一种兽用微生态制剂及其制备方法与用途.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201010281964.X

申请日:

2010.09.15

公开号:

CN101982089A

公开日:

2011.03.02

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A23K 1/18申请日:20100915|||公开

IPC分类号:

A23K1/18; C12N1/20; C12R1/145(2006.01)N

主分类号:

A23K1/18

申请人:

北京大北农科技集团股份有限公司; 北京百林康源生物技术有限责任公司

发明人:

宋维平; 聂实践

地址:

100080 北京市海淀区中关村大街27号中关村大厦14层大北农集团

优先权:

专利代理机构:

代理人:

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内容摘要

本发明涉及一种兽用微生态制剂及其制备方法与用途,属于微生态制剂技术领域。该微生态制剂的活性成分为酪酸梭菌CGMCC No.1925菌粉。本发明的兽用微生态制剂活菌含量高;对抗生素有耐受性,对一些抗生素不敏感或敏感性弱;而且,该微生态制剂可替代一些抗生素;可耐胃酸、胆盐、高温等。另外,本发明微生态制剂的制备方法简单,用本发明的制备方法制备出的微生态制剂,酪酸梭菌活菌含量高。本发明的兽用微生态制剂有较好的市场前景。

权利要求书

1: 一种兽用微生态制剂, 其特征在于活性成分为酪酸梭菌 CGMCC No.1925 菌粉。
2: 权 1 所 述 的 兽 用 微 生 态 制 剂, 其 特 征 在 于 酪 酸 梭 菌 CGMCC No.1925 菌 浓 度 为 6 10 1×10 CFU/g ~ 1×10 CFU/g。
3: 权 2 所 述 的 兽 用 微 生 态 制 剂, 其 特 征 在 于 酪 酸 梭 菌 CGMCC No.1925 菌 浓 度 为 9 1×10 CFU/g。
4: 权 1 ~ 3 任一项所述的兽用微生态制剂, 其特征在于进一步包含载体, 载体为石粉、 硫酸钾铝、 玉米芯粉中的任一种或两种。
5: 如权 1 ~ 4 任一项所述的兽用微生态制剂的制备方法, 其特征在于制备过程如下 : (1) 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 的菌种复壮 ; (2) 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 的培养、 发酵 : 将复壮菌种接种于 CBM 液体培养基中, 37℃ 恒温箱中培养 24 小时, 芽孢率在 75%以上后, 接种于发酵罐中, 接种量 10%, 37℃恒温培养 24 小时, 芽孢率达到 75%以上时, 使发酵液降温至 20℃ ; (3) 连续离心收集菌体, 将菌泥用保护液和载体调配至固型物浓度 5-10%, 以进口温 度 115℃, 出口温度 80℃的条件进行喷雾干燥, 收集菌粉, 即得 ; CBM 培 养 基 配 方 : 葡 萄 糖 1.0 %、 酪 蛋 白 胨 1.0 %、 酵 母 粉 0.5 %、 牛 肉 膏 0.5 %、 (NH4)2SO40.3%、 NaCl 0.3%、 K2HPO4·H2O 0.4%、 MnSO4·H2O 0.02%、 MgSO4·7H2O0.05%、 CaCO30.2%、 琼脂 2.0% ( 固体培养基用 ), pH 值 : 7.2, 灭菌条件 : 121℃, 30 分钟。
6: 权 5 所述的兽用微生态制剂的制备方法, 其特征在于所述的保护液为 10%的脱脂 奶。 7. 如权 1 ~ 4 任一项所述的兽用微生态制剂在制备饲料添加剂中的应用。
7: 2, 灭菌条件 : 121℃, 30 分钟。 6. 权 5 所述的兽用微生态制剂的制备方法, 其特征在于所述的保护液为 10%的脱脂 奶。 7. 如权 1 ~ 4 任一项所述的兽用微生态制剂在制备饲料添加剂中的应用。

说明书


一种兽用微生态制剂及其制备方法与用途

    【技术领域】
     本发明涉及一种兽用微生态制剂及其制备方法与用途, 属于微生态制剂技术领域。 背景技术
     兽用微生态制剂是一种绿色、 安全的饲料添加剂, 具有防病、 增强机体免疫力、 促 进生长、 增加体重等多种功能, 且无污染, 无残留, 不产生抗药性。
     目前, 市场上的微生态制剂存在以下几个方面的问题 : (1) 活菌含量低, 而研究表 7 明, 如果一种菌在盲肠内容物中的浓度低于 10 个 /g, 则该菌产生的酶及代谢产物不足以影 响宿主, 难以满足治疗需要 ; (2) 不耐抗生素 ; (3) 对高温、 胃酸和胆盐不稳定, 致使只有少 数菌株进入肠道后仍具有活性, 达不到发挥作用所需的活菌数量 ; (4) 不稳定, 保存期短。 由于微生态制剂存在的这些问题, 从而影响了其在动物上的应用效果, 限制了微生态制剂 的广泛应用。 发明内容
     本发明的目的在于提供一种对抗生素有耐受性、 活菌含量高、 稳定、 保存期长的兽 用微生态制剂。该兽用微生态制剂中主要活性成分是酪酸梭菌 CGMCCNo.1925 菌粉。
     本发明的另一目的是提供该兽用微生态制剂的制备方法和用途。
     本发明的目的是通过如下技术方案实现的 :
     本发明提供一种兽用微生态制剂, 该制剂的活性成分为酪酸梭菌 CGMCC No.1925 菌粉。
     其中, 所述的酪酸梭菌 (Clostridium butyricum)CGMCC No.1925 为申请人从动 物肠道中分离、 选育得到, 经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定, 并于 2007 年 1 月 22 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏 ( 简称 CGMCC), 保藏号为 : CGMCC No.1925。本发明的酪酸梭菌 CGMCC No.1925 对胆汁的耐受性很高, 胆汁处理对酪酸 梭菌的活性几乎没有影响 ; 短时间内可耐强酸, 如 pH 1.0 或 pH 2.0, 在 pH 3.0、 4.0 条件下 可长时间耐酸, 酪酸梭菌的活性基本不受影响 ; 耐高温, 具有较好的热存放稳定性 ; 对一些 抗生素不敏感, 如对硫酸粘杆菌素不敏感, 对诺氟沙星敏感性弱。
     本发明的兽用微生态制剂中, 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 菌浓度为 1×106CFU/g ~ 1×1010CFU/g。
     进一步, 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 菌浓度为 1×109CFU/g。
     本发明的兽用微生态制剂还可进一步包含载体, 载体为石粉、 硫酸钾铝、 玉米芯粉 中的任一种或两种。
     本发明还提供了该兽用微生态制剂的制备方法, 其制备过程如下 :
     (1) 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 的菌种复壮 ;
     菌种的复壮代数可根据实际需要进行, 但申请人在发明过程中发现, 酪酸梭菌CGMCC No.1925 经过 4 代复壮, 第 4 代发酵液芽孢率高且平板记数较高, 因此申请人优选第 四代作为复壮菌种 ;
     (2) 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 的培养、 发酵 : 将复壮菌种接种于 CBM 液体培养基中, 37℃恒温箱中培养 24 小时, 芽孢率在 75%以上后, 接种于发酵罐中, 接种量 10%, 37℃恒温 培养 24 小时, 芽孢率达到 75%以上时, 使发酵液降温至 20℃ ;
     (3) 连续离心收集菌体, 将菌泥用保护液和载体调配至固型物浓度 5-10%, 以进 口温度 115℃, 出口温度 80℃的条件进行喷雾干燥, 收集菌粉, 即得 ;
     菌粉的收集方法可为其它方法, 如用 45℃左右气流干燥, 干燥后制成菌粉, 但申请 人发现喷雾干燥制备的菌粉活菌含量高, 所以本发明优选喷雾干燥。
     其中, CBM 培养基配方 : 葡萄糖 1.0 %、 酪蛋白胨 1.0 %、 酵母粉 0.5 %、 牛肉膏 0.5%、 (NH4)2SO40.3%、 NaCl 0.3%、 K2HPO4·H2O 0.4%、 MnSO4·H2O 0.02%、 MgSO4·7H2O 0.05%、 CaCO3 0.2%、 琼脂 2.0% ( 固体培养基用 ), pH 值 : 7.2, 灭菌条件 : 121℃, 30 分钟。
     其中, 所述的保护液为 10%的脱脂奶。
     本发明还提供了该兽用微生态制剂用于制备饲料添加剂的用途。
     本发明的兽用微生态制剂活菌含量高, 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 菌浓度可高达 10 1×10 CFU/g ; 对抗生素有耐受性, 在动物的生长过程中, 不可避免的要使用抗菌素对动物 疾病进行治疗, 为了防止疾病的发生和促进生长, 国内的一些饲料生产企业和养殖企业在 饲料中添加亚剂量的抗菌素, 这种养殖行为对动物肠道微生态会产生很大的影响, 很多微 生态制剂在此种情况下而不能发挥其原有的作用, 但本发明的微生态制剂对某些抗生素不 敏感或敏感性弱, 如对硫酸粘杆菌素不敏感, 对诺氟沙星敏感性弱, 因此本发明的微生态制 剂在制备及使用过程中, 就可不受这些抗生素的影响, 即使这些抗生素存在, 也能发挥本发 明微生态制剂的活性成分——酪酸梭菌 CGMCC No.1925 增强机体免疫力、 促进生长、 增加体 重等益生作用 ; 而且, 微生态制剂因其绿色、 环保可替代抗生素而受人类青睐, 本发明的微 生态制剂在研究中还发现, 本发明的微生态制剂可真正替代一些抗生素, 如黄霉素, 二者抗 病能力相当 ; 本发明的微生态制剂耐胃酸、 胆盐、 高温等, 菌株进入肠道后仍具有活性, 从而 发挥其作用 ; 且该制剂在 25℃、 40℃温度的保存条件下活性基本稳定, 随存放时间的延长, 活性虽有下降, 但活性损失不大 ; 另外, 本发明微生态制剂的制备方法简单, 各种实验条件 都经过了申请人的实验研究, 用本发明的制备方法制备出的微生态制剂, 酪酸梭菌活菌含 量高, 在制备过程中酪酸梭菌 CGMCC No.1925 表现较好的抗机械加工性, 造粒加工后, 活性 基本没有被破坏, 在饲料中的稳定性较好等。
     通过下列实施例将更具体的说明本发明, 但是应理解所述实施例仅是为了说明本 发明, 而不是以任何方式限制本发明的范围。 具体实施方式
     实施例 1 酪酸梭菌的分离、 鉴定
     样品采集 : 菌种分离的样品来自动物肠道中。
     菌体为直或弯曲, 端圆, 单个或成对、 短链偶见长丝状菌体, 周生鞭毛, 能运动 ; 革 兰氏阳性, 在老培养物中能变为阴性 ; 菌体中常有圆形或椭圆形芽孢, 使菌体中部膨大成梭 形, 孢子偏心或次端生、 无孢子外壁或附属丝 ; 表面菌落圆形或不规则, 直径 1-3 毫米, 稍凸, 白色至奶油色, 表面有光泽至无光泽 ; 该菌为厌氧菌, 在合适的培养基中生长良好, 并产 气。经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定为酪酸梭菌 (Clostridium Butyricum)。
     实施例 2 酪酸梭菌的培养
     1. 材料与方法
     (1) 菌种 : 酪酸梭菌 CGMCC No.1925
     (2) 器材 : 光学显微镜, 厌氧罐, 恒温培养箱等。
     (3) 药品 : 结晶紫染液, 石炭酸复红染液。
     (4) 培养方式 : 三角瓶液体深层静置培养 ( 非严格厌氧条件 )。平皿固体培养需置 于厌氧罐中进行。
     (5) 检测方法 : 菌数测定可用平板倾注法和血球记数法。菌体形态用结晶紫染液 及石炭酸复红染液染色后于显微镜下观察。
     2. 结果
     (1) 碳氮源配比试验
     以葡萄糖为碳源, 氮源选用蛋白胨、 酵母粉及牛肉浸膏组成复合氮源提供菌体生 长所需的生长因子。 实验中固定培养基其他组分用量, 分别以碳氮源为变量进行对比培养, 以下是不同碳氮源用量及比例的培养结果。
     ①碳源用量试验 : 以葡萄糖为碳源, 分为 6 个用量水平进行培养, 结果见表 1。
     表 1. 葡萄糖用量对比试验结果
     结果表明碳源在 1.0%水平时, 菌体生长较好, 菌数较高。
     ②氮源配比试验 : 鉴于酪酸梭菌菌株的生长要求, 参考几种现有培养基的组成, 试 验以酪蛋白胨、 酵母浸膏粉和牛肉浸膏为复合氮源, 分别做不同配比的培养试验, 结果见表 2。
     表 2. 氮源配比试验结果
     结果表明氮源组成和比例对菌数有明显影响, 其中 6、 7 组的培养结果较好。
     ③碳氮综合试验 : 结合以上两个试验结果, 进行不同碳氮比下菌体得率和芽孢生 成率的试验。结果见表 3。
     表 3. 碳氮综合试验结果结果表明 2 组菌数和芽孢转化率较高。
     综合以上试验结果, 兼顾菌量和芽孢率, 最终确定碳氮源配比 : 葡萄糖 1.0 %、 酪 蛋白胨 1.0%、 酵母粉 0.5%、 牛肉浸膏 0.5%。
     (2) 无机盐及微量元素的配比研究
     根据酪酸梭菌营养利用特性, 分别做了几组不同无机盐及微量元素配比的培养试 验, 试验中采用 (NH4)2SO4 作为无机氮源 ; 用 K2HPO4 作为缓冲物及 K+ 来源 ; 添加 MgSO4 和 MnSO4 试验结果见表 4。
     表 4. 无机盐及微量元素配比试验结果
     结果表明无机盐及微量元素的配比与芽孢形成有密切的关系, 尤其是 Mg2+ 对芽孢 转化率的提高有显著的作用。其中第 5 组的培养结果较理想, 按此可确定无机盐及微量元 素的配比。
     (3) 添加抗氧化剂对菌体生长影响的研究
     本实验用 Vc 和半胱氨酸作为抗氧化剂加入培养基, 与空白组做培养对比试验, 结 果见表 5。
     表 5. 厌氧试验
     从表 5 结果可以看出, 抗氧化剂添加与否对培养结果并无明显影响, 而抗氧化剂 灭菌时易失活, 且会影响培养基 pH。因此培养基中可不必添加抗氧化剂。综合以上试验结 果, 最终确定培养基配方, 见表 6。
     表 6. 酪酸菌培养基配方
     pH = 7.0 灭菌条件 : 121℃ 20min。 (4) 接种 pH 本实验以几种不同的接种 pH 进行接种培养, 培养结果见表 7。 表 7. 接种 pH 试验
     结果表明酪酸梭菌适宜接种 pH 为中性, 确定 pH7.0 为最佳接种条件。 (5) 热处理方法研究酪酸梭菌为内生芽孢菌, 此类菌的优选及复壮一般都可采用热处理的方法。据此 本实验在菌种转接时进行热处理。具体操作为培养基升温至 80℃接种, 接种后于 80℃保持 10 分钟, 然后冷却至培养温度继续培养, 通过此步处理可起到优化菌种、 激活芽孢促使其尽 快萌发、 促成同步培养以及进一步防止污染等效果。以下为热处理组与常温接种组连续转 接 3 次后的对照实验结果。
     表 8. 热处理对照实验结果
     (6) 培养温度研究
     酪酸梭菌适宜培养温度为 32-40℃, 本实验分别取不同温度进行培养, 24hr 培养 结果见表 9。
     表 9. 培养温度试验
     根据表 9 结果, 可确定最适培养温度为 36℃。
     (7) 培养时间研究
     培养时间是影响菌浓及芽孢成熟率的重要因素, 本实验取不同培养时间进行培 养, 结果见表 10。
     表 10. 培养时间试验
     结果表明培养时间短菌数高, 但芽孢转化率及成熟度均较低 ; 时间过长芽孢转化 率及成熟度并无提高, 反而出现菌体老化、 菌数下降的情况。试验结果表明 24hr 为最适培 养时间。
     实施例 3 酪酸梭菌的耐受性实验
     1、 实验材料
     菌种 : 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 ; 嗜酸乳杆菌, 北京市真菌工程实验室提供 ;
     胆汁 : 动物胆汁, 中国农业科学院畜牧研究所提供 ;
     培养基 : 酪酸梭菌和嗜酸乳杆菌培养, 均使用 MRS 培养基 ; MRS 培养基配方 : 葡 萄糖 2 %、 酪蛋白胨 0.5 %、 酵母粉 0.3 %、 牛肉膏 0.5 %、 (NH4)2SO40.2 %、 NaCl 0.2 %、 K2HSO4·H2O 0.2%、 KH2SO40.2%、 CaCO30.5%、 琼脂 2.0% ( 固体培养基用 )、 pH 值 : 7.2, 灭 菌条件 : 121℃ 30 分钟。
     2、 实验方法
     2.1 酪酸梭菌培养基接种后培养 24 小时, 芽孢生成率≥ 85%, 离心分离, 使用蒸馏 水制成菌悬液 ; 嗜酸乳杆菌培养基接种后培养 24 小时, 离心分离, 使用蒸馏水制成菌悬液 ;
     2.2 配制不同胆汁浓度的液体, 加入 1/5 的菌悬液, 使胆汁的最终浓度为 0.0、 0.3、 0.6、 1.0%, 处理 1-6 小时, 用蒸馏水逐级稀释至一定浓度, 进行酪酸梭菌平板计数 ;
     2.3 将酪酸梭菌菌悬液用盐酸调 pH 到 1、 2、 3、 4, 处理 1-4 小时后, 用 0.2M pH7.0 的无菌磷酸盐缓冲溶液将样品逐级稀释至一定浓度, 进行酪酸梭菌平板计数 ;
     2.4 将酪酸梭菌菌粉于常温 (25℃ )、 80、 90、 100℃生理盐水中处理 5、 10、 15、 20 分 钟后, 用蒸馏水逐级稀释至一定浓度, 进行酪酸梭菌平板计数。 将酪酸梭菌菌粉用铝薄袋包 装, 放于常温 (25℃ ) 和 60℃保温箱中存放 10 天, 于第 5、 10 天, 取样用蒸馏水逐级稀释至 一定浓度, 进行酪酸梭菌平板计数。
     3、 实验结果
     3.1 耐胆汁试验
     将酪酸梭菌和嗜酸乳杆菌的菌悬液用预先配制好的胆汁溶液处理, 处理时间分别 为 1、 1.5、 3、 4.5、 6 小时, 用蒸馏水逐级稀释至一定浓度, 然后测定酪酸梭菌活菌数, 以无胆 汁处理的样品为 100%, 计算存活率。结果见表 11。
     表 11. 酪酸梭菌耐胆汁试验
     结果表明胆汁处理对酪酸梭菌的活性几乎没有影响, 而嗜酸乳杆菌经胆汁处理后 活性有明显下降的趋势, 酪酸梭菌对胆汁的耐受性很高。
     3.2 耐酸试验
     使用盐酸模拟胃酸环境, 处理酪酸梭菌和嗜酸乳杆菌, 不同时间测定酪酸梭菌和 嗜酸乳杆菌的活性, 以 pH7 样品的活菌数为 100%, 计算试验样品的存活率, 测定结果见表 12。
     表 12. 酪酸梭菌耐酸试验
     结果表明, 在 2 小时内, 酪酸梭菌对酸不敏感, 活性基本无变坏, 甚至在 pH 1.0 的 环境中也很稳定, 但随其在酸溶液中时间的延长, 在 pH 1.0、 2.0 条件下活性明显降低, 在pH 3.0、 4.0 条件下酪酸梭菌的活性基本不受影响。结果显示, 酪酸梭菌的耐酸性能明显强 于嗜酸乳杆菌。
     3.3 耐温试验
     酪酸梭菌菌粉于常温 (25℃ )、 80、 90、 100℃生理盐水中处理 5、 10、 15、 20 分钟后, 用蒸馏水逐级稀释至一定浓度, 进行酪酸梭菌平板计数, 以 25℃条件的活菌数为 100%, 计 算存活率。结果见表 13。
     酪酸梭菌菌粉于常温 (25℃ ) 和 60℃温箱保存, 在第 5、 10 天取样, 用蒸馏水逐级 稀释至一定浓度, 进行酪酸梭菌平板计数, 以 25℃条件的活菌数为 100%, 计算存活率。结 果见表 14。
     表 13. 液体中耐高温试验
     结果表明, 在高温液体中酪酸梭菌具有一定的耐受能力, 但在 100℃条件下存活率 降低较快, 饲料加工过程只是瞬间达到高温, 因此判断酪酸梭菌具有耐受饲料加工的瞬间 热破坏的能力。同样条件下嗜酸乳杆菌全部灭活。
     表 14. 耐高温保存试验
     结果表明酪酸梭菌具有较好的热存放稳定性。 实施例 4 酪酸梭菌的抗性 1、 材料与方法 1.1 菌种 : 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 1.2 培养基 : MRS 培养基 1.3 不锈钢小管 : 内径 6mm、 高 10mm、 外径 7.8mm。 1.4 抗菌素 : (1) 卡那霉素 : 含量 98%, 北京百林康源生物技术有限责任公司提供。 (2) 杆菌肽锌 : 含量 15%, 天津新兴兽药厂提供。 (3) 黄霉素 : 含量 5%, 北京大北农饲料科技公司提供。(4) 硫酸粘杆菌素 : 含量 15%, 天津新兴兽药厂提供。
     (5) 诺氟沙星 : 含量 95%, 北京都德伟业饲料公司提供。
     1.5 方法
     (1) 菌悬液配置 : 取酪酸梭菌接种于 250ml 灭菌的 MRS 培养中, 37℃培养 24 小时, 7 计数后, 用无菌水稀释至浓度为 1×10 个菌 /ml 的菌悬液, 作为接种液。
     (2) 双碟的制备 : 将 20ml 灭菌后的 MRS 固体培养基融化后加入培养皿中, 冷却制 作第一层培养基。然后去融化的 MRS 培养基 5ml 和菌悬液 1ml, 于 50-60℃加入培养皿中, 摇匀后冷却制作第二层培养基 ( 作为菌层 )。
     (3) 检测 : 采用三剂量法, 在每个培养皿中放入 6 个不锈钢小管, 其中一组间隔的 3 个管中滴加高、 中、 低浓度的参照抗菌素溶液。另外 3 管加入稀释至一定浓度的试验高、 中、 低浓度样品 ( 使用饲料用抗菌素推荐用量 ), 使用卡那霉素作为参照抗菌素。 试验用抗菌素 溶液配置见表 15。
     表 15. 抗菌素样品配置表
     2、 试验结果
     将按表 15 配制的抗菌素溶液滴加到培养皿的钢管中, 于 37℃, 厌氧罐中培养 24 小 时后, 观察抑菌圈大小, 同参照抗菌素相同或接近的判断为敏感。研究结果表明, 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 对硫酸粘杆菌素不敏感, 对诺氟沙星敏感性弱。
     实施例 5 微生态制剂的制备
     (1) 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 的菌种复壮 ;
     酪酸梭菌 CGMCC No.1925 的菌种接种于 250mlMRS 培养基 (500ml 三角瓶 ) 中, 于 37℃恒温箱中培养 24 小时, 按此条件依次接种 5 代 ( 接种量为 10% )。实验结果如表 16。
     表 16. 酪酸梭菌传代试验
     由上表可知第 4 代发酵液芽孢率高且平板记数较高, 但发酵参数无很大差距, 传 代过程中, 选第四代进行平板分离, 挑取单菌落制作试管斜面, 并将其保存在 4℃冰箱中。
     (2) 酪酸梭菌 CGMCC No.1925 的培养、 发酵 : 将复壮菌种接种于 CBM 液体培养基中, 37℃恒温箱中培养 24 小时, 芽孢率在 75%以上后, 接种于发酵罐中, 接种量 10%, 37℃恒温 培养 24 小时, 芽孢率达到 75%以上时, 使发酵液降温至 20℃ ;
     (3) 连续离心收集菌体, 将菌泥用 10 %脱脂奶和玉米芯粉调配至固型物浓度 10%, 以进口温度 115℃, 出口温度 80℃的条件进行喷雾干燥, 收集菌粉或风干收集菌粉 ;
     CBM 培养基配方 : 葡萄糖 1.0 %、 酪蛋白胨 1.0 %、 酵母粉 0.5 %、 牛肉膏 0.5 %、 (NH4)2SO40.3%、 NaCl 0.3%、 K2HPO4·H2O 0.4%、 MnSO4·H2O 0.02%、 MgSO4·7H2O0.05%、 CaCO30.2%、 琼脂 2.0% ( 固体培养基用 ), pH 值 : 7.2, 灭菌条件 : 121℃, 30 分钟。结果见表 17
     表 17. 微生态制剂检测结果 ( 离心风干分离 )
     表 18. 微生态制剂检测结果 ( 喷雾干燥 )
     结果表明喷雾干燥方式制备的菌粉比气流干燥制备的菌粉菌含量高, 所得菌粉用 铝箔袋封口, 保存于 4℃冰箱中。
     实施例 6 微生态制剂的稳定性试验
     一、 材料与方法
     1、 实施例 5 喷雾干燥制备的微生态制剂, 菌浓度 7.4×109cfu/g
     2. 培养基 : 葡萄糖 15g, 酪蛋白胨 5g, 酵母浸膏 5g, 氯化钠 2g, 磷酸氢二钾 2g, 磷 酸二氢钾 2g, 硫酸铵 2g, 琼脂 20g, 蒸馏水 1000ml, pH 7.2。将上述培养基分装后高压灭菌 121℃ 20-30 分钟。
     3. 取样稀释 : 以无菌操作取样品 1g, 放入装有 99ml 灭菌液体培养基和适量玻璃珠 的三角瓶中, 放于 37℃恒温箱中活化 1 小时, 用机械振荡器振荡 30 分钟制成 1 ∶ 100 的样 品均液。用 1ml 无菌吸管, 吸取 1 ∶ 100 样品均液 1ml, 沿管壁注入含有 9ml 无菌水生理水 的试管中。另取 1ml 无菌吸管, 按上述操作顺序, 作 10 倍递增稀释液。如此每递增一支, 更 换 1 支 1ml 无菌吸管。
     4. 培养条件 : 选择合适的三个连续稀释度样品液进行平板计数。每个稀释度作 6 个平皿, 在平皿上作上标记。每个平皿中加入 12-15ml 已融化并冷却至 45-50℃的 MRS 培 养基, 待培养基冷却且表面干燥后, 用无菌吸管吸取相应梯度的混合稀释液 0.1ml 加入平 皿中, 并立即用涂布器均匀涂布在冷却培养基表面。以上整个操作应自培养物加入培养皿 开始至接种结束须在 20 分钟内完成。如果某一样品液在取出供试部分前的放置时间超过 2 分钟, 应用机械振荡器振荡 15 秒。待稀释液完全渗入培养基内后, 将平板翻转, 置于厌氧 菌培养罐中于 37±1℃温箱内培养 24-48 小时取出。
     5. 厌氧培养 :
     (1) 利用氢硼化钠或氢硼化钾与水反应产生氢气, 在钯的催化下, 氢气与袋内的氧 气结合生成水, 从而建立起无氧环境。
     (2) 在无氧环境下加入 10%左右的二氧化碳, 有利于厌氧菌的生长。二氧化碳是 由柠檬酸和碳酸氢钠反应得到的。
     (3) 称取 2 克氢硼化钠或氢硼化钾, 1 克柠檬酸和 1 克碳酸氢钠, 用适当大小的滤 纸包好, 并装在三面密封的小塑料袋中。将干燥剂在电炉上烘烤 5 分钟左右, 安装在厌氧菌 培养罐的盖子下面。
     (4) 将准备好的平板倒置于铝制的小架子里, 放在厌氧罐中, 将装有药品的小塑料 袋放在小架子旁边。
     (5) 将厌氧菌培养罐的盖子盖好, 把盖子上的小口打开, 用吸管吸取 10ml 左右的
     蒸馏水, 通过小口加入到药品包上, 尽快撤出吸管, 并把口拧紧。
     (6) 待药品反应完全, 且罐无漏气现象, 将罐置于 37±1℃温箱中培养。
     6. 计数 :
     7. 样品试验 :
     (1) 制剂存放试验 : 将实施例 6 喷雾干燥制备的微生态制剂分装于铝薄袋中, 分别 存放于 25℃、 40℃温度的保温箱中, 于不同时间测定样品中的菌数。
     (2) 制剂在饲料中的稳定性试验 : 将实施例 6 喷雾干燥制备的微生态制剂按 1%的 添加量添加于饲料中, 进行冷造粒, 颗粒料分装于塑料袋中, 存放于室温 (20-30℃ ), 于不 同时间取样测定饲料中的酪酸梭菌活菌数量。
     二 . 试验结果
     1. 制剂存放试验
     (1)25℃存放试验, 见表 19。
     表 19 25℃存放试验结果
     (2)40℃存放试验, 见表 20。 表 20 40℃存放试验结果
     2. 本发明的微生态制剂在饲料中的稳定性试验, 见表 21。 表 21 本发明的微生态制剂在饲料中的稳定性试验
     试验结果表明, 本发明实施例 5 制备的微生态制剂在 25℃、 40℃温度的保存条件 下活性基本稳定, 随存放时间的延长, 活性略有下降, 但在试验期内活性损失不大。
     实施例 7 酪酸梭菌替代肉鸡饲料抗生素的应用效果实验
     1 材料与方法
     1.1 试验材料
     实施例 5 喷雾干燥制备的微生态制剂, 即微生态制剂, 活菌数 7.4×109CFU/g。
     1.2 试验动物及分组
     试验地点 : 试验在山东寿光鸡场
     试验时间 : 42 天
     选取 10 日龄健康的 AA 肉鸡 ( 公母混合 )1200 只, 随机分布到 10 个处理组, 每个 处理 3 个重复, 每个重复 40 只。饲养时间为 42 天。试验分组情况见表 22。
     表 22 试验动物分组及分组
     1.3 日粮配制
     参照 NRC(1994) 肉鸡营养需要标准和本试验鸡场的饲养标准进行日粮设计和配 制。基础日粮配方见表 23。
     表 23 试验基础日粮组成
     1.4 饲养管理
     按照本试验鸡场的常规管理程序进行免疫和日常管理, 采用地面平养垫料方式进 行饲养, 自由采食和饮水, 每天投料两次, 即上午 9 点和下午 4 点。在 10、 22 和 43 日龄以重 复为单位进行空腹称重, 每天仔细观察和记录鸡只的健康状况和粪便情况, 以重复为单位 记录每天的投料量。
     1.5 检测指标
     平均日采食量、 平均日增重、 料重比、 腹泻率和成活率
     1.6 数据分析
     采用 SPSS13.0 软件进行数据统计分析。
     2 结果与分析
     2.1 不同益生菌处理组对 10-21 日龄生产性能比较 表 24 10-21 日龄生产性能比较
     备注 : 表格中同一列不同字母代表差异显著 (p ≤ 0.05), 字母相同者代表差异不 显著 (p ≥ 0.05), 以下表同。
     从表 24 结果得知, 21d 平均个体重 : 添加酪酸梭菌的试验组, 添加量 0.2%组最高, 比抗生素对照组提高 2.27%。
     10-21d 平均日增重 : 酪酸梭菌组以 0.2%添加剂最高, 显著高于 0.05%和 0.1%添 加组 (p ≤ 0.05), 酪酸梭菌各处理组与两个对照组差异都不显著 (p ≤ 0.05) ; 各处理组以 添加酪酸梭菌 0.2%组最高。
     10-21d 料 重 比 : 酪 酸 梭 菌 组 以 0.2 % 添 加 剂 最 低, 但各组间差异不显著 (p ≥ 0.05)。
     2.2 10-42 日龄不同益生菌处理生产性能比较
     表 25 10-42 日龄生产性能比较
     从表 25 结果可以看出, 10-42d 平均日增重和料重比及 42d 平均个体重各组间都差 异不显著。酪酸梭菌组的 42d 平均个体重和 10-42d 平均日增重以低剂量的 0.05%添加组 最好, 且分别比抗生素对照组提高了 1.97%。
     3 结论
     本试验结果表明, 在肉鸡生长前期添加 0.2%酪酸梭菌替代抗生素的综合效果较 好; 生长后期酪酸梭菌以低剂量的 0.05%添加效果较好, 添加本发明微生态制剂组死淘率 显著降低, 与添加黄霉素组死淘率相当, 说明本发明的微生态制剂与黄霉素具有同等的抑 菌作用, 可替代黄霉素预防动物的疾病发生。19

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1、10申请公布号CN101982089A43申请公布日20110302CN101982089ACN101982089A21申请号201010281964X22申请日20100915192520070122A23K1/18200601C12N1/20200601C12R1/14520060171申请人北京大北农科技集团股份有限公司地址100080北京市海淀区中关村大街27号中关村大厦14层大北农集团申请人北京百林康源生物技术有限责任公司72发明人宋维平聂实践54发明名称一种兽用微生态制剂及其制备方法与用途57摘要本发明涉及一种兽用微生态制剂及其制备方法与用途,属于微生态制剂技术领域。该微生态制剂的。

2、活性成分为酪酸梭菌CGMCCNO1925菌粉。本发明的兽用微生态制剂活菌含量高;对抗生素有耐受性,对一些抗生素不敏感或敏感性弱;而且,该微生态制剂可替代一些抗生素;可耐胃酸、胆盐、高温等。另外,本发明微生态制剂的制备方法简单,用本发明的制备方法制备出的微生态制剂,酪酸梭菌活菌含量高。本发明的兽用微生态制剂有较好的市场前景。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书17页CN101982091A1/1页21一种兽用微生态制剂,其特征在于活性成分为酪酸梭菌CGMCCNO1925菌粉。2权1所述的兽用微生态制剂,其特征在于酪酸梭菌CGMCCNO。

3、1925菌浓度为1106CFU/G11010CFU/G。3权2所述的兽用微生态制剂,其特征在于酪酸梭菌CGMCCNO1925菌浓度为1109CFU/G。4权13任一项所述的兽用微生态制剂,其特征在于进一步包含载体,载体为石粉、硫酸钾铝、玉米芯粉中的任一种或两种。5如权14任一项所述的兽用微生态制剂的制备方法,其特征在于制备过程如下1酪酸梭菌CGMCCNO1925的菌种复壮;2酪酸梭菌CGMCCNO1925的培养、发酵将复壮菌种接种于CBM液体培养基中,37恒温箱中培养24小时,芽孢率在75以上后,接种于发酵罐中,接种量10,37恒温培养24小时,芽孢率达到75以上时,使发酵液降温至20;3连续。

4、离心收集菌体,将菌泥用保护液和载体调配至固型物浓度510,以进口温度115,出口温度80的条件进行喷雾干燥,收集菌粉,即得;CBM培养基配方葡萄糖10、酪蛋白胨10、酵母粉05、牛肉膏05、NH42SO403、NACL03、K2HPO4H2O04、MNSO4H2O002、MGSO47H2O005、CACO302、琼脂20固体培养基用,PH值72,灭菌条件121,30分钟。6权5所述的兽用微生态制剂的制备方法,其特征在于所述的保护液为10的脱脂奶。7如权14任一项所述的兽用微生态制剂在制备饲料添加剂中的应用。权利要求书CN101982089ACN101982091A1/17页3一种兽用微生态制剂。

5、及其制备方法与用途技术领域0001本发明涉及一种兽用微生态制剂及其制备方法与用途,属于微生态制剂技术领域。背景技术0002兽用微生态制剂是一种绿色、安全的饲料添加剂,具有防病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能,且无污染,无残留,不产生抗药性。0003目前,市场上的微生态制剂存在以下几个方面的问题1活菌含量低,而研究表明,如果一种菌在盲肠内容物中的浓度低于107个/G,则该菌产生的酶及代谢产物不足以影响宿主,难以满足治疗需要;2不耐抗生素;3对高温、胃酸和胆盐不稳定,致使只有少数菌株进入肠道后仍具有活性,达不到发挥作用所需的活菌数量;4不稳定,保存期短。由于微生态制剂存在的这些问题,。

6、从而影响了其在动物上的应用效果,限制了微生态制剂的广泛应用。发明内容0004本发明的目的在于提供一种对抗生素有耐受性、活菌含量高、稳定、保存期长的兽用微生态制剂。该兽用微生态制剂中主要活性成分是酪酸梭菌CGMCCNO1925菌粉。0005本发明的另一目的是提供该兽用微生态制剂的制备方法和用途。0006本发明的目的是通过如下技术方案实现的0007本发明提供一种兽用微生态制剂,该制剂的活性成分为酪酸梭菌CGMCCNO1925菌粉。0008其中,所述的酪酸梭菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUMCGMCCNO1925为申请人从动物肠道中分离、选育得到,经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定,并于2。

7、007年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏简称CGMCC,保藏号为CGMCCNO1925。本发明的酪酸梭菌CGMCCNO1925对胆汁的耐受性很高,胆汁处理对酪酸梭菌的活性几乎没有影响;短时间内可耐强酸,如PH10或PH20,在PH30、40条件下可长时间耐酸,酪酸梭菌的活性基本不受影响;耐高温,具有较好的热存放稳定性;对一些抗生素不敏感,如对硫酸粘杆菌素不敏感,对诺氟沙星敏感性弱。0009本发明的兽用微生态制剂中,酪酸梭菌CGMCCNO1925菌浓度为1106CFU/G11010CFU/G。0010进一步,酪酸梭菌CGMCCNO1925菌浓度为1109CFU/G。。

8、0011本发明的兽用微生态制剂还可进一步包含载体,载体为石粉、硫酸钾铝、玉米芯粉中的任一种或两种。0012本发明还提供了该兽用微生态制剂的制备方法,其制备过程如下00131酪酸梭菌CGMCCNO1925的菌种复壮;0014菌种的复壮代数可根据实际需要进行,但申请人在发明过程中发现,酪酸梭菌说明书CN101982089ACN101982091A2/17页4CGMCCNO1925经过4代复壮,第4代发酵液芽孢率高且平板记数较高,因此申请人优选第四代作为复壮菌种;00152酪酸梭菌CGMCCNO1925的培养、发酵将复壮菌种接种于CBM液体培养基中,37恒温箱中培养24小时,芽孢率在75以上后,接种。

9、于发酵罐中,接种量10,37恒温培养24小时,芽孢率达到75以上时,使发酵液降温至20;00163连续离心收集菌体,将菌泥用保护液和载体调配至固型物浓度510,以进口温度115,出口温度80的条件进行喷雾干燥,收集菌粉,即得;0017菌粉的收集方法可为其它方法,如用45左右气流干燥,干燥后制成菌粉,但申请人发现喷雾干燥制备的菌粉活菌含量高,所以本发明优选喷雾干燥。0018其中,CBM培养基配方葡萄糖10、酪蛋白胨10、酵母粉05、牛肉膏05、NH42SO403、NACL03、K2HPO4H2O04、MNSO4H2O002、MGSO47H2O005、CACO302、琼脂20固体培养基用,PH值7。

10、2,灭菌条件121,30分钟。0019其中,所述的保护液为10的脱脂奶。0020本发明还提供了该兽用微生态制剂用于制备饲料添加剂的用途。0021本发明的兽用微生态制剂活菌含量高,酪酸梭菌CGMCCNO1925菌浓度可高达11010CFU/G;对抗生素有耐受性,在动物的生长过程中,不可避免的要使用抗菌素对动物疾病进行治疗,为了防止疾病的发生和促进生长,国内的一些饲料生产企业和养殖企业在饲料中添加亚剂量的抗菌素,这种养殖行为对动物肠道微生态会产生很大的影响,很多微生态制剂在此种情况下而不能发挥其原有的作用,但本发明的微生态制剂对某些抗生素不敏感或敏感性弱,如对硫酸粘杆菌素不敏感,对诺氟沙星敏感性弱。

11、,因此本发明的微生态制剂在制备及使用过程中,就可不受这些抗生素的影响,即使这些抗生素存在,也能发挥本发明微生态制剂的活性成分酪酸梭菌CGMCCNO1925增强机体免疫力、促进生长、增加体重等益生作用;而且,微生态制剂因其绿色、环保可替代抗生素而受人类青睐,本发明的微生态制剂在研究中还发现,本发明的微生态制剂可真正替代一些抗生素,如黄霉素,二者抗病能力相当;本发明的微生态制剂耐胃酸、胆盐、高温等,菌株进入肠道后仍具有活性,从而发挥其作用;且该制剂在25、40温度的保存条件下活性基本稳定,随存放时间的延长,活性虽有下降,但活性损失不大;另外,本发明微生态制剂的制备方法简单,各种实验条件都经过了申请。

12、人的实验研究,用本发明的制备方法制备出的微生态制剂,酪酸梭菌活菌含量高,在制备过程中酪酸梭菌CGMCCNO1925表现较好的抗机械加工性,造粒加工后,活性基本没有被破坏,在饲料中的稳定性较好等。0022通过下列实施例将更具体的说明本发明,但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明,而不是以任何方式限制本发明的范围。具体实施方式0023实施例1酪酸梭菌的分离、鉴定0024样品采集菌种分离的样品来自动物肠道中。0025菌体为直或弯曲,端圆,单个或成对、短链偶见长丝状菌体,周生鞭毛,能运动;革兰氏阳性,在老培养物中能变为阴性;菌体中常有圆形或椭圆形芽孢,使菌体中部膨大成梭形,孢子偏心或次端生、无孢子外壁。

13、或附属丝;表面菌落圆形或不规则,直径13毫米,稍说明书CN101982089ACN101982091A3/17页5凸,白色至奶油色,表面有光泽至无光泽;该菌为厌氧菌,在合适的培养基中生长良好,并产气。经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定为酪酸梭菌CLOSTRIDIUMBUTYRICUM。0026实施例2酪酸梭菌的培养00271材料与方法00281菌种酪酸梭菌CGMCCNO192500292器材光学显微镜,厌氧罐,恒温培养箱等。00303药品结晶紫染液,石炭酸复红染液。00314培养方式三角瓶液体深层静置培养非严格厌氧条件。平皿固体培养需置于厌氧罐中进行。00325检测方法菌数测定可用平板倾注法。

14、和血球记数法。菌体形态用结晶紫染液及石炭酸复红染液染色后于显微镜下观察。00332结果00341碳氮源配比试验0035以葡萄糖为碳源,氮源选用蛋白胨、酵母粉及牛肉浸膏组成复合氮源提供菌体生长所需的生长因子。实验中固定培养基其他组分用量,分别以碳氮源为变量进行对比培养,以下是不同碳氮源用量及比例的培养结果。0036碳源用量试验以葡萄糖为碳源,分为6个用量水平进行培养,结果见表1。0037表1葡萄糖用量对比试验结果00380039结果表明碳源在10水平时,菌体生长较好,菌数较高。0040氮源配比试验鉴于酪酸梭菌菌株的生长要求,参考几种现有培养基的组成,试验以酪蛋白胨、酵母浸膏粉和牛肉浸膏为复合氮源。

15、,分别做不同配比的培养试验,结果见表2。0041表2氮源配比试验结果00420043结果表明氮源组成和比例对菌数有明显影响,其中6、7组的培养结果较好。0044碳氮综合试验结合以上两个试验结果,进行不同碳氮比下菌体得率和芽孢生成率的试验。结果见表3。说明书CN101982089ACN101982091A4/17页60045表3碳氮综合试验结果00460047结果表明2组菌数和芽孢转化率较高。0048综合以上试验结果,兼顾菌量和芽孢率,最终确定碳氮源配比葡萄糖10、酪蛋白胨10、酵母粉05、牛肉浸膏05。00492无机盐及微量元素的配比研究0050根据酪酸梭菌营养利用特性,分别做了几组不同无机盐。

16、及微量元素配比的培养试验,试验中采用NH42SO4作为无机氮源;用K2HPO4作为缓冲物及K来源;添加MGSO4和MNSO4试验结果见表4。0051表4无机盐及微量元素配比试验结果00520053结果表明无机盐及微量元素的配比与芽孢形成有密切的关系,尤其是MG2对芽孢转化率的提高有显著的作用。其中第5组的培养结果较理想,按此可确定无机盐及微量元素的配比。00543添加抗氧化剂对菌体生长影响的研究0055本实验用VC和半胱氨酸作为抗氧化剂加入培养基,与空白组做培养对比试验,结果见表5。0056表5厌氧试验说明书CN101982089ACN101982091A5/17页700570058从表5结果。

17、可以看出,抗氧化剂添加与否对培养结果并无明显影响,而抗氧化剂灭菌时易失活,且会影响培养基PH。因此培养基中可不必添加抗氧化剂。综合以上试验结果,最终确定培养基配方,见表6。0059表6酪酸菌培养基配方00600061PH70灭菌条件12120MIN。00624接种PH0063本实验以几种不同的接种PH进行接种培养,培养结果见表7。0064表7接种PH试验006500660067结果表明酪酸梭菌适宜接种PH为中性,确定PH70为最佳接种条件。00685热处理方法研究说明书CN101982089ACN101982091A6/17页80069酪酸梭菌为内生芽孢菌,此类菌的优选及复壮一般都可采用热处理。

18、的方法。据此本实验在菌种转接时进行热处理。具体操作为培养基升温至80接种,接种后于80保持10分钟,然后冷却至培养温度继续培养,通过此步处理可起到优化菌种、激活芽孢促使其尽快萌发、促成同步培养以及进一步防止污染等效果。以下为热处理组与常温接种组连续转接3次后的对照实验结果。0070表8热处理对照实验结果007100726培养温度研究0073酪酸梭菌适宜培养温度为3240,本实验分别取不同温度进行培养,24HR培养结果见表9。0074表9培养温度试验00750076根据表9结果,可确定最适培养温度为36。00777培养时间研究0078培养时间是影响菌浓及芽孢成熟率的重要因素,本实验取不同培养时间。

19、进行培养,结果见表10。0079表10培养时间试验0080说明书CN101982089ACN101982091A7/17页90081结果表明培养时间短菌数高,但芽孢转化率及成熟度均较低;时间过长芽孢转化率及成熟度并无提高,反而出现菌体老化、菌数下降的情况。试验结果表明24HR为最适培养时间。0082实施例3酪酸梭菌的耐受性实验00831、实验材料0084菌种酪酸梭菌CGMCCNO1925;嗜酸乳杆菌,北京市真菌工程实验室提供;0085胆汁动物胆汁,中国农业科学院畜牧研究所提供;0086培养基酪酸梭菌和嗜酸乳杆菌培养,均使用MRS培养基;MRS培养基配方葡萄糖2、酪蛋白胨05、酵母粉03、牛肉膏。

20、05、NH42SO402、NACL02、K2HSO4H2O02、KH2SO402、CACO305、琼脂20固体培养基用、PH值72,灭菌条件12130分钟。00872、实验方法008821酪酸梭菌培养基接种后培养24小时,芽孢生成率85,离心分离,使用蒸馏水制成菌悬液;嗜酸乳杆菌培养基接种后培养24小时,离心分离,使用蒸馏水制成菌悬液;008922配制不同胆汁浓度的液体,加入1/5的菌悬液,使胆汁的最终浓度为00、03、06、10,处理16小时,用蒸馏水逐级稀释至一定浓度,进行酪酸梭菌平板计数;009023将酪酸梭菌菌悬液用盐酸调PH到1、2、3、4,处理14小时后,用02MPH70的无菌磷酸。

21、盐缓冲溶液将样品逐级稀释至一定浓度,进行酪酸梭菌平板计数;009124将酪酸梭菌菌粉于常温25、80、90、100生理盐水中处理5、10、15、20分钟后,用蒸馏水逐级稀释至一定浓度,进行酪酸梭菌平板计数。将酪酸梭菌菌粉用铝薄袋包装,放于常温25和60保温箱中存放10天,于第5、10天,取样用蒸馏水逐级稀释至一定浓度,进行酪酸梭菌平板计数。00923、实验结果009331耐胆汁试验0094将酪酸梭菌和嗜酸乳杆菌的菌悬液用预先配制好的胆汁溶液处理,处理时间分别为1、15、3、45、6小时,用蒸馏水逐级稀释至一定浓度,然后测定酪酸梭菌活菌数,以无胆汁处理的样品为100,计算存活率。结果见表11。0。

22、095表11酪酸梭菌耐胆汁试验说明书CN101982089ACN101982091A8/17页1000960097结果表明胆汁处理对酪酸梭菌的活性几乎没有影响,而嗜酸乳杆菌经胆汁处理后活性有明显下降的趋势,酪酸梭菌对胆汁的耐受性很高。009832耐酸试验0099使用盐酸模拟胃酸环境,处理酪酸梭菌和嗜酸乳杆菌,不同时间测定酪酸梭菌和嗜酸乳杆菌的活性,以PH7样品的活菌数为100,计算试验样品的存活率,测定结果见表12。0100表12酪酸梭菌耐酸试验010101020103结果表明,在2小时内,酪酸梭菌对酸不敏感,活性基本无变坏,甚至在PH10的环境中也很稳定,但随其在酸溶液中时间的延长,在PH1。

23、0、20条件下活性明显降低,在说明书CN101982089ACN101982091A9/17页11PH30、40条件下酪酸梭菌的活性基本不受影响。结果显示,酪酸梭菌的耐酸性能明显强于嗜酸乳杆菌。010433耐温试验0105酪酸梭菌菌粉于常温25、80、90、100生理盐水中处理5、10、15、20分钟后,用蒸馏水逐级稀释至一定浓度,进行酪酸梭菌平板计数,以25条件的活菌数为100,计算存活率。结果见表13。0106酪酸梭菌菌粉于常温25和60温箱保存,在第5、10天取样,用蒸馏水逐级稀释至一定浓度,进行酪酸梭菌平板计数,以25条件的活菌数为100,计算存活率。结果见表14。0107表13液体中。

24、耐高温试验01080109结果表明,在高温液体中酪酸梭菌具有一定的耐受能力,但在100条件下存活率降低较快,饲料加工过程只是瞬间达到高温,因此判断酪酸梭菌具有耐受饲料加工的瞬间热破坏的能力。同样条件下嗜酸乳杆菌全部灭活。0110表14耐高温保存试验01110112结果表明酪酸梭菌具有较好的热存放稳定性。0113实施例4酪酸梭菌的抗性01141、材料与方法011511菌种酪酸梭菌CGMCCNO1925011612培养基MRS培养基011713不锈钢小管内径6MM、高10MM、外径78MM。011814抗菌素01191卡那霉素含量98,北京百林康源生物技术有限责任公司提供。01202杆菌肽锌含量1。

25、5,天津新兴兽药厂提供。01213黄霉素含量5,北京大北农饲料科技公司提供。说明书CN101982089ACN101982091A10/17页1201224硫酸粘杆菌素含量15,天津新兴兽药厂提供。01235诺氟沙星含量95,北京都德伟业饲料公司提供。012415方法01251菌悬液配置取酪酸梭菌接种于250ML灭菌的MRS培养中,37培养24小时,计数后,用无菌水稀释至浓度为1107个菌/ML的菌悬液,作为接种液。01262双碟的制备将20ML灭菌后的MRS固体培养基融化后加入培养皿中,冷却制作第一层培养基。然后去融化的MRS培养基5ML和菌悬液1ML,于5060加入培养皿中,摇匀后冷却制作。

26、第二层培养基作为菌层。01273检测采用三剂量法,在每个培养皿中放入6个不锈钢小管,其中一组间隔的3个管中滴加高、中、低浓度的参照抗菌素溶液。另外3管加入稀释至一定浓度的试验高、中、低浓度样品使用饲料用抗菌素推荐用量,使用卡那霉素作为参照抗菌素。试验用抗菌素溶液配置见表15。0128表15抗菌素样品配置表012901302、试验结果0131将按表15配制的抗菌素溶液滴加到培养皿的钢管中,于37,厌氧罐中培养24小时后,观察抑菌圈大小,同参照抗菌素相同或接近的判断为敏感。研究结果表明,酪酸梭菌CGMCCNO1925对硫酸粘杆菌素不敏感,对诺氟沙星敏感性弱。0132实施例5微生态制剂的制备0133。

27、1酪酸梭菌CGMCCNO1925的菌种复壮;0134酪酸梭菌CGMCCNO1925的菌种接种于250MLMRS培养基500ML三角瓶中,于37恒温箱中培养24小时,按此条件依次接种5代接种量为10。实验结果如表16。0135表16酪酸梭菌传代试验说明书CN101982089ACN101982091A11/17页1301360137由上表可知第4代发酵液芽孢率高且平板记数较高,但发酵参数无很大差距,传代过程中,选第四代进行平板分离,挑取单菌落制作试管斜面,并将其保存在4冰箱中。01382酪酸梭菌CGMCCNO1925的培养、发酵将复壮菌种接种于CBM液体培养基中,37恒温箱中培养24小时,芽孢率。

28、在75以上后,接种于发酵罐中,接种量10,37恒温培养24小时,芽孢率达到75以上时,使发酵液降温至20;01393连续离心收集菌体,将菌泥用10脱脂奶和玉米芯粉调配至固型物浓度10,以进口温度115,出口温度80的条件进行喷雾干燥,收集菌粉或风干收集菌粉;0140CBM培养基配方葡萄糖10、酪蛋白胨10、酵母粉05、牛肉膏05、NH42SO403、NACL03、K2HPO4H2O04、MNSO4H2O002、MGSO47H2O005、CACO302、琼脂20固体培养基用,PH值72,灭菌条件121,30分钟。结果见表170141表17微生态制剂检测结果离心风干分离01420143表18微生态。

29、制剂检测结果喷雾干燥说明书CN101982089ACN101982091A12/17页1401440145结果表明喷雾干燥方式制备的菌粉比气流干燥制备的菌粉菌含量高,所得菌粉用铝箔袋封口,保存于4冰箱中。0146实施例6微生态制剂的稳定性试验0147一、材料与方法01481、实施例5喷雾干燥制备的微生态制剂,菌浓度74109CFU/G01492培养基葡萄糖15G,酪蛋白胨5G,酵母浸膏5G,氯化钠2G,磷酸氢二钾2G,磷酸二氢钾2G,硫酸铵2G,琼脂20G,蒸馏水1000ML,PH72。将上述培养基分装后高压灭菌1212030分钟。01503取样稀释以无菌操作取样品1G,放入装有99ML灭菌液。

30、体培养基和适量玻璃珠的三角瓶中,放于37恒温箱中活化1小时,用机械振荡器振荡30分钟制成1100的样品均液。用1ML无菌吸管,吸取1100样品均液1ML,沿管壁注入含有9ML无菌水生理水的试管中。另取1ML无菌吸管,按上述操作顺序,作10倍递增稀释液。如此每递增一支,更换1支1ML无菌吸管。01514培养条件选择合适的三个连续稀释度样品液进行平板计数。每个稀释度作6个平皿,在平皿上作上标记。每个平皿中加入1215ML已融化并冷却至4550的MRS培养基,待培养基冷却且表面干燥后,用无菌吸管吸取相应梯度的混合稀释液01ML加入平皿中,并立即用涂布器均匀涂布在冷却培养基表面。以上整个操作应自培养物。

31、加入培养皿开始至接种结束须在20分钟内完成。如果某一样品液在取出供试部分前的放置时间超过2分钟,应用机械振荡器振荡15秒。待稀释液完全渗入培养基内后,将平板翻转,置于厌氧菌培养罐中于371温箱内培养2448小时取出。01525厌氧培养01531利用氢硼化钠或氢硼化钾与水反应产生氢气,在钯的催化下,氢气与袋内的氧气结合生成水,从而建立起无氧环境。01542在无氧环境下加入10左右的二氧化碳,有利于厌氧菌的生长。二氧化碳是由柠檬酸和碳酸氢钠反应得到的。01553称取2克氢硼化钠或氢硼化钾,1克柠檬酸和1克碳酸氢钠,用适当大小的滤纸包好,并装在三面密封的小塑料袋中。将干燥剂在电炉上烘烤5分钟左右,安。

32、装在厌氧菌培养罐的盖子下面。01564将准备好的平板倒置于铝制的小架子里,放在厌氧罐中,将装有药品的小塑料袋放在小架子旁边。01575将厌氧菌培养罐的盖子盖好,把盖子上的小口打开,用吸管吸取10ML左右的说明书CN101982089ACN101982091A13/17页15蒸馏水,通过小口加入到药品包上,尽快撤出吸管,并把口拧紧。01586待药品反应完全,且罐无漏气现象,将罐置于371温箱中培养。015901606计数01617样品试验01621制剂存放试验将实施例6喷雾干燥制备的微生态制剂分装于铝薄袋中,分别存放于25、40温度的保温箱中,于不同时间测定样品中的菌数。01632制剂在饲料中的。

33、稳定性试验将实施例6喷雾干燥制备的微生态制剂按1的添加量添加于饲料中,进行冷造粒,颗粒料分装于塑料袋中,存放于室温2030,于不同时间取样测定饲料中的酪酸梭菌活菌数量。0164二试验结果01651制剂存放试验0166125存放试验,见表19。0167表1925存放试验结果01680169240存放试验,见表20。0170表2040存放试验结果017101722本发明的微生态制剂在饲料中的稳定性试验,见表21。0173表21本发明的微生态制剂在饲料中的稳定性试验说明书CN101982089ACN101982091A14/17页1601740175试验结果表明,本发明实施例5制备的微生态制剂在25。

34、、40温度的保存条件下活性基本稳定,随存放时间的延长,活性略有下降,但在试验期内活性损失不大。0176实施例7酪酸梭菌替代肉鸡饲料抗生素的应用效果实验01771材料与方法017811试验材料0179实施例5喷雾干燥制备的微生态制剂,即微生态制剂,活菌数74109CFU/G。018012试验动物及分组0181试验地点试验在山东寿光鸡场0182试验时间42天0183选取10日龄健康的AA肉鸡公母混合1200只,随机分布到10个处理组,每个处理3个重复,每个重复40只。饲养时间为42天。试验分组情况见表22。0184表22试验动物分组及分组0185018613日粮配制0187参照NRC1994肉鸡营。

35、养需要标准和本试验鸡场的饲养标准进行日粮设计和配制。基础日粮配方见表23。0188表23试验基础日粮组成说明书CN101982089ACN101982091A15/17页170189019014饲养管理0191按照本试验鸡场的常规管理程序进行免疫和日常管理,采用地面平养垫料方式进行饲养,自由采食和饮水,每天投料两次,即上午9点和下午4点。在10、22和43日龄以重复为单位进行空腹称重,每天仔细观察和记录鸡只的健康状况和粪便情况,以重复为单位记录每天的投料量。019215检测指标0193平均日采食量、平均日增重、料重比、腹泻率和成活率019416数据分析0195采用SPSS130软件进行数据统计。

36、分析。01962结果与分析说明书CN101982089ACN101982091A16/17页18019721不同益生菌处理组对1021日龄生产性能比较0198表241021日龄生产性能比较01990200备注表格中同一列不同字母代表差异显著P005,字母相同者代表差异不显著P005,以下表同。0201从表24结果得知,21D平均个体重添加酪酸梭菌的试验组,添加量02组最高,比抗生素对照组提高227。02021021D平均日增重酪酸梭菌组以02添加剂最高,显著高于005和01添加组P005,酪酸梭菌各处理组与两个对照组差异都不显著P005;各处理组以添加酪酸梭菌02组最高。02031021D料重。

37、比酪酸梭菌组以02添加剂最低,但各组间差异不显著P005。0204221042日龄不同益生菌处理生产性能比较0205表251042日龄生产性能比较020602070208从表25结果可以看出,1042D平均日增重和料重比及42D平均个体重各组间都差异不显著。酪酸梭菌组的42D平均个体重和1042D平均日增重以低剂量的005添加组最好,且分别比抗生素对照组提高了197。说明书CN101982089ACN101982091A17/17页1902093结论0210本试验结果表明,在肉鸡生长前期添加02酪酸梭菌替代抗生素的综合效果较好;生长后期酪酸梭菌以低剂量的005添加效果较好,添加本发明微生态制剂组死淘率显著降低,与添加黄霉素组死淘率相当,说明本发明的微生态制剂与黄霉素具有同等的抑菌作用,可替代黄霉素预防动物的疾病发生。说明书CN101982089A。

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