一种创制梨 100% 自花结实性种质的方法 一、 技术领域
本发明提供了一种创制梨 100％自花结实性种质的方法， 属于遗传育种学领域， 建 立了简捷、 快速创制梨自花结实性种质的技术体系， 在果树自花结实性品种 ( 株系 ) 的选育 中有着重要的推广价值。 二、 背景技术
梨是我国乃至世界主要水果之一， 我国现有栽培面积 125.84 万公顷， 是我国的第 三大水果。梨是典型的配子体型自交不亲和性果树， 也就是说梨绝大多数品种自花授粉不 结实性， 在生产中必须合理配置授粉树或进行人工辅助授粉， 才有可能获得应有的产量， 也 常常因授粉树配置不当、 花期不良气象条件影响昆虫传粉或人工授粉不及时等原因造成减 产， 尤其是近年来地球气候变化激烈， 春季倒春寒以及花期低温阴雨天气影响昆虫的传粉 活动， 使得许多梨树授粉受精不良， 坐果率低下， 严重影响产量。如果所栽培的梨品种自花 授粉能结实的话， 就能避免或减少因传粉媒介昆虫的不活动而造成授粉受精不良、 坐果率 低下、 产量受损的问题， 尤其是对于保护地栽培的果树来说更为重要。因此， 创新梨自花结 实性种质， 选育出梨自花结实性 ( 自交亲和性 ) 品种是个亟待解决的问题， 也是今后梨、 苹 果等自花授粉不结实性果树新品种选育的目标之一。鉴于此， 各国的梨育种学家已经把培 育自花结实性品种作为育种目标， 但是进展比较缓慢。 ‘奥嗄二十世纪’ 为自花结 实性梨品种， 其雌蕊 基因发生变异， 导致雌蕊自交不亲和性功能丧失， 花粉自交 不亲和性功能正常， 因而是培育自花结实性后代的理想材料。日本已经利用 ‘奥嗄二十世 纪’ 作亲本， 培育出自花结实性优良品种 ‘秋荣’ 早期以 ‘奥嗄二十世纪’ 和 ‘秋荣’ 为亲本培育自花结实性种质， 杂交后代中既有自花结实性株系， 又有自 花不结实性株系， 需经过筛选， 只有携带 基因的株系 ( a ≠ 4) 才表现为自花结 实。
正是由于自花结实性品种在栽培上有着良好的应用前景， 所以寻找一种快速、 准 确创制梨自花结实性后代株系 ( 品种等 ) 的方法显得尤为重要。本发明提供了一种创制 梨 100 ％自花结实性种质的方法， 利用 ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代纯合体株系 ‘54S-135’ 作父本， 另一个品种 (SaSb， a、 b ≠ 4) 为母本进行杂交授粉， 根据基因的分离规律， 在其杂交后代中均携带自花结实性基因 故无需筛选， 只要能得到 后代株系即 为自花结实性种质。本技术体系简便快捷， 为自花结实性优良梨品种的选育节约了育种成 本， 缩短了育种进程。 该理论体系还可借鉴应用于其他作物自花结实种质的创制， 因此有着 广返的应用价值和推广前景。 三、 发明内容
技术问题
本发明的目的是 ： 提供了一种创制梨 100％自花结实性种质的方法。利用 ‘奥嗄 二十世纪’ 自交后代纯合体株系 ‘54S-135’ 作父本， 另一个品种 (SaSb， a、 b ≠ 4)为母本， 进行杂交授粉， 得到后代株系即为自花结实性种质。
技术方案
创制梨 100％自花结实性种质的方法， 其特征在于 ： sm
1) 田间授粉实验 ： 以基因型为 S2S4 的 ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代 S 基因纯合体 株系 ‘54S-135’ 为父本， 春季采集其大蕾期花苞的花药， 室内 25℃干燥条件下散出 的花粉， 于开花前 1 天选用另一个基因型为 SaSb， a、 b ≠ 4 品种为母本， 对拟授粉的花蕾去雄 后， 人工授予 ‘54S-135’ 花粉， 每个组合授粉 200 朵左右的花序， 再套上硫酸纸袋， 授粉后 25 天调查花序和花朵坐果率， 每花序留 1 ～ 2 个果， 种子成熟后采果并取出种子， 沙藏育苗 ；
2) 基因的鉴证 ： 用梨自花结实性 基因特异正反向引物 sm
S4 F ： 5′ -TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3′ sm
S4 R ： 5′ -GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3′
扩增杂交后代各株系的基因组 DNA， 若能扩增出一条 666bp 的片段， 则标记着该植 株中含有 基因的存在， 由于后代中各植株中均携带自花结实性基因 S4sm-RNase， 故所得后代均为自花结实性株系。
有益效果 本发明所提供的一种创制梨 100％自花结实性种质的方法， 具有以下优点 ：
(1) 本发明的方法简便、 快捷。 该方法所得到的杂交后代的自花结实性无需通过其 它方法的辅助鉴定和筛选， 由于各株系中均携带自花结实性基因 S4sm-RNase， 只要能从杂交 种中繁育出株系即可得到自花结实性种质。 整个技术体系只涉及简单的人工杂交授粉和育 苗工作， 操作流程简便易行， 为选育工作节约了成本， 缩短了进程。 sm
(2) 本发明的准确度高。自花结实 S4 -RNase 基因与控制花粉自花不结实基因的 遗传距离为 0， 它在后代中没有发生遗传重组， 各株系中均检测出 S4sm-RNase 基因， 证实 了 该育种方法的准确率为 100％。
(3) 该发明还可借鉴应用于其他作物的自花结实性种质的创制。只要能得到作物 某一自花结实基因纯合体株系， 运用该技术体系进行杂交育种即可在短时间内大量繁育出 自花结实性株系， 因此有着广返的应用价值和推广前景。
四、 附图说明 ：
图 1 创制梨 100％自花结实性种质方法的技术路线
图 2 新高 株杂交后代
A： 梨 S 基因保守区序列引物扩增， B： 梨 特异引物扩增 五、 具体实施方式 ：
( 一 ) 实验方法
本研究以新高 (S3S9) 为母本试材， ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代 S 基因纯合 sm sm 体株系 ‘54S-135’ (S4 S4 ) 为父本进行杂交创制梨自花结实性种质， 具体技术流程如下 ：
1、 田间授粉实验
在 ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代中， 选择 S 基因型为 S4smS4sm 品系定名 ‘54S-135’ 。春 季采集 ‘54S-135’ 大蕾期花苞的花药， 室内 25℃条件下使其散粉， 收集花粉以备作授粉使用。于开花前 1 天为 ‘新高’ ( 该品种的 S 基因型为 S3S9， 现为我国主要栽培的砂梨品种之 一， 购自中国农业科学院兴城果树研究所梨种质资源圃 ) 去雄， 授以 ‘54S-135’ 花粉 200 朵 左右的花序， 再套上硫酸纸袋。授粉后 25d 调查花序和花朵坐果率， 每花序留 1 ～ 2 个果， 种子成熟后采果并取出种子， 沙藏育苗。
2、 杂交后代各株系 S 基因型的鉴定
(1)CTAB 法 ( 张妤艳， 黄绍西， 张绍铃， 等 . 京白梨等品种 S 基因型鉴定及新基因 S28、 S30 的核苷酸序列分析 [J]. 园艺学报， 2006， 33(3) ： 496-500) 提取各后代株系幼叶的基 因组 DNA。
(2) 引 物 合 成 ： 合 成 梨 S 基 因 保 守 区 序 列 引 物 PF(5′ -GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′ ) 和 PR(5′ -CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′ ) 以及 梨自花结实性 基因特异正反向引物 (5’ -TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3’ ) 和 (5’ -GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3’ ( 引物序列参照本课题组张绍铃， 吴华清， 齐永杰 等 . 快速鉴定梨自花结实性植株的分子标记法 [Z].CN101565748 ： ， 2009)
(3) 用梨 S 基因保守区序列引物 PF、 PR 和 特异引物 分 别对各后代株系基因组 DNA 进行扩增 ：
反应体系总体积均为 25μL ： 10×PCR Buffer 2.5μL 3.0mM MgCl2， 0.2mM dNTP， 各引物 0.1μM， 20-50ng 模板， Taq 酶 1.0U ；
S 基 因 保 守 区 序 列 引 物 PCR 扩 增 所 用 程 序 为 ： 94 ℃ 预 变 性 2min， 94 ℃ 15s， 48℃ 30s， 72℃ 3min， 10 个循环后， 94℃变性 15S， 48℃退火 30S， 72℃ 3.5min， 25 个循环后 72℃延伸 7min ；
基因的特异引物 PCR 扩增所用程序为 ： 94 ℃预变性 2min， 94 ℃， 15s， 65℃， 30s， 72℃ 3min， 10 个循环后， 94℃变性 15S， 65℃退火 30S， 72℃， 3.5min， 25 个循环后 72℃延伸 7min ；
应用 PTC-200 扩增仪 (BIO-RAD) 进行扩增 ；
(4) 反应结束后取 PCR 产物 5μl， 用 1.5％的琼脂糖凝胶在 80V 电压条件下电泳 45 分钟， 检测 PCR 产物。EB 染色， 在紫外灯下观测， 拍照。
( 二 ) 结果与分析 ：
如图 2-A 所示， 由于 单元型中 S4-RNase 基因发生了缺失， 故用 S 基因保守区 序列引物 PF 和 PR 不能扩增出 基因， 只能从各株系的基因组 DNA 中扩增出另 一个 S 基因， 即大小为 1347bp 的 S9-RNase 基因， 或大小为 384bp 的 S3-RNase 基因。通过 sm sm 的特异引物 S4 F 和 S4 R 扩增各株系的基因组 DNA， 若能扩增出一条 666bp 的片 段， 则标记着该植株中含有 基因的存在。如图 2-B 所示， 31 株杂交株系中均能 扩增出 基因， 故所得后代均为自花结实性株系。这与我们理论推测的结果保持 一致， 证实了该育种方法的可行性和准确性。 最终确定了 31 株杂交后代中 S3S4sm ∶ S9S4sm ＝ 16 ∶ 15 ≈ 1 ∶ 1， 符合基因分离规律。
本发明提供了一种创制梨 100％自花结实性种质的方法， 属于遗传育种学领域， 建 立了简捷、 快速创制梨自花结实性种质的技术体系， 在果树自花结实性品种 ( 株系 ) 的选育 中有着重要的推广价值。 二、 背景技术
梨是我国乃至世界主要水果之一， 我国现有栽培面积 125.84 万公顷， 是我国的第 三大水果。梨是典型的配子体型自交不亲和性果树， 也就是说梨绝大多数品种自花授粉不 结实性， 在生产中必须合理配置授粉树或进行人工辅助授粉， 才有可能获得应有的产量， 也 常常因授粉树配置不当、 花期不良气象条件影响昆虫传粉或人工授粉不及时等原因造成减 产， 尤其是近年来地球气候变化激烈， 春季倒春寒以及花期低温阴雨天气影响昆虫的传粉 活动， 使得许多梨树授粉受精不良， 坐果率低下， 严重影响产量。如果所栽培的梨品种自花 授粉能结实的话， 就能避免或减少因传粉媒介昆虫的不活动而造成授粉受精不良、 坐果率 低下、 产量受损的问题， 尤其是对于保护地栽培的果树来说更为重要。因此， 创新梨自花结 实性种质， 选育出梨自花结实性 ( 自交亲和性 ) 品种是个亟待解决的问题， 也是今后梨、 苹 果等自花授粉不结实性果树新品种选育的目标之一。鉴于此， 各国的梨育种学家已经把培 育自花结实性品种作为育种目标， 但是进展比较缓慢。 ‘奥嗄二十世纪’ 为自花结 实性梨品种， 其雌蕊 基因发生变异， 导致雌蕊自交不亲和性功能丧失， 花粉自交 不亲和性功能正常， 因而是培育自花结实性后代的理想材料。日本已经利用 ‘奥嗄二十世 纪’ 作亲本， 培育出自花结实性优良品种 ‘秋荣’ 早期以 ‘奥嗄二十世纪’ 和 ‘秋荣’ 为亲本培育自花结实性种质， 杂交后代中既有自花结实性株系， 又有自 花不结实性株系， 需经过筛选， 只有携带 基因的株系 ( a ≠ 4) 才表现为自花结 实。
正是由于自花结实性品种在栽培上有着良好的应用前景， 所以寻找一种快速、 准 确创制梨自花结实性后代株系 ( 品种等 ) 的方法显得尤为重要。本发明提供了一种创制 梨 100 ％自花结实性种质的方法， 利用 ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代纯合体株系 ‘54S-135’ 作父本， 另一个品种 (SaSb， a、 b ≠ 4) 为母本进行杂交授粉， 根据基因的分离规律， 在其杂交后代中均携带自花结实性基因 故无需筛选， 只要能得到 后代株系即 为自花结实性种质。本技术体系简便快捷， 为自花结实性优良梨品种的选育节约了育种成 本， 缩短了育种进程。 该理论体系还可借鉴应用于其他作物自花结实种质的创制， 因此有着 广返的应用价值和推广前景。 三、 发明内容
技术问题
本发明的目的是 ： 提供了一种创制梨 100％自花结实性种质的方法。利用 ‘奥嗄 二十世纪’ 自交后代纯合体株系 ‘54S-135’ 作父本， 另一个品种 (SaSb， a、 b ≠ 4)为母本， 进行杂交授粉， 得到后代株系即为自花结实性种质。
技术方案
创制梨 100％自花结实性种质的方法， 其特征在于 ： sm
1) 田间授粉实验 ： 以基因型为 S2S4 的 ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代 S 基因纯合体 株系 ‘54S-135’ 为父本， 春季采集其大蕾期花苞的花药， 室内 25℃干燥条件下散出 的花粉， 于开花前 1 天选用另一个基因型为 SaSb， a、 b ≠ 4 品种为母本， 对拟授粉的花蕾去雄 后， 人工授予 ‘54S-135’ 花粉， 每个组合授粉 200 朵左右的花序， 再套上硫酸纸袋， 授粉后 25 天调查花序和花朵坐果率， 每花序留 1 ～ 2 个果， 种子成熟后采果并取出种子， 沙藏育苗 ；
2) 基因的鉴证 ： 用梨自花结实性 基因特异正反向引物 sm
S4 F ： 5′ -TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3′ sm
S4 R ： 5′ -GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3′
扩增杂交后代各株系的基因组 DNA， 若能扩增出一条 666bp 的片段， 则标记着该植 株中含有 基因的存在， 由于后代中各植株中均携带自花结实性基因 S4sm-RNase， 故所得后代均为自花结实性株系。
有益效果 本发明所提供的一种创制梨 100％自花结实性种质的方法， 具有以下优点 ：
(1) 本发明的方法简便、 快捷。 该方法所得到的杂交后代的自花结实性无需通过其 它方法的辅助鉴定和筛选， 由于各株系中均携带自花结实性基因 S4sm-RNase， 只要能从杂交 种中繁育出株系即可得到自花结实性种质。 整个技术体系只涉及简单的人工杂交授粉和育 苗工作， 操作流程简便易行， 为选育工作节约了成本， 缩短了进程。 sm
(2) 本发明的准确度高。自花结实 S4 -RNase 基因与控制花粉自花不结实基因的 遗传距离为 0， 它在后代中没有发生遗传重组， 各株系中均检测出 S4sm-RNase 基因， 证实 了 该育种方法的准确率为 100％。
(3) 该发明还可借鉴应用于其他作物的自花结实性种质的创制。只要能得到作物 某一自花结实基因纯合体株系， 运用该技术体系进行杂交育种即可在短时间内大量繁育出 自花结实性株系， 因此有着广返的应用价值和推广前景。
四、 附图说明 ：
图 1 创制梨 100％自花结实性种质方法的技术路线
图 2 新高 株杂交后代
A： 梨 S 基因保守区序列引物扩增， B： 梨 特异引物扩增 五、 具体实施方式 ：
( 一 ) 实验方法
本研究以新高 (S3S9) 为母本试材， ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代 S 基因纯合 sm sm 体株系 ‘54S-135’ (S4 S4 ) 为父本进行杂交创制梨自花结实性种质， 具体技术流程如下 ：
1、 田间授粉实验
在 ‘奥嗄二十世纪’ 自交后代中， 选择 S 基因型为 S4smS4sm 品系定名 ‘54S-135’ 。春 季采集 ‘54S-135’ 大蕾期花苞的花药， 室内 25℃条件下使其散粉， 收集花粉以备作授粉使用。于开花前 1 天为 ‘新高’ ( 该品种的 S 基因型为 S3S9， 现为我国主要栽培的砂梨品种之 一， 购自中国农业科学院兴城果树研究所梨种质资源圃 ) 去雄， 授以 ‘54S-135’ 花粉 200 朵 左右的花序， 再套上硫酸纸袋。授粉后 25d 调查花序和花朵坐果率， 每花序留 1 ～ 2 个果， 种子成熟后采果并取出种子， 沙藏育苗。
2、 杂交后代各株系 S 基因型的鉴定
(1)CTAB 法 ( 张妤艳， 黄绍西， 张绍铃， 等 . 京白梨等品种 S 基因型鉴定及新基因 S28、 S30 的核苷酸序列分析 [J]. 园艺学报， 2006， 33(3) ： 496-500) 提取各后代株系幼叶的基 因组 DNA。
(2) 引 物 合 成 ： 合 成 梨 S 基 因 保 守 区 序 列 引 物 PF(5′ -GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG-3′ ) 和 PR(5′ -CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT-3′ ) 以及 梨自花结实性 基因特异正反向引物 (5’ -TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC-3’ ) 和 (5’ -GCCTTAAGGGTTCATTGGGC-3’ ( 引物序列参照本课题组张绍铃， 吴华清， 齐永杰 等 . 快速鉴定梨自花结实性植株的分子标记法 [Z].CN101565748 ： ， 2009)
(3) 用梨 S 基因保守区序列引物 PF、 PR 和 特异引物 分 别对各后代株系基因组 DNA 进行扩增 ：
反应体系总体积均为 25μL ： 10×PCR Buffer 2.5μL 3.0mM MgCl2， 0.2mM dNTP， 各引物 0.1μM， 20-50ng 模板， Taq 酶 1.0U ；
S 基 因 保 守 区 序 列 引 物 PCR 扩 增 所 用 程 序 为 ： 94 ℃ 预 变 性 2min， 94 ℃ 15s， 48℃ 30s， 72℃ 3min， 10 个循环后， 94℃变性 15S， 48℃退火 30S， 72℃ 3.5min， 25 个循环后 72℃延伸 7min ；
基因的特异引物 PCR 扩增所用程序为 ： 94 ℃预变性 2min， 94 ℃， 15s， 65℃， 30s， 72℃ 3min， 10 个循环后， 94℃变性 15S， 65℃退火 30S， 72℃， 3.5min， 25 个循环后 72℃延伸 7min ；
应用 PTC-200 扩增仪 (BIO-RAD) 进行扩增 ；
(4) 反应结束后取 PCR 产物 5μl， 用 1.5％的琼脂糖凝胶在 80V 电压条件下电泳 45 分钟， 检测 PCR 产物。EB 染色， 在紫外灯下观测， 拍照。
( 二 ) 结果与分析 ：
如图 2-A 所示， 由于 单元型中 S4-RNase 基因发生了缺失， 故用 S 基因保守区 序列引物 PF 和 PR 不能扩增出 基因， 只能从各株系的基因组 DNA 中扩增出另 一个 S 基因， 即大小为 1347bp 的 S9-RNase 基因， 或大小为 384bp 的 S3-RNase 基因。通过 sm sm 的特异引物 S4 F 和 S4 R 扩增各株系的基因组 DNA， 若能扩增出一条 666bp 的片 段， 则标记着该植株中含有 基因的存在。如图 2-B 所示， 31 株杂交株系中均能 扩增出 基因， 故所得后代均为自花结实性株系。这与我们理论推测的结果保持 一致， 证实了该育种方法的可行性和准确性。 最终确定了 31 株杂交后代中 S3S4sm ∶ S9S4sm ＝ 16 ∶ 15 ≈ 1 ∶ 1， 符合基因分离规律。
如果母本中存在 S4 的基因型， 那么和 S4smS4sm 做父本杂交就会在后代中出现 S4S4sm 基因型的植株存在， 虽然含有 基因， 但 S4 单元型花粉的自交不亲和性功能正常， 其表型依然为自花授粉不结实。为了避免这种情况的发生， 我们在选择母本时就针对性的 选择 SaSb， a、 b ≠ 4 的基因型做母本， 这样就能很好的排除 S4S4sm 基因型植株的存在， 只要能得到后代株系， 无需筛选， 即为自花结实性种质， 这大大节约了育种成本， 缩短了育种进程， 为自花结实性优良梨品种的选育带来了很大的方便。6101982063 A CN 101982065
序列表1/2 页
7101982063 A CN 101982065序列表2/2 页