环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010502878.7	申请日：	2010.10.11
公开号：	CN101982072A	公开日：	2011.03.02
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A01K 61/00申请公布日:20110302\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01K 61/00申请日:20101011\|\|\|公开
IPC分类号：	A01K61/00	主分类号：	A01K61/00
申请人：	上海市环境科学研究院; 北京师范大学
发明人：	胡双庆; 沈根祥; 史江红; 孟耀斌; 张洪渠; 朱江; 王晓丹; 赵庆节; 郭春霞; 钱晓雍; 朱英; 顾海蓉; 王振旗
地址：	200233 上海市徐汇区钦州路508号
优先权：
专利代理机构：	上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227	代理人：	张美娟
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内容摘要

本发明公开了一种环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，利用胚胎对环境污染物或者化学物质刺激的敏感性，将大银鱼胚胎暴露于含有受试物的一系列浓度的标准稀释水溶液中，以半静态条件进行试验。试验从将处于囊胚期的活胚胎暴露于含受试物的水溶液开始，至对照组和暴露组中所有的胚胎孵化完成结束，持续30天左右。毒性终点包括致死、致畸和孵化延迟。通过对暴露组毒性终点的观察及与对照组的比较，确定该受试物对大银鱼胚胎发育的毒性。研究两种天然雌激素E2和EE2对大银鱼胚胎-卵黄囊阶段的影响，以确定它们对大银鱼胚胎发育毒性的剂量-效应关系，并且评价该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。

权利要求书

1：环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：具体步骤如下： 1）首先称取 1 mg 的 E2 溶于 500 ml 标准稀释水中，配制成 2 mg/L 的 E2 储备液，将试剂瓶用膜封口后置于 2℃冰箱避光保存，用同样的方法配制 2 mg/L 的 EE2 储备液并保存； 2）试验时，取出上述储备液，待恢复到室温并充分摇匀后，用标准稀释水分别于玻璃培养皿内配制浓度为 1、 0.2、 0.04 mg/L， 8、 1.6 μg/L 和 10、 0.05 mg/L 的 E2 和 EE2 的暴露溶液，并各移取 20 ml 放入培养皿中；空白对照为 20 ml 标准稀释水，另取经脱脂棉过滤的长江水 20 ml 作为自然水体环境对照，以上暴露液和对照液均设置 3 组平行； 3）随机挑选处于囊胚期的活胚胎置于倒置显微镜下进行观察试验，在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入 10 个胚胎，然后将胚胎置于恒温培养箱内培养，在 2-10℃条件下保持恒温、无光照，试验持续 30 天，每天用倒置显微镜观察测试的终点，并记录； 4）使用 SPSS 13.0 for Windows 软件，对大银鱼胚胎在暴露浓度下与空白下的存活、生长和发育进行显著性分析。
2：根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：所述的标准稀释水，采用分析纯的化学品和全玻璃蒸馏水或去离子水，取氯化钙溶液、硫酸镁溶液、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液 4 种溶液各 25 ml 加以混合，稀释至 1 L，稀释用水需经曝气至氧饱和为止，然后储存备用。 3. 根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：所述的氯化钙溶液是将 11.76 g CaCl2· 2H2O 溶解于 1 L 水中，所述的硫酸镁溶液是将 4.93 g MgSO4· 7H2O 溶解于 1 L 水中，所述的碳酸氢钠溶液是将 2.59 g NaHCO3 溶解于 1 L 水中，所述的氯化钠溶液是将 0.23 g KCl 溶解于 1 L 水中。 4. 根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：步骤 2）中各暴露浓度组的配制方法如下：取 12.5 ml E2 或 EE2 储备液于等体积的标准稀释水中，配成 1 mg/L 的 E2 或 EE2 暴露液 25 ml ；充分混匀后按 5 倍体积逐级稀释成 200、 40、 8 和 1.6 μg/L 的暴露液；然后再取 125 μL 的 1.6 μg/L 暴露液于 19.875 ml 标准稀释水中，配成 10 mg/L 的暴露液；取 100 μL 的 10 mg/L 暴露液于 19.9 ml 稀释水中，配成 0.05 ng/L 的暴露液。 5. 根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：步骤 3）中，将胚胎置于恒温培养箱内培养，在 8℃条件下保持恒温。 6. 根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：步骤 3）中，采用半静态暴露方式，所有暴露液和对照液每 2 天更换一次；更换溶液时，用吸管逐一地吸取胚胎转移至新鲜溶液内，如有死亡胚胎或死亡的幼鱼，采用吸管吸取将之移除；测试的终点包括致死、致畸和孵化延迟。
3： 0 for Windows 软件，对大银鱼胚胎在暴露浓度下与空白下的存活、生长和发育进行显著性分析。 2. 根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：所述的标准稀释水，采用分析纯的化学品和全玻璃蒸馏水或去离子水，取氯化钙溶液、硫酸镁溶液、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液 4 种溶液各 25 ml 加以混合，稀释至 1 L，稀释用水需经曝气至氧饱和为止，然后储存备用。 3. 根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：所述的氯化钙溶液是将 11.76 g CaCl2· 2H2O 溶解于 1 L 水中，所述的硫酸镁溶液是将
4： 93 g MgSO4· 7H2O 溶解于 1 L 水中，所述的碳酸氢钠溶液是将 2.59 g NaHCO3 溶解于 1 L 水中，所述的氯化钠溶液是将 0.23 g KCl 溶解于 1 L 水中。 4. 根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：步骤 2）中各暴露浓度组的配制方法如下：取 12.5 ml E2 或 EE2 储备液于等体积的标准稀释水中，配成 1 mg/L 的 E2 或 EE2 暴露液 25 ml ；充分混匀后按 5 倍体积逐级稀释成 200、 40、 8 和 1.6 μg/L 的暴露液；然后再取 125 μL 的 1.6 μg/L 暴露液于 19.875 ml 标准稀释水中，配成 10 mg/L 的暴露液；取 100 μL 的 10 mg/L 暴露液于 19.9 ml 稀释水中，配成 0.05 ng/L 的暴露液。
5：根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：步骤 3）中，将胚胎置于恒温培养箱内培养，在 8℃条件下保持恒温。
6：根据权利要求 1 所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于：步骤 3）中，采用半静态暴露方式，所有暴露液和对照液每 2 天更换一次；更换溶液时，用吸管逐一地吸取胚胎转移至新鲜溶液内，如有死亡胚胎或死亡的幼鱼，采用吸管吸取将之移除；测试的终点包括致死、致畸和孵化延迟。

说明书

环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法
    技术领域本发明涉及一种毒性测试方法，具体为环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，属于鱼类急性毒性测试领域。
     背景技术近三十年来，环境中的外源性化合物 —— 环境雌激素（Environmental estrogens）能够造成人类和野生动物发育和繁殖方面的健康损害，引起了人们高度重视，目前已报道的环境雌激素危害包括：男性精液减少、野生鱼类性发育紊乱（包括雌雄同体、雄鱼雌化等）、两栖动物（如短吻鳄、蟾蜍）种群减少等。环境雌激素是内分泌干扰物中重要的一类，它们或者属于天然雌激素（即由生物体内源雌激素排泄而进入环境），或者属于人工合成雌激素以及具有雌激素活性的合成化学品，当其进入生物体后能模拟体内内源性雌激素的功能和行为，引发类雌激素反应，从而对生物体的激素平衡、生殖、发育和行为等造成负面影响。研究证实，目前环境中已经存在成百上千种具有不同雌激素活力的化合物。其中，几种常见的环境雌激素及其雌激素活力和来源如表 1 所示；
     *EEq (17β-E2 Equivalent) ：换算成 17β- 雌二醇的雌激素活力当量。
     雌激素活力当量越大，对生物体潜在的内分泌干扰效应就越强，因此， E2 和 EE2 是两种最受关注的环境雌激素，它们的化学结构式和理化性质见表 2。前者是天然雌激素中雌激素活力最强的一种，通常被用作值为 1 的雌激素当量，以衡量其他化合物的雌激素活力。主要通过粪便和尿液进入自然环境。据报道，一头奶牛每天排泄的 E2 由人或动物分泌而成，粪便中 E2 含量达 170~1230 μg/kg，成年女性 E2 的排泄量可达 82~695 μg/ 天，而怀孕期间妇女 E2 的排泄量可达平时的 1000 倍。后者是人工合成的雌激素，主要作为女性避孕药和治疗绝经期综合症的雌激素替代疗法用药；。
     半个世纪以来，由于全球工业化的加速和集约化畜禽养殖厂的兴起，排放到环境中的 E2 和 EE2 量显著增多。目前， E2 和 EE2 已被报道在各种环境介质中存在（见表 3）。虽然传统的污水处理厂（STP）对 E2 和 EE2 有一定的去除效果（雌激素活力降低 80~97%），但有报道证实，若生物体长期生活在 STP 出水的受纳水体中（含有 ng/L 痕量水平的 E2 或 EE2），会诱发机体产生负面效应。由于 E2 和 EE2 具有较高的 Log Kow 值，它们能够在生物体脂肪组织中长时间存在，因此会通过食物链的生物放大作用，对人体健康带来更大的威胁；* 污泥干重。
     无论环境雌激素是通过 STP 排放进入地表水，还是通过底泥的释放作用再次进入水体，水环境总是环境雌激素的重要赋存介质，因此，鱼类（如斑马鱼、拟鲤、青鳉、虹鳟鱼等）可用作环境雌激素生态风险评估的重要试验生物。鱼类急性毒性试验（Fish Acute Toxicity Test）是目前化学品生态毒性测试的必要组成部分，然而试验中鱼类致死率是唯一的测试终点，该试验的道德性和科学性正受到越来越多的质疑。因此，一些替代的测试方法得到研究者们的开发和验证，例如鱼类细胞或细胞系体外测试方法、鱼类胚胎测试方法等，其中鱼类胚胎毒性（Fish Embryo Toxicity, FET）测试是目前被广泛认可并最具有潜力的替代方法。
     Lange 等人在 1995 年报道了利用斑马鱼胚胎作为试验载体来测试十种特定化合物的急性毒性，研究结果发现，这十种化合物能够引起斑马鱼胚胎发育明显损害，指示终点包括胚胎凝固、原肠胚的发育、肌节的数量、器官的发育、心跳、着色等。其后，将斑马鱼胚胎测试（Danio rerio embryo test, DarT）结果与利用虹鳟鱼细胞系 RTG-2 作为试验载体的毒性测试结果相比较，发现 DarT 测试比成鱼或 RTG-2 细胞急性毒性测试更为灵敏，因而推荐 DarT 测试作为成鱼急性毒性测试的替代方法。随后为了验证该方法的可靠性，欧洲几个国家试验室同时开展了化合物和城市污水的 DarT 测试，并将结果进行了比较，发现 DarT 测 2 试结果不仅与成鱼急性毒性测试结果具有很好的相关性（R =0.84），而且在不同试验室之间并没有显著性差别（p > 0.05）。2005 年， Braunbeck 等提供数据证实除斑马鱼外其他的一些测试鱼种，如黑头呆鱼 (Pimephales promelas ) 和日本青鳉 (Oryzias latipes )，其早期胚胎阶段也可以用做 FET 测试。自 2005 年起， FET 测试已经被德国强制要求作为 STP 总出水的日常毒性测试项目，随后 STP 总出水斑马鱼胚胎测试也被采纳为国际标准。 2006 年， OECD 发布了 FET 测试作为化学品测试项目的草案。
     FET 测试具有三大优点：（1）耗时较短（其中 DarT 测试仅需 48 小时）（2）；数据真实可靠；（3）可观察的毒性终点较多且灵敏，包括致死、半致死、致畸等。其中，最后一点对于测试在环境浓度下通常没有致死效应的化合物（如环境雌激素）的毒性效应更为适用。目前国际上 FET 测试推荐的试验鱼种仅限于斑马鱼和日本青鳉，但这两个鱼种并非我国的本土种，并且在我国自然水环境中没有这两个物种存在，因此，选取一种我国特有的、具有广泛代表性的鱼种进行 FET 测试，从而对我国水体环境中雌激素类物质开展生态风险评估，具有重要的理论价值和现实意义。而大银鱼（Protosalanx hyalocranius Abbott）正好符合这种研究需求。
     当前，国内对大银鱼的研究还局限于它的生物学特性、增殖和移植技术，尚未利用大银鱼胚胎开展 FET 测试研究。本文利用大银鱼胚胎阶段对化学物质的敏感性，研究两种天然雌激素（E2 和 EE2）对大银鱼胚胎 - 卵黄囊阶段的影响，以确定它们对大银鱼胚胎发育毒性的剂量—效应关系，并且评价该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。本文也是国内外首次使用大银鱼作为试验生物，开展雌激素胚胎毒性效应的研究。发明内容本发明的目的是为了提供一种环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，以测试该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。
     本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
     环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，具体步骤如下： 1）首先称取 1 mg 的 E2 溶于 500 ml 标准稀释水中，配制成 2 mg/L 的 E2 储备液，将试剂瓶用膜封口后置于 2℃冰箱避光保存，用同样的方法配制 2 mg/L 的 EE2 储备液并保存； 2）试验时，取出上述储备液，待恢复到室温并充分摇匀后，用标准稀释水分别于玻璃培养皿内配制浓度为 1、 0.2、 0.04 mg/L， 8、 1.6 μg/L 和 10、 0.05 mg/L 的 E2 和 EE2 的暴露溶
     液，并各移取 20 ml 放入培养皿中；空白对照为 20 ml 标准稀释水，另取长江水（经脱脂棉过滤） 20 ml 作为自然水体环境对照，以上暴露液和对照液均设置 3 组平行； 3）随机挑选处于囊胚期的活胚胎置于倒置显微镜下进行观察试验，在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入 10 个胚胎，然后将胚胎置于恒温培养箱内培养，在 2-10℃条件下保持恒温、无光照，试验持续 30 天，每天用倒置显微镜观察测试的终点，并记录； 4）使用 SPSS 13.0 for Windows 软件，对大银鱼胚胎在暴露浓度下与空白下的存活、生长和发育进行显著性分析。
     所述的标准稀释水，采用分析纯的化学品和全玻璃蒸馏水或去离子水（电导率 ≤ 10 μS/cm），取氯化钙溶液、硫酸镁溶液、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液 4 种溶液各 25 ml 加以混合，稀释至 1 L，稀释用水需经曝气至氧饱和为止（不低于空气饱和值的 90%），然后储存备用。
     所述的氯化钙溶液是将 11.76 g CaCl2·2H2O 溶解于 1 L 水中。
     所述的硫酸镁溶液是将 4.93 g MgSO4·7H2O 溶解于 1 L 水中。
     所述的碳酸氢钠溶液是将 2.59 g NaHCO3 溶解于 1 L 水中。
     所述的氯化钠溶液是将 0.23 g KCl 溶解于 1 L 水中。步骤 2）中各暴露浓度组的配制方法如下：取 12.5 ml E2 或 EE2 储备液于等体积的标准稀释水中，配成 1 mg/L 的 E2 或 EE2 暴露液 25 ml ；充分混匀后按 5 倍体积逐级稀释成 200、 40、 8 和 1.6 μg/L 的暴露液；然后再取 125 μL 的 1.6 μg/L 暴露液于 19.875 ml 标准稀释水中，配成 10 mg/L 的暴露液；取 100 μL 的 10 mg/L 暴露液于 19.9 ml 稀释水中，配成 0.05 ng/L 的暴露液。
     步骤 3）中，将胚胎置于恒温培养箱内培养，在 8℃条件下保持恒温。
     步骤 3）中，采用半静态暴露方式，所有暴露液和对照液每 2 天更换一次。更换溶液时，用吸管逐一地吸取胚胎转移至新鲜溶液内。如有死亡胚胎或死亡的幼鱼，采用吸管吸取将之移除。测试的终点包括致死（胚胎凝固、幼鱼无心跳、幼鱼无自动）、致畸（卵黄囊畸形、幼鱼脊柱畸形）和孵化延迟。
     暴露试验放置在恒温培养箱（MGC-300H，上海）中进行，鱼类胚胎使用倒置显微镜（Zeiss Axiovert S100， USA）观察。玻璃培养皿（Φ9cm）用蒸馏水润洗 3 次、烘干，供试验使用。
     本发明利用胚胎对环境污染物或者化学物质刺激的敏感性，在一定条件下，将大银鱼胚胎暴露于含有受试物的一系列浓度的标准稀释水溶液中，以半静态条件进行试验。试验从将处于囊胚期的活胚胎暴露于含受试物的水溶液开始，至对照组和暴露组中所有的胚胎孵化完成结束，持续 30 天左右。毒性终点包括致死、致畸和孵化延迟。通过对暴露组毒性终点的观察及与对照组的比较，确定该受试物对大银鱼胚胎发育的毒性，包括半致死浓度（LC50）、致畸率、孵化率和孵化延迟时间等。
     本发明利用大银鱼胚胎阶段对化学物质的敏感性，研究两种天然雌激素（E2 和 EE2）对大银鱼胚胎 - 卵黄囊阶段的影响，以确定它们对大银鱼胚胎发育毒性的剂量 - 效应关系，并且评价该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。
     附图说明
     图 1 为不同温度下空白组大银鱼胚胎孵化时间和存活率柱形图；图 2 为 E2 和 EE2 暴露条件下胚胎 / 仔鱼的最大致畸率柱形图；图 3 为不同雌激素暴露浓度下第一条大银鱼仔鱼孵出的时间柱形图。具体实施方式
     下面结合具体实施例和附图具体阐述本发明的技术特点。
     受试生物为大银鱼胚胎。在大银鱼产卵期（每年 12 月中旬至翌年 3 月中下旬）采集其受精卵。实验开始前，将受精卵小心地移入装有标准稀释水的玻璃培养皿中，使其在培养皿底部散布均匀，然后置于 2℃冰箱避光保存。每两天全部更换一次溶液。
     预试验在助溶剂甲醇对照组中，大银鱼胚胎暴露 2 天后全部死亡，因此正式试验中不使用助溶剂，雌激素最高暴露浓度设置为 1 mg/L （低于雌激素在水中的最大溶解度）。标准稀释水中胚胎的发育与孵化情况（见表 4 和图 1）基本与水库水中胚胎的发育和孵化情况相一致，因此，为了更好地控制试验条件，正式试验采用标准稀释水作为稀释液和空白对照液；。在 3、 6、 8 和 10℃下，大银鱼胚胎表现出不同的发育和存活情况，如图 1 所示。可见，在 8℃下，大银鱼胚胎的发育既能达到孵化时间短（胚胎开始孵化时间 16 天及全部胚胎孵化时间 18 天），又能实现较高存活率（80%）。而在较低的温度下胚胎出现发育缓慢的现象（胚胎开始孵化时间 20~28 天及全部胚胎孵化时间 24~32 天），在较高的温度下又不能保证空白组较高的存活率（仅有 60%）。因此， 8℃应为大银鱼胚胎发育的最适温度，正式实验将采用该温度进行。
     雌激素的致死效应每天观察大银鱼胚胎 / 仔鱼的存活数量，并记录。致死终点包括胚胎凝固、幼鱼无自动和幼鱼无心跳。
     试验观察 27 天后，暴露在不种浓度的 E2 和 EE2 下，大银鱼胚胎 / 仔鱼的存活情况。根据空白组胚胎 / 仔鱼存活率，选取 5 个典型时段分析雌激素暴露与胚胎 / 仔鱼存活数之
     间的关系。
     在各组暴露浓度下， E2 和 EE2 对大银鱼胚胎 / 仔鱼的致死效应在 15 天后才显现出来。但 15 天后，空白对照组的存活率也降至 76.7%（17~23 d）和 70.0%（24~27 d），这是由于野生大银鱼胚胎本身就存在孵化率低的特点。第 23 天时， 1 mg/L 的 E2 暴露组中活体的数目比空白对照组显著减少（p < 0.05）；第 27 天时， 1 mg/L 的 EE2 暴露组中活体的数目比空白对照组十分显著减少（p < 0.01）；而暴露于长江水的活体数与空白对照组的活体数无明显差异。
     雌激素的致畸效应每天观察大银鱼胚胎 / 仔鱼的畸形数量，并记录，致畸终点包括卵黄囊畸形和仔鱼脊柱畸形。
     试验观察 27 天后， E2 和 EE2 对大银鱼胚胎 / 仔鱼的致畸效应见图 2 所示。选取 27 天内大银鱼胚胎 / 仔鱼最大致畸率进行讨论。在 27 天内，空白对照组和长江水对照组都没有畸形胚胎 / 仔鱼的出现；而在 1 mg/L 的 E2 和 EE2 暴露组中，由于致死效应明显，故也没有观察到畸形个体的出现；在 E2 暴露条件下，最大致畸率出现在第 16 天的 8 μg/L 暴露组；而 EE2 暴露条件下，最大致畸率出现在第 18 天的 0.2 mg/L 暴露组。
     雌激素的孵化延迟效应记录各暴露浓度下第一条大银鱼仔鱼孵化出的时间，结果如图 3 所示。在 0.2 mg/L 的 E2 和 EE2 暴露浓度组，第一条仔鱼孵化出的时间与空白对照组相比，出现了明显的延迟；而在 1 mg/L 的 E2 和 EE2 暴露浓度组，第一条仔鱼孵化出的时间与空白对照组相比，出现了更加明显的延迟，分别比空白对照组晚了 7 天和 11 天；而长江水对大银鱼仔鱼的孵化没有明显影响。
     正式试验开始 15 天后，暴露于 1 mg/L 的 E2 和 EE2 浓度组中，大银鱼胚胎出现大量死亡，存活率分别从第 15 天的 90.0% 和 90.0% 降至第 23 天的 40.0% 和 43.3% ；而暴露于 0.2 mg/L~0.05 ng/L 的 E2 和 EE2 浓度组中，第 23 天存活率均大于 60.0%。结果表明 E2 和 EE2 对大银鱼的 23 d-LC50 在 0.2 ~ 1 mg/L 的浓度范围内，此浓度远远高于两种雌激素在自然水体环境中检测到的浓度，因此可以初步判断这两种雌激素在自然水体环境中不会对大银鱼胚胎或仔鱼产生致死效应。这与 Tabata 等人（2001 年）研究得到的结论相一致。他们将日本青鳉胚胎暴露在 E2 中 200~230 天，结果发现 25 μg/L 的 E2 暴露下青鳉才出现存活率显著减小的现象。而 Westerlund 等人（2000 年）将 E2 注射入雌性斑马鱼的体内，结果发现 1 μmol/kg(0.27 mg/kg) 和 1 nmol/kg(0.27 μg/kg) 的 E2 注射量下， 8 天后致死率达到 95% 和 79%。研究结果的差异可以是由于试验鱼种对 E2 的耐受性不同，或者由于暴露方式的不同造成。对于 EE2 的致死效应， Jaser 等人（2003）用水溞 (Ceriodaphnia reticulate ) 作为试验生物开展急性毒性测试，得到 24h-EC50 值为 1.814 mg/L。
     无论是暴露于 E2 或 EE2 条件下，最大致畸率都出现在第 16 天至第 18 天之间，原因是一些在成形期就产生畸形的胚胎孵化后大部分均死亡。虽然致畸率没有表现出明显的剂量 - 效应关系，但即使在自然环境能检测到的 E2 和 EE2 浓度下，大银鱼胚胎孵化后均出现一定数目的畸形幼体。目前，许多研究者都开始关注 EE2 的性逆转能力，即雄鱼雌化。而通过本文的研究，这两种雌激素致畸能力（卵黄囊畸形和仔鱼脊柱畸形）也是不容忽视的。
     Kishida 等人（2001 年）报道了暴露于 10 μmol/L (2.72 mg/L) E2 后，斑马鱼胚胎出现了孵化时间延迟。Versonnen 等人（2004 年）报道 100 ng/L 的 EE2 暴露 120h 后，斑马鱼胚胎孵化率仅为 67%，而对照组则有 95% 的孵化率。在本试验中，由于雌激素高浓度下胚胎死亡数量较多，不适合用孵化率来表示雌激素对胚胎孵化的影响，因此我们选用第一条仔鱼孵化出的时间来评价 E2 和 EE2 对大银鱼胚胎孵化延迟的影响。结果表明这两种雌激素对大银鱼胚胎孵化具有延迟效应，而且随着暴露浓度的升高，延迟现象越明显。
     从试验结果中可以看出，采自长江口大银鱼孵化地的水样对大银鱼胚胎 / 仔鱼的存活或者发育都没有明显影响。
     由于环境雌激素具有痕量高毒、环境分布广泛、种类繁多的特点，本文选取大银鱼胚胎 / 仔鱼进行试验具有非常重要的意义：（1）大银鱼的胚胎发育阶段对外界刺激非常敏感，能对痕量环境雌激素产生多种效应终点；（2）大银鱼广泛分布在中国东部湖泊、河口和江口里，具有重要的经济价值和生态学意义，用其作为模式生物，可以为评价环境雌激素对该区域水生生物的影响提供有利指导。

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1、10申请公布号CN101982072A43申请公布日20110302CN101982072ACN101982072A21申请号201010502878722申请日20101011A01K61/0020060171申请人上海市环境科学研究院地址200233上海市徐汇区钦州路508号申请人北京师范大学72发明人胡双庆沈根祥史江红孟耀斌张洪渠朱江王晓丹赵庆节郭春霞钱晓雍朱英顾海蓉王振旗74专利代理机构上海伯瑞杰知识产权代理有限公司31227代理人张美娟54发明名称环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法57摘要本发明公开了一种环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，利用胚胎对环境污染物或者化学物质刺激。

2、的敏感性，将大银鱼胚胎暴露于含有受试物的一系列浓度的标准稀释水溶液中，以半静态条件进行试验。试验从将处于囊胚期的活胚胎暴露于含受试物的水溶液开始，至对照组和暴露组中所有的胚胎孵化完成结束，持续30天左右。毒性终点包括致死、致畸和孵化延迟。通过对暴露组毒性终点的观察及与对照组的比较，确定该受试物对大银鱼胚胎发育的毒性。研究两种天然雌激素E2和EE2对大银鱼胚胎卵黄囊阶段的影响，以确定它们对大银鱼胚胎发育毒性的剂量效应关系，并且评价该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图2页CN101982074A1。

3、/1页21环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于具体步骤如下1）首先称取1MG的E2溶于500ML标准稀释水中，配制成2MG/L的E2储备液，将试剂瓶用膜封口后置于2冰箱避光保存，用同样的方法配制2MG/L的EE2储备液并保存；2）试验时，取出上述储备液，待恢复到室温并充分摇匀后，用标准稀释水分别于玻璃培养皿内配制浓度为1、02、004MG/L，8、16G/L和10、005MG/L的E2和EE2的暴露溶液，并各移取20ML放入培养皿中；空白对照为20ML标准稀释水，另取经脱脂棉过滤的长江水20ML作为自然水体环境对照，以上暴露液和对照液均设置3组平行；3）随机挑选处于囊胚期的活胚胎。

4、置于倒置显微镜下进行观察试验，在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入10个胚胎，然后将胚胎置于恒温培养箱内培养，在210条件下保持恒温、无光照，试验持续30天，每天用倒置显微镜观察测试的终点，并记录；4）使用SPSS130FORWINDOWS软件，对大银鱼胚胎在暴露浓度下与空白下的存活、生长和发育进行显著性分析。2根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于所述的标准稀释水，采用分析纯的化学品和全玻璃蒸馏水或去离子水，取氯化钙溶液、硫酸镁溶液、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液4种溶液各25ML加以混合，稀释至1L，稀释用水需经曝气至氧饱和为止，然后储存备用。3根据权利要求1所。

5、述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于所述的氯化钙溶液是将1176GCACL22H2O溶解于1L水中，所述的硫酸镁溶液是将493GMGSO47H2O溶解于1L水中，所述的碳酸氢钠溶液是将259GNAHCO3溶解于1L水中，所述的氯化钠溶液是将023GKCL溶解于1L水中。4根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于步骤2）中各暴露浓度组的配制方法如下取125MLE2或EE2储备液于等体积的标准稀释水中，配成1MG/L的E2或EE2暴露液25ML；充分混匀后按5倍体积逐级稀释成200、40、8和16G/L的暴露液；然后再取125L的16G/L暴露液于1。

6、9875ML标准稀释水中，配成10MG/L的暴露液；取100L的10MG/L暴露液于199ML稀释水中，配成005NG/L的暴露液。5根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于步骤3）中，将胚胎置于恒温培养箱内培养，在8条件下保持恒温。6根据权利要求1所述的环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，其特征在于步骤3）中，采用半静态暴露方式，所有暴露液和对照液每2天更换一次；更换溶液时，用吸管逐一地吸取胚胎转移至新鲜溶液内，如有死亡胚胎或死亡的幼鱼，采用吸管吸取将之移除；测试的终点包括致死、致畸和孵化延迟。权利要求书CN101982072ACN101982074A1/8。

7、页3环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法技术领域0001本发明涉及一种毒性测试方法，具体为环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，属于鱼类急性毒性测试领域。背景技术0002近三十年来，环境中的外源性化合物环境雌激素（ENVIRONMENTALESTROGENS）能够造成人类和野生动物发育和繁殖方面的健康损害，引起了人们高度重视，目前已报道的环境雌激素危害包括男性精液减少、野生鱼类性发育紊乱（包括雌雄同体、雄鱼雌化等）、两栖动物（如短吻鳄、蟾蜍）种群减少等。环境雌激素是内分泌干扰物中重要的一类，它们或者属于天然雌激素（即由生物体内源雌激素排泄而进入环境），或者属于人工合成雌激素以及具有雌激素活。

8、性的合成化学品，当其进入生物体后能模拟体内内源性雌激素的功能和行为，引发类雌激素反应，从而对生物体的激素平衡、生殖、发育和行为等造成负面影响。研究证实，目前环境中已经存在成百上千种具有不同雌激素活力的化合物。其中，几种常见的环境雌激素及其雌激素活力和来源如表1所示；EEQ17E2EQUIVALENT换算成17雌二醇的雌激素活力当量。0003雌激素活力当量越大，对生物体潜在的内分泌干扰效应就越强，因此，E2和EE2是两种最受关注的环境雌激素，它们的化学结构式和理化性质见表2。前者是天然雌激素中雌激素活力最强的一种，通常被用作值为1的雌激素当量，以衡量其他化合物的雌激素活力。E2由人或动物分泌而成。

9、，主要通过粪便和尿液进入自然环境。据报道，一头奶牛每天排泄的粪便中E2含量达1701230G/KG，成年女性E2的排泄量可达82695G/天，而怀孕期间妇女E2的排泄量可达平时的1000倍。后者是人工合成的雌激素，主要作为女性避孕药和治疗绝经期综合症的雌激素替代疗法用药；说明书CN101982072ACN101982074A2/8页4。0004半个世纪以来，由于全球工业化的加速和集约化畜禽养殖厂的兴起，排放到环境中的E2和EE2量显著增多。目前，E2和EE2已被报道在各种环境介质中存在（见表3）。虽然传统的污水处理厂（STP）对E2和EE2有一定的去除效果（雌激素活力降低8097），但有报道证。

10、实，若生物体长期生活在STP出水的受纳水体中（含有NG/L痕量水平的E2或EE2），会诱发机体产生负面效应。由于E2和EE2具有较高的LOGKOW值，它们能够在生物体脂肪组织中长时间存在，因此会通过食物链的生物放大作用，对人体健康带来更大的威胁；污泥干重。0005无论环境雌激素是通过STP排放进入地表水，还是通过底泥的释放作用再次进入水体，水环境总是环境雌激素的重要赋存介质，因此，鱼类（如斑马鱼、拟鲤、青鳉、虹鳟鱼等）可用作环境雌激素生态风险评估的重要试验生物。鱼类急性毒性试验（FISHACUTETOXICITYTEST）是目前化学品生态毒性测试的必要组成部分，然而试验中鱼类致死率是唯一的测试。

11、终点，该试验的道德性和科学性正受到越来越多的质疑。因此，一些替代的测试方说明书CN101982072ACN101982074A3/8页5法得到研究者们的开发和验证，例如鱼类细胞或细胞系体外测试方法、鱼类胚胎测试方法等，其中鱼类胚胎毒性（FISHEMBRYOTOXICITY,FET）测试是目前被广泛认可并最具有潜力的替代方法。0006LANGE等人在1995年报道了利用斑马鱼胚胎作为试验载体来测试十种特定化合物的急性毒性，研究结果发现，这十种化合物能够引起斑马鱼胚胎发育明显损害，指示终点包括胚胎凝固、原肠胚的发育、肌节的数量、器官的发育、心跳、着色等。其后，将斑马鱼胚胎测试（DANIORERIO。

12、EMBRYOTEST,DART）结果与利用虹鳟鱼细胞系RTG2作为试验载体的毒性测试结果相比较，发现DART测试比成鱼或RTG2细胞急性毒性测试更为灵敏，因而推荐DART测试作为成鱼急性毒性测试的替代方法。随后为了验证该方法的可靠性，欧洲几个国家试验室同时开展了化合物和城市污水的DART测试，并将结果进行了比较，发现DART测试结果不仅与成鱼急性毒性测试结果具有很好的相关性（R2084），而且在不同试验室之间并没有显著性差别（P005）。2005年，BRAUNBECK等提供数据证实除斑马鱼外其他的一些测试鱼种，如黑头呆鱼PIMEPHALESPROMELAS和日本青鳉ORYZIASLATIPES。

13、，其早期胚胎阶段也可以用做FET测试。自2005年起，FET测试已经被德国强制要求作为STP总出水的日常毒性测试项目，随后STP总出水斑马鱼胚胎测试也被采纳为国际标准。2006年，OECD发布了FET测试作为化学品测试项目的草案。0007FET测试具有三大优点（1）耗时较短（其中DART测试仅需48小时）；（2）数据真实可靠；（3）可观察的毒性终点较多且灵敏，包括致死、半致死、致畸等。其中，最后一点对于测试在环境浓度下通常没有致死效应的化合物（如环境雌激素）的毒性效应更为适用。目前国际上FET测试推荐的试验鱼种仅限于斑马鱼和日本青鳉，但这两个鱼种并非我国的本土种，并且在我国自然水环境中没有这两。

14、个物种存在，因此，选取一种我国特有的、具有广泛代表性的鱼种进行FET测试，从而对我国水体环境中雌激素类物质开展生态风险评估，具有重要的理论价值和现实意义。而大银鱼（PROTOSALANXHYALOCRANIUSABBOTT）正好符合这种研究需求。0008当前，国内对大银鱼的研究还局限于它的生物学特性、增殖和移植技术，尚未利用大银鱼胚胎开展FET测试研究。本文利用大银鱼胚胎阶段对化学物质的敏感性，研究两种天然雌激素（E2和EE2）对大银鱼胚胎卵黄囊阶段的影响，以确定它们对大银鱼胚胎发育毒性的剂量效应关系，并且评价该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。本文也是国内外首次使用大银鱼作为试验。

15、生物，开展雌激素胚胎毒性效应的研究。发明内容0009本发明的目的是为了提供一种环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，以测试该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。0010本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。0011环境雌激素对大银鱼胚胎发育毒性测试方法，具体步骤如下1）首先称取1MG的E2溶于500ML标准稀释水中，配制成2MG/L的E2储备液，将试剂瓶用膜封口后置于2冰箱避光保存，用同样的方法配制2MG/L的EE2储备液并保存；2）试验时，取出上述储备液，待恢复到室温并充分摇匀后，用标准稀释水分别于玻璃培养皿内配制浓度为1、02、004MG/L，8、16G/L和10、005MG。

16、/L的E2和EE2的暴露溶说明书CN101982072ACN101982074A4/8页6液，并各移取20ML放入培养皿中；空白对照为20ML标准稀释水，另取长江水（经脱脂棉过滤）20ML作为自然水体环境对照，以上暴露液和对照液均设置3组平行；3）随机挑选处于囊胚期的活胚胎置于倒置显微镜下进行观察试验，在每个装有暴露液和对照液的培养皿内放入10个胚胎，然后将胚胎置于恒温培养箱内培养，在210条件下保持恒温、无光照，试验持续30天，每天用倒置显微镜观察测试的终点，并记录；4）使用SPSS130FORWINDOWS软件，对大银鱼胚胎在暴露浓度下与空白下的存活、生长和发育进行显著性分析。0012所述。

17、的标准稀释水，采用分析纯的化学品和全玻璃蒸馏水或去离子水（电导率10S/CM），取氯化钙溶液、硫酸镁溶液、碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液4种溶液各25ML加以混合，稀释至1L，稀释用水需经曝气至氧饱和为止（不低于空气饱和值的90），然后储存备用。0013所述的氯化钙溶液是将1176GCACL22H2O溶解于1L水中。0014所述的硫酸镁溶液是将493GMGSO47H2O溶解于1L水中。0015所述的碳酸氢钠溶液是将259GNAHCO3溶解于1L水中。0016所述的氯化钠溶液是将023GKCL溶解于1L水中。0017步骤2）中各暴露浓度组的配制方法如下取125MLE2或EE2储备液于等体积的标准稀释水。

18、中，配成1MG/L的E2或EE2暴露液25ML；充分混匀后按5倍体积逐级稀释成200、40、8和16G/L的暴露液；然后再取125L的16G/L暴露液于19875ML标准稀释水中，配成10MG/L的暴露液；取100L的10MG/L暴露液于199ML稀释水中，配成005NG/L的暴露液。0018步骤3）中，将胚胎置于恒温培养箱内培养，在8条件下保持恒温。0019步骤3）中，采用半静态暴露方式，所有暴露液和对照液每2天更换一次。更换溶液时，用吸管逐一地吸取胚胎转移至新鲜溶液内。如有死亡胚胎或死亡的幼鱼，采用吸管吸取将之移除。测试的终点包括致死（胚胎凝固、幼鱼无心跳、幼鱼无自动）、致畸（卵黄囊畸形、。

19、幼鱼脊柱畸形）和孵化延迟。0020暴露试验放置在恒温培养箱（MGC300H，上海）中进行，鱼类胚胎使用倒置显微镜（ZEISSAXIOVERTS100，USA）观察。玻璃培养皿（9CM）用蒸馏水润洗3次、烘干，供试验使用。0021本发明利用胚胎对环境污染物或者化学物质刺激的敏感性，在一定条件下，将大银鱼胚胎暴露于含有受试物的一系列浓度的标准稀释水溶液中，以半静态条件进行试验。试验从将处于囊胚期的活胚胎暴露于含受试物的水溶液开始，至对照组和暴露组中所有的胚胎孵化完成结束，持续30天左右。毒性终点包括致死、致畸和孵化延迟。通过对暴露组毒性终点的观察及与对照组的比较，确定该受试物对大银鱼胚胎发育的毒性。

20、，包括半致死浓度（LC50）、致畸率、孵化率和孵化延迟时间等。0022本发明利用大银鱼胚胎阶段对化学物质的敏感性，研究两种天然雌激素（E2和EE2）对大银鱼胚胎卵黄囊阶段的影响，以确定它们对大银鱼胚胎发育毒性的剂量效应关系，并且评价该鱼种暴露在雌激素环境浓度水平下存在的潜在风险。说明书CN101982072ACN101982074A5/8页7附图说明0023图1为不同温度下空白组大银鱼胚胎孵化时间和存活率柱形图；图2为E2和EE2暴露条件下胚胎/仔鱼的最大致畸率柱形图；图3为不同雌激素暴露浓度下第一条大银鱼仔鱼孵出的时间柱形图。具体实施方式0024下面结合具体实施例和附图具体阐述本发明的技术特。

21、点。0025受试生物为大银鱼胚胎。在大银鱼产卵期（每年12月中旬至翌年3月中下旬）采集其受精卵。实验开始前，将受精卵小心地移入装有标准稀释水的玻璃培养皿中，使其在培养皿底部散布均匀，然后置于2冰箱避光保存。每两天全部更换一次溶液。0026预试验在助溶剂甲醇对照组中，大银鱼胚胎暴露2天后全部死亡，因此正式试验中不使用助溶剂，雌激素最高暴露浓度设置为1MG/L（低于雌激素在水中的最大溶解度）。标准稀释水中胚胎的发育与孵化情况（见表4和图1）基本与水库水中胚胎的发育和孵化情况相一致，因此，为了更好地控制试验条件，正式试验采用标准稀释水作为稀释液和空白对照液；说明书CN101982072ACN1019。

22、82074A6/8页8。0027在3、6、8和10下，大银鱼胚胎表现出不同的发育和存活情况，如图1所示。可见，在8下，大银鱼胚胎的发育既能达到孵化时间短（胚胎开始孵化时间16天及全部胚胎孵化时间18天），又能实现较高存活率（80）。而在较低的温度下胚胎出现发育缓慢的现象（胚胎开始孵化时间2028天及全部胚胎孵化时间2432天），在较高的温度下又不能保证空白组较高的存活率（仅有60）。因此，8应为大银鱼胚胎发育的最适温度，正式实验将采用该温度进行。0028雌激素的致死效应每天观察大银鱼胚胎/仔鱼的存活数量，并记录。致死终点包括胚胎凝固、幼鱼无自动和幼鱼无心跳。0029试验观察27天后，暴露在不种。

23、浓度的E2和EE2下，大银鱼胚胎/仔鱼的存活情况。根据空白组胚胎/仔鱼存活率，选取5个典型时段分析雌激素暴露与胚胎/仔鱼存活数之说明书CN101982072ACN101982074A7/8页9间的关系。0030在各组暴露浓度下，E2和EE2对大银鱼胚胎/仔鱼的致死效应在15天后才显现出来。但15天后，空白对照组的存活率也降至767（1723D）和700（2427D），这是由于野生大银鱼胚胎本身就存在孵化率低的特点。第23天时，1MG/L的E2暴露组中活体的数目比空白对照组显著减少（P005）；第27天时，1MG/L的EE2暴露组中活体的数目比空白对照组十分显著减少（P001）；而暴露于长江水的。

24、活体数与空白对照组的活体数无明显差异。0031雌激素的致畸效应每天观察大银鱼胚胎/仔鱼的畸形数量，并记录，致畸终点包括卵黄囊畸形和仔鱼脊柱畸形。0032试验观察27天后，E2和EE2对大银鱼胚胎/仔鱼的致畸效应见图2所示。选取27天内大银鱼胚胎/仔鱼最大致畸率进行讨论。在27天内，空白对照组和长江水对照组都没有畸形胚胎/仔鱼的出现；而在1MG/L的E2和EE2暴露组中，由于致死效应明显，故也没有观察到畸形个体的出现；在E2暴露条件下，最大致畸率出现在第16天的8G/L暴露组；而EE2暴露条件下，最大致畸率出现在第18天的02MG/L暴露组。0033雌激素的孵化延迟效应记录各暴露浓度下第一条大银。

25、鱼仔鱼孵化出的时间，结果如图3所示。在02MG/L的E2和EE2暴露浓度组，第一条仔鱼孵化出的时间与空白对照组相比，出现了明显的延迟；而在1MG/L的E2和EE2暴露浓度组，第一条仔鱼孵化出的时间与空白对照组相比，出现了更加明显的延迟，分别比空白对照组晚了7天和11天；而长江水对大银鱼仔鱼的孵化没有明显影响。0034正式试验开始15天后，暴露于1MG/L的E2和EE2浓度组中，大银鱼胚胎出现大量死亡，存活率分别从第15天的900和900降至第23天的400和433；而暴露于02MG/L005NG/L的E2和EE2浓度组中，第23天存活率均大于600。结果表明E2和EE2对大银鱼的23DLC50。

26、在021MG/L的浓度范围内，此浓度远远高于两种雌激素在自然水体环境中检测到的浓度，因此可以初步判断这两种雌激素在自然水体环境中不会对大银鱼胚胎或仔鱼产生致死效应。这与TABATA等人（2001年）研究得到的结论相一致。他们将日本青鳉胚胎暴露在E2中200230天，结果发现25G/L的E2暴露下青鳉才出现存活率显著减小的现象。而WESTERLUND等人（2000年）将E2注射入雌性斑马鱼的体内，结果发现1MOL/KG027MG/KG和1NMOL/KG027G/KG的E2注射量下，8天后致死率达到95和79。研究结果的差异可以是由于试验鱼种对E2的耐受性不同，或者由于暴露方式的不同造成。对于EE。

27、2的致死效应，JASER等人（2003）用水溞CERIODAPHNIARETICULATE作为试验生物开展急性毒性测试，得到24HEC50值为1814MG/L。0035无论是暴露于E2或EE2条件下，最大致畸率都出现在第16天至第18天之间，原因是一些在成形期就产生畸形的胚胎孵化后大部分均死亡。虽然致畸率没有表现出明显的剂量效应关系，但即使在自然环境能检测到的E2和EE2浓度下，大银鱼胚胎孵化后均出现一定数目的畸形幼体。目前，许多研究者都开始关注EE2的性逆转能力，即雄鱼雌化。而通过本文的研究，这两种雌激素致畸能力（卵黄囊畸形和仔鱼脊柱畸形）也是不容忽视的。0036KISHIDA等人（2001。

28、年）报道了暴露于10MOL/L272MG/LE2后，斑马鱼胚说明书CN101982072ACN101982074A8/8页10胎出现了孵化时间延迟。VERSONNEN等人（2004年）报道100NG/L的EE2暴露120H后，斑马鱼胚胎孵化率仅为67，而对照组则有95的孵化率。在本试验中，由于雌激素高浓度下胚胎死亡数量较多，不适合用孵化率来表示雌激素对胚胎孵化的影响，因此我们选用第一条仔鱼孵化出的时间来评价E2和EE2对大银鱼胚胎孵化延迟的影响。结果表明这两种雌激素对大银鱼胚胎孵化具有延迟效应，而且随着暴露浓度的升高，延迟现象越明显。0037从试验结果中可以看出，采自长江口大银鱼孵化地的水样对大银鱼胚胎/仔鱼的存活或者发育都没有明显影响。0038由于环境雌激素具有痕量高毒、环境分布广泛、种类繁多的特点，本文选取大银鱼胚胎/仔鱼进行试验具有非常重要的意义（1）大银鱼的胚胎发育阶段对外界刺激非常敏感，能对痕量环境雌激素产生多种效应终点；（2）大银鱼广泛分布在中国东部湖泊、河口和江口里，具有重要的经济价值和生态学意义，用其作为模式生物，可以为评价环境雌激素对该区域水生生物的影响提供有利指导。说明书CN101982072ACN101982074A1/2页11图1图2说明书附图CN101982072ACN101982074A2/2页12图3说明书附图CN101982072A。

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