一种银杏内酯与银杏黄酮组合药物及其制剂、 应用 技术领域 本发明一种银杏内酯与银杏黄酮组合药物及其制剂、 应用涉及的是一种药物制剂 的组合方法及制备方法， 更具体地说， 涉及一种银杏内酯与银杏黄酮的组合方法及其制剂、 应用。
背景技术
银杏叶的活性成分主要是黄酮和内酯类化合物。银杏黄酮有清除氧自由基、 保 护脂质抗过氧化、 降低微血管通透性、 舒张小动脉、 改善微循环的作用， 银杏内酯有抗血 小板活化因子的作用， 两者之间有复杂的交叉、 协同作用。目前欧洲标准的银杏提取物 (EGb-761， 如德国的 Tebonin 和法国的 Tanakan 等 ) 含总黄酮≥ 24％、 总内酯≥ 6％， 国内 银杏叶药物的标准， 也参照此比例制定。换而言之， 目前市售的银杏叶药物中， 银杏黄酯与 银杏内酯比例多年未变。
关于银杏叶的药理实验和临床研究， 大部分采用上述标准提取物 EGb-761 进行， 少量分别采用银杏黄酮或银杏内酯， 极少量采用单体。 为推动国内银杏叶的研发， 充分发挥 其在心脑血管疾病中的治疗作用， 发明人通过试验研究了银杏黄酮与银杏内酯不同比例对 其药效的影响， 并确定了银杏黄酮与银杏内酯的最佳配比范围， 充分发挥两者之间的协同 作用， 增强银杏叶制剂的临床应用。 发明内容 本发明目的是提供了一种银杏黄酮与银杏内酯的最佳配比组合， 以及由此组合制 备的药物制剂。
一种银杏内酯与银杏黄酮的组合药物及其制备方法、 应用是采取以下方案实现 ：
一种银杏内酯与银杏黄酮组合药物， 其特征在于有效成分由银杏叶的内酯类提取 物银杏内酯和银杏叶的黄酮类提取物银杏黄酮配比而成， 其中银杏内酯与银杏黄酮重量配 比为 3-1 ∶ 2.3-10。
所述银杏内酯与银杏内酯重量配比优选为 2-1.2 ∶ 2.4-4.8。
所述银杏内酯与银杏黄酮重量配比进一步的优选为下述比例中的任何一种 ： 3 ∶ 2.3、 2 ∶ 2.4， 1.2 ∶ 4.8、 1 ∶ 10。其中特别优选的比例是 2 ∶ 2.4。
一种银杏内酯与银杏黄酮的组合药物， 其银杏内酯中总内酯含量不低于 70％， 银 杏黄酮总黄酮含量不低于 20％。优选的银杏内酯中总内酯含量不低于 90％， 银杏黄酮总黄 酮含量不低于 25％。
一种银杏内酯与银杏黄酮的组合药物， 其特征在于其制剂为口服制剂或者注射制 剂， 相应含有口服制剂的药用辅料或者注射制剂的药用辅料。
一种银杏内酯与银杏黄酮的组合药物， 其口服制剂包括硬胶囊剂、 软胶囊剂、 颗粒 剂、 滴丸剂、 片剂、 分散片、 胃漂浮片， 其注射制剂包括小容量注射液、 大容量注射液和粉针， 可按常规的药物制备工艺制得。
所述的一种银杏内酯与银杏黄酮组合药物在制备治疗冠心病、 心绞痛和中风中经 络的痰瘀阻络症 ( 脑血栓形成、 脑栓塞 ) 药物中的应用。
本发明提供了一种银杏内酯与银杏黄酮的最佳配比， 充分发挥银杏内酯与银杏黄 酮之间的协同作用， 为治疗冠心病、 心绞痛和中风中经络的痰瘀阻络症 ( 脑血栓形成、 脑栓 塞 ) 提供了一种新的应用药物。
具体实施方法
以下通过实施例， 结合药效学试验结果， 进一步说明本发明， 下述实施例仅用于说 明本发明而对本发明没有限制。
实施例 1
处方 ：
银杏内酯提取物 30g
银杏黄酮提取物 23g
微晶纤维素 25g
羧甲基基淀粉钠 28g
滑石粉 2g 聚维酮 K30(PVPK30) 6g
制法 ： 按处方称取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物， 加入微晶纤维素和羧甲基 淀粉钠， 混合均匀。加入 4％的 PVPK30 液混合揉制成软材， 过 20 目筛， 制湿粒。在 50 ～ 60℃ 干燥 2 小时后， 用 18 目筛整粒， 加入滑石粉， 混合均匀， 用胶囊灌装得 1000 粒。
实施例 2
处方 ：
银杏内酯提取物 40g
银杏黄酮提取物 48g
色拉油 386g
蜂蜡 16g
氢化棕榈油 28g
大豆磷脂 20g
甲基硅油 0.5g
制法 ： 取色拉油， 加入蜂蜡、 氢化棕榈油， 加热使其溶解， 放冷， 加入大豆磷脂， 搅 匀， 加入银杏内酯提取物、 银杏黄酮提取物， 搅匀， 胶体磨研匀， 加入甲基硅油， 减压除气， 药 液压制成软胶囊 1000 粒。
实施例 3
处方 ：
银杏内酯提取物 12g
银杏黄酮提取物 48g
蔗糖 500g
淀粉 380g
打浆淀粉 50g
香精 2ml
制法 ： 称取处方量的银杏内酯提取物、 银杏黄酮提取物、 蔗糖和淀粉， 粉碎过 100 目筛， 并充分混和半小时 ； 将打浆淀粉冲成 10％淀粉浆， 放冷备用。搅拌下将淀粉浆加入到 已混和好的料中， 制成软材， 过 14 目筛， 制湿粒。 湿粒于 55℃干燥 3 小时， 整粒后喷入香精， 放置半小时， 分装得 1000 包
实施例 4
处方 ：
银杏内酯提取物 10g
银杏黄酮提取物 100g
聚乙二醇 6000 适量
8％欧巴代液 30ml
制法 ： 取聚乙二醇 6000 适量， 置 90℃水浴上搅拌至全熔， 加银杏内酯提取物、 银杏 黄酮提取物， 充分混匀。开启滴丸机， 控制料罐、 滴头温度 70℃进行预热， 至温度恒定后， 将 上述料液加入滴丸机料罐中， 保温约 10 分钟， 用内径 3mm 的滴管滴入温度为 0 ～ -4℃的二 甲基硅油中， 取出滴丸， 擦干二甲基硅油。取丸芯， 置包衣锅中， 用 8％的欧巴代液 (50％乙 醇作溶剂 ) 喷洒包衣， 包装即成滴丸。
实施例 5
处方 ：
银杏内酯提取物 60g
银杏黄酮提取物 46g
淀粉 50g
微晶纤维素 35g
羧甲淀粉钠 15g
硬脂酸镁 1g
5％聚维酮 K30 适量
制法 ： 淀粉、 微晶纤维素、 羧甲淀粉钠、 硬脂酸镁分别过 80 目筛 ； 取聚维酮 K30 用 无水乙醇溶解制成 5％的溶液， 混匀备用。 按处方量称取银杏内酯提取物、 银杏黄酮提取物、 淀粉、 微晶纤维素、 羧甲淀粉钠， 混合均匀， 加入 5％聚维酮 K30 液制成软材， 过 20 目筛， 制 湿粒， 湿粒置在 50℃干燥后， 过 18 目筛， 加入硬脂酸镁， 混匀后， 用 φ8mm 浅弧冲压成 1000 片， 片重约 210mg。
实施例 6
处方 ：
银杏内酯提取物 12.5g
银杏黄酮提取物 15g
微晶纤维素 20g
低取代羟丙基纤维素 90g
阿斯巴甜 1g
十二烷基硫酸钠 1.5g
香兰素 1g
硬脂酸镁 1g聚维酮 K30 适量
欧巴代 适量
制法 ： 所有原辅料过 100 目筛。将聚维酮 K30、 十二烷基硫酸钠用注射用水溶解， 制得 5％聚维酮液备用。按处方称取微晶纤维素、 低取代羟丙基纤维素、 阿斯巴甜， 以等量 递加法混匀， 待用。按处方称取银杏内酯提取物、 银杏黄酮提取物， 与上述混合后的辅料以 等量递加法混匀， 加入聚维酮液制成软材， 过 24 目筛制湿粒。湿粒置 65℃干燥后， 过 18 目 筛， 加入香兰素、 硬脂酸镁， 混匀后， 用 φ8mm 冲头压片， 取片芯筛去表面细粉， 置包衣锅中， 用 8％的欧巴代液 (50％乙醇作溶剂 ) 喷洒包衣得分散片 1000 片。
实施例 7
处方 ：
银杏内酯提取物 10g
银杏黄酮提取物 40g
羟丙基甲基纤维素 (HPMC) 15g
十八醇 20g
碳酸氢钠 15g 乳糖 10g
十二烷基硫酸钠 2g
硬脂酸镁 2g
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 适量
制法 ： 所有原辅料过 100 目筛。将聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、 十二烷基硫酸钠用注射 用水溶解， 制得 10％聚维酮液备用。按处方称取银杏内酯提取物、 银杏黄酮提取物， 与辅料 以等量递加法混匀， 加入聚维酮液制成软材， 过 20 目筛制湿粒。湿粒置 55℃干燥后， 过 18 目筛， 加入硬脂酸镁， 混匀后压片， 得胃漂浮片 1000 片。
实施例 8
处方 ：
银杏内酯提取物 5g
银杏黄酮提取物 5g
吐温 -80 5ml
乙醇 500ml
注射用水 500ml
制法 ： 称取处方量的银杏内酯提取物、 银杏黄酮提取物， 加乙醇 500ml， 加入吐 温 -80 约 5ml， 加入注射用水 500ml， 超声处理至完全溶解， 调节溶液 pH 值 4.9， 经中间体检 测、 过滤、 灌封、 灭菌、 灯检， 即得小容量注射液。
实施例 9
处方 ：
银杏内酯提取物 5g
银杏黄酮提取物 6g
氯化钠 900g
葡甲胺 适量
注射用水 100000ml
制法 ： 取总量 50％的注射用水， 加入处方量的氯化钠， 加入适量活性炭 (0.05％ )， 煮沸半小时 ； 闭汽， 冷却至 50-60℃。脱炭， 过滤至澄清。加入处方量的银杏内酯提取物、 银 杏黄酮提取物， 搅拌中加入葡甲胺调节至全溶 (pH 约 8)， 搅拌 30 分钟， 再加入注射用水至全 量， 搅拌均匀， 测定中间体含量， 测 pH 值合格后， 过滤、 再经 0.22μm 微孔滤膜精滤后灌装， 扎盖， 121℃灭菌 8 分钟， 即得大容量注射液。
实施例 10
处方 ：
银杏内酯提取物 6g
银杏黄酮提取物 5g
吐温 -80 5ml
甘露醇 25g
丙二醇 500ml
注射用水 500ml
制法 ： 称取处方量的银杏内酯提取物、 银杏黄酮提取物， ， 加 500ml 丙二醇溶解， 充 分搅拌至完全溶解， 加入 5ml 吐温 -80， 再加入 500ml 注射用水和 25g 甘露醇， 调节溶液 pH 值 5.0， 加入 0.05％ (w/v) 活性炭， 充分搅拌， 过滤脱炭， 经 0.22μm 微孔滤膜过滤除菌， 灌 装于管制低硼硅玻璃管制注射剂瓶中， 盖上丁基橡胶塞， 放入冻干机中进行冷冻干燥， 压紧 瓶塞取出样品， 铝盖压口， 包装即得粉针剂。 银杏黄酮和银杏内酯不同剂量配比的药效学初筛试验资料
一、 实验目的 ：
研究银杏黄酮提取物 ( 三个剂量 0.36mg/kg， 1.44mg/kg， 5.76mg/kg) 和银杏内酯 提取物 ( 三个剂量 0.72mg/kg， 1.44mg/kg， 4.8mg/kg) 不同剂量配比的初步药效学作用， 为 受试药的继续开发提供实验依据。
二、 实验材料 ：
1、 药品和试剂 ：
名称 ： 银杏黄酮提取物， 含量 30％ ( 以总黄醇苷计 ) ； 银杏内酯提取物， 含量 90％。
药物配制 ： 临用前将受试药物用 0.5 ％羧甲基纤维素钠 (0.5 ％ CMC-Na) 研磨配 制成所需浓度的均匀混悬溶液。1 ∶ 8 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.144mg/ml 和银杏内酯 1.152mg/ml 的均匀混悬液。第 1 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.036mg/ml 和银杏内酯 0.072mg/ ml 的均匀混悬液。第 2 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.036mg/ml 和银杏内酯 0.144mg/ml 的均 匀混悬液。第 3 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.036mg/ml 和银杏内酯 0.48mg/ml 的均匀混悬液。 第4组： 配制成含银杏黄酮 0.144mg/ml 和银杏内酯 0.072mg/ml 的均匀混悬液。第 5 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.144mg/ml 和银杏内酯 0.144mg/ml 的均匀混悬液。第 6 组 ： 配制成含 银杏黄酮 0.144mg/ml 和银杏内酯 0.48mg/ml 的均匀混悬液。第 7 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.576mg/ml 和银杏内酯 0.072mg/ml 的均匀混悬液。第 8 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.576mg/ ml 和银杏内酯 0.144mg/ml 的均匀混悬液。第 9 组 ： 配制成含银杏黄酮 0.576mg/ml 和银杏 内酯 0.48mg/ml 的均匀混悬液。
复方丹参片 ： 河南辅仁堂制药有限公司生产， 批号 ： Z20073091。
药物配制 ： 临用前用 0.3％ CMC-Na 研磨配制成 43.5mg/ml 的均匀混悬液。
垂体后叶素注射液 ： 南京新百药业有限公司生产规格 ： 6U/ml， 批号 ： 090201， 临用 前用 0.9％氯化钠注射液稀释配制成浓度为 0.7U/ml 的药液。
乌来糖 ： 上海青析化工科技有限公司生产， 批号 ： 071123。
羧甲基纤维素钠 ： 国药集团化学试剂有限公司， 批号 ： 30036328。
0.9％氯化钠注射液 ： 四川科伦药业股份有限公司， 批号 ： L1100109D
氯化钠 ： 南京化学试剂有限公司， 批号 ： 09011960030
磷酸二氢钾 ： 南京化学试剂有限公司， 批号 ： 080760460
氯化钾 ： 上海凌峰化学试剂有限公司， 批号 ： 080710
磷酸氢二钠 ： 上海凌峰化学试剂有限公司， 批号 ： 090902
水合氯醛 ： A.R， 国药集团化学试剂有限公司， 批号 ： 20090724， 规格 ： 250g/ 瓶 ( 使 用时用 0.9％氯化钠注射液配制成浓度为 3％的溶液 )。
2， 3， 5- 三苯基氯化四氮唑 ： A.R， 国药集团化学试剂有限公司， 批号 ： F20090317， 规格 ： 10g/ 瓶 ( 临用前用磷酸缓冲溶液配制成浓度为 1％的溶液 )。
2、 实验仪器 ： ECG-6511 型心电图机 ： 上海光电医用电子仪器有限公司生产。
HH-2 数显恒温水浴锅 ： 国华电器有限公司产品。
BS 224s 型电子天平 ： 北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱， 上海精宏实验设备有限公司产品。
3、 实验动物
SD 大鼠， 雌雄各半， 227-287g， 由浙江省实验动物中心和中国人民解放军南京军区 医学动物实验中心提供， 许可证号 ： SCXK( 浙 )20080033， SCXK( 军 )2007-012， 用于心肌缺血 试验。
雄性清洁级 SD 大鼠， 体重 250 ～ 300g， 浙江省实验动物中心提供， 动物质量合格证 号： SCXK( 浙 )2008-0033， 用于脑缺血试验。
饲料 ： 颗粒饲料， 由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。
四、 实验方法和结果 ： 2]
1、 对垂体后叶素所致心肌缺血大鼠心电图的影响 [1，
取体重 227-287g SD 大鼠 120 只， 按体重随机分为 12 组， 每组 10 只， 雌雄各半。 分 别为模型对照组、 阳性对照组、 1 ∶ 8 组、 第 1 组、 第 2 组、 第 3 组、 第 4 组、 第 5 组、 第 6 组、 第 7 组、 第 8 组、 第 9 组。各组给药剂量如下 ：
阳性对照药组 ： 复方丹参片 435mg/kg ；
1∶8组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (1.44mg/kg ： 11.52mg/kg) ；
第1组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (0.36mg/kg ： 0.72mg/kg) ；
第2组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (0.36mg/kg ： 1.44mg/kg) ；
第3组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (0.36mg/kg ： 4.8mg/kg) ；
第4组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (1.44mg/kg ： 0.72mg/kg) ；
第5组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (1.44mg/kg ： 1.44mg/kg) ；
第6组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (1.44mg/kg ： 4.8mg/kg) ；
第7组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (5.76mg/kg ： 0.72mg/kg) ；
第8组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (5.76mg/kg ： 1.44mg/kg) ；
第9组： 银杏黄酮 ： 银杏内酯 (5.76mg/kg ： 4.8mg/kg) ；
各组给药容积均为 1ml/100g ； 模型对照组给予等容积的 0.5％ CMC-Na。每天灌胃 给药一次， 连续 5 天， 末次给药后 20min， 将大鼠用 20％乌拉坦以 1.2g/kg 的剂量腹腔注射 麻醉后， 仰卧位固定， 分离一侧股静脉， 记录一段正常 II 导心电图， 观察 R-R 间期 ( 心率 ) [1] ， J 点及 T 波的高度， 然后静脉推注垂体后叶素 0.7u/kg(0.7U/ml)， 10 秒内推完 [2]， 于注 射前 (0sec) 及注射后 5sec、 10sec、 30sec、 1min、 2min、 5min、 10min、 20min 记录 II 导联心电 图。将注射垂体后叶素后各时间点心电图各指标数值与注射前进行自身前后 t 检验比较， 并进行给药前后差值的组间 t 检验比较， 结果见表 1-3。
由表 1 可见， 模型对照组大鼠静脉注射垂体后叶素后 5 秒至 20 分钟 J 点显著抬高 (P ＜ 0.01)， 表明造模成功。 注射垂体后叶素后各时间点心电图 J 点高度减去注射前 (0sec)J 点高度的差值与模型对照组比较 ： 8 ∶ 1 组在各个时间点均能极显著性抑制 J 点抬高 (P ＜ 0.01) ； 第 2 组在造模后 5s、 10s 能显著性抑制 J 点抬高 (P ＜ 0.05) ； 第 3 组在造模后 5s、 10s、 5min 能显著性抑制 J 点抬高 (P ＜ 0.05) ； 第 4 组和第 5 组在造模后 5s、 10s、 30s、 1min 能显著性抑制 J 点抬高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 6 组在造模后 5s、 10s、 30s、 1min、 5min 能显著性抑制 J 点抬高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 7 组在造模后 5s、 10s、 30s、 1min 能 显著性抑制 J 点抬高 (P ＜ 0.05) ； 第 8 组和第 9 组在造模后各时间点均能极显著性抑制 J 点抬高 (P ＜ 0.01)。与阳性药组比较 ： 8 ∶ 1 组在造模后 10s、 5min、 20min 较阳性药组有显 著性优势 (P ＜ 0.05) ； 第 9 组在造模后各时间点较阳性药组均存在显著性优势 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)。与 1 ∶ 8 组相比 ： 第 9 组在造模后 30s、 1min、 2min、 5min、 10min 较 1 ∶ 8 组存 在显著性优势 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)。与第 8 组 (4 ∶ 1) 相比， 第 9 组在造模后 10s、 30s、 1min 能够明显抑制 J 点抬高， 差异显著 (P ＜ 0.05)。
由表 2 可见， 模型对照组大鼠静脉注射垂体后叶素后 5 秒以后各时间点 T 波与给 造模剂之前比较显著升高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)， 表明造模成功。 由各给药组注射垂体后叶 素后诸时间点与注射之前 T 波差值与模型组差值的组间比较可知 ： 8 ∶ 1 组在各个时间点 均能极显著性抑制 T 波抬高 (P ＜ 0.01) ； 第 1 组在造模后 5s、 10s、 2min 至 5min 能显著性 抑制 T 波抬高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 2 组在造模后 5s、 10s、 20min 能显著性抑制 T 波抬 高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 3 组在造模后 5s 至 1min 能显著性抑制 T 波抬高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 4 组在造模后 5s、 10s、 20min 能显著性抑制 T 波抬高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 5 组在造模后 5s、 10s、 30s、 1min、 2min、 5min、 20min 能显著性抑制 T 波抬高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 6 组和第 7 组在造模后 5s、 10s、 30s、 20min 能显著性抑制 T 波抬高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 8 组和第 9 组在造模后各时间点均能极显著性抑制 T 波抬高 (P ＜ 0.01)。 与阳性药组比较 ： 1 ∶ 8 组在造模后 1min、 2min、 10min、 20min 较阳性药组有显著性优势 (P ＜ 0.05) ； 第 9 组在造模后各时间点较阳性药组均存在显著性优势 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 其他各组没有表现出显著性差异。 各给药组与 1 ∶ 8 组进行组间比较 ： 只有第 9 组在造模后 5s、 10s、 10min、 20min 较 1 ∶ 8 组存在显著性优势 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)， 其他各组均未表 现出显著性差异。与第 8 组 (4 ∶ 1) 相比， 第 9 组在造模后 5s、 10s、 30s、 1min、 2min、 5min、 10min、 20min 能够明显抑制 T 波抬高， 差异显著 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)。
由表 3 可见， 模型对照组大鼠静脉注射垂体后叶素后 5 秒以后各时间点与给造模 剂之前比较 R-R 间期延长 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)。各给药组给垂体后叶素前后诸时间点与 注射之前单个 R-R 间期差值与模型组的组间比较发现 ： 8 ∶ 1 组在各个时间点均能极显著 性抑制 R-R 间期延长 (P ＜ 0.01) ； 第 1 组在造模后 5s、 1min 至 20min 能显著性抑制 T 波抬 高 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 2 组在造模后 5s、 10min、 20min 能显著性抑制 R-R 间期延长 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 3 组在造模后 5s、 10s、 1min、 5min、 10min、 20min 能显著性抑制 R-R 间期延长 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 4 组在造模后 5s、 10s、 30s、 1min 能显著性抑制 R-R 间 期延长 P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 5 组在造模后各时间点均显著性抑制了 R-R 间期延长 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05) ； 第 6 组和第 7 组在造模后 5s 显著性抑制 R-R 间期延长 (P ＜ 0.05) ； 第 8 组在造模后 1min、 5min、 10min、 20min 能极显著性抑制 R-R 间期延长 (P ＜ 0.01) ； 第9 组在各个时间点均能极显著性抑制 R-R 间期延长 (P ＜ 0.01)。与阳性药组比较 ： 8∶1组 在造模后 5s、 2min 至 20min 较阳性药组有显著性优势 (P ＜ 0.05) ； 第 9 组在造模后各时间点较阳性药组均存在极显著性优势 (P ＜ 0.01) ； 其他各组没有表现出显著性差异。各给药 组与 1 ∶ 8 组进行组间比较 ： 只有第 9 组在造模后 30s、 5min、 10min、 20min 较 1 ∶ 8 组存在 显著性优势 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)， 其他各组均未表现出显著性差异。与第 8 组相比， 第9 组在造模后 5s、 10s、 30s、 1min、 2min、 5min、 10min、 20min 能够明显抑制 R-R 间期延长， 差异 显著 (P ＜ 0.01)。
2、 对大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO) 再灌所致局灶性脑缺血实验研究 [3-5]
SD 大鼠， 130 只， 体重 250-300g， 参考 Longa[3][4] 等人的方法， 采用颈内动脉线栓 法制备大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO) 模型 ： 大鼠用 3％水合三氯乙醛 (300mg/kg) 腹腔注射 (ip) 麻醉， 仰卧手术台上， 颈部正中切口， 暴露右侧颈总动脉， 向外牵引二腹肌及胸锁乳突 肌， 由颈总动脉分叉处向头端依次游离， 结扎并剪断颈外动脉的分支 ： 枕骨下动脉和甲状腺 上动脉。在颈外动脉远端结扎， 切断颈外动脉使其主干游离备用。然后分离颈内动脉， 用丝 线在颈外动脉根部打一松扣， 夹闭颈总动脉和颈内动脉。 将渔线 ( 长 40mm， 直径 0.26mm) 经 颈外动脉主干切口， 缓慢向颈内动脉入颅方向推进， 当渔线进入颈内动脉后松开颈内动脉 上的动脉夹。以颈总动脉分叉处为标记， 推进 18mm 左右时感到阻力， 即达到了较细的大脑 前动脉内， 阻断了 MCA 的所有血供来源， 扎紧颈外动脉根部松扣。 2h 后， 拔出尼龙线， 扎紧动 脉残端。缝合皮肤， 完成 MCAO 导致局灶性脑缺血 - 再灌模型。假手术组大鼠麻醉后， 仅暴 露颈内外动脉分叉， 不闭塞 MCA。动物分为 13 组， 分别为两因素三水平正交设计 9 组 ( 第 1 组 - 第 9 组 )， 1 ∶ 8 配比组， 阳性对照组 ( 金纳多 )， 假手术组及缺血模型对照组。每组 8 只。于再灌后 1h 各组给药， 一日给药 3 次， 相邻两次间隔 4 小时， 给药剂量及给药容积同实 验 1。末次给药后 24h 检测以下指标 ： 神经行为学评分、 脑含水量 (％ )、 梗塞率 (％ )。
渔线的制备 ： 将一长 40mm， 直径 0.26mm 的渔线的一端用记号笔标记， 在距离此标 记端 18mm 处用记号笔再做一标记， 置于生理盐水中备用。
末次给药后 24h 按 Bederson[5] 的方法对动物的行为缺陷进行分级评分， 标准如 下：
0分： 未观察到神经症状 ；
1分： 提尾悬空时， 动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲， 肩内旋， 肘外展， 紧贴胸 壁；
2分： 将动物置于光滑平面上， 推手术侧肩向对侧移动时， 阻力降低 ；
3分： 动物自由行走时向手术对侧环转或转圈 ；
4分； 软瘫， 肢体无自发活动。
神经功能评分后， 将大鼠麻醉， 暴露脑并测脑温， 之后断头处死大鼠， 取出全脑称 重。 在视交叉及其前后各 2mm 处， 做冠状切四刀， 切成五片后迅速将脑片置 5ml 含有 1％ TTC 的磷酸缓冲溶液中， 避光温孵 30 分钟， 在温孵过程中每隔 7 ～ 8 分钟翻动一次， 温孵 30 分钟 后取出脑片， 用数码相机拍照， 之后用眼科镊分离苍白区 ( 梗塞区 ) 和非苍白区 ( 正常区 )， 计算梗塞百分比如下 ：
梗塞百分比 (％ ) ＝苍白区重量 /( 苍白区重量 + 非苍白区重量 )×100％
将染色后的脑组织置于 110℃烘箱烘干， 对照大脑湿重求出脑含水量如下 ：
脑组织含水量 (％ ) ＝ (1- 脑组织干重 / 脑组织湿重 )×100％
结果见表 4。表 4 对大脑中动脉闭塞再灌所致局灶性脑缺血大鼠神经行为、 脑梗塞率、 脑含水 量的影响 ( n ＝ 8)
# ## △ *p ＜ 0.05， **p ＜ 0.01vs， 模型对照组 ； p ＜ 0.05， p ＜ 0.01vs.1 ∶ 8 组 ； p ◆ ＜ 0.05， vs 金纳多组。 p ＜ 0.05， vs 第 8 组。
由表 4 可见， 与模型对照组相比， 第 8、 9 组和 1 ∶ 8 组可极显著降低脑缺血大鼠的 神经行为学评分 (p ＜ 0.01)， 金纳多和第 6 组可显著降低脑缺血大鼠的神经行为学评分 (p ＜ 0.05) ； 金纳多、 第 8、 9 组和 1 ∶ 8 组可极显著降低脑缺血大鼠的脑梗塞率 (p ＜ 0.01)， 第 6 组可显著脑缺血大鼠的脑梗塞率 (p ＜ 0.05) ； 第 9 组可极显著降低脑水肿 (p ＜ 0.01)， 金 纳多、 第 6、 8 和 1 ∶ 8 组可显著降低脑水肿 (p ＜ 0.05)。将第 9 组分别与金纳多组、 1∶8 组、 第 8 组进行组间显著性 t 检验比较， 该组动物的神经行为学评分和脑梗塞率均显著低于 上述 3 组 (p ＜ 0.05)。
四、 试验结论
垂体后叶素所致大鼠急性心肌缺血实验结果表明 ： 复方丹参片、 1 ∶ 8 组和 9 个受 试药组对垂体后叶素所致的大鼠心肌缺血的 J 点抬高、 T 波上升和 R-R 间期延长有不同程 度的改善作用 (P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)。其中第 9 组效果显著好于 1 ∶ 8 组及第 8 组 (4 ∶ 1 组 )(P ＜ 0.01， P ＜ 0.05)。
大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO) 再灌所致局灶性脑缺血实验结果表明 ： 于 MCAO 后 2h 进行再灌， 再灌后 1h 开始灌胃给药， 一日内给药 3 次， 与模型对照组相比， 金纳多组、 第 6、 8、 9 组和 1 ∶ 8 组可显著降低脑缺血大鼠的神经学评分、 脑梗塞率和脑含水量 ； 与 1 ∶ 8 剂量 组相比， 其中第 9 组脑缺血大鼠的神经学评分、 脑梗塞率显著低于 1 ∶ 8 组及第 8 组 (4 ∶ 1 组 )(P ＜ 0.05)。
上述结果表明， 第 9 组疗效显著好于阳性对照药组、 1 ∶ 8 组和第 8 组， 提示其值得 进一步开发。
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