一种创制梨100自花结实性种质的方法.pdf

1、10申请公布号CN101982063A43申请公布日20110302CN101982063ACN101982063A21申请号201010256234422申请日20100818A01H1/02200601C12Q1/6820060171申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市卫岗1号72发明人张绍铃齐永杰吴俊吴华清陶书田齐开杰74专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人张素卿54发明名称一种创制梨100自花结实性种质的方法57摘要本发明提供了一种创制梨100自花结实性种质的方法，属于遗传育种学领域。利用“奥嗄二十世纪”自交后代纯合体株系“54S135”作父本，另外任何一

2、个品种SASB，A、B4为母本，进行杂交授粉，其杂交后代的S基因型存在两种可能，即或均携带自交亲和性基因故所得后代无需筛选即为自花结实性株系。本技术流程简便快捷，只需通过简单的杂交授粉、留种育苗，即可获得大量的自花结实性株系，缩短了选育自花结实性种质的进程，节约了选育自花结实性品种的成本。该技术体系还可借鉴应用于其他作物自花结实种质的创制，因此有着广返的应用价值和推广前景。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表2页附图2页CN101982065A1/1页21一种创制梨100自花结实性种质的方法，其特征在于1田间授粉实验以基因型为S2S4SM

3、的奥嗄二十世纪自交后代S基因纯合体株系54S135为父本，春季采集其大蕾期花苞的花药，室内25干燥条件下散出的花粉，于开花前1天选用另一个基因型为SASB，A、B4品种为母本，对拟授粉的花蕾去雄后，人工授予54S135花粉，每个组合授粉200朵左右的花序，再套上硫酸纸袋，授粉后25天调查花序和花朵坐果率，每花序留12个果，种子成熟后采果并取出种子，沙藏育苗；2基因的鉴证用梨自花结实性基因特异正反向引物S4SMF5TCGTCTTAGGGATTTCCAATGC3S4SMR5GCCTTAAGGGTTCATTGGGC3扩增杂交后代各株系的基因组DNA，若能扩增出一条666BP的片段，则标记着该植株中含

4、有基因的存在，由于后代中各植株中均携带自花结实性基因S4SMRNASE，故所得后代均为自花结实性株系。权利要求书CN101982063ACN101982065A1/4页3一种创制梨100自花结实性种质的方法一、技术领域0001本发明提供了一种创制梨100自花结实性种质的方法，属于遗传育种学领域，建立了简捷、快速创制梨自花结实性种质的技术体系，在果树自花结实性品种株系的选育中有着重要的推广价值。二、背景技术0002梨是我国乃至世界主要水果之一，我国现有栽培面积12584万公顷，是我国的第三大水果。梨是典型的配子体型自交不亲和性果树，也就是说梨绝大多数品种自花授粉不结实性，在生产中必须合理配置授粉

5、树或进行人工辅助授粉，才有可能获得应有的产量，也常常因授粉树配置不当、花期不良气象条件影响昆虫传粉或人工授粉不及时等原因造成减产，尤其是近年来地球气候变化激烈，春季倒春寒以及花期低温阴雨天气影响昆虫的传粉活动，使得许多梨树授粉受精不良，坐果率低下，严重影响产量。如果所栽培的梨品种自花授粉能结实的话，就能避免或减少因传粉媒介昆虫的不活动而造成授粉受精不良、坐果率低下、产量受损的问题，尤其是对于保护地栽培的果树来说更为重要。因此，创新梨自花结实性种质，选育出梨自花结实性自交亲和性品种是个亟待解决的问题，也是今后梨、苹果等自花授粉不结实性果树新品种选育的目标之一。鉴于此，各国的梨育种学家已经把培育自

6、花结实性品种作为育种目标，但是进展比较缓慢。奥嗄二十世纪为自花结实性梨品种，其雌蕊基因发生变异，导致雌蕊自交不亲和性功能丧失，花粉自交不亲和性功能正常，因而是培育自花结实性后代的理想材料。日本已经利用奥嗄二十世纪作亲本，培育出自花结实性优良品种秋荣早期以奥嗄二十世纪和秋荣为亲本培育自花结实性种质，杂交后代中既有自花结实性株系，又有自花不结实性株系，需经过筛选，只有携带基因的株系A4才表现为自花结实。0003正是由于自花结实性品种在栽培上有着良好的应用前景，所以寻找一种快速、准确创制梨自花结实性后代株系品种等的方法显得尤为重要。本发明提供了一种创制梨100自花结实性种质的方法，利用奥嗄二十世纪自

7、交后代纯合体株系54S135作父本，另一个品种SASB，A、B4为母本进行杂交授粉，根据基因的分离规律，在其杂交后代中均携带自花结实性基因故无需筛选，只要能得到后代株系即为自花结实性种质。本技术体系简便快捷，为自花结实性优良梨品种的选育节约了育种成本，缩短了育种进程。该理论体系还可借鉴应用于其他作物自花结实种质的创制，因此有着广返的应用价值和推广前景。三、发明内容0004技术问题0005本发明的目的是提供了一种创制梨100自花结实性种质的方法。利用奥嗄二十世纪自交后代纯合体株系54S135作父本，另一个品种SASB，A、B4说明书CN101982063ACN101982065A2/4页4为母本

8、，进行杂交授粉，得到后代株系即为自花结实性种质。0006技术方案0007创制梨100自花结实性种质的方法，其特征在于00081田间授粉实验以基因型为S2S4SM的奥嗄二十世纪自交后代S基因纯合体株系54S135为父本，春季采集其大蕾期花苞的花药，室内25干燥条件下散出的花粉，于开花前1天选用另一个基因型为SASB，A、B4品种为母本，对拟授粉的花蕾去雄后，人工授予54S135花粉，每个组合授粉200朵左右的花序，再套上硫酸纸袋，授粉后25天调查花序和花朵坐果率，每花序留12个果，种子成熟后采果并取出种子，沙藏育苗；00092基因的鉴证用梨自花结实性基因特异正反向引物0010S4SMF5TCGT

9、CTTAGGGATTTCCAATGC30011S4SMR5GCCTTAAGGGTTCATTGGGC30012扩增杂交后代各株系的基因组DNA，若能扩增出一条666BP的片段，则标记着该植株中含有基因的存在，由于后代中各植株中均携带自花结实性基因S4SMRNASE，故所得后代均为自花结实性株系。0013有益效果0014本发明所提供的一种创制梨100自花结实性种质的方法，具有以下优点00151本发明的方法简便、快捷。该方法所得到的杂交后代的自花结实性无需通过其它方法的辅助鉴定和筛选，由于各株系中均携带自花结实性基因S4SMRNASE，只要能从杂交种中繁育出株系即可得到自花结实性种质。整个技术体系只

10、涉及简单的人工杂交授粉和育苗工作，操作流程简便易行，为选育工作节约了成本，缩短了进程。00162本发明的准确度高。自花结实S4SMRNASE基因与控制花粉自花不结实基因的遗传距离为0，它在后代中没有发生遗传重组，各株系中均检测出S4SMRNASE基因，证实了该育种方法的准确率为100。00173该发明还可借鉴应用于其他作物的自花结实性种质的创制。只要能得到作物某一自花结实基因纯合体株系，运用该技术体系进行杂交育种即可在短时间内大量繁育出自花结实性株系，因此有着广返的应用价值和推广前景。四、附图说明0018图1创制梨100自花结实性种质方法的技术路线0019图2新高株杂交后代0020A梨S基因保

11、守区序列引物扩增，B梨特异引物扩增五、具体实施方式0021一实验方法0022本研究以新高S3S9为母本试材，奥嗄二十世纪自交后代S基因纯合体株系54S135S4SMS4SM为父本进行杂交创制梨自花结实性种质，具体技术流程如下00231、田间授粉实验0024在奥嗄二十世纪自交后代中，选择S基因型为S4SMS4SM品系定名54S135。春季采集54S135大蕾期花苞的花药，室内25条件下使其散粉，收集花粉以备作授粉使说明书CN101982063ACN101982065A3/4页5用。于开花前1天为新高该品种的S基因型为S3S9，现为我国主要栽培的砂梨品种之一，购自中国农业科学院兴城果树研究所梨种质

12、资源圃去雄，授以54S135花粉200朵左右的花序，再套上硫酸纸袋。授粉后25D调查花序和花朵坐果率，每花序留12个果，种子成熟后采果并取出种子，沙藏育苗。00252、杂交后代各株系S基因型的鉴定00261CTAB法张妤艳，黄绍西，张绍铃，等京白梨等品种S基因型鉴定及新基因S28、S30的核苷酸序列分析J园艺学报，2006，333496500提取各后代株系幼叶的基因组DNA。00272引物合成合成梨S基因保守区序列引物PF5GTTGTTTACGGTTCACGGTTTG3和PR5CTTTTGGCACTTGARTTTTGGT3以及梨自花结实性基因特异正反向引物5TCGTCTTAGGGATTTCCA

13、ATGC3和5GCCTTAAGGGTTCATTGGGC3引物序列参照本课题组张绍铃，吴华清，齐永杰等快速鉴定梨自花结实性植株的分子标记法ZCN101565748，200900283用梨S基因保守区序列引物PF、PR和特异引物分别对各后代株系基因组DNA进行扩增0029反应体系总体积均为25L10PCRBUFFER25L30MMMGCL2，02MMDNTP，各引物01M，2050NG模板，TAQ酶10U；0030S基因保守区序列引物PCR扩增所用程序为94预变性2MIN，9415S，4830S，723MIN，10个循环后，94变性15S，48退火30S，7235MIN，25个循环后72延伸7MI

14、N；0031基因的特异引物PCR扩增所用程序为94预变性2MIN，94，15S，65，30S，723MIN，10个循环后，94变性15S，65退火30S，72，35MIN，25个循环后72延伸7MIN；0032应用PTC200扩增仪BIORAD进行扩增；00334反应结束后取PCR产物5L，用15的琼脂糖凝胶在80V电压条件下电泳45分钟，检测PCR产物。EB染色，在紫外灯下观测，拍照。0034二结果与分析0035如图2A所示，由于单元型中S4RNASE基因发生了缺失，故用S基因保守区序列引物PF和PR不能扩增出基因，只能从各株系的基因组DNA中扩增出另一个S基因，即大小为1347BP的S9R

15、NASE基因，或大小为384BP的S3RNASE基因。通过的特异引物S4SMF和S4SMR扩增各株系的基因组DNA，若能扩增出一条666BP的片段，则标记着该植株中含有基因的存在。如图2B所示，31株杂交株系中均能扩增出基因，故所得后代均为自花结实性株系。这与我们理论推测的结果保持一致，证实了该育种方法的可行性和准确性。最终确定了31株杂交后代中S3S4SMS9S4SM161511，符合基因分离规律。0036如果母本中存在S4的基因型，那么和S4SMS4SM做父本杂交就会在后代中出现S4S4SM基因型的植株存在，虽然含有基因，但S4单元型花粉的自交不亲和性功能正常，其表型依然为自花授粉不结实。

16、为了避免这种情况的发生，我们在选择母本时就针对性的选择SASB，A、B4的基因型做母本，这样就能很好的排除S4S4SM基因型植株的存在，只要能说明书CN101982063ACN101982065A4/4页6得到后代株系，无需筛选，即为自花结实性种质，这大大节约了育种成本，缩短了育种进程，为自花结实性优良梨品种的选育带来了很大的方便。说明书CN101982063ACN101982065A1/2页700010002序列表CN101982063ACN101982065A2/2页8序列表CN101982063ACN101982065A1/2页9图1说明书附图CN101982063ACN101982065A2/2页10图2说明书附图CN101982063A