由复合 MSC 的 PLGA/TCP 和 MSC 组成的制剂及其应用 【技术领域】
本发明涉及由复合 MSC 的 PLGA/TCP 和 MSC 组成的制剂及其应用。背景技术 由疾病、 创伤所致的骨、 软骨缺损是临床常见且较难医治的病症， 而各种原因造成 的关节软骨缺损以及因自身缺乏有效的修复能力， 造成损伤后常引起疼痛和关节功能障碍 等。间充质干细胞为骨缺损的治疗提供了广阔的前景。
间充质干细胞 (MSC) 来源广泛， 广泛存在于全身结缔组织和器官间质中， 具有自 我更新和增殖能力， 在适宜的微环境中具有多潜能分化特性。基于 MSC 具有易获得、 易培 养、 方便运输、 低免疫原性、 免疫调节特性、 能在宿主体内长期存活、 易于外源基因转染和转 染后外源基因可以稳定表达等优点， 其已成为组织工程、 细胞移植、 基因治疗及器官移植等 领域的理想种子细胞。将 MSC 作为种子细胞与支架材料复合之后移植到创伤部位， 被认为 是现今最好的修复骨缺损的方法之一。
支架材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能， 还必须具有生物安全性， 组 织相容性等基本特性， 以保证其使用的安全性， 聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物 (PLGA/ TCP) 为常用的生物材料。有大量研究报道表明， MSC 与生物材料相复合， 在体内可以向成 骨、 软骨组织分化。但是仍然存在一些不足， 目前利用 MSC 来促进组织工程骨的研究， 基本 上是自体细胞移植， 从而产生了许多局限性 ： 自体 MSC 来源有限 ； 增加机体创伤 ； 体外扩增 需要一定时间而难于应用于急诊手术等。 MSC 具有低免疫原性及免疫调节能力， 提示 MSC 可 用于异体移植， 而异体 MSC 移植是否存在安全问题， 其在体内引起怎样的免疫反应变化等 目前还没有明确的结论。
国内郝伟等应用兔脂肪干细胞与 PLGA/TCP 复合， 从而构建成骨组织工程复合体， 体外成骨诱导培养 2 周， 结果发现成骨分化成功。但是关于生物工程骨在体内引起的免疫 反应还没有报道， 生物工程骨移植后成功率也是潜在的问题。 并且， 组织工程骨要在临床推 广应用也必须实现产业化生产、 降低移植物成本， 也要考虑异体细胞的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于减轻生物材料复合骨片异体移植免疫反应的制 剂。
本发明提供的用于减轻生物材料复合骨片异体移植免疫反应的制剂的活性成分 是如下单独包装的物质 1) 和 2) ：
1) 由间充质干细胞和聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物复合成的生物材料复合 骨片 ；
2) 离体的间充质干细胞。
优选地是物质 1) 和 2) 中的间充质干细胞是相同来源的。
物质 1) 中， 所述生物材料复合骨片的制备方法包括如下步骤 ： 将所述间充质干细胞滴加到所述聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物上， 在 35℃ -40℃和 4-6％ CO2 培养条件下 培养 1.5-3 小时。
进一步， 上述培养条件是 37℃和 5％ CO2 ； 培养时间为 2 小时。
上述间充质干细胞与所述聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物的配比是 ： 长 5mm、 宽 5 5个 5mm、 厚 1-2mm 的聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物上复合 10 -5×10 间充质干细胞。
进一步讲， 上述间充质干细胞与所述 PLGA/TCP 的配比是 ： 长 5mm、 宽 5mm、 厚 1-2mm 5 的聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物上复合 2×10 间充质干细胞。
本发明的另一目的在于提供另一种用于减轻生物材料移植免疫反应的制剂。
本发明提供的另一种用于减轻生物材料移植免疫反应的制剂的活性成分是如下 单独包装的物质 a) 和 b) ：
a) 聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物 ；
b) 离体的间充质干细胞。
物质 a) 中， 所述聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物是长 5mm、 宽 5mm、 厚 1-2mm。
实验证明 ： 材料生物材料复合骨片异体皮下移植 1 周后， 可以看到生物材料复合 骨片移植体区域 (M+T) 与相应的单纯材料移植组 (T) 相比， 并没有减少炎性细胞浸润， 主要 为淋巴细胞浸润， 而输注 MSC(M+T-C， T-C) 后， 发现降低了炎性细胞的浸润 ； 取移植后 1 周各 组小鼠脾脏， 做病理切片， HE 染色分析， 观察到生物材料复合骨片移植体区域 (M+T) 以及单 纯材料移植组 (T) 的脾小结较大， 较多， 而输注 MSC(M+T-C， T-C ； ) 后脾小结相应减小和减 + 少， MSC 输注降低了 CD3 T 淋巴细胞早期活化指标 CD69 的比例。 。由此可见， 我们建立了一 种间充质干细胞静脉输注来减轻生物材料或生物材料复合骨片异体移植所引起的免疫反 应的方法。 附图说明
图 1 为 PLGA/TCP 材料细胞接种率。
图 2 为检测成骨诱导间充质干细胞和 PLGA/TCP 材料生物材料复合骨片 ALP 活性。
图 3 为 MSC 输注降低了移植体区域炎性反应的图片， 从左到右依次为 ： T， T-C， M+T， M+T-C ； 材料移植和生物材料复合骨片移植后输注 MSC(T-C， M+T-C) 降低了材料移植和生物 材料复合骨片移植 (T， M+T) 引起的炎性细胞浸润 ； 放大倍数 100×。
图 4 为 MSC 输注减轻了脾脏病理改变的图片， A： 正常对照 (Control) ； B： 从左到右 依次为 ： T， T-C， M+T， M+T-C ； 材料移植和生物材料复合骨片移植后输注 MSC(T-C， M+T-C)， 脾 小结相对材料移植和生物材料复合骨片移植 (T， M+T) 减小， 减少 ； 放大倍数 100×。 +
图 5 为 MSC 输注降低了 CD3 T 淋巴细胞早期活化指标 CD69 的比例。在不同的时 间点收集材料 PLGA/TCP 的各个处理组 (T， T-C， M+T， M+T-C) 脾淋巴细胞， 标记抗体， 流式细 胞仪检测， 输注 MSC(T-C， M+T-C) 后与单纯材料和生物材料复合骨片移植 (T， M+T) 相比， 降 + + + 低了 CD69 CD3 与 CD3 的比例。 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中， 如无特殊说明， 均为常规方法。实施例 1
一、 制备生物材料复合骨片
1、 生物材料无菌处理
将生物材料聚乳酸聚乙醇酸 / 磷酸三钙聚合物 (PLGA/TCP， 数均分子量为 3 万， 中国科学院成都有机化学有限公司 ) 均切成的小块 ( 每块规格长 5mm、 宽 5mm、 厚 1-2mm)， 用 70％乙醇浸泡半小时使材料具有亲水性， 再用 PBS 多次冲洗后， 紫外消毒半小时， 最后在 α-MEM(Gibco)+10％ FCS(Hyclone) 充分浸泡。
2、 小鼠骨实质 MSC 的分离和培养
将 2-3 周龄 C57BL/6 小鼠 ( 购自军事医学科学院动物中心 )， 断颈处死小鼠， 75％ 酒精浸泡消毒小鼠→无菌条件下分离小鼠胫骨和股骨， 置于平皿中→用无菌纱布搓去附着 肌肉， 去除干骺端→用 PBS+10％ FCS(Hyclone) 反复冲洗骨髓腔， 冲出骨髓细胞→将骨组织 剪成约 1mm×1mm 大小→用 0.2 ％胶原酶 (Invitrogen)， 37 ℃消化 2 小时→消化后吸出消 化液， 用 α-MEM(Gibco) 洗骨片 3 遍→接种于培养瓶中， 使骨片均匀分布瓶底， 培养体系含 α-MEM(Gibco)+10％ FCS(Hyclone)+100U/ml 青霉素 +100U/ml 链霉素， 37℃、 5％ CO2 的饱 和湿度条件下培养→每 3 天换液 1 次→细胞接近 70-80％汇合时， 0.25％胰酶 (Hyclone) 消 化传代， 传代细胞接种密度为 4000 个细胞 /cm2。
3. 生物材料复合骨片的制备
将不同含量 (104 个、 5×104 个、 105 个、 2×105 个、 5×105 个 ) 的小鼠骨片来源的 MSC 悬于 10μl 含血清的培养基 (α-MEM+10％ FCS) 中， 得到各个细胞浓度的悬液， 然后滴 加到材料一块 PLGA/TCP 材料表面上， 并在材料中央反复轻轻吹吸， 使细胞尽量多的与材料 接触。将上述滴加有细胞悬液的材料放入 24 孔板中， 37℃、 5％ CO2 条件下培养 2 小时， 得 到复合有各个细胞浓度的生物材料复合骨片。
4、 细胞接种率测定
往 步 骤 2 得 到 的 复 合 有 各 个 细 胞 浓 度 的 生 物 材 料 复 合 骨 片 中 加 入 1ml 培 养 液 (α-MEM(Gibco)+10 ％ FCS(Hyclone)， 放 入 孵 箱 中 培 育 过 夜。 同 时 设 相 应 细 胞 浓 度 的 对 照 组， 即 将 各 个 细 胞 浓 度 的 悬 液 直 接 种 入 24 孔 板 中， 然 后 同 样 加 入 1ml 培 养 液 (α-MEM(Gibco)+10％ FCS(Hyclone)， 放入孵箱中培育过夜。
然后每孔中加入 5mg/ml MTT 100μl， 37 ℃孵育 4 小时。小心吸弃孔内培养液， 用 PBS 冲洗一次， 将材料分别置于 1.5ml EP 管中， 然后加入 200μl 异丙醇， 将材料夹碎， 2000g， 离心 10 分钟， 取上清 150μl 到 96 孔板中。 培养板中直接加入异丙醇， 溶解 10 分钟。 选择 570nm 波长， 在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值， 记录结果。将各处理组与相应对 照组做比值 ( 即图 1 纵坐标值 )， 绘制生物材料细胞接种率曲线图。
结果如图 1 所示， 将不同的细胞浓度接种两种材料上， 测定细胞接种率， 发现随着 5 5 细胞接种浓度的升高而相对增加， 当细胞浓度为 10 -5×10 时两种材料的细胞接种率较 5 高； 当细胞浓度为 2×10 时两种材料的细胞接种率最高。
5、 成骨分化能力测定
往步骤 2 得到的复合有各个细胞浓度的生物材料复合骨片中加入 1ml 培养液 (Gibco)+10％ FCS(Hyclone)， 放入孵箱中培育过夜。然后换入成骨诱导培养基， 成分如下 ：
分别培养 7d， 14d， 21d， 碱性磷酸酶 (ALP) 试剂盒 (Sigma) 检测 ALP 活性。将诱导 后的载体用 PBS 洗两遍， 移入离心管中， 加入 300μl 0.2％ NP-40， 4℃， 10000rpm 离心 10 分 钟。根据 ALP 活性测定试剂盒说明， 在预先加入工作液的 96 孔板中， 吸取上清 50μl 到 96 孔板， 反应 30min， 然后终止。选择 405nm 波长， 在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值， 记 录结果。
结果如图 2 所示， 当诱导 14 天时， 每个处理组相对第 7 天时 ALP 活性显著增加， 随 着诱导时间的增加， 在第 21 天时检测到 ALP 活性反而下降， 这可能是由于在 MSC 分化后期， 主要表现为钙沉积， 而 ALP 低表达或不表达 ； 而且随着细胞接种浓度的升高 ALP 活性也随着 5 升高， 当诱导 14 天时， 检测到 2×10 的接种浓度与其它接种浓度相比其 ALP 活性要较高，
这与步骤 3 检测到的细胞接种率相一致。
综上所述， 最佳生物材料复合骨片是在， 每块 PLGA/TCP 材料中复合 2×105 个 MSC， 命名为 MSC+PLGA/TCP。 以下步骤二实验中用到的生物材料复合骨片就是该最佳生物材料复 合骨片。
二、 异体小鼠皮下移植
1、 用 0.7％戊巴比妥钠麻醉后， 按照如下实验分组进行异体小鼠皮下移植。 每日观 察小鼠存活， 及伤口红肿情况 ：
①正常对照组 (Control) ： 未处理的小鼠。
②未复合 MSC 的材料移植组
PLGA/TCP( 简称 T) ： 单纯移植一块的生物材料 PLGA/TCP ；
③生物材料复合骨片移植组
MSC+PLGA/TCP( 简称 M+T) ： 单纯移植一块生物材料复合骨片 MSC+PLGA/TCP ；
④未复合 MSC 的材料移植且输注 MSC 组
PLGA/TCP-MSC( 简称 T-C) ： 移植一块生物材料 PLGA/TCP 的同时静脉输注 MSC。
⑤生物材料复合骨片移植且输注 MSC 组
MSC+PLGA/TCP-MSC( 简称 M+T-C) ： 移植一块生物材料复合骨片 MSC+PLGA/TCP 的同 时静脉输注 MSC。
其中， 上述④和⑤中输注的 MSC 均是悬在 0.2ml PBS 中 5×105 个的 MSC。
2. 病理分析 ： 将移植后一周的小鼠断颈处死， 取移植体区域和脾脏用 10％福尔马 林固定， 石蜡包埋， 做病理切片 HE 染色分析。
1)MSC 输注降低了移植体区域炎性反应
生物材料复合骨片异体皮下移植 1 周后， 可以看到生物材料复合骨片移植体区域 (M+T) 与相应的单纯材料移植组 (T) 相比， 并没有减少炎性细胞浸润， 主要为淋巴细胞浸 润， 而输注 MSC(M+T-C， T-C) 后， 发现降低了炎性细胞的浸润 ( 图 3)。2)MSC 输注降低了脾脏病理改变
取移植后 1 周各组小鼠脾脏， 做病理切片， HE 染色分析， 观察到生物材料复合骨片 移植体区域 (M+T) 以及单纯材料移植组 (T) 的脾小结较大， 较多， 而输注 MSC(M+T-C， T-C) 后脾小结相应减小和减少 ( 图 4)。
3. 流式分析脾细胞表型变化
取移植后第 12h， 24h， 2d， 3d， 7d 的脾脏， 每组 3 只， 夹碎后， 用淋巴细胞分离液分离 6 出淋巴细胞， 1×10 / 管， 用抗体 CD3、 CD69(ebioscience) 标记细胞， 4℃， 避光反应 30 分钟 ； PBS 洗两遍， 1％多聚甲醛固定， 4℃避光保存， 1 周内上机检测。结果用 WinMDI 2.9 软件分 析。
结果如图 5， MSC 输注降低了 CD3+T 淋巴细胞早期活化指标 CD69 的比例。 在不同的 时间点收集材料 PLGA/TCP 的各个处理组 (T， T-C， M+T， M+T-C) 脾淋巴细胞， 标记抗体， 流式 细胞仪检测， 输注 MSC(T-C， M+T-C) 后与单纯材料和生物材料复合骨片移植 (T， M+T) 相比， + + + 2 天后降低了 CD69 CD3 与 CD3 的比例。
实施例 2
本实施例与实施例的区别在于将分离得到的 MSC 换成商业化的 MSC(C3H10T1/2， 上海复医生科科研服务中心 )， 其余实验完全相同。结果发现 ： 本实施例与实施例 1 的结果 无显著差异， 说明通过间充质干细胞静脉输注可以来减轻生物材料或生物材料复合骨片的 异体移植所引起的免疫反应。