生产威兰胶的菌株及方法.pdf

一株生产威兰胶的海洋菌株，属于鞘氨醇单胞菌（Sphingomonassp.WG），保藏号为CCTCC No: M2013161。在液体培养基中培养本发明菌株，可获得威兰胶，生产效率较高。本发明的菌株对碳源和氮源要求较低。发酵工艺步骤为：（1）培养种子液；（2）发酵生产威兰胶。提取纯化步骤为：（1）发酵液预处理；（2）粗品析出；（3）除杂质；（4）干燥得到威兰胶产品。利用本发明的海洋菌株发酵生产威兰胶产量最高可达33g/L，提取纯化收率最高可达95%。利用本发明能够实现威兰胶的低成本、高效率、高品质的生产。

1.  一种生产威兰胶的鞘氨醇单胞菌WG菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: M2013161。

2.  根据权利要求1所述的生产威兰胶的菌株，其特征在于：
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）由青岛胶州湾海泥中分离得到，其单菌落呈黄色，圆形，中央凸起，粘稠，不透明，边缘整齐，表面光滑；
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG）菌株形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢；
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）生理生化特征：生长温度为20~40℃，生长pH为4~9，NaCl耐受性为3%；氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、β-半乳糖苷酶以及柠檬酸利用实验为阳性，VP、吲哚产生、明胶水解实验、H₂S产生实验为阴性。

3.  一种发酵生产威兰胶的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：（1）菌种活化：将权利要求1所述的菌株在YPD固体培养基中于20~40℃恒温培养2~6天；（2）种子液制备：将步骤1）中活化好的单菌落接种于新鲜无菌的YPD液体培养基中培养，之后采用逐级放大扩培的方式进行，培养温度为20~40℃，培养时间为10~26小时；（3）发酵生产威兰胶：将步骤2）中逐级扩培得到的种子液以1%~15%的接种比例接种于发酵培养基中，通过对发酵过程的调控实现威兰胶的发酵生产，可获得较高产量的威兰胶。

4.  根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于步骤3）所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，碳源1~15%，氮源0.2~5.0%，硫酸镁0.02~0.2%，磷酸氢二钾0.02~0.4%，磷酸氢二钠0.3~1.0%，磷酸二氢钠0.1~0.5%，pH值为4.5~8.5。

5.  根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、淀粉和糊精之中的一种或几种。

6.  根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的氮源为蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、硫酸铵和硝酸盐之中的一种或几种。

7.  根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的发酵过程的调控分为三个阶段：第一阶段：0~24小时，此阶段为菌体生长阶段，逐步提高发酵罐内的溶氧水平，控制在20%以上；第二阶段：24~48小时，此阶段为前体补加阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加前体物质；第三阶段，48~90小时，此阶段为补料阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加一定比例的碳源和氮源维持威兰胶的生产。

8.  根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的前体物质为甘露糖、鼠李糖、甘露醇和乙酸盐中的一种或几种。

9.  根据权利要求4所述的发酵生产威兰胶的方法，其特征在于所述的威兰胶的产量高达33 g/L。

10.  一种提取纯化威兰胶的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）发酵液预处理：采用除菌方法以破坏或去除菌体细胞，并抑制威兰胶被降解；（2）粗品析出：将步骤（1）中预处理好的发酵液与醇溶剂混合，体积比为1:1~1:5，以pH调节剂调节混合液pH，使其最终pH为2~7，反应时间大于10分钟，威兰胶逐渐析出，采用离心、过滤等方法获得威兰胶粗品；（3）除杂质：将步骤（2）中的威兰胶粗品用洗涤溶剂进行洗涤除杂，获得威兰胶半成品；（4）干燥：将步骤（3）中获得的威兰胶半成品采用干燥方法进行脱水干燥，获得威兰胶成品，总收率最高可达95%。

11.  根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤1）中所述的除菌方法包括加热、添加杀菌剂、离心和过滤中的一种或几种。

12.  根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤2）中所述的醇溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或几种。

13.  根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤2）中所述的pH调节剂为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸、草酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种或几种。

14.  根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤3）中所述的洗涤溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种。

15.  根据权利要求11所述的提取纯化威兰胶的方法，其特征在于步骤4）中所述的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥中的一种或几种。

生产威兰胶的菌株及方法
技术领域
本发明涉及一株高产威兰胶的海洋菌株鞘氨醇单胞菌（Sphingomonassp. WG）及利用该菌株进行威兰胶高产发酵和提取纯化的工艺方法，属于工业微生物技术领域。
背景技术
威兰胶（Welan gum）是一种由微生物合成的杂多糖，是一种高分子聚合物，它的骨架结构由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖的单元组成。侧链由单链的L-甘露糖或单链的L-鼠李糖构成。
威兰胶具有良好的热稳定性、悬浮性、乳化性和增稠性，可作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和粘合剂应用于工农业的各个方面，特别是在食品、混凝土、石油和油墨等工业中具有广泛的应用前景。
目前，威兰胶主要是通过微生物发酵法生产，美国kelco公司现已成为全球最大的威兰胶生产和供应商，国内对威兰胶的研究尚处于起步阶段，南京工业大学、南昌大学、江南大学和河北鑫合化工有限公司从事这方面的研究，但生产菌株和发酵工艺各不相同，此外还未见其他相关报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种鞘氨醇单胞菌，其可以在低成本的液体培养基中合成威兰胶。
本发明的另一个目的在于提供一种威兰胶的发酵生产工艺。
本发明的最后一个目的在于提供一种威兰胶的提取纯化工艺。
本发明所述的一种产威兰胶的菌株，其特征在于所述的菌株为鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG），于2013年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学），保藏号为：CCTCC No: M2013161；本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG）由青岛胶州湾海泥中分离得到，其单菌落呈黄色，圆形，中央凸起，粘稠，不透明，边缘整齐，表面光滑；本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp. WG）菌株形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢；本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonas sp.WG）生理生化特征：生长温度为20~40℃，生长pH为4~9，NaCl耐受性为3%；氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、β-半乳糖苷酶以及柠檬酸利用实验为阳性，VP、吲哚产生、明胶水解实验、H₂S产生实验为阴性。
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）的16S rRNA基因序列特征：将鞘氨醇单胞菌WG接种于LB培养基，30℃ 180 rpm 培养 16~18 h，利用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取其基因组DNA，采用上游引物5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增，得到其16S rRNA基因片段。PCR条件如下：94℃ 5 min； 94℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。将PCR扩增得到的16S rRNA基因片段纯化后，用快连试剂盒连接至pMD18-T载体，连接产物转化E. coli DH5α，在含100 μg /mL氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，经PCR鉴定获得阳性克隆，将单克隆送去上海生工生物工程有限公司，利用pMD18-T载体通用测序引物进行测序。测序结果表明，该菌株16S rRNA基因序列长度为1434 bp。
一种威兰胶的发酵生产工艺，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将鞘氨醇单胞菌在YPD固体培养基中于20~40℃恒温培养2~6天；（2）种子液制备：将步骤（1）中活化好的单菌落接种于新鲜无菌的YPD液体培养基中培养，之后采用逐级放大扩培的方式进行，培养温度为20~40℃，培养时间为10~26小时；（3）发酵生产威兰胶：将步骤（2）中逐级扩培得到的种子液以1%~15%的接种比例接种于发酵培养基中，通过对发酵过程的调控实现威兰胶的发酵生产，可获得较高产量的威兰胶，最高可达33 g/L。
步骤（3）所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，碳源1~15%，氮源0.2~5.0%，硫酸镁0.02~0.2%，磷酸氢二钾0.02~0.4%，磷酸氢二钠0.3~1.0%，磷酸二氢钠0.1~0.5%，pH值为4.5~8.5。
所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜、甘油、淀粉和糊精之中的一种或几种。
所述的氮源为蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、花生饼粉、生物氮素、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、硫酸铵和硝酸盐之中的一种或几种。
步骤（3）所述的发酵过程的调控分为三个阶段：第一阶段：0~24小时，此阶段为菌体生长阶段，逐步提高发酵罐内的溶氧水平，控制在20%以上；第二阶段：24~48小时，此阶段为前体补加阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加前体物质；第三阶段，48~90小时，此阶段为补料阶段，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加一定比例的碳源和氮源维持威兰胶的生产。
所述的前体物质为甘露糖、鼠李糖、甘露醇和乙酸盐中的一种或几种。
一种威兰胶的提取纯化工艺，包括如下步骤：
（1）发酵液预处理：采用除菌方法以破坏或去除菌体细胞，并抑制威兰胶被降解；（2）粗品析出：将步骤（1）中预处理好的发酵液与pH调节剂调节后的酸性醇溶剂混合，体积比为1:1~1:5，混合液最终pH为2~7，反应时间大于10分钟，威兰胶逐渐析出，采用离心、过滤等方法获得威兰胶粗品；（3）除杂质：将步骤（2）中的威兰胶粗品用洗涤溶剂进行洗涤除杂，获得威兰胶半成品；（4）干燥：将步骤（3）中获得的威兰胶半成品采用干燥方法进行脱水干燥，获得威兰胶成品，总收率最高可达95%。
步骤（1）中所述的除菌方法包括加热、添加杀菌剂、离心和过滤中的一种或几种。
步骤（2）中所述的醇溶剂为甲醇、乙醇和异丙醇中的一种或几种。
步骤（2）中所述的pH调节剂为盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸、草酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种或几种。
步骤（3）中所述的洗涤溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种。
步骤（4）中所述的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥中的一种或几种。
本发明的优点：
1. 本发明提供的鞘氨醇单胞菌从青岛胶州湾海泥中分离得到，对高盐环境具有良好的耐受性，可利用多种廉价的碳源和氮源发酵生产威兰胶。
2. 采用有效的发酵调控手段，将威兰胶发酵过程分为三阶段控制，为菌体生长和威兰胶的合成提供适宜的溶氧、碳源、氮源和前体物质，最终发酵产量高达33 g/L，超过其他文献报道的20 g/L左右的产量，实现了威兰胶的高效生产。
3. 采用了发酵液预处理、粗品析出、除杂和干燥4步工艺从发酵液中提取纯化威兰胶，在整个提取过程初始添加杀菌剂，进一步有效抑制威兰胶被降解，总收率可达95%，工艺简单，适合工业化生产。
附图说明
图1是LB培养基上30℃培养24 h时菌株WG的单菌落形态。
图2是威兰胶发酵过程曲线。
具体实施方式
实施例1 本发明提供的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.WG菌株的形态和生理生化鉴定
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）由青岛胶州湾海泥中分离得到，经过连续多次稀释涂平板得到纯培养物。通过革兰氏染色、形态观察、博检革兰氏阴性细菌鉴定系统对其菌株形态和生理生化反应进行鉴定。
鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）在LB平板上30℃培养24 h即可长出单菌落，其单菌落呈黄色，圆形，中央凸起，粘稠，不透明，边缘整齐，表面光滑（见附图1）；该菌株革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢；其生长温度为20~40℃，生长pH为4~9，NaCl耐受性为3%；氧化酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、β-半乳糖苷酶以及柠檬酸利用实验为阳性，VP、吲哚产生、明胶水解实验、H₂S产生实验为阴性。
实施例2 本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）的16S rRNA基因的克隆和序列测定
本发明提供的鞘氨醇单胞菌WG（Sphingomonassp.WG）的16S rRNA基因序列特征：将WG菌株接种于LB培养基，30℃ 180 rpm培养16~18 h，利用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取其基因组DNA，采用上游引物5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’ 进行PCR扩增，得到其16S rRNA基因片段。PCR条件如下：94℃ 5 min； 94℃ 50 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。将PCR扩增得到的16S rRNA基因片段纯化后，用快连试剂盒连接至pMD18-T载体，连接产物转化E. coli DH5α，在含100 μg /mL氨苄青霉素的LB 平板上进行筛选，经PCR鉴定获得阳性克隆，将单克隆送去上海生工生物工程有限公司，利用pMD18-T载体通用测序引物进行测序。测序结果表明，该菌株16S rRNA基因序列长度为1434 bp。
实施例3 种子液的制备
固体培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH7.5。
液体培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH7.5。
将鞘氨醇单胞菌WG的菌种在YPD固体培养基划线于30℃恒温培养4天进行活化，待长出黄色菌落，于2~4℃下短期保藏待用。将活化好单菌落接入装有YPD液体培养基的250 ml三角瓶中，三角瓶装液量为50 ml，在30℃、摇床转速为230 rpm下恒温培养18 h，获得一级种子液。将一级种子液以1.5%接种量接种于含有100 ml液体YPD培养基的500 ml三角瓶中，在30℃、摇床转速为230 rpm下恒温培养15 h，获得二级种子液。
实施例4 发酵罐（20 L）中发酵生产威兰胶
液体发酵培养基：麦芽糖5%，酵母膏0.4%，玉米浆0.2%，生物氮素1.5%，硫酸镁0.8%，磷酸氢二钾0.2%，磷酸氢二钠0.75%，磷酸二氢钠0.25%。121℃实罐灭菌20分钟。
将实施例3中所获得的鞘氨醇单胞菌二级种子液以10%接种量接种于含有15 L液体发酵培养基的20 L发酵罐中，初始条件：pH为7.5，转速为300 rpm，通气量为7.2 L/min，温度为30℃。
对威兰胶发酵进行三个阶段的调控。第一阶段：0~24小时，通过提高转速、增加罐压、添加氧载体等方式逐步提高发酵罐内的溶氧水平，始终控制溶氧大于20%；第二阶段：24~48小时，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加前体物质甘露糖和鼠李糖，二者比例为1:1，最终补加量均为1.2 g/L；第三阶段，48~90小时，控制发酵罐内溶氧水平在30%以上，并补加葡萄糖和酵母膏来维持威兰胶的生产，二者比例为10:1，最终补加量分别为40 g/L和4 g/L。威兰胶产量达33.3 g/L，发酵液体积达17 L，总产量为566 g。发酵过程曲线见附图2。
实施例5 威兰胶的提取纯化
将实施例4中获得的威兰胶发酵液中添加异噻唑啉酮使其终浓度为0.2 g/L，以杀死发酵液中鞘氨醇单胞菌，并破坏蛋白质的键，从而抑制细胞液中的多种酶类的活性，保证威兰胶不被降解。
将预处理好的发酵液与草酸调节的酸性乙醇混合，体积比为1:1，混合液最终pH为5.2，反应时间20分钟，威兰胶逐渐析出，采用板框过滤的方法获得威兰胶粗品。
将威兰胶粗品依次用丙酮和纯水进行洗涤3次，威兰胶：丙酮为1:1（质量体积比），威兰胶：水为1:2（质量体积比），以除去多余的杂蛋白、细胞碎片和盐，采用板框过滤的方法获得威兰胶半成品，丙酮加以回收利用。
将威兰胶半成品至于低温连续真空干燥机中进行干燥，干燥温度为80℃，干燥时间大于1小时，至含水量低于10%，取出后经粉碎最终获得威兰胶成品，总收率为95.4%。