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一种大豆AOC类酶及其编码基因与应用
    【技术领域】

    本发明涉及一种大豆AOC类酶及其编码基因与应用，属于植物基因工程领域。具体涉及与抗虫相关信号物质茉莉酸合成途径关键酶丙二烯氧化物还原酶(Allene oxide cyclase，AOC)及其编码基因与应用，并涉及来源于大豆的与茉莉酸合成相关AOC类酶GmAOC及其编码基因与其在培育抗虫植物品种中的应用。

    背景技术

    虫害是造成农作物减产的主要因素之一，据世界粮农组织(FAO)统计，在全世界范围内，每年因虫害造成的农作物损失约占总收获量的14％，损失约数千亿美元。大豆[Glycine max(L.)Merr.]作为一种重要地粮食及经济作物，多种害虫严重能够影响其产量和品质。使用至今的化学杀虫剂，即增加了农业成本，又致使许多害虫抗药性迅速增强，同时环境，食物链和水资源也受到严重污染。

    目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物抗虫性的重要方法之一。研究表明茉莉酸能激活植物体内与抗虫相关的防御基因，使植物产生蛋白酶抑制剂、次生化合物以及释放挥发物等(Ryan and Pearce，1998)。Allene oxidecyclase(AOC)是茉莉酸(EC 5.3.99.6)合成途径关键酶，它可以将不稳定底物催化成茉莉酸途径第一个稳定五环化合物。AOC类酶广泛存在于植物中，目前主要从拟南芥、苜蓿、水稻等克隆出此基因。

    提高大豆抗虫性，减少虫害对大豆产量和品质的影响，对提高农业经济效益和改善人类生活质量具有积极而深远的现实意义。

    【发明内容】

    技术问题

    本发明的目的是提供一种大豆AOC类酶及其编码基因与应用。

    技术方案

    本发明所提供的大豆AOC类酶，名称为GmAOC1，来源于大豆属大豆[Glycinemax(L.)]，是具有序列表中的SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的蛋白质。

    上述大豆AOC类酶的编码基因，其cDNA基因具有序列表中GmAOC1基因SEQ IDNO.1的DNA序列；其中，序列表中的GmAOC1基因SEQ ID NO.1由脱氧核苷酸，本序列为GmAOC1基因的读码框，编码具有序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

    含有本发明GmAOC1基因SEQ ID NO.1的表达载体是指pMDC83-GmAOC1植物过量表达载体，宿主菌是指将GmAOC1基因转入的根癌农杆菌菌株EHA105。

    扩增GmAOC1基因的引物：

    GmAOC1 ORF正向引物：5‘-ATGGCTTCCATGGGCTCTC-3’

    GmAOC1 ORF反向引物：5‘-GTTGGTGAAGTTTGGCAAA-3’；

    上述大豆GmAOC1酶及其编码基因GmAOC1基因可在培育抗虫植物中得到应用。

    有益效果

    过量表达GmAOC1的烟草与野生型烟草相比，其抗虫性显著提高，说明GmAOC1基因在提高植物抗虫性方面起着重要作用。

    本发明的GmAOC1对培育抗虫农作物，减少虫害对农作物产量的影响特别是对大豆产量的影响具有重要意义。

    利用植物表达载体，将本发明的GmAOC1的编码基因导入植物细胞，可获得抗虫转基因植株。

    使用GmAOC1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

    携带有本发明GmAOC1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

    【附图说明】

    图1为GmAOC1基因在大豆染色体位置结构示意图

    图2为含有GmAOC1的植物表达载体的部分结构示意图

    图3为转GmAOC1烟草株系与野生型烟草的叶片同时饲喂斜纹夜蛾结果示意图

    第一行：转基因烟草叶片，第二行：野生型烟草叶片

    【具体实施方式】

    下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

    下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

    一、大豆GmAOC1及其编码基因的cDNA克隆与鉴定大豆(Glycine max(L.)Merr.)材料黄皮小青豆(juanjuan Wu，et al.Constitutive overexpression ofAOS-l ike gene from soybean enhanced tolerance to insect attack intransgenic tobacco.Biotechnology letters，2008)，材料种植于网室，常规田间管理。

    以已报道的植物苜蓿(Medicago truncatula)中鉴定的AOC基因：MtAOC1(AJ308489)和MtAOC2(AJ866733)，根据物种间氨基酸序列的同源性，搜索大豆的TIGR数据库和NCBI(WGS)数据库，经过拼接，延伸后获得一条高度同源序列。其序列5’端均不完整。分别设计了5’RACE的特异性引物(GSP)和巢式引物(NGSP)，扩增后克隆测序，拼接得到包含完整ORF的序列。

    设计特异引物分别以大豆基因组及大豆嫩叶的cDNA为模板进行克隆验证。用Peimer3程序设计包含完整ORF序列的引物：

    AOC ORF正向引物：5‘-ATGGCATCATCCTCATCAA-3’

    AOC ORF反向引物：5‘-GTCAGTGAAGCCAGCAATA-3’；应用RT-PCR方法，以大豆总RNA反转合成的cDNA为模板扩增GmAOC1基因。取黄皮小青豆叶片，置于液氮中研碎，RNA提取依据TIANGEN总RNA提取试剂盒RNA Plant Extraction kit DP417进行。cDNA第一链合成依据TaKaRa试剂公司cDNA第一链合成试剂盒TaKaR a PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis KitD6110A，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板，分别用1对引物进行PCR扩增反应。25μl μl PCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(10μM)、2.5μl 10×PCR缓冲液、2.5μl Mg2+、4μl dNTP(10mM)和1.25U LA TaqDNA聚合酶，用超纯水补足25μl。反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，其程序为95℃变性5min；再94℃30sec，56℃50sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物回收后经链接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5α、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析，结果表明PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，命名为GmAOC1基因。将ORF序列与基因组序列比对后发现，如图1所示：GmAOC1基因含有两个外显子，一个内含子。

    二、GmAOC1基因编码蛋白的功能鉴定

    利用Invitrogen公司的GatewayTechnology with ClonaseTM II试剂盒，将GmAOC1基因正向插入到表达载体pMDC83(Sokolov et al(2005)A redox-regulat ed chloroplast protein phosphatase binds to starch diurnally andfunctions in its accumulation，PNAS，103：9732-9737)中，得到pMDC83-GmAOC1植物过量表达载体，图2显示了pMDC83-GmAOC1部分序列。用冻融法分别将pMDC83-GmAOC1转入根癌农杆菌菌株EHA105(Avsian-Kretchmer et al，TheSalt-Stress Signal Transd uction Pathway That Activates the gpx1 PromoterIs Mediated byIntracell ular H2O2，Diff erent from the Pathway Inducedby Extracellular H2O2，2004，Plant Physiology，135：1685-1696)中。pMDC83-GmAOC1通过农杆菌EHA105介导转化烟草，PCR检测结果表明获得56阳性植株。用转基因烟草株系和野生型烟草的叶片同时饲喂斜纹夜蛾(购于江苏省农科院)，结果如图3所示：转基因烟草叶片的损失量显著少于野生型烟草叶片的损失量，说明转基因株系与野生型烟草相比抗虫性显著提高，过量表达GmAOC1基因能提高转基因烟草的抗虫性。

    【序列表】

    <110>南京农业大学

    <120>一种大豆AOC类蛋白及其编码基因与应用

    <130>说明书

    <160>4

    <170>PatentIn version 3.1

    <210>1

    <211>765

    <212>DNA

    <213>大豆属大豆(Glycine max L.)

    <220>

    <221>GmAOC1基因读码框(ORF)

    <222>(1)..(765)

    <223>

    <400>1

    atggcttcca tgggctctct gaagatgatt tcgtccctca aactctcccg ttcaagttgt    60

    tctatctctc cccttcaaac ccaaaagcaa gtaggttcaa gtctctttca atccttccca    120

    accaaaactt taaaattctc agctacccct caagtatcta catccagaag aagtaccaac    180

    aagaccacta ccactgcatt cttcttcaat aaccaaaagc agcatcaaga ttcctcacag    240

    ccagccaaag ttcaagaact ctttgtctac gagatcaacg aacgcgaccg aggaagtcct    300

    gcatacctta ggctaagcca gaagccagtt aactctctag gagacttagt gccattcagc    360

    aacaagatat actctggaga cttgcaaaag agactaggga taactgcagg cttgtgtgtg    420

    ctcatccagc atgagcctga gaaaaagggt gatagatatg aggccattta cagcttctac    480

    tttggaaact atggccacat atcagtgcaa ggagcctatc tcacattcca agacacatat    540

    ctggcagtta caggaggctc tggaatcttt gaaggtgctt ctggacaagt gaagcttcac    600

    caacttgtgt tccctttcaa gctgttctac accttctatt tgaagggtgt tcctgatttg    660

    cctcctgaac tgcttgggaa acctgttgaa ccttcaccaa gtgttgagcc ttctcctgct    720

    gctatggcta ccgagcctca tgcctgtttg ccaaacttca ccaac                    780

    <210>2

    <211>255

    <212>PRT

    <213>大豆属大豆(Glycine max L.)

    <220>

    <221>GmAOC1蛋白序列

    <222>(1)..(255)

    <223>

    <400>2

    Met Ala Ser Met Gly Ser Leu Lys Met Ile Ser Ser Leu Lys Leu Ser

    1               5                   10                  15

    Arg Ser Ser Cys Ser Ile Ser Pro Leu Gln Thr Gln Lys Gln Val Gly

                20                  25                  30

    Ser Ser Leu Phe Gln Ser Phe Pro Thr Lys Thr Leu Lys Phe Ser Ala

            35                  40                  45

    Thr Pro Gln Val Ser Thr Ser Arg Arg Ser Thr Asn Lys Thr Thr Thr

        50                  55                  60

    Thr Ala Phe Phe Phe Asn Asn Gln Lys Gln His Gln Asp Ser Ser Gln

    65                  70                  75                  80

    Pro Ala Lys Val Gln Glu Leu Phe Val Tyr Glu Ile Asn Glu Arg Asp

                    85                  90                  95

    Arg Gly Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Leu Ser Gln Lys Pro Val Asn Ser

                100                 105                 110

    Leu Gly Asp Leu Val Pro Phe Ser Asn lys Ile Tyr Ser Gly Asp Leu

            115                 120                 125

    Gln Lys Arg Leu Gly Ile Thr Ala Gly Leu Cys Val Leu Ile Gln His

        130                 135                 140

    Glu Pro Glu Lys Lys Gly Asp Arg Tyr Glu Ala Ile Tyr Ser Phe Tyr

    145                 150                 155                 160

    Phe Gly Asn Tyr Gly His Ile Ser Val Gln Gly Ala Tyr Leu Thr Phe

                    165                 170                 175

    Gln Asp Thr Tyr Leu Ala Val Thr Gly Gly Ser Gly Ile Phe Glu Gly

                180                 185                 190

    Ala Ser Gly Gln Val Lys Leu His Gln Leu Val Phe Pro Phe Lys Leu

            195                 200                 205

    Phe Tyr Thr Phe Tyr Leu Lys Gly Val Pro Asp Leu Pro Pro Glu Leu

        210                 215                 220

    Leu Gly Lys Pro Val Glu Pro Ser Pro Ser Val Glu Pro Ser Pro Ala

    225                 230                 235                 240

    Ala Met Ala Thr Glu pro His Ala Cys Leu Pro Asn Phe Thr Asn

                    245                 250                 255

    <210>3

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工合成

    <220>

    <221>GmAOC1 ORF正向引物

    <222>(1)..(19)

    <223>

    <400>3

    atggcttccatgggctctc                                      19

    <210>4

    <211>19

    <212>DNA

    <213>人工合成

    <220>

    <221>GmAOC1 ORF反向引物

    <222>(1)..(19)

    <223>

    <400>4

    gttggtgaagtttggcaaa                                      19