犬莱姆病疫苗.pdf

本发明提供了用于犬莱姆病的疫苗以及单独或与其它保护剂联合制备及应用该疫苗的方法。

1.  一种疫苗组合物，其包含来自疏螺旋体属基因种的第一或单一菌株的免疫有效量的生物体，其中当在标准疏螺旋体属基因种生长条件下培养所述第一或所述单一菌株的生物体时，它们在用严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)注射的动物中诱发的OspC特异性抗体存在下被杀死。

2.  权利要求1的疫苗，其中所述的免疫有效量的生物体已被灭活。

3.  权利要求1的疫苗，其中所述第一或所述单一菌株在其细胞表面呈现OspC抗原，并且其中当用所述的疫苗组合物免疫犬时，在所述犬中诱导OspC杀疏螺旋体属抗体。

4.  权利要求3的疫苗组合物，其中显著比例的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体对OspC7是特异的。

5.  权利要求3的疫苗组合物，其中所述第一或所述单一菌株是严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)。

6.  权利要求1的疫苗组合物，其还包含来自疏螺旋体属基因种的第二菌株的免疫有效量的灭活生物体；并且其中所述第二菌株在其细胞表面呈现OspA抗原、OspB抗原，或呈现OspA抗原和OspB抗原两者。

7.  权利要求6的疫苗组合物，其中当用所述疫苗组合物免疫犬时，在所述犬中诱导OspC杀疏螺旋体属抗体和OspA杀疏螺旋体属抗体。

8.  权利要求6的疫苗组合物，其中所述第二菌株是严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)菌株。

9.  权利要求6的疫苗组合物，其包含每毫升约1×10⁴至约1×10¹⁰个生物体的第一菌株及每毫升约1×10⁴至约1×10¹⁰个生物体的第二菌株。

10.  权利要求9的疫苗组合物，其包含每毫升约5.0×10⁸至约5×10⁹个生物体的第一菌株及每毫升约1.0×10⁸至约5×10⁸个生物体的第二菌株。

11.  权利要求1的疫苗组合物，其还包含可药用佐剂。

12.  权利要求1的疫苗组合物，其还包含可药用免疫刺激剂。

13.  权利要求1的疫苗组合物，其还包含至少一种用于诱发针对非疏螺旋体属病原体的保护性免疫的非疏螺旋体属免疫原。

14.  权利要求13的疫苗组合物，其中所述非疏螺旋体属免疫原选自：犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬流感病毒、钩端螺旋体属血清型、利什曼原虫属生物、支气管败血性包特氏菌、支原体属物种、狂犬病病毒、犬埃里希氏体、无形体属生物，及其组合。

15.  权利要求14的疫苗组合物，其中所述的钩端螺旋体属血清型选自：Leptospira kirschneri感冒伤寒型血清型、肾脏钩端螺旋体犬血清型、肾脏钩端螺旋体出血性黄疸型血清型、肾脏钩端螺旋体pomona血清型，及其组合。

16.  权利要求14的疫苗组合物，其中所述的支原体属物种包含犬支原体。

17.  针对病原性疏螺旋体属基因种免疫犬的方法，其包括用免疫有效量的权利要求1的疫苗注射犬。

18.  针对病原性疏螺旋体属基因种免疫犬的方法，其包括用免疫有效量的权利要求6的疫苗注射犬。

19.  权利要求18的方法，其中所述第二菌株是严格意义上的布氏疏螺旋体。

20.  权利要求18的方法，其中所述第二菌株选自：严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)、严格意义上的布氏疏螺旋体B-31(ATCC No.35210)、阿氏疏螺旋体(ATCC No.51567)、嘎氏疏螺旋体(ATCC No.51383或51991)、严格意义上的布氏疏螺旋体DK7、严格意义上的布氏疏螺旋体61BV3、严格意义上的布氏疏螺旋体ZS7、严格意义上的布氏疏螺旋体Pka、严格意义上的布氏疏螺旋体IP1，IP2，IP3、严格意义上的布氏疏螺旋体HII、严格意义上的布氏疏螺旋体P1F、严格意义上的布氏疏螺旋体Mil、严格意义上的布氏疏螺旋体20006、严格意义上的布氏疏螺旋体212、严格意义上的布氏疏螺旋体ESP1、严格意义上的布氏疏螺旋体Ne-56、严格意义上的布氏疏螺旋体Z136、严格意义上的布氏疏螺旋体ia、及其组合。

21.  权利要求18的方法，其中免疫的犬产生杀疏螺旋体属抗体。

22.  权利要求18的方法，其中用约5×10⁷至约5×10⁹的疏螺旋体属物种的每种分别的菌株注射所述犬。

23.  血清，其包含获自通过权利要求21的方法免疫的犬的与布氏疏螺旋体OspC结合的杀疏螺旋体属抗体。

24.  获自通过权利要求21的方法免疫的犬的与严格意义上的布氏疏螺旋体OspC结合的杀疏螺旋体属抗体。

25.  权利要求24的杀疏螺旋体属抗体，其包含OspC7特异性抗体。

犬莱姆病疫苗
与相关申请的交叉引用
本申请是非临时申请，其根据35U.S.C.§119(e)要求2006年11月3日提交的临时申请美国系列号60/864,258的优先权，所述临时申请的内容通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明涉及用于犬莱姆病(Lyme disease)的疫苗。还提供了单独或与其它保护剂联合制备及应用该疫苗的方法。

背景
犬莱姆病是由疏螺旋体属(Borrelia)物种(spp.)螺旋体感染引起的，所述疏螺旋体属物种螺旋体主要包括美国的严格意义上的布氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensu stricto(ss))和欧洲的严格意义上的布氏疏螺旋体(B.burgdorferi ss)、嘎氏疏螺旋体(B.garinii)和阿氏疏螺旋体(B.afzelii)(Baranton等，Int.J.Sys.Bacteriol.1992，42：378-383；Hovius等，J.Clin.Microbiol.2000，38：2611-2621)。当感染的硬蜱属(Ixodes)物种蜱获得血粉时，即传播了螺旋体，并且在犬中所发生的感染导致亚临床滑膜炎至急性关节炎和关节疼范围内的临床体征(Jacobson等，Semin.Vet.Med.Surg.1996，11：172-182；Summers等，J.Comp.Path.2005，133：1-13)。重要的是，在人类病例数量增加的同时，犬莱姆病病例的发生率每年也在持续增加(Haninkova等，Emerg.Infect.Dis.2006，12：604-610)。
针对疏螺旋体属物种感染发生反应产生的抗体具有两种不同的功能，然而迄今为止，两种反应对于从哺乳动物宿主中消除隐蔽的螺旋体都可能是无效的。对于在针对自然感染的正常免疫反应中的这一缺陷，已经假设了许多解释，包括抗原变异(Schwan，Biochem.Soc.Trans.2003，31：108-112；Tokarz等，Infect.Immun.2004，72：5419-5432)、宿主模仿(Barbour等，Microbiol.Rev.1986，50：381-400)和细胞内定位(Ma等，Infect.Immun.1991，59：671-678)。
最常见的体液免疫反应是产生非特异性结合/调理(包被)抗体，其“标记”螺旋体以使其被吞噬细胞摄取。不幸的是，调理抗体是由若干种与其它微生物共同的蛋白(即，包含细菌鞭毛的41kDa蛋白)诱导的，这使得它们对于接种疫苗诱导的抗体介导的免疫性的价值即使抱最乐观的看法也是可疑的。
第二常见的免疫反应是产生杀疏螺旋体属(borreliacidal)(致死)抗体。与调理抗体不同，杀疏螺旋体属抗体识别仅在少数疏螺旋体属物种蛋白质上的表位。在与螺旋体上的特定靶结合后，该杀疏螺旋体属抗体最通常诱导补体以形成膜攻击复合物，其杀死该生物，而不需要通过吞噬细胞的清除。
已开发了当前在疫苗中应用的犬莱姆病菌苗，以通过诱导OspA杀疏螺旋体属抗体(Hsien-Chu等，JAVMA 1992，201：403-411；Ma等，Vaccine 1996，14：1366-1374；Wikle等，Intern.J.Appl.Res.Vet.Med.2006，4：23-28；Straubinger等，Vaccine 2001，20：181-193)来提供保护，当寄生虫获得血粉时，所述抗体杀死该感染的蜱中表达OspA的螺旋体(Fikrig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89：5418-5421)。Straubinger等(Vaccine 2002，20：181-193)报道了全细胞疫苗比重组OspA诱导显著更高滴度的杀疏螺旋体属抗体。尽管此类疫苗已经相当成功，但也报道了接种失败(Levy等，JAVMA 1993，202：1834-1838；Ma等，Vaccine 1996，14：1366-1374；Schutzer等，N.Engl.J.Med.1997，337：794-795)。
现在已理解所产生的OspA杀疏螺旋体属抗体通常不能对摄食的蜱进行灭菌，因为该抗体仅识别表达OspA的严格意义上的布氏疏螺旋体(Jobe等，J.Clin.Microbiol.1994，32：618-622；Lovrich等，Infect.Immun.1995，63：2113-2119)，而蜱通常感染不表达OspA的严格意义上的布氏疏螺旋体螺旋体(Fikrig等，Infect.Immun.1995，63：1658-1662；Ohnishi等，Proc.Natl.Acad.Sci.2001，98：670-675)。此外，蜱通常还感染其它病原性疏螺旋体属物种，包括阿氏疏螺旋体和嘎氏疏螺旋体(Ornstein等，J.Clin.Microbiol.2001，39：1294-1298)，而OspA抗体是基因种特异的(Lovrich等，Infect.Immun.1995，63：2113-2119)。此外，即使当该螺旋体是敏感的，通过OspA杀疏螺旋体属抗体来保护的“机会窗口”也是有限的，因为在感染的蜱开始摄食之后，OspA(其介导与蜱中肠的吸附(Pal等，J.Clin.Invest.2000，106：561-569))的表达立即下调(Schwan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995，92：2909-2913)。
严格意义上的布氏疏螺旋体的OspC是对于杀疏螺旋体属抗体介导的免疫而言另一个潜在的靶(Rousselle等，J.Infect.Dis.1998，178：733-741)。这一蛋白质似乎具有负责诱导杀疏螺旋体属抗体的表位，并且在病原性疏螺旋体属物种中是保守的(Lovrich等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005，12：746-751)。尽管OspC蛋白的特异性功能仍然未知，但已暗示OspC的表达对于哺乳动物的感染是必需的，但对于蜱的感染不是必需的(Grimm等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.101(9)：3142-3147)。无论如何，在蜱开始摄食后不久，莱姆病螺旋体即表达OspC(Schwan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995，92：2909-2913)并且必须持续表达OspC，以建立哺乳动物中的感染(Stewart等，Infect.Immun.2006，74：3547-3553，Tilly等，Infect.Immun.2006，74：3554-3564)。因此，与OspA杀疏螺旋体属抗体相比较，OspC杀疏螺旋体属抗体的“有效性窗口”显著增加。
已显示OspC蛋白能够诱导保护性杀疏螺旋体属抗体(Rousselle等，J.Infect.Dis.1998，178：733-741，Ikushima等，FEMS Immunol.Med.Microbiol.2000，29：15-21)，然而一些之前的“作图”研究已将该表位定位至该蛋白质的高异质区域(Buckles等，Clin.Vacc.Immunol.2006，13：1162-1165)。因此，针对这些区域产生的杀疏螺旋体属OspC抗体仅能提供针对少数疏螺旋体属物种分离株的抗体介导的免疫性。Lovrich等(Clin.Diagn.Lab.Immunol.2005，12：746-751)鉴定了在该蛋白质C端7个氨基酸之内的一个OspC杀疏螺旋体属抗体表位(OspC7)。最显著的是，该表位在病原性疏螺旋体属物种中是保守的。然而，不能在实验室操作表达OspA(即，含有ospA/ospB操纵子)的传统实验室严格意义上的布氏疏螺旋体分离株，以在不显著地减少它们诱导OspA杀疏螺旋体属抗体的能力的情况下，还诱导出显著水平的OspC杀疏螺旋体属抗体。此外，用灭活的表达OspA的传统实验室严格意义上的布氏疏螺旋体分离株接种不能诱导杀疏螺旋体属OspC抗体(Schwan等，1995，Proc.Natl.Acad.SCi.USA，92：2909-2913，Obonyo等，1999，J.Clin.Microbiol.，37：2137-2141)。
Callister等(美国专利号6,210,676和6,464,985，在此通过引用并入本文)已建议单独或与OspA多肽联合应用OspC的免疫原性多肽片段，以制备保护人类和其它哺乳动物免于莱姆病的疫苗。Livey等(美国专利号6,872,550，在此通过引用并入本文)也提议用重组OspA、OspB和OspC蛋白联合制备用于针对莱姆病免疫的疫苗。然而，迄今为止，没有重组蛋白疫苗显示比当前市售疫苗更好。因此，本领域仍然有保护哺乳动物、尤其是犬免于莱姆病的改进疫苗的长期需要。
本文中任何参考文献的引用不应当解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”而可获得。
发明简述
因此，本发明提供了可用于疫苗的新的免疫原性组合物。在本发明的一个方面，疫苗针对莱姆病提供保护。在此类型的一个特定实施方案中，该疫苗的接受者是犬。在另一个实施方案中，该疫苗的接受者是家猫。其它家养哺乳动物也可能受到本发明的疫苗和/或方法的保护，诸如马和/或牛。本发明还提供了用于诱发针对莱姆病和其它疾病(例如，其它犬传染病)的保护性免疫的联合疫苗。还提供了制备和应用本发明疫苗的方法。
本发明的疫苗包含免疫有效量的表达OspC抗原的第一或单一菌株(任选灭活的)生物。该菌株是这样的菌株，即当在标准培养条件下生长时，在通过严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物中诱发的OspC-特异杀疏螺旋体属抗体(任选需要补体)存在下，该菌株能被杀死，其中所述抗体包括针对保守的表位OspC7的杀疏螺旋体属抗体。在此类型的一个具体实施方案中，疏螺旋体属基因种的第一或单一菌株组成型表达OspC抗原。在一个更具体的实施方案中，该第一菌株是严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)。
本发明的疫苗组合物还可以包括免疫有效量的来自一种或更多种另外的菌株(在本文中可将其统称为第二菌株)的灭活生物，所述另外的菌株来自病原性螺旋体属基因种。在一个特定的实施方案中，该第二菌株呈现OspA和OspB抗原。
合适的第二菌株的实例包括以下的一种或更多种：严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)、严格意义上的布氏疏螺旋体B-31(ATCC No.35210)、阿氏疏螺旋体(例如可作为ATCC No.51567获得)和嘎氏疏螺旋体(例如可作为ATCC No.51383和51991获得)、严格意义上的布氏疏螺旋体DK7、严格意义上的布氏疏螺旋体61BV3、严格意义上的布氏疏螺旋体ZS7、严格意义上的布氏疏螺旋体Pka、严格意义上的布氏疏螺旋体IP1，IP2，IP3、严格意义上的布氏疏螺旋体HII、严格意义上的布氏疏螺旋体P1F、严格意义上的布氏疏螺旋体Mil、严格意义上的布氏疏螺旋体20006、严格意义上的布氏疏螺旋体212、严格意义上的布氏疏螺旋体ESP1、严格意义上的布氏疏螺旋体Ne-56、严格意义上的布氏疏螺旋体Z136、严格意义上的布氏疏螺旋体ia和/或其任意组合。
该疫苗组合物广泛地包括每毫升约1×10⁴至约1×10¹⁰个生物体的每种菌株。在一个具体的实施方案中，该疫苗包括每毫升约1×10⁶至约5×10⁹个生物体的每种菌株。在另一个实施方案中，该疫苗包括每毫升约1×10⁸至约5×10⁸个生物体的第二菌株(或每种第二菌株)以及每毫升约5.0×10⁸至约5×10⁹个生物体的第一菌株。
该疫苗组合物还可以包括可药用佐剂，例如，诸如铝化合物(例如，磷酸铝、氢氧化铝)、可代谢和不可代谢油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质，以及(例如，CARBOPOL 941)。在一个具体的实施方案中，可药用佐剂包含水乳化液中均匀分散的微米尺寸油滴(例如，以商标市售)。
该疫苗组合物任选地还包括可药用免疫刺激剂，例如细胞因子，生长因子，趋化因子，来自淋巴细胞、单核细胞或来自淋巴器官的细胞的细胞培养物上清液，细胞制备物和/或来自植物、细菌或寄生生物的提取物，或促细胞分裂剂。
本发明还提供了用于针对病原性疏螺旋体属物种，尤其是严格意义上的布氏疏螺旋体免疫犬或其它哺乳动物的方法，包括给犬注射免疫有效量的上述发明的疫苗。此类疫苗例如可包括约1×10⁸至约3×10⁹个生物体的每种分别的菌株。可通过诸如以下的途径施与疫苗：肌肉内注射、皮下注射、静脉内注射、皮内注射、口服施与、鼻内施与及其组合。在一个具体的实施方案中，在接种疫苗后，免疫的犬产生杀疏螺旋体属抗体。
本发明还提供了从接种疫苗的动物获得的血清，所述动物含有与严格意义上的布氏疏螺旋体的OspC结合的杀疏螺旋体属抗体。类似地，本发明提供与OspC结合的纯化的抗体。在一个具体的实施方案中，该血清含有显著比例的OspC7特异性杀疏螺旋体属抗体。
本发明还提供了包括与一种或更多种其它犬病原体和/或免疫原联合的一种或更多种本发明的疏螺旋体属基因种菌株的联合疫苗，所述其它犬病原体和/或免疫原包括，例如，用于诱发针对犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬流感病毒和/或钩端螺旋体属(Leptospira)血清型(例如Leptospira kirschneri感冒伤寒型血清型、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)犬血清型、肾脏钩端螺旋体出血性黄疸型血清型和/或肾脏钩端螺旋体pomona血清型)的免疫原。可以加入到本发明的联合疫苗中的另外的犬病原体包括利什曼原虫属(Leishmania)生物(诸如硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)和婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum))；支气管败血性包特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；支原体属(Mycoplasma)物种(例如，犬支原体(Mycoplasma cynos))；狂犬病病毒；无形体属(anaplasma)生物(诸如anaplasma phagocytophilum和anaplasma platys)；以及犬埃里希氏体(Ehrlichia canis)。
通过参考以下附图和发明详述能更好地理解本发明的这些和其它方面。

附图简述
图1是正常狗血清对照(NS)或来自用测试产物(TP)接种后(研究的第43天)或用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的蜱(NI)攻击后(研究的第134天)的狗的血清的Western印迹。注意针对具有约20kDa分子量的蛋白质的感染特异性抗体的存在。
图2A是正常狗血清对照(NS)或来自用安慰剂接种和用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的蜱攻击后(研究的第134天)的各个狗(从1-15编号)的分离组群的血清的Western印迹。
图2B是正常狗血清对照(NS)或来自用测试产物接种后的各个狗(从1-15编号)的分离组群的血清的Western印迹。注意在14只(93％)用安慰剂接种的狗中(图2A)和0只(p＜0.0001)用测试产物接种的狗中(图2B)感染特异性20kDa抗体的存在。
图3A是用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的安慰剂接种的狗的关节中组织病理学改变的代表示例。在矩形内的区域代表犬莱姆关节炎特点的嗜中性粒细胞和单核细胞的显著浸润。
图3B是用严格意义上的布氏疏螺旋体感染的测试产品接种的狗的关节中不存在组织病理学改变的代表示例。椭圆形内的区域中没有任何浸润的嗜中性粒细胞和单核细胞。
图4图示了应用来自没有莱姆病或莱姆病相关症状(图表回顾)的历史的个体(n＝36)的正常血清(N)，来自献血者(BD，n＝100)或进行胆固醇筛查的个体(CS，n＝100)的不特殊的血清；或来自具有通常与严格意义上的布氏疏螺旋体抗原交叉反应的血液因子或疾病(包括抗细胞核抗体(ANA，n＝20)、类风湿病因子(RF，n＝20)、单核细胞增多症(EBV，n＝10)、巨细胞病毒(CMV，n＝10)、梅毒(SYPH，n＝13)或落基山斑疹热(RMSF n＝4))的志愿者的血清的OspC7 ELISA反应性的确定。实线表示比正常及潜在交叉反应血清平均吸附值高3个标准差。在该线之上的值对应于达99％可能性的阳性结果(1％背景值)。
图5图示了应用来自代表具有典型莱姆病损伤的患者的具有游走性红斑的极可能的(probable)莱姆病患者(n＝86)、具有“非典型损伤”的很可能的(likely)莱姆病患者(n＝22)和具有全身症状(最早的临床体征)的可能的(possible)莱姆病患者(n＝49)的血清的OspC7ELISA反应性。实线表示比正常及潜在交叉反应血清平均吸附值高3个标准差。
发明详述
本发明提供了包括免疫有效量的来自疏螺旋体属基因种一种或更多种菌株的生物体的疫苗组合物，其能在接受疫苗接种的动物中诱导有效的杀疏螺旋体属抗体介导的免疫。当在标准疏螺旋体属基因种生长条件下培养此类菌株的生物时，它们能在OspC特异性抗体存在下被杀死，所述抗体例如是在用严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物中诱发的抗体。
在本发明的一方面，与常规的仅基于OspA杀疏螺旋体属抗体的疫苗相比，由本发明疫苗诱导的抗体的有效性窗口显著地增加了。在另一方面，本发明的疫苗提供了刺激有益免疫记忆反应的更好的机会(例如，由于体内表达OspC)和/或另外的和/或增强的针对多种疏螺旋体属物种病原株的保护。
在本发明的一个实施方案中，当在标准疏螺旋体属基因种培养条件下培养此类菌株生物体时，它们组成型地表达OspC抗原。在此类型的一个具体实施方案中，当在标准疏螺旋体属基因种培养条件下培养此类菌株生物体时，它们被补体特异性反应杀死。在另一个实施方案中，由包含此类菌株生物体的疫苗所诱导的血清中的显著比例的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体对保守表位OspC7是特异的，并且由此提供了针对多种病原性疏螺旋体属基因种(例如，严格意义上的布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体和/或嘎氏疏螺旋体)的保护。在另一个实施方案中，此类菌株生物体不呈现OspA或OspB抗原。在另一个实施方案中，此类菌株生物体具有任何两个或更多个这些特征。在另一个实施方案中，此类菌株生物体具有任何三个或更多个这些特征。在另一个实施方案中，此类菌株生物体具有任何四个或更多个这些特征。在一个特别的实施方案中，此类菌株生物体具有所有的这些特征。此类特定菌株之一是严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)。
在一个备选的实施方案中，本发明的疫苗是包括如上所述的第一菌株和有效量的至少一种第二菌株的生物体的组合物。第二菌株优选来自这样的病原性疏螺旋体属基因种，即当作为本发明疫苗的一部分施与时，其能诱导杀疏螺旋体属OspA抗体。在其中还可以包括一种或更多种另外的相容的疫苗基因种。此外，本发明的疫苗可以包括一种或更多种其它哺乳动物(例如犬)病原体和/或免疫原。
为更完全地理解本发明，提供了以下定义：
为了方便在说明书中使用的单数术语决不是意图限制于此。因此，例如，提及包含“一种多肽”的组合物包括提及一种或更多种此类多肽。此外，除非另外指出，提及一个“生物体”包括提及复数个此类生物体。
本文所使用的术语“大约”可与术语“约”互换使用，表示在所标明的值百分之五十之内的值，即，含有每毫升“大约”1×10¹⁰个生物体的组合物每毫升含有5×10⁹至5×10¹⁰个生物体。
术语“基因种”由G.Baranton等，1992，International J.ofSystematic Bacteriology 42：378-383第一次使用并定义，本文中在描述非疏螺旋体属生物体分类学中与术语“物种”以相同的方式应用。
用于培养疏螺旋体属基因种的“标准培养条件”需要在约33℃至约35℃的温度下，在BSK(Barbour Stoenner Kelly)培养基中培养。本文描述的BSK培养基根据Callister等[Detection of BorreliacidalAntibodies by Flow Cytometry，第11.5.1-11.5.12节，Current Protocols inCytometry，John Wiley and Sons，Inc.Supplement 26，(2003)，在此通过引用全文并入本文]制备。(BSK培养基也可商购，例如，从Sigma，St.Louis，MO)。
本文所使用的“OspC7”是位于OspC C-端50个氨基酸之内7氨基酸区域中的免疫显性的OspC杀疏螺旋体属抗体表位(Lovrich等，2005，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，12：746-751，在此通过引用全文并入本文)，如Callister等(美国专利号6,210,676B1和6,464,985B1，在此通过引用全文并入本文)所公开的那样，其在已知的病原性疏螺旋体属物种中是绝对保守的。可通过BLAST检索编码由Lovrich等描述的该7个氨基酸的片段的密码子片段很容易地确认这一保守性。当在2006年10月9日进行该检索时，产生了含有上述OspC 7-mer表位编码片段的100个疏螺旋体属物种的结果列表。
“OspC特异性杀疏螺旋体属抗体”是例如在用严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物血清中找到的抗体，并且是与OspC抗原的任意表位选择性结合并依赖或不依赖补体杀死该螺旋体的抗体。“OspC7特异性杀疏螺旋体属抗体”是例如在用严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)接种的动物血清中找到的抗体，并且是与如Lovrich等[Clin.Diagn.Lab.Immunol.，12：746-751，(2005)，在此通过引用全文并入本文]描述的OspC 7个C-端氨基酸选择性结合并杀死该螺旋体(通常通过诱导补体介导的膜攻击复合物)的抗体。已很好地建立了OspC杀疏螺旋体属抗体的特异性。例如，通常通过在杀疏螺旋体属抗体测试中测量严格意义上的布氏疏螺旋体50772的敏感性来在莱姆病血清中检测OspC杀疏螺旋体属抗体。来自患有密切相关疾病的人类患者的血清仅极少(2％)含有也能杀死菌株50772的交叉反应抗体(详细描述于Callister等，1996，Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(4)：399-402)。此外，应用OspC7杀疏螺旋体属表位的肽ELISA精确地捕获莱姆病血清中的杀疏螺旋体属抗体，而来自患有其它密切相关疾病的患者的血清仅极少(＜2％)含有也与该OspC7肽结合的交叉反应抗体(图示于图4和5)。
当由疫苗诱导的血清中的“显著比例”的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体对保守表位OspC7特异时，其意味着在用OspC7吸附该血清后，在血清中的OspC特异性杀疏螺旋体属抗体有可检测的减少。优选定义为在用OspC7吸附该血清后，通过应用严格意义上的布氏疏螺旋体50772检测的血清的杀疏螺旋体属抗体滴度至少2倍的减少，更优选定义为血清的杀疏螺旋体属抗体滴度2至4倍或更多的减少。
“补体特异性反应”是需要血清补体存在以通过杀疏螺旋体属抗体杀死疏螺旋体属物种生物体的抗体反应。
为本发明的目的，“灭活的”严格意义上的布氏疏螺旋体生物体是这样的生物体，即其能够在动物中诱发免疫反应，但是不能感染动物。可通过选自由以下组成的组的试剂灭活严格意义上的布氏疏螺旋体分离株：二乙烯亚胺、福尔马林、β-丙内酯、硫柳汞或加热。在一个特定的实施方案中，通过二乙烯亚胺灭活严格意义上的布氏疏螺旋体分离株。
术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，其定义为一种或更多种引起免疫系统刺激的物质。在本文中，应用佐剂以增强针对一种或更多种疫苗抗原/分离株的免疫反应。可在施与疫苗之前、与施与疫苗联合、或在其之后向目标动物施与佐剂。可从许多来源中的任何来源获得本发明的佐剂，包括来自自然来源、重组来源和/或化学合成等。用作佐剂的化学化合物的实例包括但不限于铝化合物、可代谢和不可代谢油、嵌段聚合物、ISCOM’s(免疫刺激复合物)、维生素和矿物质(包括但不限于：维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、QuilA(皂甙)，以及与聚链烯醚或二乙烯乙二醇交联的丙烯酸聚合物(例如)。有时特别提及为免疫刺激剂的佐剂的其它实例包括细菌和真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、β-1，3/1，6-聚糖)、衍生自植物的各种复合碳水化合物(例如，聚糖、乙酰吗喃)、衍生自动物的多种蛋白质和肽(例如，激素、细胞因子、共刺激因子)、以及衍生自病毒和其它来源的新核酸(例如，双链RNA、CpG)。此外，上述物质任意数量的组合可提供佐剂效果，因此能够形成本发明的佐剂。一种优选的佐剂是
在美国专利号6,210,676指出的严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)和在美国专利号6,316,005指出的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10(ATCC No.PTA-1680)分别在1999年7月30日和2000年4月11日保藏在美国模式培养物保藏所(American TypeCulture Collection)，10801 University Boulevard Manassas(VA)20110。本发明权利的共同拥有者分别地享有上述这两个专利的权利。
也应当理解，本发明不限于本文公开的特定构型、方法步骤和材料，因为此类构型、方法步骤和材料可以有些不同。还应当理解，本文使用的术语仅仅是用于描述特定实施方案的目的，并不意图用于限制，因为本发明的范围仅通过所附权利要求及其等同形式限定。
另外的疫苗菌株
另外的OspC菌株
在一方面，本发明提供了在针对莱姆病提供保护的疫苗中严格意义上的布氏疏螺旋体50772(ATCC No.PTA-439)的单独或与其它疏螺旋体基因种菌株联合的用途。值得注意的是，最开始拒绝把严格意义上的布氏疏螺旋体50772作为有用的疫苗候选者是因为错误地报道了这一菌株不表达OspC(Anderson等，1996，J.Clin.Microbiol.，34：524-529)。
本发明还提供了选择/鉴定对本发明的疫苗有用的其它此类分离株的独特且特异的标准。具体而言，可以选择/鉴定对通过OspC特异性抗体杀死敏感的分离株，并且优选地还具有一个或更多个或所有以下特性：(i)对通过补体特异性反应由OspC特异性抗体杀死的敏感性，(ii)在用该分离株接种的接受者中诱导OspC杀疏螺旋体属抗体的能力；(iii)显著比例的这样诱导以对C端7个氨基酸内的保守表位(OspC7)是特异的OspC杀疏螺旋体属抗体；(iv)缺乏表达OspA和OspB的能力；和/或(v)在体外组成型表达OspC的能力。
A.通过培养条件抑制OspA/B表达并增强OspC表达
Obonyo等(J.Clin.Microbiol.1999，37：2137-2141)已显示，通过将正常病原性疏螺旋体属物种菌株(严格意义上的布氏疏螺旋体菌株JMNT和N40)和蜱细胞系(肩突硬蜱(Ixodes scapularis)ISE6)共培养5天能够下调OspA表达并上调OspC表达。在37℃培养能观察到最显著的效果。因此，本方法能够将一种或更多种常规的疏螺旋体属菌株转化为可用于本发明疫苗的形式。
B.通过突变抑制OspA/B表达并增强OspC表达
在另一个实施方案中，应用对最初表达OspA和OspB的疏螺旋体属物种菌株的遗传操作以下调或缺失编码OspA和OspB表达的基因，其导致OspC表达的上调。预期可将任何本领域已知的遗传操作方法用于这一目的。例如，可以制备有抗生素选择标记的疏螺旋体属物种相容质粒的形式将失活的OspA/OspB基因类似物导入疏螺旋体属物种菌株的复数个生物体中(例如，参见Grimm等，2004，Proc.Nat′lAcad.Sci 101(9)：3142-3147，其报道了可通过将OspC失活和互补质粒插入到布氏疏螺旋体B31-A3菌株中封闭疏螺旋体属物种中OspC的表达)。在所导入的质粒和天然存在的携带OspA/OspB的质粒之间的重组事件将产生一定数量的成功重组的携带有突变OspA/OspB质粒的疏螺旋体属物种生物体。例如可通过连接的抗生素耐性及在相应抗生素的存在下培养以预先进行选择。预期具有选择性消除OspA/OspB表达的疏螺旋体属物种生物体上调OspC的表达。
在另一个任选的实施方案中，在疫苗组合物中可以包括一种或更多种表达OspA、OspB和/或一种或更多种其它Osp抗原的另外的严格意义上的布氏疏螺旋体或疏螺旋体属物种生物体作为另外的生物体。
每种灭活的生物体优选以约1×10⁴至约1×10¹⁰生物体/mL的浓度范围存在于该疫苗中。具体而言，优选以不少于1.0×10⁸生物体/mL的严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10、以及不少于5.0×10⁸生物体/mL的严格意义上的布氏疏螺旋体50772的剂量将疫苗施用于犬。
另外的OspA菌株
第二菌株，假设是OspA抗原，可以是常规的病原性实验室严格意义上的布氏疏螺旋体分离株(Barbour等，1985，J.Clin.Microbiol.52：478-484)，诸如严格意义上的布氏疏螺旋体B-31(ATCC No.35210)。特定的第二生物体的例子是严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10菌株(ATCC No.PTA-1680)。适于用作针对北美之外区域优化的疫苗组合物的第二生物体的另外的菌株包括例如以下菌株：严格意义上的布氏疏螺旋体B-31(ATCC No.35210)、阿氏疏螺旋体(例如，可作为ATCC No.51567获得)和嘎氏疏螺旋体(例如，可作为ATCC No.51383及51991获得)，以及在下表1中列出的那些。
表1

¹Lagal等，J.Clin.Microbiol.2003，41：5059-5065.
²Heikkila等，J.Clin.Microbiol.2002，40：1174-1180.
疫苗组合物可以包括可药用佐剂。“佐剂”是这样的试剂，即其非特异地增加针对特定抗原的免疫反应，由此减少在任何给定疫苗中所需抗原的量，和/或为产生足够的针对目的抗原的免疫反应所需的注射频率。用于动物接种的合适的佐剂包括但不限于：佐剂65(含有花生油、一油酸二缩甘露醇酯(mannide monooleate)和单硬脂酸铝)；弗氏完全或不完全佐剂；矿物凝胶(诸如氢氧化铝、磷酸铝和明矾)；表面活性剂(诸如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、N，N-双十八烷基-N′，N′-双(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油、以及pluronic多元醇)；聚阴离子(诸如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸以及(例如CARBOPOL 941))；肽(诸如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬肽(tuftsin))；以及油乳剂。关于佐剂的信息公开于，例如P.Tijssen的系列[Practice and Theory of EnzymeImmunoassays，第3版，1987，Elsevier，New York，通过引用在此并入]。
疫苗组合物任选地还可以包括可药用免疫刺激剂，诸如细菌和/或真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽)、多种衍生自植物的复合碳水化合物(例如聚糖、乙酰吗喃)、多种衍生自动物的蛋白质和肽(例如激素、细胞因子、共刺激因子)、以及衍生自病毒和/或其它来源的新核酸(例如双链RNA、CpG)。
可通过任意标准途径容易地施与疫苗组合物，包括：静脉内、肌肉内、皮下、口服、鼻内、皮内和/或腹膜内接种。技术人员能够理解优选针对每一类受体动物和施与途径恰当地配制疫苗组合物。
因此，本发明还提供了针对严格意义上的布氏疏螺旋体和其它疏螺旋体属物种免疫犬的方法。一种此类方法包括用免疫有效量的本发明的疫苗注射犬，由此该犬产生适当的OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体。
在一个实施方案中，本发明的皮下施与引起高浓度OspA和OspC杀疏螺旋体属抗体的产生，所述抗体包括对OspC7特异的杀疏螺旋体属抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了有效针对有害疏螺旋体属物种的包含特定的、最小量的每种严格意义上的布氏疏螺旋体菌株的疫苗。在另一个实施方案中，本发明的疫苗对在狗中预防严格意义上的布氏疏螺旋体和其它病原性疏螺旋体属物种感染是有效的。在一个特定的实施方案中，该疫苗包含安全且免疫有效的两种本发明的严格意义上的布氏疏螺旋体菌株的组合及可药用佐剂。
本发明公开了包含特定最小量的两种严格意义上的布氏疏螺旋体分离株的疫苗保护狗在蜱攻击后免受疏螺旋体属物种感染。本发明还公开了在接种疫苗的狗中诱发特定最小量的严格意义上的布氏疏螺旋体特异性OspA和疏螺旋体属物种特异性OspC杀疏螺旋体属抗体的疫苗。本发明的疫苗还可以与可接受的免疫刺激剂和/或佐剂一起施与。
实施例
以下实施例用于提供本发明的进一步理解，但决不是意味着限制本发明的有效范围。
实施例1
用重组OSPA接种疫苗
A.材料和方法
动物
从Charles River Breeding Laboratories，Inc.(Wilmington，Mass.)获得5至10周龄的LVG仓鼠。在21℃的环境温度下每笼饲养3或4只仓鼠，并且无限制地提供食物和水。
接种仓鼠并收集血清
用0.5mL可商购的重组OspA(rOspA)疫苗Lyme(Merial Limited，Duluth，GA)在颈背皮下接种仓鼠，并且在初次接种3周后给予加强剂量。在初次接种3、7、9和15周后，通过吸入包含在鼻口杯中的乙醚适度麻醉每组5只仓鼠的组，并且通过心内穿刺取血。使血液凝固，分离血清并在-70℃储存直到使用。此外，汇集来自三只未接种仓鼠的仓鼠血清，并且用作正常血清对照。作为另外的对照，用0.25mL可商购的含有严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10的全细胞犬莱姆病疫苗(Galaxy，Solvay Animal Health，Inc.，MendotaHeights，Minn.，现在是Schering-Plough Animal Health，Elkhorn，Nebraska)同时在两条后股上接种20只仓鼠。给予该动物加强剂量，如上所述收集血清。
制备BSK培养基
将Barbour-Stoenner-Kelly(BSK)肉汤培养基用于体外培养布氏疏螺旋体，并且其为在杀疏螺旋体属抗体测试及本申请从头至尾描述的方法中所应用的主要基质。如Callister等[Detection of BorreliacidalAntibodies by Flow Cytometry，第11.5.1-11.5.12节，Current Protocolsin Cytometry，John Wiley and Sons，Inc.，Supplement 26，(2003)，在此通过引用全文并入本文]描述的那样制备BSK培养基。简而言之，通过以下方法制备BSK培养基：
材料：
HEPES(Sigma)
Neopeptone(Difco)
柠檬酸钠(Sigma)
葡萄糖(Sigma)
碳酸氢钠(Sigma)
TC酵母自溶液(TC yeastolate)(Difco)
丙酮酸(Sigma)
N-乙酰葡萄糖胺(Sigma)
牛血清白蛋白(Sigma)
明胶(微生物学级；Difco)
5N NaOH
10×含有L-谷氨酰胺且没有碳酸氢钠的Connaught MedicalResearch Laboratories(CMRL)1066(MP Biomedicals)或Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640培养基(Sigma)
兔血清(Life Technologies)，在56℃热灭活45分钟
56℃水浴
正压泵
微孔滤器多支管
预滤器(124mm)
0.2-、0.45-和0.8-μm滤器(142-mm直径)
0.2-μm钟形滤器(bell filter)
无菌100ml容器
暗视野显微镜
BSK培养基的制备
1.在2升烧瓶中合并以下物质，混合2至4小时。
900mL Mini-Q双重过滤或去离子蒸馏水：
6.0g HEPES
5.0g neopeptone
0.7g柠檬酸钠
5.0g葡萄糖
2.2g碳酸氢钠
2.5g TC酵母自溶液
0.8g丙酮酸
0.4g N-乙酰葡萄糖胺
50g牛血清白蛋白(级份V)
2.应用最慢的搅动板设置缓慢地混合上述组分，因为剧烈的搅拌可能导致对布氏疏螺旋体有毒的分解产物。
3.在混合BSK组分的同时，如下制备明胶溶液：在500ml烧瓶中，将200ml Mini-Q双重过滤或去离子蒸馏水和14g明胶合并，并在培养基设置上搅拌加热以溶解。然后将该溶液在121℃高压灭菌15分钟，之后置于56℃水浴中。
4.当BSK组分完全溶解时，用5N NaOH将该溶液调节至pH 7.5。
5.然后将200mL明胶溶液、100mL 10×CMRL 1066培养基和64mL热灭活兔血清(在56℃45分钟)与其它BSK组分合并，并充分混合。
BSK培养基灭菌
6.应用正压泵，将BSK培养基泵送通过装载有124-mm预滤器和142-mm 0.2-、0.45-和0.8-μm孔直径滤器(按孔尺寸最小(底部)至最大(顶部)重叠滤器)的微孔滤器多支管。[不能通过高压灭菌对BSK培养基灭菌。在过滤灭菌之前需要预过滤以移除大的颗粒]。
7.然后应用正压泵和无菌0.2-μm钟形滤器将BSK培养基过滤灭菌至无菌容器中。
确认无菌
8.无菌操作移出1ml无菌BSK整分试样并转移至无菌1.5ml微量离心管中，并在35℃孵育过夜。将剩下的过滤灭菌的BSK储存在4℃。
9.在孵育后，应用暗视野显微镜检查无菌BSK以确认无菌。
10.然后将无菌BSK转移至无菌储存容器中。[在填装储存容器时，保持顶部空间最小，以减少无菌BSK培养基的氧化]。
Barbour-Stoenner-Kelly(BSK)培养基的质量控制
在应用BSK培养基之前，确保BSK支持少量疏螺旋体属物种的生长并且有活力的螺旋体不成团生长是很重要的。BSK培养基的高度可变组分是牛血清白蛋白(BSA)。本文应用的质量控制规程利用测试培养物以孵育并检查产生的培养物，如同上的Callister等，2003详细描述的那样。
OspA杀疏螺旋体属抗体的检测
应用流式细胞方法和严格意义上的布氏疏螺旋体S-1-10检测OspA杀疏螺旋体属抗体(Callister等，Arch.Intern.Med.1994，154：1625-1632)。用新鲜BSK将新鲜的螺旋体培养物稀释至约5×10⁶螺旋体/ml的浓度。同时，用新鲜BSK 1∶40稀释血清样品并通过0.2微米(μm)孔大小的微量离心滤器灭菌。然后将200μL试样转移至无菌1.5mL螺旋盖微量离心管中，并在BSK中从1∶80至1∶20,480系列稀释。在56℃热灭活血清样品10分钟，并加入100μL螺旋体悬浮液试样(5×10⁵螺旋体)和10μL无菌豚鼠补体(Sigma)。充分混合测试样品并在35℃温育16-24小时。
在温育后，将100μL每一测试悬浮液转移至含有400μL PBS和1μg/mL吖啶橙的聚丙烯管中。然后应用FACScan流式细胞仪(BectonDickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)检测杀疏螺旋体属活性。通过选通(gating)(CellQuest software，Becton Dickinson)分离螺旋体并用低流速设置分析1-2分钟。通过监测当吖啶橙嵌入起泡的、没有活力的螺旋体时所发生的增加的荧光密度间接检测OspA杀疏螺旋体属抗体。认为与正常血清对照相比平均荧光密度≥13％的变化是阳性的(Callister等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.2002，9：908-912)。然后通过暗视野显微镜确认起泡的、非运动性的布氏疏螺旋体的存在。每一测试包括阳性对照，并且需要来自运行之间相同的反应性(+/-1稀释度)，以最小化测试间变化性。此外，同时分析收集自每只狗的血清样品。
B.结果
用rOspA疫苗接种7周后仅诱导极小量(平均滴度＜61)的OspA杀疏螺旋体属抗体，其在15周后即检测不到(表2)。相反，用含有典型(Barbour等，J.Infect.Dis.1985，152-478-484)严格意义上的布氏疏螺旋体菌株(S-1-10)的犬疫苗接种的仓鼠诱导高水平的杀疏螺旋体属OspA抗体，其在第7周达到峰值(滴度＞2560)并在该研究的持续时间保持高水平。
表2.在用rOspA或GALAXY^TM(S-1-10)犬莱姆病疫苗接种后OspA杀疏螺旋体属抗体^b的平均滴度^a