微生物与4羟双氢鞘氨醇衍生物的美容组合.pdf

微生物与4-羟双氢鞘氨醇衍生物的美容组合
    【技术领域】

    本发明旨在提供用于防止和/或处理皮肤老化的特别有利的组合。

    背景技术

    表皮是一种上皮，它通常分为以下几层：由角质形成细胞形成的基底层，所述角质形成细胞特别含有皮肤干细胞并构成表皮的生发层；由位于所述基底层上的几层多角细胞构成的“刺状”层；含有一至三层被称为扁平细胞(含有特殊的细胞质内含物、透明角质颗粒)的“颗粒”层；以及最终的一组上层，称为角质层(或角化层)，它们由角质形成细胞处于它们分化末端状态的被称为角化细胞(corneocytes)构成。

    角化层或角质层是位于生物体与其环境之间界面表皮的表面层。它由角化细胞构成，该角化细胞是由表皮的角质形成细胞分化而产生的无核细胞。角化细胞富含角蛋白、并由不能渗透的脂质基质包围。依靠其蛋白质和脂质组成，角化层起到基本的皮肤阻挡层的作用。它防止微生物因子的侵入并可以使皮肤保湿(hydration)以及因此使全身保湿(hydration)。

    在皮肤老化的过程中，除了年龄对皮肤具有舒敏(relief)的公知的结果，中年以上的个体报告了许多形式的不适。这些形式的不适是由他们皮肤的阻挡作用和表皮稳态的损伤而引起的。因此，老化皮肤与年轻皮肤相比，其角化层具有降低的细胞间脂质含量，特别是在冬季期间。在角化层组成中的这种变化破坏了其物理化学的皮肤阻挡性能。最终，角化层损伤后阻挡作用的恢复速度随着年龄而减慢下来，这意味着表皮稳态作用的功能障碍(Denda，M.，2002；Ghadially，R.et al，1995；Leveque，J.L.，2001)。另外，申请人的公司发现，在这些相同的情形下，在响应于对角化层的物理或化学侵袭中，特定的基因显示出根据个体的年龄而显著不同的调节动力。尤其是发现，与年轻皮肤相比，某些基因表达的诱导在老化皮肤中减慢。

    在暴露到应激的中年以上个体中，其表达特别减慢的这些基因特别为角蛋白6B基因(KRT6B)，而且，该角蛋白6B基因的特性是从其参与的表皮修复和再生过程的观点看特别有利。

    此外，皮肤且特别是表皮的稳态由皮肤细胞的增殖与分化过程之间的精细调节的平衡而产生。这些增殖和分化过程被完美地调节：它们参与了皮肤的更新和/或再生并维持恒定皮肤厚度、特别是维持恒定表皮厚度。皮肤的这种稳态还包括保持皮肤的机械性能。

    然而，皮肤的这种稳态可以被某些生理学因素(年龄、绝经、激素等)或者环境因素(UV应激、污染、氧化应激、刺激物应激等)损害。表皮再生的潜力变得不大：基础层的细胞分化不活跃，这特别导致减慢和/或降低了表皮的更新。因此，细胞的更新不再补偿在表面所除去细胞的损失，导致表皮的萎缩和/或皮肤厚度的减少和/或弹性的损失和/或皮肤的稳定性。

    表皮稳态的更改还通过无光泽和/或很差的皮肤肤色外观反映。

    该现象会因为绝经而加强：女人抱怨她们的皮肤紧绷并变干，或者甚至出现干燥症的现象。与绝经有关的激素缺乏是伴随着，特别是伴随着新陈代谢活性的下降出现的，所述新陈代谢活性的下降导致角质形成细胞增殖的减少和表皮分化的增加。

    【发明内容】

    因此，本发明有利的是还具有能促进皮肤稳态的有用组合物，以保持和/或增加皮肤的厚度并因此而保持和/或改善皮肤的机械性能和/或促进肤色的光亮度(radiance)。

    通过发明人观察所得的知识，本发明更特别地显示出，恰好发现了特定的组合在满足这些要求时是有效的，而且特别是通过对某些基因表达的刺激作用。有利地，可以补偿某些基因表达的减慢，特别是可以补偿在皮肤老化过程中所观察的基因表达的减慢，例如对于KRT6B。

    因此，根据本发明的第一方面，本发明涉及具有护理和/或修补角蛋白物质的用途的美容组合物，该组合物含有在生理学上可接受的介质中的至少一种4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物和双歧杆菌(Bifidobacterium species)属的至少一种微生物的至少一种溶菌产物。

    根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种组合的用途、特别是美容用途，所述用途是刺激选自KRT6B或KRT10和套膜蛋白(involuerin)基因中至少一种基因表达，所述组合含有双歧杆菌属的至少一种微生物的至少一种溶菌产物和至少一种4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物。

    更特别地，本发明涉及一种组合的用途、即美容用途，所述用途是刺激皮肤老化的个体受试者的选自KRT6B、KRT10和套膜蛋白基因中至少一种基因表达，所述组合含有双歧杆菌属的至少一种微生物的至少一种溶菌产物和至少一种4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物。

    因此发现根据本发明所考虑的组合特别有利地是防止和/或补偿随着老化而观察到的KRT6B基因表达的降低。

    【附图说明】

    图1表示采用本发明的组合物与对照物处理Episkin重构表皮6小时后，对K6B，K10和INV表达量的影响结果。

    双歧杆菌属的微生物溶菌产物(如Repair Complex CLR溶菌产物)的用途可确认无疑地从EP 0043128中获知，但仅仅是用于皮肤细胞DNA修补的目的。

    就它们而言，下列文献提出了微生物、特别是益生菌微生物的基本上用于处理干燥和/或敏感皮肤以及有关条件的目的的用途，但却是以不同于溶菌产物的形式。

    因此，文献WO 02/28402说明了益生菌微生物在调节皮肤超敏感性反应方面可以具有有益的效果，超敏感性反应例如作为免疫学过程结果的炎症和过敏反应。文献EP 1609463、EP 1642570、EP 1731137和FR 2876029描述了将一种或多种益生菌微生物与用于治疗敏感皮肤的无机阳离子组合的组合物。至于文献PCT/FR2006/050768，它提出了用于治疗与干燥皮肤有关的敏感皮肤的益生菌微生物与聚不饱和脂肪酸和/或聚不饱和脂肪酸酯的组合。因此，这些文献都没有描述双歧杆菌属微生物的溶菌产物的用途，甚至很少以本发明所考虑的组合形式。

    关于4-羟双氢鞘氨醇及其盐、特别是其盐酸盐，已在皮肤病学领域提出过。实际上，对于4-羟双氢鞘氨醇，最先知道的是它的抗菌活性。因此，根据该活性，4-羟双氢鞘氨醇已经有利地用于治疗痤疮，以及根据其对皮肤上微生物的生长具有抑制活性(US 5,326,565和EP 0919226)。最近，鞘脂类衍生物、特别是4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯类型的衍生物已经被描述为显示出调节角质形成细胞分化的能力(GParagh et al；Exp Dermatol.2008 Dec；17(12)：1004-16)。就文献US 5,882,665而言，该文献提出了描述为具有作为抗痤疮药剂、抗菌剂、抗皱纹剂以及皮肤光亮剂用途的新的4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物。

    然而，对于发明人的知识，从未注意到由4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物与双歧杆菌属的溶菌产物的组合对于某些基因表达所显示出的有益作用或甚至协同作用。

    如下文中的实施例所显示，根据本发明的组合明显地刺激了KRT6B基因、以及KRT10和套膜蛋白基因的表达。特别使用重构的皮肤模型通过qRT-PCR来验证该作用。

    对于本发明的目的，该组合所显示的作用是协同作用，因为它证明了比由4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物和双歧杆菌属微生物的溶菌产物的各自作用的简单叠加所预期的作用更大。

    根据本发明的另一方面，本发明涉及上述考虑的组合的用途，该用途是加强上皮、尤其是表皮、特别是老化表皮的修补和再生能力。

    根据本发明的另一方面，本发明涉及双歧杆菌属的至少一种微生物的至少一种溶菌产物与至少一种4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物的组合在制备加强上皮、尤其是表皮、特别是老化表皮的修补和再生能力的组合物中的用途。

    如上述所显示出，这种效果特别通过刺激在皮肤老化过程中自然减慢的一个基因或多个基因表达、特别是通过刺激KRT6B表达而实现。

    根据本发明的一个方面，本发明涉及一种组合的用途、即美容用途，该用途是刺激加强上皮、尤其是表皮、特别是老化表皮的修补和再生能力的选自KRT6B、KRT10和套膜蛋白基因中至少一种基因表达，所述组合含有双歧杆菌属的至少一种微生物的至少一种溶菌产物和至少一种4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物。

    根据本发明的另一方面，本发明涉及一种处理方法、尤其是美容处理的方法，该方法包括至少给予皮肤老化的个体受试者上述考虑的组合。

    这种给予可以特别通过口服或局部给予来实现。

    本发明还涉及本发明的组合物的美容用途，尤其是所述组合物含有生理学上可接受的介质并专用于皮肤局部施用，以增加皮肤厚度、提高肤色光亮度、促进和/或改善皮肤机械性能、和/或促进和/或改善皮肤弹性和/或稳定性。

     双歧杆菌属的微生物

    如上详述，本发明的用作活性剂的双歧杆菌属微生物以溶菌产物的形式使用。

    溶菌产物通常表示一种通过以下方法获得的物质，即通过称为细胞裂解的现象使生物细胞破坏或溶解结束时，由此而引起所考虑的微生物细胞内天然含有的细胞内生物成分的释放。

    用于本发明的该目的，使用术语“溶菌产物”没有区别地表示由有关的微生物的溶解所得到的整个溶菌产物，或者仅仅是其部分。

    因此，本发明涉及双歧杆菌的溶菌产物和/或其部分的用途。

    因此，所使用的溶菌产物是由细胞内的生物成分和由细胞壁和细胞膜的成分全部或部分组成。

    更具体而言，所述溶菌产物含有细胞质的细胞部分，该细胞质的细胞部分含有酶，如乳酸脱氢酶、磷酸酶、磷酸酮醇酶和转醛醇酶、以及代谢物。用于说明目的，细胞壁成分尤其为肽聚糖、胞壁质或粘肽和磷壁酸，且细胞膜成分由甘油磷脂构成。

    这种细胞裂解可以通过各种技术来完成，例如通过超声波、或者其它在离心类型的机械压力下的渗透性冲击、热冲击。

    特别是，该溶菌产物可以根据专利US 4,464,362中描述的技术来获得，并且特别根据下列方案来获得。

    例如根据文献US 4,464,362和EP 0043128中描述的条件，将所考虑的双歧杆菌类型的微生物厌氧培养在合适的培养基中。当达到生长的稳定期时，可以通过巴氏灭菌法来灭活培养基，例如在60-65℃的温度下30分钟。然后通过常规的分离技术(例如膜过滤、离心)来回收微生物，并再悬浮在生理浓度的NaCl无菌溶液中。可以通过超声波瓦解这种介质而获得溶菌产物，以从其中释放细胞质部分、细胞壁部分和代谢衍生的产物。随后，所有成分以它们天然分布的方式稳定在弱酸性水溶液中。

    由此通常获得的溶菌产物的浓度，以活性物质的重量计，为溶菌产物总重量的0.1-50重量％、特别是1-20重量％、特别是约5重量％。

    可以以各种形式来使用溶菌产物，例如以溶液的形式或以粉末状的形式。

    特别适合于本发明的微生物属于选自以下种的双歧杆菌属：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)或假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、以及它们的混合物。

    长双歧杆菌最特别适合于本发明。

    该溶菌产物可以有利地为国际专业命名化妆品原料(INCI)名称下登记的溶菌产物：乳酸菌发酵液(Bifidat ferment Lysate)，欧洲目前市场流通的化学品目录(EINECS)名称：长双歧杆菌，EINECS号为：306-168-4且CAS号为：96507-89-0。

    由公司K.Richter GmbH以商品名Repair Complex出售的产品并由长双歧杆菌的灭活溶菌产物所形成的落入本发明的范围内。

    本发明所使用的溶菌产物如以上所述。

     4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物

    自然地，在角化层中存在的4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物相应于天然存在于皮肤中三种鞘脂成分(base)中的一种。

    在本发明中，特别考虑的4-羟双氢鞘氨醇衍生物为4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯类型的衍生物，即由至少一种4-羟双氢鞘氨醇分子共价键合到至少一种水杨酸分子上而衍生的化合物。该键合可以为酯或酰胺类型，优选为酰胺类型。

    对于本发明的目的，这些4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物包括相应化合物的各种离子形式。

    这种衍生物有利地相应于下列结构式：

    

    其中：

    -R表示：

    -氢原子，

    -饱和或不饱和的、直链或支链的C₁-C₄₉脂肪族基团，其中被羟基适当地取代，或者

    -基团Y-O(C_aH_b)_m-，

    a为7-50的整数，b为10-100的整数，m为0或1，且Y表示H或具有式-CO-(C_xH_yZ_z)CH₃的C₁₄-C₂₂的脂肪酸，

    Z为-OH或者环氧的氧，x为12-20的整数，y为20-40的整数，

    且z为0或1-4的整数；

    -R¹表示饱和或不饱和的、直链或支链的C₈-C₂₈、特别为C₁₀-C₂₀、尤其为C₁₂-C₁₈的脂肪族基团，其中被羟基适当地取代；以及

    -R²表示H、磷酸酯基、硫酸酯基或糖。

    这种衍生物在文献EP 919226中有特别描述。

    式I中R和R²分别表示氢原子、且R¹为直链和饱和的、特别是C₁₄烷基的衍生物特别适合于本发明。

    该衍生物相应于下列式子：

    

    这种衍生物特别为由公司Evonick Goldschmidt以商品名Phytosphingosine SLC出售的。

    本发明所使用的4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物如上所述。

    形成本发明组合的4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物与溶菌产物的各自的量(可以使用的，也称作“有效量”)依赖于需要的效果、并因此可以在很大范围内改变。

    对于本发明的目的，措辞“有效量”意图表示所需要的最小量以观察期望的效果，即美容效果或治疗效果；可以理解的是获得美容效果或治疗效果的所需要的有效量可以适当地相同或不同。

    为了给出数量级，形成本发明的两种化合物各以组合物总重量的0.0001-50％的量存在，特别以组合物总重量的0.001-10％的量存在。

    特别地，在本发明的组合物中，形成溶菌产物且属于双歧杆菌属的活性剂的用量，以活性物质的干重量计，可以为含有该活性剂的支持物或组合物的总重量的至少0.001％(表示为干重量)，特别为0.01-20％，更特别为0.01-15％。

    就本发明组合物中的4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物而言，以活性物质干重量计，可以以含有该衍生物的支持物或组合物的总重量的至少0.0001％(表示为干重量)、特别为0.001-20％、更特别为0.05-2％配制在组合物中。

     本发明的组合物

    本发明所考虑的组合物可以为化妆品的或药学上的、特别为皮肤病用的组合物。

    对于本发明的目的，措辞“预防条件”意图表示减缓出现与皮肤老化有关的条件，特别如上所述。

    可以理解的是，本发明所考虑的所有组合物都使用生理学上可接受的介质。

    对于本发明的目的，术语“生理学上可接受的介质”意图表示适合将组合物施用于角蛋白物质、特别是皮肤的介质。

    根据一个特定的实施方式，本发明的组合物还可以含有对皮肤有活性的至少一种补充剂。

    可以补充本发明的组合的各种成分的量为所考虑领域的常规使用的那些。

    -补充活性剂

    作为可以用于本发明范围内的补充活性剂的例子，可以提到的有用于改善皮肤状况的活性剂(例如水合的或增湿的活性剂)，或者用于改善天然脂质阻挡层的活性剂(如神经酰胺、胆甾醇硫酸酯和/或脂肪酸)、以及它们的混合物。

    还可以使用对皮肤具有活性的酶，如蛋白酶、脂肪酶、脑苷酶、酰胺酶和/或麦拉宁酶(melanases)、以及它们的混合物。

    还可以使用微生物的活化剂、特别是益生菌微生物类型，如申请WO 2006/000992和WO 2006/037922中所描述的。

    对于本发明的目的，术语“益生菌微生物”意指一种活微生物，该活微生物为当其以适当量消耗时具有对其宿主健康具有积极作用、并且可以特别改善肠内微生物平衡，可以参考“Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health andNutritional Properties of Probiotic in Food Including Powder Milk with Live Lactic AcidBacteria，6 October 2001”。

    适合于本发明的微生物可以特别选自子囊菌(如酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、德巴利酵母属(Debaromyces)、假丝酵母(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、曲霉属(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium))，双歧杆菌属的细菌，类菌体(Bacteroides)，梭杆菌(Fusobacterium)，蜜蜂球菌属(Melissococcus)，丙酸杆菌属(Propionibacterium)，肠球菌(Enterococcus)，乳球菌(Lactococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，消化链球菌属(Peptostrepococcus)，杆菌(Bacillus)，小球菌属(Pediococcus)，微球菌(Micrococcus)，明串珠菌(Leuconostoc)，魏斯氏菌属(Weissella)，气球菌属(Aerococcus)，酒球菌属(Oenococcus)和乳酸杆菌(Lactobacillus)，以及它们的混合物。

    作为最特别适合于本发明的子囊菌，可以特别提到的有解脂假丝酵母(Yarrowialipolitica)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，以及同等的啤酒酵母菌(Saccharomyces cereviseae)，孢圆酵母属，裂殖酵母，假丝酵母和毕赤酵母属。

    益生菌微生物的特定例子为两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、营养乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳酸杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbruckii subsp.Lactis)、格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)、罗伊乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)(乳酸杆菌GG)、米酒乳酸杆菌(Lactobacillus sake)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococccus carnosus)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、以及它们的混合物。

    更特别地，它们是衍生自乳酸菌组的益生菌微生物，尤其是例如乳酸杆菌和/或双歧杆菌。为了说明这些乳酸菌，特别可以提到的是约氏乳酸杆菌、罗伊乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌或假链状双歧杆菌、以及它们的混合物。

    乳双歧杆菌的菌株可以从Hansen(Chr.Hansen A/S，10-12 Boege Alle，P.O.Box407，DK-2970 Hoersholm，Denmark)以名称Bb 12获得。

    该微生物可以以活的、半活性的或灭活的、死亡的形式包含在本发明的组合物中。

    还可以以细胞成分片断的形式或代谢物的形式含有它(它们)。该微生物、代谢物或片断还可以以冻干粉末的形式、培养物上清液的形式和/或，适当时以浓缩的形式被引入。

    在局部用的组合物的特定情况中，还可以有利地以灭活的或者甚至死亡的形式使用这些微生物。

    关于益生菌微生物，通常使用下列细菌和酵母属：

    -乳酸菌：通过发酵从乳酸中产生糖。根据其形态它们可以分成两组：

    ·乳酸杆菌：嗜酸乳酸杆菌(LC1、NCFB 1748)；食淀粉乳酸杆菌、干酪(干酪)乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌(GG菌株)、短乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、德氏乳酸杆菌(delbruckii)(保加利亚亚种，乳酸亚种)、发酵乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、鸡(gallinarum)乳酸杆菌、格氏(gasseri)乳酸杆菌、约氏乳酸杆菌(lohnsonii)、副干酪乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、罗伊氏(reuteri)乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、唾液乳杆菌。

    ·Gocci：肠球菌(Enterocossus)(粪肠球菌、蜜蜂屎(faeciul)肠球菌)、乳酸乳球菌(乳酸或乳脂亚种)、肠膜明串珠菌右旋葡聚糖亚种(Leuconstocmesenteroides subsp dextranicum)、乳酸片球菌(动物饲料)、菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)、唾液链球菌嗜热亚种。

    -双歧杆菌或双歧杆菌种：青春双歧杆菌；动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌，

    -酵母：酵母属(啤酒酵母或布拉(boulardii)酵母)。

    -其它形成孢子的细菌：芽孢杆菌(蜡状芽孢杆菌变种东洋(cereus var toyo)或枯草芽孢杆菌)、凝固芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、大肠杆菌尼斯菌株(Escherichia coli strain nissle)、费氏丙酸杆菌。

    乳酸菌和双歧杆菌都是最常使用的益生菌。

    特别适合于本发明的益生菌微生物的特定例子为两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、营养乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌干酪亚种、干酪乳酸杆菌代田株(Lactobacillus casei Shirota)、副干酪乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌、德氏乳酸杆菌乳酸亚种、格氏乳酸杆菌、约氏乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌(乳酸杆菌GG)、米酒(sake)乳酸杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌、以及它们的混合物。

    更特别地，它们是衍生自乳酸菌组中的益生菌微生物，特别是例如乳酸杆菌和/或双歧杆菌。为了说明这些乳酸菌，特别可以提到的是约氏乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌或两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌或假链状双歧杆菌、以及它们的混合物。

    最适合的种类为根据与巴斯德研究院(Institut Pasteur)的布达佩斯条约(28 ruedu Docteur Roux，F-75024 Paris cedex 15)保藏的约氏乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌和乳双歧杆菌NCC 2818(也表示为Bb12 ATCC 27536)；它们的保藏日分别为：30/06/92、12/01/99、15/04/99、15/04/99和07/06/05；它们的保藏号分别是CNCM I-1225、CNCM I-2116、CNCM I-2168和CNCM I-2170和CNCM I-3446；以及长双歧杆菌属(BB536)。从Hansen(Chr.HansenA/S，10-12 BoegeAlle，P.O.Box 407，DK-2970 Hoersholm，Denmark)可以获得乳双歧杆菌菌株CNCMI-3446。

    适用于本发明的活性剂的其它例子包括：止痛活性剂、抗酵母活性剂、抗菌活性剂、抗寄生虫活性剂、抗真菌活性剂、抗病毒活性剂、甾族消炎活性剂、麻醉活性剂、止痒活性剂、角质层分离活性剂、自由基清除活性剂、抗溢脂活性剂、防头皮屑活性剂、抗痤疮活性剂、针对防止皮肤老化和/或改善皮肤状况的活性剂、抗老化活性剂、抗皮炎活性剂、抗刺激活性剂、免疫调制活性剂、用于治疗干燥皮肤的活性剂、止汗活性剂、治牛皮癣活性剂、抗组胺活性剂、愈合活性剂、仿晒(self-tanning)活性剂、抗氧化剂(如绿茶或其活性组分)、甘油、锂皂石(laponite)、咖啡碱、芳族精油、除色素活性剂、去角质(exfoliant)活性剂、脂肪调节剂，软化活性剂、清新活性剂、除臭活性剂、脱敏活性剂、漂白活性剂或滋养活性剂，以及用于减少皮肤分化和/或增殖和/或色素沉着的活性剂，以及它们的混合物。

    补充活性剂还可以选自以下的试剂：用于改善阻挡作用的试剂、皮肤脱收缩剂(dermodecontracting agent)、抗糖化剂、刺激皮肤和/或表皮大分子合成和/或防止它们降解的试剂、用于刺激成纤维细胞或角质形成细胞增殖和/或角质形成细胞分化的试剂、用于促进角质膜(homy envelope)成熟的试剂、NO合酶抑制剂、外周苯二氮卓受体(PBR)拮抗剂、用于增加皮脂腺活性的试剂、用于刺激细胞能量代谢的试剂、紧绷剂(tensioning agent)、脂肪重构剂、减肥剂、用于促进皮肤毛细血管循环的试剂、镇静剂、调节皮脂剂或抗溢脂剂、收敛剂、消炎剂和抗痤疮剂。

    可以用于本发明范围内的活性剂以及特别是抗老化活性剂中，可以提到的作为非限制的例子为：大豆蛋白提取物(如由公司Silab以商品名出售的产品)，腺苷或合成的腺苷(如由公司Pharma Waldoff出售的产品)，波色因(pro-xylane)，黑麦种子(rye seed)提取物(如由Silab以商品名Coheliss出售的)，紫花苜蓿(苜蓿(luzeme))提取物(如由Silab以商品名Vitanol出售的)，四肽(N-乙酰基-谷氨酰胺-天冬氨酸-缬氨酸-组氨酸)(如由Cognis以商品名Dermican LS9745出售的产品)，大米三肽和二肽(如从公司Silab以商品名Nutriskin购得的)，飞蛾豆(Vigna aconitifolia)种子提取物(如由公司Cognis以商品名Vitoptine LS 9529和Vit-A-Like LS9737出售的)，纤细眼虫(Euglena gracilis)提取物(如从Sederma以商品名Chronodyn购得的)，结合到棕榈酸上的小麦氨基酸(由Seppic以商品名Deepline PVB(Lipacide PVB)出售的)，蓝莓提取物(如来自公司Cosmetochem的Herbasol Myrtille Extract)，姜根提取物，什塔克菇(Shiitake)(香菇(Lentinus edodes))的水提取物(如来自Silab的Fermiskin)，以及由Lipotec出售的冰河醣蛋白(antarcticine)，石榴(Punica granatum)提取物、来自公司Lipotec的六胜肽(argireline)SC36(六肽(乙酰基-谷氨酸-谷氨酸-甲基-谷氨酸-精氨酸-精氨酸-酰胺))，燕麦提取物(如由Silab以商品名Reductine出售的产品)，紫米提取物(如来自公司Oryza的紫米提取物)，葡萄花细胞分散液(如来自公司Naolys的Fiber BoosterSequoia葡萄属花)，阿魏酸(ferullic acid)(如来自公司Oryza Oil和Fat的Oryzaferulix)，地下沃安齐贾籽(Voandzeia subterranea)(班巴拉族(bambara))提取物(如来自公司Cognis的Filadyn LS 9397)，大豆提取物(如由公司Pentapharm出售的产品Elhibin)，水解的杏梅(Prunus domestica)果实提取物(如来自公司Ichimaru Pharco的商品名Clairju)。

    特别地，在对皮肤有活性且适用于本发明的其它试剂中，可以提到的有水合的活性剂和/或表皮剥离(desquamating)活性剂(如甘醇)、尿素或其衍生物、HEPES、螯合剂、洗涤剂和茉莉酸衍生物、以及它们的混合物。

    本领域的技术人员会根据对角蛋白物质所需要的效果选择所述活性剂。

    -植物制剂(galenical)形式

    用于口服给药，本发明的组合物可以为任何合适的形式，特别是以口服溶液、糖浆、片剂、糖衣片、凝胶胶囊、胶囊或其它营养食品或营养补剂的形式。

    本发明的组合物还可以含有适合于口服给药的至少一种适合的赋形剂。

    本发明所考虑的组合以与含有它的任何组合物相同的方式可以有利地局部给药。

    专用于局部给药的组合物可以特别是水溶液、水醇溶液或油溶液的形式，溶液型分散液或者洗液型或浆液型分散液的形式，具有乳状的液体或半液体稠度的乳液形式；以脂肪相在水相(O/W)中的分散液或水相在脂肪相(W/O)中的分散液获得，或者霜剂型的软的、半固体或固体稠度的悬浮液或乳液的形式，含水或无水凝胶的形式，或者其它微乳液的形式、微胶囊的形式、微颗粒的形式、或离子和/或非离子型的小泡分散液的形式。

    当本发明的组合物含有至少一种水相(如水溶液、乳液等)时，该组合物的pH优选为4-9、优选4-7、更优选5-6、特别是pH为5.5。

    本发明的组合物可以几乎为流体、且具有白色或彩色外观的霜剂、软膏、乳剂、洗液、浆液、糊剂或泡沫剂。该组合物可以以气溶胶的形式任选地涂敷在皮肤上。还可以以固体形式、且例如以条状的形式。该组合物可以用作护理产品，还可以用作美容产品和/或修饰产品。

    该组合物可以构成用于面部、用于手、用于脚或用于身体的面膜、清洗霜、防护霜、治疗霜或护理霜(例如日霜、晚霜、卸妆霜、基础霜、防晒霜)，卸妆乳，或皮肤护理液，凝胶或泡沫，如清洗液。

    通常地，本发明的任何组合都可以涂敷到皮肤(身体皮肤的任何部位)上或涂敷到粘液膜(口部、面颊、齿龈、生殖器、结膜等)上。

    用已知的方式，美容组合物还可以含有在化妆品领域通常使用的辅助剂，如亲水的或亲脂的胶凝剂、亲水或亲脂的添加剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填料、UV(太阳)掩蔽剂、气味吸收剂和染料。用于本发明组合物成分的含量和特性由本领域的技术人员来调节，以基本上不影响本发明所考虑的组合的效果。

    本发明的组合物可以证明特别具有以下优点，改善皮肤特别是表皮的增湿作用、皮肤的稳态，改善皮肤阻挡作用，防止和/或处理表皮的老化迹象(例如皱纹)、细纹、表皮的稳定性或弹性或密度和/或紧张性缺失。

    因此，本发明特别指向的皮肤状况可以为干燥皮肤或非常干燥的皮肤，并且在皮肤具有老化外观的个体中、特别是在45岁年龄以上和/或绝经后的女人、或者甚至非常年老的女人中。

    如上所述，本发明还涉及方法，特别是美容方法，该方法包括对皮肤老化的个体受试者至少给予至少一种本发明的组合。

    这种处理方法可以特别通过局部或口服给予(如每日给予)本发明所考虑的组合来实现。

    本发明的方法可以包括单独给予。根据另一个实施方式，反复给予(例如一日或多日内每日2-3次)，且通常持续至少4周、或者甚至4-15周，适当时候，可以中断一个或多个期间。

    在说明书和下列实施例中，除非有其它说明，百分数为重量百分数，且以“在……与……之间”形式措辞的数值范围包括所说明的上限和下限。

    下面通过本发明领域的非限制说明给出实施例和附图。

     实施例1

    在该实施例中，所使用的溶菌产物为由公司K.RICHTER GmbH以商品名Repair Complex出售的产品，其由长双歧杆菌的灭活溶菌产物形成，4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯衍生物为由公司Evonick Goldschmidt以商品名PhytosphingosineSLC出售的产品。

    测试下列四种组合物对重构表皮分化的作用。

    -A：制剂载体(乙醇(3％)和水(97％))，

    -B：溶菌产物(乙醇(3％)，水(87％)，溶菌产物(10％))，

    -C：4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯(乙醇(3％)，水(96.998％)，4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯(0.002％))，以及

    -D：本发明的组合＝(0.002％ 4-羟双氢鞘氨醇水杨酸酯+10％溶菌产物+乙醇(3％)+水(96.998％))。

    将J6重构表皮放入含有2ml维持培养基的12孔板中，并在37℃和5％CO₂下培养24小时。孵育后，用测试组合物(50μl/重构表皮)局部处理该表皮并孵育6小时。

    在处理后小时后使用实时PCR方法(定量PCR，qPCR)分析细胞角蛋白6B(K6B)、细胞角蛋白10(K10)和套膜蛋白(INV)基因的表达来表征这些结果。

    1、保持的方案

    a)分化表达的分析

    在处理6小时、24小时和48小时后，通过RT-qPCR对从各处理的重构表皮中提取的信使RNA评价所选择标记物的表达(在RNA提取前集中双份)。

    b)反转录

    -使用TRI-Reagent从各样品中提取的总RNA

    -通过用无DNA体系(Ambion ref.1906)处理除去的潜在污染的痕量DNA。使用Nanovue(Amersham)量化的RNA。

    -在寡聚(dT)引物和Superscript II酶(Gibco)存在下实现mRNA反转录反应。

    -使用超微量分光光度计(Nanovue)(Amersham)量化得到的cDNA，并cDNAs调节至10ng/μl。

    c)定量PCR

    通过具有“Light Cycler”系统的定量PCR(Roche Molecular Systems Inc.)来实现PCR反应(聚合酶链反应)。该分析系统可以进行快速和有效的PCR反应，交换之前设定的用于各种引物的分析条件。它可以由两种主要成分组成：

    -最佳的温度循环器：允许非常快速的热传输；

    -荧光计：允许连续测量掺入到DNA中的荧光的强度(在521nm检测)。

    使用特定用于研究的基因的成对探针，扩增下列特定的片段：

       基因名称(编码的蛋白质)   缩写  基因库   cDNA bp   肝脏甘油醛-3-磷酸脱氢酶   G3PD  NM 002046   269   细胞角蛋白6B   K6B  NM 005555   277   细胞角蛋白10   K10  NM 000421   236   套膜蛋白   INV  NM 005547   251

    用于各样品的反应混合物(最终10μl)如下：

    -2.5μg的cDNA。

    -用于各种所使用的标记物的引物。

    -含有耐热性DNA聚合酶的酶的反应混合物(Roche)，SRGreen I标签(在延长步骤过程中插入双链DNA中的荧光团)和MgCl₂。

    d)定量PCR数据的处理

    在PCR循环过程中连续测量掺入到扩增的DNA中的荧光。该系统可以获得荧光测量与PCR循环的函数的曲线，并因此评价对于各标记物的相对表达值。

    基于荧光曲线的“出口”点，测定循环数。对于所分析的单独标记物，样品出来越晚(很高的循环数)，mRNA初始复制量越低。

    根据下列式子以任意的单位来表达相对表达值：

    (1/2^循环数)×10⁶

    e)所观察的对基因表达的作用的标准化

    为了标准化的解释，保留了下列分类表：

       与对照物相比的相  对表达％   所观察结果的分类   ＞150％和＜200％   缓和刺激，待确认的   ＞200％   明显的刺激   ＞300％   强刺激   ＜65％和＞50％   缓和抑制   ＜50％和＞30％   明显的抑制   ＜30％   强抑制

     2、结果

    相对于标记物的三个研究的表达动力学示于下面的表1中，并在图1中说明。

    该结果相对于G3PDH信使(参考基因)的数量，并表达为未处理的对照的％。

    

    在该测试的试验条件下，显示出在6小时后仅仅本发明的组合增加了编码的细胞角蛋白6B、细胞角蛋白10和套膜蛋白的基因的表达。

    实施例2

    依赖于其情况，化合物以化学品名称或CTFA(国际化妆品成分词典和手册)名称列出。

    以水凝胶形式的面部护理组合物

                                                重量％

    4-羟双氢鞘氨醇-                       0.002％

    Repair Complex                        10％

    透明质酸钠                                  0.4％

    黄原胶                                      0.1％

    1，2-辛二醇                                 0.3％

    乙二胺四乙酸二钠盐                          0.099％

    甘油                                        5％

    柠檬酸                                      0.015％

    乙醇                                        4.6％

    4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸                   1％

    脂肪物质                                    0.016％

    乳化剂                                      0.099％

    填料                                        0.2％

    防腐剂                                      0.55％

    溶剂                                        1％

    香味剂                                      0.005％

    水                                          足量至100％