连续顺序提取细胞壁和细胞质中含有的疏水成分， 然后在高温 下使用浓度递减的乙醇 (80％， 50％， 40％以及 20％ ) 连续清洗除去异丙醇。然后将获得的
     MDP/DNA 微粒悬浮在 6M 盐酸胍中， 然后入水洗净， 通过将它在 540nm 的吸光度与浊度标准的 吸收度相关， 测量其浓度。调整 MDP/DNA 微粒的浓度至 10mg/ml， 保存， 待用。
     对该制剂的分析表明胞壁酰二肽广泛地与细菌 DNA 交联形成主要为 1 至 3 微米 大的微粒。MDP/DNA 微粒含有胞壁酸， 且以氨基连接的的 L- 丙氨酸 -D 异谷酰胺二肽和细 菌 DNA 片段为生物活性成分。这样的微粒能够从天然来源分离， 如上所述 ； 或使用众所周 知的合成工艺合成 ( 例如 Liu G. ； Zhang S.-D. ； Xia S.-Q. ； Ding Z.-K.Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters， 10(12)， 2000， pp.1361-1363(3) ； Schwartzman S.M.， Ribi E.， Prep Biochem.1980 ； 10(3) ： 255-67 ； Ohya et al.Journal of Bioactive and Compatible Polymers， 1993 ； 8： 351-364).。 由本方法生成的 MDP/DNA 微粒能够具有宽的尺 寸范围 ( 例如 0.011-30 微米 )， 但是优选的尺寸大小为 0.5-3 微米。
     例 2- 配体和免疫原与 MDP/DNA 微粒的共价连接
     采用还原胺化能够实现配体和免疫原与 MDP/DNA 微粒的连接。本领域所属技术人 员可知， 通过用偏高碘酸钠氧化羧酸盐可在 MDP/DNA 微粒上， 含有羧酸盐的配体 / 免疫原 上， 或在葡萄聚糖， 聚乙烯乙二醇或曼宁桥上生成稳定的羰基。这导致了稳定羰基 ( 醛基 ) 的形成的同时， 其与存在于特定 TLR 配体和免疫原上的氨基反应形成希夫碱中间体。在发 生了形成希夫碱的反应中加入氰基硼氢化钠造成不稳定的希夫碱中间体向化学稳定的键 的完全还原 ( 见下图 )。 与硼氢化钠不同， 氰基硼氢化钠足够温和而能够避免不利地将醛还 原为不反应的羟基。 丛书编辑 Richard Coico( 康奈尔大学 )， 约翰 wiley&sons 出版公司出 版的免疫学实验室手册中对该方法学的方法进行了描述。
     所采用方法的一个例子如下 ： 将 20 ％ 乙 醇 中 的 MDP/DNA 微 粒 (20mg) 离 心 沉 淀， 重新打散在水中， 并用大量水清洗。然后将 MDP/DNA 微粒沉淀和以每 mL 偏高碘酸钠 (0.05-0.5M) 中 MDP/DNA 微粒浓度 50mg 的浓度重新打散， 在室温下进行 1 小时的氧化反应。 在用偏高碘酸钠活化后， 将 MDP/DNA 微粒悬浮液离心沉淀， 重新打散在水中， 并用大量水清 洗。氧化中 MDP/DNA 微粒， 配体， 免疫原等内产生的活化点的数量能够通过改变偏高碘酸钠 的浓度和反应时间来调整。每一 MDP/DNA 微粒的活化的 MDP/DNA 微粒应与至少一分子的对 象免疫原或配体的反应和共价连接。 优选地， 每一 MDP/DNA 微粒， 10-100 分子的对象二肽或 配体， 最优选地， 每一 MDP/DNA 微粒， 100-1000 对象二肽或配体。对于一个高度活化的 MDP/ DNA 微粒的制剂， 使用终浓度为 0.5M 的偏高碘酸钠并且氧化反应进行 1 小时。优选的偏高 碘酸钠的浓度在 5 至 30mM 之间。
     在偏高碘酸钠氧化后， 将 MDP/DNA 微粒沉淀和大量清洗以除去偏高碘酸钠。然后 将活化的 MDP/DNA 微粒重新打散在期望的免疫原或配体 ( 例如 TLR9 或 NOD2， ≥ 1mg/ml， w/ w 20 ∶ 1) 的碳酸氢钠缓冲 (0.1M pH 9.5) 中， 孵育 ( 环境温度 )18-24 小时。离心反应物， 现含有通过中间体希夫碱连接至 MDP/DNA 微粒的免疫原 / 配体的沉淀被还原形成 MDP/DNA 微粒与免疫原 / 配体之间的稳定共价键。
     为该目的可以采用很多还原剂， 典型的被使用的还原剂的一个例子是硼氢化钠。 在希夫碱的还原后， 将 MDP/DNA 微粒 - 免疫原 / 配体结合物沉淀， 清洗， 并以期望的免疫原 / 配体浓度重新打散在期望的疫苗缓冲中。
     如使用， 还能够通过双功能交联剂来将免疫原或配体共价连接至 MDP-DNA 微粒。
     同源双功能亚氨酸酯交联剂介导的耦合DMA， DMP 和 DMS( 如下所示 ) 为水溶性、 可膜渗透的同源双功能亚氨酸酯交联剂。 亚氨酸酯功能基是已有用于伯胺修饰的最明确的酰化基团之一， 其对蛋白质 / 配体中的其 它亲核基团的交联反应性最小。 此外， 亚氨酸酯反应产物不改变蛋白质的整体电荷， 潜在保 留了蛋白质 / 配体的天然构象和活性。蛋白质 / 配体的结合通过二步反应完成， 其中， 首先 根据避免空间位阻要求的间隔臂长， 将 MDP/DNA 微粒与期望的选自下面显示的三种的亚氨 酸酯交联剂孵育。
     首先通过用溶于 0.2M 三乙醇胺， pH8.0( 反应缓冲 ) 的超过 20 倍摩尔量的交联剂 的孵育来使 MDP/DNA 微粒上存在的自由氨基饱和。反应混合物在室温下孵育 30 分钟， 通过 离心和用反应缓冲洗涤 (3x) 从活化的 MDP/DNA 微粒中除去过量的交联剂。将活化的 MDP/ DNA 微粒重新打散在含有期望配体的反应缓冲中。 将反应混合物在室温下孵育 1-2 小时， 将 MDP/DNA 微粒 - 配体结合物沉淀， 用甘氨酸缓冲盐水 (0.05M 甘氨酸 pH 6.5， NaCl 0.9％ ) 洗涤 (x3)， 通过细胞因子诱导实验测生物活性。 如上面对还原胺化连接方法的概述， 使用接 近比例的微粒和免疫原 / 配体。应当指出， 尽管对于作用机制没有限制， MDP/DNA 微粒 - 免疫原 / 配体组合物很 可能通过影响优先的细胞吸收、 蛋白质半衰期以及 MHC 免疫活动的抗原呈递来影响免疫原 性。当期望使不止一个对象免疫原 / 配体免疫时， 能够通过将单独的结合物以最大化引入 混合物中的每个对象肽的免疫原性的比例混合来制备对象免疫原 / 配体 MDP/DNA 微粒结 合物的混合物。在该配制下， 每个微粒结合物 (100-1000 免疫原 - 配体 / 微粒 ) 上获得了 用以增强单个抗原呈递 / 应答细胞的抗原呈递的足够免疫原。能够通过调节每个 MDP/DNA 微粒载体的对象肽的数量和期望时疫苗混合物中免疫原的比例来最大化对象免疫原 / 配 体的免疫原性 / 活性以实现期望的免疫应答。在该配制下， 抗原呈递细胞经过 MHC 相互作
     用进行的抗原加工导致抗原呈递细胞表面呈现高密度的肽 ( 通常超过 100 和最常见的超过 500)。
     其它连接方法可以采用马来酰亚胺的结合化学性质。 可以根据使用磺基琥珀酰亚 胺 4-[N- 甲基马来酸 ]-4- 环己烷 -1- 羧酸盐 (sulfo-SMCC)(Pierce) 的标准实验方案使用 磺酸基修饰的磺基琥珀酰亚胺 -4- 环己烷 -1- 羧酸盐或适于巯基连接的其它连接剂来完成 马来酰亚胺的连接。
     例3： 外周血单核细胞、 类浆细胞 (pDC) 和骨髓 (mDC) 树细胞对荧光标记的 MDP/ DNA 微粒的的内化
     将全血与 50， 25， 10 或 1μg/mL 的 AlexaFluor 488(Invitrogen) 标记的 MDP/DNA 微粒一起孵育， 在 37℃下孵育 30 分钟。使用一组荧光抗体 (Becton Dickinson) 来识别单 核细胞、 类浆细胞和骨髓 DC， 并基于 CD45， BDCA-1， BDCA-2， 宗族标记和 CD14 表达来设置选 通。图 1 显示了每个内化了 AF488 微粒的亚群的％。这些细胞的免疫刺激对于广谱抗感染 防御的启动非常重要， 也因此是 MDP/DNA 微粒的关键的靶向细胞。
     例 4- 由 MDP/DNA 微粒刺激的人类全血介导的一般固有亲炎症应答的表征
     将完全介质 +5％ Ab 血清中全人 1/10 稀释血在 24 壁组织培养板 10μg/mL MDP/ DNA 微粒中培养。将样品孵育 72 小时， 收集不含细胞的上清液用于细胞因子含量分析。使 用流式细胞小球微阵列技术 (Bender MedSystem Flow Cytomix 人类 Th1/Th2 细胞因子多 重套件 ) 分析上清液。图 2 中测量的细胞因子显示 MDP/DNA 微粒是免疫刺激性的， 诱导对 固有免疫细胞的活化和成熟以及固有免疫的诱导非常重要的细胞因子。
     例 5- 用 MDP/DNA 微粒刺激后的内小体 / 溶酶体依赖的 pDC 分泌的 IFNα。
     通过对 BDCA-2+ 细胞的磁珠选择， 将人类 pDC 从 PBMCs 中纯化出来。将 MDP/DNA 微粒或 TLR9 型 A 配体在没有或在 5μm 氯喹的存在下与排序细胞 (106/ml) 一起培养 16 小 时。使用流式细胞仪检测细胞因子球微阵列方法测量了上清液中 IFNα 的含量。图 3 中显 示的结果表明 pDC 的 IFNα 诱导 ( 一种强大的抗病毒细胞因子 ) 的剂量反应性。这由微粒 的核酸成分介导， 最可能通过存在于细胞内体腔中的 TLR9 配体发生作用。与此一致， IFNα 的微粒诱导通过溶酶体 / 内小体抑制剂氯喹可抑制。MDP/DNA 微粒能够激活 pDC IFNα 产 生是非常有利的， 因为这些细胞代表了体内 IFN-α 的天然来源。能够靶向 IFN-α 的固有 产生的剂为病毒感染治疗用重组 IFN-α 提供选择的， 毒性较小的治疗制度。
     例 6- 纯 NK 和 NKT 细胞在用 MDP/DNA 微粒刺激 40 小时后产生的 IFNγ、 GM-CSF、 MIP-1α 以及 TNFα
     使用分离 NK(CD56+CD3-) 和 NKT 细胞 (CD56+CD3+) 的 MAC 阳性选择珠从全血中将 人 CD56+ 细胞以 99％的纯度纯化出来。然后将纯化的细胞在没有刺激剂， IL-2(500U/ml)， IL-12(50ng/ml) 或 MDP/DNA 微粒 (40， 20， 10， and 5 and 1μg/ml) 存在下培养 (7.5x105/ ml)40 小时。使用流式细胞仪检测细胞因子球微阵列方法测量了上清液中 IFN-γ、 TNF-α、 GM-CSF 以及 MIP-1-α 的含量。从图 4 可见， MDP/DNA 微粒明显地刺激了细胞因子 IFNγ、 TNFα 以及 MIP-1α 和 GM-CSF 的产生。NK 细胞在破坏病毒感染细胞中发挥重要作用， 而这 些因子是 NK 细胞免疫激活的标志。NK 细胞和从它们中衍生的因子还可以激活和提高巨噬 细胞和其它吞噬细胞的防御。
     例 7- 单核细胞在用 MDP/DNA 微粒刺激 22 小时后的 TNF 的诱导产生用 20， 10， 5 和 1μg/ml 的 MDP/DNA 微粒培养人 PBMC(106/ml)22 小时。在培养的最 后 6 小时加入蛋白质输送抑制剂 (brefeldin A) 以使细胞因子能够积累。用可固定的活 / 死的紫株 (Invitrogen) 标记细胞， 清洗， 接着使用 Cytofix/Cytoperm(Becton Dickinson) 固定 / 使可透过， 接着， 用抗 -TNFα-APC-Cy7 单克隆抗体标记。如图 5A 所示， 基于活 / 死 染料排斥结合 FSC-v-high SSC 门控辨别出活的单核细胞。在图 5B 中， 确定了表达 TNFα 选通的可行单核细胞在全部 MDP/DNA 微粒浓度下的比例。TNFα 表达单核细胞的最大比例 为 20μg/ml MDP/DNA 微粒时的 73.8％。TNFα 是激活 PMN 细胞粒的吞噬和杀菌活性的重 要细胞因子。
     例 8- 用 MDP/DNA 微粒刺激后人 PBMC 同时 NK 杀死活性的增强
     用 40， 20， 10 和 5μg/ml 的 MDP/DNA 微 粒 培 养 PBMC。 已 知 的 NK 细 胞 激 活 剂 IL-2(500U/ml) 和 TLR3 配体， 聚 I:C(50μg/ml) 作为阳性对照实验。培养 18 小时后， 将 PBMC 入新鲜介质洗涤， 测试其对荧光标记的 NK 敏感 K562 肿瘤目标在效应物 ： 目标比例为 100 ∶ 1， 10 ∶ 1， 1 ∶ 1 时的细胞毒性。4 小时后使用流式细胞仪活 / 死区分门控确定对荧 光 K562 目标的肿瘤细胞杀害。结果见图 6。这些数据表明功能性 NK 活性由 MDP/DNA 微粒 诱导。NK 细胞杀害的激活是期望的， 因为众所周知它们能杀死病毒感染细胞。
     例 9- 由从用 1， 5 或 10μg/ml MDP/DNA 微粒刺激 48 小时的 PBMC 培养液中收集的 培养菌 s/n. 介导的 HIV-1 分支 A 和 B 病毒生物负载的抑制
     在加入 33％ v/v MDP/DNA 微粒刺激的培养菌 s/n(0.2μm 过滤 ) 之前， 将 PBMC 培养 菌用 HIV-1 病毒苗预孵化 24h。作为对 HIV-1 复制抑制的阳性对照， 加入 10， 100 或 1000U/ ml 的重组人类 IFNa。 在第 5 天施加 HIV-1 感染， 收集 PBMC， 使用流式细胞仪分析细胞内活细 胞的 p24 抗原表达来确定 HIV 感染细胞的％。计算了关于仅带有病毒培养菌细胞的平均生 物负载的感染抑制百分数 (％ )。结果表明， 标准误差平均值来自于第三份的微培养菌 ( 图 7)。DNA 细胞凋亡 / 细胞周期分析确定了， MDP/DNA 微粒激活的 s/n 或 IFNa 对整个 PBMC 培 养菌的生存能力没有影响 ( 数据未显示 )。这些数据证明 MDP/DNA 微粒诱导能够直接抑制 病毒复制的可溶性因子产生。
     例 10-MDP/DNA 微粒对感染 ( 鼠疫 ) 的影响
     C57BL6 老鼠接受了 MDP/DNA 微粒 (100g i.p.) 的表示的时间表， 然后在第 0 天用 耶尔森氏菌感染
     对于耶尔森氏菌感染， 用 1x105CFU 株 KIM D27 通过滴鼻使老鼠受感染。这代表了大约 10LD50， 与 LD100 接近。所有未治疗的对照动物到第 8 天受感染而死 ( 图 8)。在治疗 的动物中有幸存者。幸存数最多 (2/5) 发生在第 10 天接受了 MDP/DNA 微粒的二组。预期 在第 10 天治疗具有最好的结果。 为进一步证实初步的发现， 做了进一步的研究 ( 图 9， 10)。 在这些研究中， 在感染前的 10 天施加 50 或 500μg 的 MDP/DNA 微粒。发现 50μg 剂量提供 比 500μg 剂量的更好的保护。二个剂量均给予了比生理盐水对照更好的保护。总之， 研究 表明 MDP/DNA 微粒能够提供防止肺鼠疫的保护。
     例 12- 通过用增加了存活率和体重的减轻测定了 MDP/DNA 微粒处理对暴露于流感 后提供的保护
     老鼠 ： 从杰克逊实验室 (Bar Harbor， ME) 购买野生型 C57BL/6 老鼠， 然后在特鲁多 研究所动物养殖基地饲养。 所有老鼠均根据特鲁多研究所动物照顾与使用委员会的指导方 针进行安置和照顾。
     病毒感染 ： 从 D.Morgan( 斯克里普斯研究所， 拉霍亚加州 ) 处获得流感 A 病毒的 A/PR/8/34(H1N1) 株。病毒苗在 10 天大的鸡胚的尿囊腔中产生， 并于 -70℃下保存。用异 氟醚将老鼠轻度麻醉， 通过滴鼻接种 0.3LD-50 流感。感染后， 每天对老鼠称重， 超过 30％ 体重的减轻被认为是垂死的。在感染病毒后一天通过尾静脉注射施加生理盐水 (50μg or 250μg) 稀释的 MDP/DNA 微粒或生理盐水。 统计 ： 通过学生试验分析体重减少数据。通过对数秩检验分析存活率数据。在两 种情况下， P ＜ 0.05 被认为是统计显著的。
     结果如图 11A) 所示， 两个剂量的 MDP-DNA 微粒对失重的影响类似。(*) 表示， MDP/ DNA 微粒治疗显著减少失重。B) 失重超过它们初始体重的 30％的动物被认为是垂死的， 使 其安乐死。从两个独立的实验 ( 每组总共 n ＝ 15 只老鼠 ) 中收集数据。用 MDP/DNA 微粒 处理的动物的发病率的降低是统计显著的 ( 对数秩检验 p 为 0.035)。 这些发现证明甚至在 病毒感染建立时， 使用单剂量的 MDP/DNA 微粒的治疗能够减轻发病率和死亡率因子相关的 流感感染。这进一步证明了 MDP/DNA 微粒诱导功能性相关水平的抗病毒的能力。
     例 14-MDP/DNA 微粒免疫结合物诱导适应性细胞 Th1 免疫
     适应性细胞 TH1 免疫对于特定感染疾病例如结核杆菌和病毒感染的保护具有重 要意义。肿瘤疫苗接种模型对于确定 MDP/DNA 微粒免疫结合物的 Th1 佐剂性质是有用的。 OVA 肿瘤抗原是被充分表征的肿瘤抗 OVA-MDP/DNA 微粒免疫原， 通过巯基连接将其共价连 接到 MDP/DNA 微粒上。 从 13A， B 中可见， 使用 OVA-MDP/DNA 微粒免疫结合物的接种疫苗诱导 了在预防性肿瘤疫苗模型中继转 CD8+ 细胞的周边扩展以及随后的抗肿瘤免疫性的诱导。
     (A) 将同源纯化的 CD8+ OT-I 细胞 (103) 通过 i.v delivery 继转至老鼠组 (C57/ B16 ； n ＝ 10)， 然后通过用 25μg Ova， 25μg OVA-MDP/DNA 微粒 (MIS416) 免疫结合物或 25μg OVA 与 200ngα- 半乳糖神经酰胺的混合物 ( 用作 Th1 反应的 i.v. 免疫化的阳性对 照 ) 进行 i.v. 免疫化。在各种时间点提取外周血的样品直至免疫化的 35 天后。使用流式 细胞仪分析带有 CD8+CD45.1+Vα2+ 显型 (OT-I 特异 ) 的 T 细胞确定了 OT-I 细胞的扩展。
     (B) 在免疫化后的 36 天， S.C. 注射入 106B16-OVA 肿瘤细胞， 并检测肿瘤测得成长。
     发现证明 MDP/DNA 微粒辅助的疫苗能够诱导保护性 Th1 免疫应答。这对于防止特 定感染疾病例如要求新型开发 TH1 疫苗佐剂的结核病的有效疫苗的产生具有尤为重要的 意义。
     例 15- 伴随 HLA-DR 上调， MDP/DNA 微粒上调共刺激分子 CD83 and CD86 的人 PMBC mDC 和 pDC 表达
     用 MDP/DNA 微粒刺激人 PBMC(106/ml)。CpG 型 C 和 HKSA 作为阳性对照试验。在 刺激后的 22 小时， 使用多参数流式细胞仪确定了 gated， 活着的 mDC 和 pDC 上的 CD83， CD86 以及 HLA-DR 的共表达。
     在抗原呈递细胞 (APC) 的细胞 repertoire 内， 无论是体内还是体外， mDC 和 pDC 对于诱导固有应答和全面的初级和次级 T 细胞适应性应答均是必不可少的。相应地， MDP/ DNA 微粒已被表明是一种体内 PBMC mDC 成熟的强力诱导剂， 如由 Ag- 呈递 MHC 类 II 分子与 CD83 和 CD86 共刺激分子至与加热杀死金黄色葡萄球菌 (HKSA) 类似程度的上调所表明。 对 pDC 成熟的共分析还揭露了 MDP-DNA 微粒能够诱导伴随 CD86 的上调的 HLA-DR 的显著上调。 相比之下 CD83 表达被上调至与其它 pDC 成熟刺激物例如合成 CpG 型 C 较少程度。MDP/DNA 微粒防止 pDC 和 mDC 的活性程度的不同一部分是由于 mDC 的吞噬性比 pDC 更强， 因而优先 内化微粒。这些发现显示在图 14 中， 支持 MDP/DNA 微粒作为固有免疫刺激剂的用途。
     例 16-MDP/DNA 微粒增强老鼠的 ESAT-6 Mtb 抗原和清除耐药结核分枝杆菌的免疫 原性 通过静脉注射使 C57Bl/6 老鼠以每只老鼠 105CFU 感染 MTb 的耐药株， 使感染进行 14 天。然后在第 14， 18 和 21 天对每只老鼠用重组 MTb ESAT-6 蛋白的 Titermax 佐剂， MDP/ DNA 微粒佐剂或无佐剂处理老鼠 ( 每只老鼠 3 剂量 )。老鼠在第 28 天死亡， 通过在 7H11 琼 脂上覆盖器官匀浆来进行肺的菌落形成单位计数。每个时间点分析 3 只老鼠。MDP/DNA 微 粒诱导了与没有处理的动物相抵显著降低的 MTb 肺菌落的形成。相比之下， 对比的佐剂， * Titermax， 没有显著增强 ETSAT 的免疫原性 ( 见图 15， 表示 t 试验显著性 )。
     尽管参考了特定优选实施方式和例子描述了本发明， 应理解， 还包涵在本发明和 本文公开的精神内所做的各种变型。