用于多种检测体系的酶底物 相关申请的相互参引
本申请要求 2008 年 3 月 13 日提交的第 61/036,211 号美国临时专利申请的优先 权，该申请在此以引用的方式纳入本文。
技术领域 本发明涉及用于使用例如质谱、免疫测定和高效液相色谱等检测方法检测酶活 性的分析试剂。 在一个方面中，本发明涉及用于检测溶酶体酶活性的底物。
背景技术
溶酶体贮积症是一种遗传病，其特征在于体内缺乏特异性酶，从而导致身体无 法分解代谢物。 例如，法布里病是一种每 40000 人中就有一人患有的溶酶体贮积症。 它 是由于缺乏 α- 半乳糖苷酶造成的，这种缺乏导致人体无法分解称为神经酰胺三己糖苷 (globotriaosylceramides) 的特定脂肪类物质。 第二个实例为戈谢病，其为一种由于无法分 解称为葡糖苷酰鞘氨醇 ( 也称为葡糖脑苷脂 ) 的脂肪类物质或类脂类物质而引起的溶酶体 贮积症。 患有戈谢病的个体不产生分解这些脂肪类物质所需的葡糖脑苷脂酶。 因而这些脂肪类物质就蓄积在肝、脾和骨髓细胞中。 第三个实例是庞皮病，其为一种由于缺乏分 解称为糖原的特定糖类所需的酸性 α- 葡萄糖苷酶而引起的溶酶体贮积症。 当酸性 α- 葡 萄糖苷酶缺失时，糖原就会蓄积在体内的各种组织和器官中。
溶酶体贮积症大多是儿童期疾病，但也有一些显露于成年期。 在大部分这些疾 病中，患者出生时是正常的，之后才开始渐进性神经系统恶化。 其临床表型取决于生化 缺陷的类型及严重程度。 一些溶酶体症，例如庞皮病及克拉伯病，主要显露于婴儿期。 在出现临床症状之前检测这类疾病以便能够开始介入治疗的方法正在努力研发中。
在过去的十年中，检测代谢疾病的试验室人员已将串联质谱引入其新生儿筛查 程序中。 串联质谱法在临床中不断普及，因为这项技术能对单一样品中的多种代谢物进 行测定。 例如，这项技术已成为利用干燥血斑样品检测新生儿遗传性代谢异常的常规临 床方法而被采用 (Schulze Aet al.， Pediatrics，2003 ；111 ：1399-406)。 虽然溶酶体酶 活性可使用串联质谱进行定量 (Gelb MH et al.， Clinical Chemistry 50 ：10，1785-1796， 2004)，但是由于繁琐的过程和苛刻的测定成分，例如氯仿，所公开的测定方法还不能容 易地适应临床环境。
第二个常用的临床测定方案是酶联免疫吸附测定法 (ELISA)。 目前使用一些 生物标记物来检测并监控戈谢病 ( 参见例如 Aerts， JM， andHollack， CD， Bailliere’ s Clin.Haematol，1997 ；10 ：691-709 ；Deegan PB， etal.， Blood Cells Mol Dis，2005 ； 35 ：259-67 ；Beutler， E， et al.， J ExpMed，1976 ；143 ：975-80)。 用于检测其中活性 成分为修饰葡糖脑苷脂酶的阿糖苷酶的抗体的 ELISA 法也有报道 (Richards SM， et al.， Blood，1993 ；82 ：1402 ；Rosenberg， M.， et al.， Blood，1999 ；93 ：2081-2088)。 然 而，这些测定方法并不直接检测溶酶体酶的活性，而是检测疾病间接标志物的水平。因此，仍需改进检测溶酶体疾病的方法及组合物。发明内容 本发明实施方案提供了用于使用例如质谱、免疫测定和高效液相色谱等检测系 统检测酶反应的改进的组合物及方法。
本发明提供了可用于评估样品中溶酶体酶活性水平的化学化合物。 溶酶体酶 活性测试可用于例如对新生儿的代谢疾病进行筛查，以及对处于影响酶活性的病症中的 个体或接受例如酶替代疗法、基因疗法、或骨髓移植等医学治疗的个体进行评估。 此处 所述化学化合物包括用于目标酶的底物以及可在酶测定中用作对照物或标准物的相关分 子。
本发明的底物具有通式 A-(B1-B2-B3-B4)，其中 A 为单糖或二糖 ；B1 为 C1-C20 烷基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环 ；B2 为氨 基酸、2，6- 二氨基己酸或
其中 R1’ 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 杂原子 C6-C20 芳基、C1-C20 羰基、C1-C20 酰氨基、C1-C20 醚基、C6-C20 芳基、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；X 为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R2’ 为不存在的基团或 C1-C20 烷基、 C4-C20 醚基、具有 N、 O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 C1-C20 酯基、 C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；Y 为 碳、氮、氧或硫亲核基团 ；n 为 1 至 30 的整数。
B3 为
其中 R1 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、杂 原子 C6-C20 芳基、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；R2 各自独立地为 H、C1-C20 烷基、具有 C1-C20 烷基取代基 的 C2-C20 烷基 ；X 各自独立地为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R3 各自独立地为不存在的 基团、C1-C20 烷基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂 环基 ；n 为 0 至 30 的整数，包括 0 和 30 ；R4 各自独立地为不存在的基团、C1-C20 烷基、 具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳 基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；B4 为不存在的基团或 C1-C20 烷基、 C4-C20 醚基、具有 N、 O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 C1-C20 酯基、 C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、 杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基。
本发明还提供了具有以下通式的化合物，其可用作例如酶测定中的对照物或标 准物 ：
B1-B2-B3-B4 (I)
其中 B1 为 C1-C20 烷基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、O 或 S 杂原
子的 C6-C20 杂环基 ；B2 为氨基酸、2，6- 二氨基己酸或
其中 R1’ 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 杂原子 C6-C20 芳基、C1-C20 羰基、C1-C20 酰氨基、C1-C20 醚基、C6-C20 芳基、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；X 为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R2’ 为不存在的基团或 C1-C20 烷基、 C4-C20 醚基、具有 N、 O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 C1-C20 酯基、 C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；Y 为 碳、氮、氧或硫亲核基团 ；n 为 1 至 30 的整数。
B3 为
其中 R1 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、杂 原子 C6-C20 芳基、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；R2 各自独立地为 H、C1-C20 烷基、具有 C1-C20 烷基取代基 的 C2-C20 烷基 ；X 各自独立地为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R3 各自独立地为不存在的 基团、C1-C20 烷基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂 环基 ；n 为 0 至 30 的整数，包括 0 和 30 ；R4 各自独立地为不存在的基团、C1-C20 烷基、 具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳 基、含有 N、 O 或 O 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；B4 为不存在的基团或 C1-C20 烷基、 C4-C20 醚基 ；具有 N、 O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 C1-C20 酯基、 C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、 杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基。
附图说明
图 1 为用于检测溶酶体贮积症的示例性底物结构及示意性合成方法。 图 2 为用于检测溶酶体贮积症的具有一般构成的示例性底物结构及示意性合成 图 3 为标示出各个结构部分的示例性底物结构。 图 4 为标示出可用于多种检测方法的多个官能中心的示例性底物结构。 图 5 为使用本发明底物的一般酶反应路线。 图 6 为使用双标记的本发明底物检测酶活性的替代可选方法。 图 7 为与现有技术参考方法相比更有利的、使用质谱法检测酶反应的本发明方方法。
法。 具体实施方式
本发明可用作检测酸水解酶活性、例如与溶酶体贮积症有关的溶酶体酶活性的 分析试剂组合物。 通过酶底物和可用作试验对照物或标准物的相关化合物的使用——它 们易溶于适用作例如质谱、HPLC 和免疫测定等分析方法的溶液中——，检测与溶酶体贮积症相关的酶活性变得更易行、更简单。
本发明提供了对溶酶体酶具有特异性的底物，其示意性地包括 ：酸 α- 半乳糖 苷酶 A(GLA)，酸 β- 葡糖脑苷脂酶 (ABG)，半乳糖脑苷脂 α- 半乳糖苷酶 (GALC) 以 及酸 α- 葡萄糖苷酶 (GAA)。 通过利用这些酶对本发明底物的作用来测定样品中相应 的酶活性，因此，这些底物可用于检测溶酶体贮积症，包括法布里病 (GLA)，戈谢病 (ABG)，克拉伯病 (GALC) 以及庞皮病 (GAA)。
本发明底物具有通式 A-(B1-B2-B3-B4)，其中 A 为单糖或二糖 ；B1 为 C1-C20 烷 基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；B2 为氨 基酸、2，6- 二氨基己酸或
其中 R1’ 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 杂原子 C6-C20 芳基、C1-C20 羰基、C1-C20 酰氨基、C1-C20 醚基、C6-C20 芳基、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；X 为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R2’ 为不存在的基团， 或 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、C1-C20 酯基、C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；Y 为 碳、氮、氧或硫亲核基团 ；n 为 1 至 30 的整数。
B3 为
其中 R1 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、杂 原子 C6-C20 芳基、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；R2 各自独立地为 H、C1-C20 烷基、具有 C1-C20 烷基取代基 的 C2-C20 烷基 ；X 各自独立地为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R3 各自独立地为不存在的 基团、C1-C20 烷基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂 环基 ；n 为 0 至 30 的整数，包括 0 和 30 ；R4 各自独立地为不存在的基团、C1-C20 烷基、 具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳 基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；B4 为不存在的基团或 C1-C20 烷基、 C4-C20醚基、具有 N、 O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 C1-C20 酯基、 C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、 杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基。
本发明底物对特定溶酶体酶的特异性部分地由糖部分 A 的结构变化提供，例如 A 为单糖或二糖。 示例性糖部分包括用于检测庞皮病的 α-D- 葡萄糖、用于检测戈谢病 的 β-D- 葡萄糖、用于检测法布里病的 α-D- 半乳糖以及用于检测克拉伯病的 β-D- 半 乳糖。
B1 为一个连接部分，其用于使糖部分 A 与底物的剩余结构结合。 B1 还作为糖部 分 A 与底物剩余结构之间的间隔基团，以便灵活接入目标酶。 连接臂 B1 可设计为能够提 供相对亲水特性。 特别地，连接臂 B1 可具有一个氢酚结构。 因此，通式 A-B1-B2-B3-B4 的本发明底物可以在例如纯甲醇或纯乙醇等溶剂中具有亲水性。 B1-B2-B3-B4 部分通常整体具有亲水性。 如此，本发明底物可溶于缓冲水溶液体系。
B2 提供了与固体载体或可测标记例如荧光标记相互作用的一个 ( 多个 ) 亲核基 团。 优选地， B2 为烷基二氨基酸的衍生物，例如 2，6- 二氨基己酸。 在 2，6- 二氨基 己酸情况下，6- 氨基任选地充当连接固体载体或可测标记的亲核基团。
季铵基团为 B3 的一个组成部分。 发生酶反应后，B1-B2-B3-B4 裂解产物在 B3 上 带有一个永久正电荷。 该性质导致串联质谱分析中出现强信号。 另外，所述永久性电荷 使本发明底物更易溶于水溶液，从而不必使用例如氯仿等溶剂。 与先前的底物相比，本 发明底物通常具有更强的亲水性，并且需要更少的洗涤剂或不需要洗涤剂。 这使得测定 过程简化，因为与使用氯仿时类似，洗涤剂的使用需要复杂的清除步骤，包括劳动密集 的液 - 液和固相萃取步骤。
本发明底物在结构上被 B4 基团封端。 可调整 B4 的结构以提供不同的链长。 这些 不同的链长有利于在酶测定中将不同的底物及其酶产物彼此区分开来。 例如，质谱中， 一种含有 13 个碳原子链的底物与含有 14 个碳原子链的底物具有不同的质荷比，如此可区 分出含有 13 个碳原子链的底物或含有 14 个碳原子链的底物。 类似地，在免疫测定法中， 具有不同链长的底物可使用对特定化学部分具有选择性的抗体加以区分。 一个实施方案中，本发明提供了这样一种式 A-B1-B2-B3-B4 的试剂，其中 A 为 单糖或二糖，优选地为己醛醣或己酮醣 ；B1 为苯酚、硝基苯酚、或苯酯例如苯甲酸苯 酯 ；B2 含有烷基基团，例如氨基酸赖氨酸 ；B3 含有一个从结构中伸出的侧链季铵阳离 子，其在单独或与 B4 尾链一起缩合至 R1 上之前为肉碱形式。
本发明提供了检测酶活性的方法。 特定酶的活性可通过其作用于同源底物以生 成酶产物的能力或比率来评估。 对于本发明底物而言，目标酶对底物 A-B1-B2-B3-B4 的 作用导致两种产物的生成 ：A 和 B1-B2-B3-B4。 通过确定样品中酶产物例如 B1-B2-B3-B4 的量，即可确定目标酶的活性。 对于需要对 B1-B2-B3-B4 的量进行定量评估的应用而言， 样品中可包含已知量的与 B1-B2-B3-B4 相应的内标物，下文将更具体地描述。 因此，本 发明提供了具有通式 B1-B2-B3-B4 的化合物。
个体血液中某些溶酶体酶的活性可用于检测该个体是否患有溶酶体贮积症。 因 此，本发明提供了用于检测病症的底物，特别是例如庞皮病、戈谢病、法布里病和克拉 伯病等溶酶体贮积症。 对于检测庞皮病而言，示例性的糖部分为 α-D- 葡萄糖，示例 性的 B1-B2-B3-B4 部分为 4- 氨基苯基 - 二氨基己酰基 - 肉碱基 - 烷基链，其中 B4 具有 10-20 个碳原子。 对于检测戈谢病而言，示例性的糖部分为 β-D- 葡萄糖，示例性的 B1-B2-B3-B4 部分为 4- 氨基苯基 - 二氨基己酰基 - 肉碱基 - 烷基，其中 B4 具有 10-20 个 碳原子的链长。 对于测定法布里病而言，示例性的糖部分为 α-D- 半乳糖，示例性的 B1-B2-B3-B4 部分为 4- 氨基苯基 - 二氨基己酰基 - 肉碱基 - 烷基，其中 B4 具有 10-20 个碳 原子的链长。 对于测定克拉伯病而言，示例性的糖部分为 β-D- 半乳糖，示例性的 B4 部 分为 4- 氨基苯基 - 二氨基己酰基 - 肉碱基 - 烷基，其中 B4 具有 10-20 个碳原子的链长。 专用于检测克拉伯病的本发明底物的一个具体实例是，基团 A 为 β-D- 半乳糖，基团 B1 为甲基，基团 B2 为酰氨基氨基酰基，基团 B3 为季铵终端的酰氨基，基团 B4 为碳链长 12 至 20 的烯基醇基。 用于检测戈谢病的本发明底物的一个具体实例是，基团 A 为 β-D- 葡 萄糖，基团 B1 为甲基，基团 B2 为酰氨基氨酰基，基团 B3 为季铵终端的酰氨基，基团 B4
为碳链长 12 至 20 的烯基醇基。
本发明底物可调整以测定各种酶，特别是与病状或出生检测有关的酶，或其他 可用于医疗目的的酶。 这种调整是可行的，因为通式 A-B1-B2-B3-B4 的 A 可为多种单糖 和二糖基团。 甚至对于新鉴定出的目标酶，一旦使用常规方法确定了其对单糖和 / 或二 糖基团的特异性，就可根据本发明的教导容易地制备本发明的底物。 可使用本文所述的 本发明底物测定的酶的非限制性实例包括酸 α- 半乳糖苷酶 A、酸 β- 葡糖脑苷脂酶、酸 半乳糖脑苷脂 α- 半乳糖苷酶、酸鞘磷脂酶和酸 α- 葡萄糖苷酶。
正如本发明所展望的，可以合成带不同的糖的底物，其每一个都对特定的溶酶 体酶具有特异性，并且每一个的子基团 B2 或 B4 的链长都各不相同。 本发明体系提供了 可随意选择的多重测定方法，其中使用结构相似的酶特异性底物即可在同一样品或样品 承托体 (sample receptacle) 中分析两种或更多种溶酶体酶。
本发明提供了可作为用于检测样品或样品承托体中酶产物的量的试验对照物或 标准物的化合物。 对于质谱法应用而言，相应于特定本发明底物的内标物与其酶产物具 有相同的结构，只是所述内标物的质荷比 (m/z) 不同。 因此，本发明的内标物包括修饰 形式的酶产物，例如，酶产物的稳定同位素标记的类似物，其中一个或多个原子被相应 的同位素原子代替以产生质谱偏移。 当通过质谱对内标物及酶产物进行分析时，谱图中 示出的内标物与酶产物会在空间上分离，其各自以各自的峰表示。 内标物的已知量由其 已知 m/z 比处的峰值反应。 酶产物的量可通过将其已知 m/z 比处的峰值与内标物的峰值 比较确定。 同位素标记生产内标物的一个实例为将 B4 酰基上的 1H 用 2D 代替。 因此， 如质谱所检测的，具有替代的 2D 的 “较重的” 内标物分子与酶产物具有不同的 m/z。
在一个具体实施方案中，用氘标记内标物以产生与相应的裂解产物相比 3 至 9 道 尔顿的质量变化。 在另一个具体实施方案中，结合的 B2-B3-B4 子基团为带有正电季铵部 分的赖氨酸 - 酰肉碱，并且酰基尾链的链长为 12 至 18 个碳原子。
在一个实施方案中，本发明底物用一种可测标记进行标记。 本领域公认有许多 荧光探针可用于标记活性胺。 用于特异性标记生物分子的一个特别敏感的靶标为赖氨酸 侧链氨基。 本发明底物的一个优选的实施方案包括 B2 位上的具有所述活性末端氨基的 赖氨酸残基。 适于标记本发明底物的可测标记的示意性实例包括荧光团，例如异硫氰酸 酯、丹磺酰氯和其它磺酰氯、7- 硝基苯并 -2- 噁 -1，3- 二唑衍生物、荧光胺等。
本发明底物可以以多种物理形式使用，例如，在溶液中以及连接或固定在固体 载体上。 固体载体可包括天然或合成材料，有机或无机材料，例如聚合物、树脂、金属 或玻璃，及其结合物。 合适的固体载体可具有多种物理形式，可包括例如膜 ；柱状物 ； 中空、实心、半实心的含孔或含空腔颗粒，例如珠粒 ；凝胶 ；纤维，包括光纤材料 ；基 质及样品承托体。 样品承托体的非限制性实例包括样品孔、管、毛细管、瓶及任何其它 能持有样品的容器、沟槽或凹槽。 样品承托体可包括在多样品平台上，例如微孔板、载 玻片、微流体装置等。 许多合适的颗粒是本领域已知的，示意性地包括 型编码颗 粒、光纤编码颗粒、磁性颗粒以及玻璃颗粒。 本发明底物和 / 或其酶裂解产物与固体载 体的共价相互作用有利于在一些测定形式进行的洗涤步骤过程中保留底物和 / 或产物， 从而产生酶活性的强而准确的信号。
当测定形式需要使用固体载体时，存在的示例性赖氨酸基团 B3 可用于例如与强结合性固体载体共价连接。 强结合性固体载体为具有裸露部分的表面，所述裸露部分具 有化学活性或能够与本发明底物或内标物共价地或高亲和力地连接。 例如， Corning Life Sciences 生产了强结合性微孔板，其通过辐射可使苯环断裂并且生成裸露羧酸。这些羧酸 易受例如一个优选实施方案底物中赖氨酸衍生物组成部分上的末端氨基的进攻。 该反应 迅速且在所述底物 / 产物与所述强结合性表面之间产生了的紧密的相互作用。
本文所述方法可以多重形式进行，从而同时测定多个样品。 一种示例性的多 重形式包括使用物理和 / 或化学编码颗粒。 编码颗粒在多重形式中的使用述于例如 US 6,649,414 和 US 6,939,720 中。 因为编码能使颗粒彼此区分，所以单一反应混合物中可存 在多种不同颗粒，从而使不同样品或不同酶同时被测定。 根据使用者的试验目的，颗粒 上编码可对应于例如样品源、待测定的特定酶、存在的特定的底物等。
可用于本发明方法的样品含有或猜测其含有一种或多种目标酶。 目标酶可包含 于取自个体和试验室材料，例如细胞系和合成蛋白源的样品中。 示例性的样品源包括组 织匀浆 ；细胞培养溶解产物 ；生物液体，包括尿液、液体或干燥形式的血液、泪液，唾 液和脑脊液。 如果需要，样品可进一步分成含有特定细胞类型的部分。 例如，血液样品 可被分成血清或含有特定血细胞类型例如红细胞或白细胞 ( 白血球 ) 的部分。 如果需要， 样品可以是来自一个受试者的多个样品的结合物，例如组织和流体样品的结合物等。 在 一个具体的实施方案中，样品为血液，其可为例如全血或其血液部分，或可由干燥血样 重建。 获取能在样品中保留分子活性或完整性的样品的方法为本领域技术人员所熟 知。 这类方法包括使用合适的缓冲剂和 / 或抑制剂，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制 剂，它们可使样品中的分子不变或使其变化最小化。 这类抑制剂包括，例如，螯合剂， 例如乙二胺四乙酸 (EDTA)、乙二醇二 (P- 氨乙基醚 )N，N，N1，N1- 四乙酸 (EGTA) ； 蛋白酶抑制剂，例如苯甲基磺酰氟 (PMSF)、抑肽酶、亮肽素、抗痛素等 ；以及磷酸 酶抑制剂，例如磷酸盐、氟化钠，钒酸盐等。 用于提取分子的合适的缓冲剂和条件为 本领域技术人员所熟知，并可根据例如待表征的样品中分子的类型变化 ( 参见例如， Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)， John Wiley&Sons， New York(1999) ；Harlow and Lane， Antibodies ：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988) ；Harlow and Lane， Using Antibodies ：A Laboratory Manual， ColdSpring Harbor Press(1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry，3rd ed.Burtis and Ashwood， eds.W.B.Saunders， Philadelphia， (1999))。 样品还可进行加工以避免存在干 扰物质或使其最小化。
干燥血斑形式的样品通常用于新生儿和儿童患者的血液筛查。 为准备这些样 品，将血样收集并保留在一张滤纸上。 为了进行分析，将所述干燥血样从滤纸上洗提 至一种水溶液中，所述水溶液通常含有一种缓冲剂例如磷酸盐缓冲盐水和一种蛋白酶抑 制剂。 蛋白酶抑制剂情况的具体实例包括例如以下的一种或多种 ：最终浓度为 50 至 400μg/ml 的 AEBSF 盐酸盐、最终浓度为 0.2 至 25mg/ml 的 EDTA 脱水二钠盐、最终浓 度为 0.5 至 1μg/ml 的亮抑蛋白酶肽以及最终浓度为 0.5 至 1μg/ml 的抑胃肽 A。 通过使 用通用测定溶液提取单一干燥血样或其它类型的样品，用以分散用于多种测定反应中， 可用于自动高通量筛查。 干燥样品的单次提取避免了从同一样品中多次取样，或收集其
它样品源等分试样的需要，并相应地减少了由血样在滤纸上的不均匀分布及样品转移误 差造成的偏差。 使用干燥样品时，提取效率可根据被分析的酶的不同而有所变化。 在这 些或其它类型的样品中，目标酶在不同的测定溶液中可具有不同的活性水平值。 可任选 地选择本发明通用的测定溶液的组成以便待测的每种酶都具有活性。
本发明底物及产物可以以多种测定形式使用。 当希望评价酶测定过程中底物的 消耗量时，可在测定中检测底物，而当希望评价酶测定过程中产物的形成时，可在测定 中检测产物。 当希望从底物和产物二者的角度评价酶反应从而确定例如产物生成量与底 物消耗量之间的关系时，可检测其二者。
例 如， 底 物 A-B1-B2-B3-B4 和 产 物 B1-B2-B3-B4 的 量 可 采 用 串 联 质 谱 分 析 法 检测。 利用质谱进行的一个示例性酶测定如下进行。 将样品用本发明底物培养一段 时间，以形成一种酶产物。 在培养期间，底物被血样中存在的目标酶裂解形成对应的 B1-B2-B3-B4 产物。 然后加入一种能使蛋白质成分沉淀的试剂淬灭反应。 示例性的试剂包 括乙醇、乙腈和稀三氟乙酸。 然后将培养混合物的一部分转移至一个新的测定容器中。 任选地，可加入一种稀释试剂例如甲醇、乙腈、水 - 甲醇混合物或水 - 乙腈来稀释转移 的部分。 由此稀释的样品减少了内源竞争物的量，从而相对增加了串联质谱分析的灵敏 度。 其它类型的试剂也为本领域技术人员选择以适用于串联质谱分析法。 借助自动取样器和液体处理器将所述稀释样品手动或自动地直接注入串联质谱 中。 如果需要，可先将样品衍生化，然后再进行分析。 试剂选择为不会对 MS/MS 系统 产生负面影响。 例如，合适的溶剂不含洗涤剂和腐蚀性试剂，例如氯仿。 通常只是简单 地使用纯乙醇和纯甲醇，因为它们可以在机械干燥过程中容易地蒸发。
串联质谱可设置为同时检测所加底物、所得的相应酶产物和相应的内标物。 这 种检测通过母离子扫描、前体离子扫描或多种反应监测扫描实现。
底物 A-B1-B2-B3-B4 的量或酶测定过程中形成的产物 B1-B2-B3-B4 的量也可使用 抗体和其它靶特异性结合分子进行测定。 对于免疫测定而言，抗体可用于检测底物、产 物或其二者。 用于这些方法的抗体可以是特异性的，以使它们能识别各个底物，或是非 特异性的，以使它们能识别多种或所有底物。 一个示意性的实例为生成的对结合物 B1-B2 硝基苯酚 - 赖氨酸的抗体。
这种抗体示意性地由动物体产生，例如小鼠、大鼠、兔、马、驴、或其它可用 于产生抗体的合适动物体。 在一些应用中，使用可测标记，例如荧光标记，来标记抗体 是有利的。 如果使用未标记的抗体，则可使用对 IgG 类第一抗体具有特异性的、示意 性地用荧光标记物例如罗丹明标记的第二抗体进行检测。 本领域应理解的是，在本发明 中，其它抗体检测体系可类似地进行操作，例如辣根过氧化物酶标记抗体，或碱性磷酸 酶标记抗体。
当采用多种对酶具有特异性的底物来检测单一样品中的多种酶时，可使用能够 识别和区分底物或其产物的抗体。 许多方法都可用于将连接至酶 - 特异性底物或其产 物的抗体复合物彼此区分。 在一个方案中，将含有目标酶的样品与连接至颗粒的底物在 一种测定溶液中接触。 在这个实例中，每个颗粒都与一种特定的底物连接，并存在代 表每种底物的多个颗粒。 目标酶作用于底物而生成产物 A 和产物 B1-B2-B3-B4。 产物 B1-B2-B3-B4 仍与颗粒相连，而产物 A 释放于溶液中。 然后将识别特定 B1-B2-B3-B4 产物
的抗体与测定溶液接触。 如果在酶测定过程中生成产物，则抗体将与该产物连接，以生 成带有结合抗体的颗粒。 为了区别颗粒上所含的不同产物，具有不同产物特异性的抗体 可具有不同的可测部分，例如不同的荧光标记。 作为检测酶产物的替代方案，可使用能 识别底物 A-B1-B2-B3-B4 的抗体来检测用酶培养之后残留在珠粒上的底物。 在这种情况 下，如果发生酶反应，则产物 A 或 B1-B2-B3-B4 仍将连接在珠粒上。 不管哪种情况，所 选底物特异性抗体都不会与与珠粒相连的产物发生显著的交叉反应。
在另一方案中，将含有目标酶的样品与与编码颗粒相连的底物在一种测定溶液 中接触。 所述编码颗粒具有一种能使它们彼此区分的特征，例如条形码或光学曲线。 例 如，编码颗粒可拥有对应于不同的目标醇底物的不同的条形码。 在这种测定方法中，目 标酶作用于底物而生成产物 A 和 B1-B2-B3-B4。 所述 B1-B2-B3-B4 将保持与颗粒相连， 而产物 A 将释放到溶液中，反之亦可。 然后将识别特异性产物的抗体与测定溶液接触。 因为颗粒的编码能指示哪种底物连在所述颗粒上，所以抗体无需对特定的产物具有特异 性，因此可以用一种类型的抗体检测由多种不同底物生成的产物。 如果在所述酶测定过 程中产生产物，这种非特异性抗体将与所述产物相连，以生成具有结合抗体的颗粒。 然 后通过例如检测抗体上的标记或颗粒的物理行为将具有结合抗体的颗粒与没有抗体的那 些区分开来。 基于每个颗粒的编码可以确定抗体结合颗粒上所含的不同产物。 在免疫测定形式的另一个实例中，生成针对特定底物的抗体。 将酶反应淬灭， 然后将反应溶液转移至一个强结合性微量滴定板中，其中活性 B2 部分通过末端氨基与该 板共价结合。 将酶和测定溶液成分洗涤除去。 然后将特异性第一抗体在每个测定孔中进 行培养，而后洗涤除去未结合的抗体。 可任选地使用一种第二抗体来进行检测和定量分 析。 每单位初始反应时间形成的产物越多，所检测酶的活性越大。
在一种替代的免疫测定形式中，任选地使用一种对 B1-B2 子基团具有特异性的抗 体作为标准夹心 ELISA 测定法 (sandwich ELISA assay) 中微量滴定板表面上的捕获抗体。 使用与产物上独特表位结合的第一抗体、例如针对 B4 部分的抗体 ( 或将 B4 部分用一种特 异性结合对成分例如生物素修饰 ) 进行检测。 如本领域所知的，可任选地使用一种标记 的第二抗体进行检测，如上所述。
在另一个免疫测定形式中，将一种示例性的抗体与结合在本发明氢酚 B1 部分上 的 α-D- 葡萄糖 A 基团反应。 底物通过赖氨酸 B2 部分连接在一种固体载体上。 或者，底 物以溶液形式提供，将反应物转移至样品承托体中，其中在示例性的酶反应淬灭之后， 将反应溶液转移至一个强结合性微量滴定板中，其中活性 B2 部分通过末端氨基与所述承 托体共价结合。 在另一种替代方案中，使用一种对本发明产物 / 底物上的替代表位具有 特异性的捕获抗体。 洗涤除去未反应的酶和缓冲剂成分。 然后将对 A-B1-B2 部分具有特 异性的抗体在各个测定孔中进行培养，以对剩余底物进行检测和定量。 初始酶反应后的 剩余底物越多，所述酶的活性越低。
抗体可示意性地不作标记，并在动物体中产生，所述动物体包括小鼠、大鼠、 兔、马、驴或其它用于产生抗体的合适的动物体。 对 IgG 类第一抗体具有特异性的第二 抗体可示意性地用一种荧光标记，例如罗丹明，进行标记，随后用于检测剩余底物。 本 领域应理解的是，本发明中，其它抗体检测体系，例如辣根过氧化物酶标记抗体或碱性 磷酸酶标记抗体，可类似地进行操作。
在合适免疫测定形式的另一个实例中，将对结合至本发明氢酚 B1 部分及赖氨酸 B2 部分的示例性 α-D- 葡萄糖 A 基团具有特异性的单克隆鼠抗本身使用一种荧光标记物 进行标记。 在该体系中，可任选地同时分析多种溶酶体酶对多种特异性底物的活性。 一 个示意性的实例包括使用了本发明底物的二酶体系，一种酶对 GLA 具有特异性而另一种 对 GAA 具有特异性。 将每种底物同时加入到与所述生物样品的反应中。 由于每种底物 任选地包含一个赖氨酸 B2 基团，因此两者将相似地结合在所述强结合性微量滴定板上。 如上洗涤后，将各自对本发明底物具有特异性的两种抗体加入至所述微量滴定板中。 每 个抗体都示意性地使用不同的荧光团例如罗丹明或花青进行标记。 由此可检测出每种抗 体的结合并将其定量，而不受其它抗体的干扰，并且还可检测来自同一个样品的微量滴 定板的同一孔中的每种酶活性的量。
另一个示意性的测定形式通过质谱法进行。 对目标酶的测定通过首先获取一种 样品进行，所述样品示意性地包括血清、血浆、全血、尿液、唾液、其它生物液体或组 织溶解液、在溶液中的重组的或自然纯净的酶、或在生物液体或液体介质中的化学或官 能修饰的酶。 然后将滤纸试样的一部分切除并置于一个非结合性试管或孔微量滴定板的 孔中，并向其中加入一种测定溶液。 所述测定溶液中包括缓冲水溶液、底物、标准物以 及蛋白酶抑制剂。 然后将样品混合物在 30 至 41℃的特定温度下培养 30 分钟至 20 小时 范围内的一段确定时间。 一旦培养完成，即加入一种终止液结束所述酶反应。 终止液 示意性地为 pH 10.4 的 0.4M 氨基乙酸 /NaOH，其以 6 倍反应体积加入。 Leonard R， et al.，J.Biol.Chem.，2006 ；281 ：4867-75 ；Boot，RG，et al.，J.Biol.Chem.，2006 ；282 ： 1305-12。 产物形成的量通过将一种已知体积的样品转移至强结合性试管或孔微量滴定板 中并培养 5 分钟至 2 小时确定。 洗涤除去未结合的物质。 无改变的底物或产物的检测示 意性地通过一种耦合过氧化物酶法进行。 在另一方案中，释放出的葡萄糖或半乳糖产物 的水平值通过一种耦合酶法进行实时测量。 一个非限制性的实例包括在庞皮病的诊断中 从对 α- 葡萄糖苷酶具有特异性的本发明底物中释放出葡萄糖。 这种测定方法中，葡萄 糖与葡萄糖氧化酶反应生成葡萄糖酸内酯并且释放出过氧化氢。 释放出的过氧化氢通过 与过氧化物酶反应生成一种荧光分子，并用一种标准荧光计对其测定而检测。 合适的过 氧化物酶的实例为辣根过氧化物酶或本领域已知的任意其它过氧化物酶。 由葡萄糖氧化 酶释放出的过氧化氢可与检测剂底物分子进行反应。 所述过氧化物酶可催化这种底物向 荧光产物的转化。 适用于本发明底物的合适的检测剂分子包括 Amplex 红，它被氧化生成 荧光产物试卤灵。 Amplex 红以及检测游离葡萄糖的试剂盒由 InvitrogenCorp. 市售。 红 色荧光产物的增加量可以激发波长为 572nm、发射波长为 585nm、通频带设为 5nm 用荧 光计设备进行测量。 糖苷酶的活性越大，红色荧光产物的生成越迅速。
在一个优选的实施方案中，制备了用于不同溶酶体酶的具有独特 B1-B4 结构的多 种底物。 这就防止了在一种酶对一种本发明底物的催化活性比另一种酶对其相应本发明 底物的催化活性强得多的情况下一种特别重要的酶的产物受抑制问题。 这对于在 6 种或 更多种溶酶体酶的底物板中筛选单一突变体糖苷酶的情况也是重要的。 由其它溶酶体酶 形成的产物可能会抑制活性较低的酶的作用以致其活性无法精确测得。 因此，可理解， 所述底物和所述产物对每种酶的特异性是任选不同的。
当通过结合针对相应酶的多种底物来同时检测多于一种的酶时，所述底物的区别可不仅在于赋予其酶特异性的糖部分的类型，而且还可在于 B4 尾链部分的长度。 这对 于使用 MS/MS 作为检测工具来说特别重要，因为具有相应的不同质量指数的不同的本发 明底物分子对应于被检测的各种酶。
所述的根据本发明使用底物试剂、免疫测定、 HPLC 和质谱法来测定酶的方法 可广泛地应用。 所述的多重技术可扩展为对单一反应中的数十种或更多种酶同时进行检 测，从而免除了为辅助确诊稀有疾病进行多次测定的必要。 当评估通过特定生物化学通 路的化学通量率或评估化学通量率用于监测生物化学信号通路时，所述方法可用来同时 测定多种酶。 由于使用的 ESI-MS 检测器具有高灵敏度，每次测定仅需要微克级以下的 底物试剂，以低克数级合成数百种底物试剂就变得经济可行。
在一个优选的实施方案中，使用本发明底物同时对两种溶酶体酶的活性进行测 量。 在一个替代实施方案中，同时对 2-6 种溶酶体酶进行测量。
作为使用本发明底物的另一个示例性形式，所述各底物可用同一种荧光团进行 标记，但具有明显互不相同的质量或电荷特性。 酶裂解反应后生成的产物的量用反相高 效液相色谱 (HPLC) 进行检测。 反应可通过加入乙醇、乙腈或稀三氟乙酸淬灭。 将一部 分培养混合物转移至一个新的测定容器中，并在其中加入一种纯溶液例如甲醇、乙腈、 水 - 甲醇混合物或水 - 乙腈。 反应产物和未反应的底物在 5μm 粒径的 C18 HPLC 柱上分 离，并通过一种荧光检测器或检测器套件进行检测。 产物的量可基于通过增加相应产物 的量而作出的标准曲线计算得到。
本领域可理解的是，通过 HPLC 法可任选地同时检测多种酶的多种底物。 如果 所用的各底物的质量或保留特性明显不同，则每种底物在 HPLC 中均可辨析并可在单独 一次测定中定量。 或者，每种底物可用具有相同或不同激发或发射性能的不同荧光团进 行标记。 可通过一系列能同时将各个产物及其相应的标记底物分别定量的荧光检测器来 完成检验。 其它检测方法也类似地适用，并为本领域已知。
图 1 示出经 4- 氨基苯基修饰的 α-D- 葡萄糖与双保护赖氨酸基团的反应。 制 备双保护赖氨酸的方法为本领域已知，其示意性实例述于 WO01/27074 中。 所形成的中 间体 A-B1-B2 在 α- 氨基处特异性脱保护，从而为后续合成步骤提供了一个合适的反应 位点。 定点脱保护的方法为本领域已知。 然后引入烷基链。 示例性的烷基链由十二烷 基肉碱 (B3-B4) 提供，其通过合成方式引入 A-B1-B2 中间体中以形成完整的底物分子链 (A-B1-B2-B3-B4)。 这种底物分子作为 GAA 特异性底物而具有活性，并可任选地用于与 质谱有关的各种分析中，或其它合适的测定及检测方法。 另一个优选的实施方案中， B2 上的 6- 氨基发生脱保护而生成一种类似的反应活性底物。 本领域可理解的是，上述底物 的多种衍生物的合成可类似地进行，例如通过变换酰肉碱上的碳链、改变糖 A 基团或 B1 基团。 此外，赖氨酸 (B2) 的多种衍生物或其它烷基也同样适用。
本领域可理解的是，相似的合成路线也适于制备本发明底物。 图 2 描述了一种 与图 1 相似的合成路线，只是保护基和酰肉碱的选择不同，其中 n 为 1 至 30 的数值。 优 选地， n 为 1 至 20。
图 3 描绘了一种用于检测溶酶体贮积症的示例性底物结构。 该结构由葡萄糖或 半乳糖形式的糖 (A) 和脂肪族基团 B 组成。 基团 B 进一步由硝基苯形式的连接臂 (B1)、 赖氨酸的子基团 B2、肉碱基的子基团 B3 和碳链长为 10 至 30 的烷基形式的子基团 B4 组成。 位于子基团 B3 上的季铵阳离子使得不必再进行质谱检测原本需要的进一步离子化。
图 4 描绘了使酶活性能使用多种测定形式检测的多种官能团。 B2 上的末端氨基 能够与固体载体上的羧酸形成共价键。 B3 上季铵的出现提供了一个永久带电的部分，使 得随后不需要为了 MS/MS 分析进行离子化从而提供一种稳定易测并且可量化的溶酶体酶 活性的检测方法。
图 5 示出了使用本发明底物的一般酶反应。 通过特异性亲和结合和酶反应，所 述底物裂解为两个部分 ：一个糖部分 A 和一个脂肪族基团 B。 所述基团 B 任选地由硝基 苯基、赖氨酸、肉碱基和长链烷基部分组成。 随后两组基团可任选地用 MS/MS 进行分 析。 同时也对一种内标物进行 MS/MS 分析。 所述内标物是 B 的同位素标记类似物，其 中用氘代替了甲基上的氢原子。 或者， B2 上的脱保护末端氨基可与一种固体载体反应， 使得可使用免疫测定法任选地检测产物的有无。 脱保护的末端氨基也可用荧光试剂衍生 化以用于 HPLC、或其它合适的检测方法。
图 6 示出了示例性的本发明方法，描绘了与现有技术方法相比更有利的、使用 质谱法对酶反应进行的检测。
现有技术中，每种溶酶体酶底物都要求唯一的合成路线。 与之相反，本发明底 物可用一种通用的合成路线合成。 对于两种或多种本发明底物而言，具有一种通用的 合成路径意味由于更短和更简单的制备过程以及通用原材料的使用而使制备环境大大节 省。 相比现有技术本发明底物还可迅速合成。 合成只需要 3 步就可完成。 对溶酶体酶 GAA( 庞皮病 ) 具有特异性的一个优选的本发明底物的合成示于图 1。
还应理解，所述化合物 B1-B2-B3-B4 还可用作拮抗剂、分析对照物，或用于例如 甲状腺机能减退、糖尿病和 HIV 等疾病的临床治疗。 所述 B1-B2-B3-B4 分子为 ：B1 为 C1-C20 烷基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ； B2 为氨基酸、2，6- 二氨基己酸、或
其中 R1’ 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、 杂原子 C6-C20 芳基、C1-C20 羰基、C1-C20 酰氨基、C1-C20 醚基、C6-C20 芳基、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；X 为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R2’ 为不存在的基团， 或 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、C1-C20 酯基、C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；Y 为 碳、氮、氧或硫亲核基团 ；n 为 1 至 30 的整数。
B3 为
其中 R1 为 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基、具有 N、O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基、杂 原子 C6-C20 芳基、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；R2 各自独立地为 H、C1-C20 烷基、具有 C1-C20 烷基取代基 的 C2-C20 烷基 ；X 各自独立地为不存在的基团、氧、硫或氮 ；R3 各自独立地为不存在的基团、C1-C20 烷基、具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂 环基 ；n 为 0 至 30 的整数，包括 0 和 30 ；R4 各自独立地为不存在的基团、C1-C20 烷基， 具有取代的 C6-C20 芳基的 C1-C20、 C1-C20 羰基、 C1-C20 酰氨基、 C1-C20 醚基、 C6-C20 芳 基、含有 N、O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基 ；B4 为不存在的基团，或 C1-C20 烷基、C4-C20 醚基 ；具有 N、 O 或 S 取代基的 C1-C20 烷基 ；C1-C20 酯基、 C1-C20 醇基、 C1-C20 烯基、 杂原子 C6-C20 芳基、含有 N、 O 或 S 杂原子的 C6-C20 杂环基。
另一个实施方案中，本发明底物 A-B1-B2-B3-B4 可任选地合成为在 A 与 B1 间有 一个非水解性连接。 这产生了能通过 A 和 B4 部分二者所赋予的特异性而保留对其目标 溶酶体酶的高特异性的自杀底物。 这些分子可用作对酶功能更具特异性和更强效的抑制 剂。
图 1 示出经 4- 氨基苯基修饰的 α-D- 葡萄糖与差异保护赖氨酸基团的反应。 制 备差异保护赖氨酸的方法为本领域已知，其示意性实例述于 WO 01/27074 中。 所形成的 中间体 A-B1-B2 在 α- 氨基处特异性脱保护，从而为后续合成步骤提供了一个合适的反 应位点。 定点脱保护的方法为本领域已知。 然后引入烷基链。 示例性的烷基链由十二 烷基肉碱 (B3-B4) 提供，其通过合成方式引入 A-B1-B2 中间体中以形成完整的底物分子链 (A-B1-B2-B3-B4)。 这种底物分子作为 GAA 特异性底物而具有活性，并可任选地用于与 质谱有关的各种分析中，或其它合适的测定及检测方法。 另一个优选的实施方案中， B2 上的 6- 氨基发生脱保护而生成一种类似的反应活性底物。 本领域可理解的是，上述底物 的多种衍生物的合成可类似地进行，例如通过变换酰肉碱上的碳链、改变糖 A 基团或 B1 基团。 此外，赖氨酸 (B2) 的多种衍生物或其它烷基也同样适用。
本领域可理解的是，相似的合成路线也适于制备本发明底物。 图 2 描绘了一种 与图 1 相似的合成路线，只是保护基和酰肉碱的选择不同，其中 n 为 1 至 30 的数值。 优 选地， n 为 1 至 20。
图 3 描绘了一种用于检测溶酶体贮积症的示例性底物结构。 该结构由葡萄糖或 半乳糖形式的糖 (A) 和脂肪族基团 B 组成。 基团 B 进一步由硝基苯形式的连接臂 (B1)、 赖氨酸的子基团 B2、肉碱基的子基团 B3 和碳链长为 10 至 30 的烷基形式的子基团 B4 组 成。 位于子基团 B3 上的季铵阳离子使得不必再进行质谱检测原本需要的进一步离子化。
图 4 描绘了使酶活性能使用多种测定形式检测的多种官能团。 B2 上的末端氨基 能够与固体载体上的羧酸形成共价键。 B3 上季铵的出现提供了一个永久带电的部分，使 得随后不需要为了 MS/MS 分析进行离子化从而提供一种稳定易测并且可量化的溶酶体酶 活性的检测方法。
图 5 示出了使用本发明底物的一般酶反应。 通过特异性亲和结合和酶反应，所 述底物裂解为两个部分 ：一个糖部分 A 和一个脂肪族基团 B。 所述基团 B 任选地由硝基 苯基、赖氨酸、肉碱基和长链烷基部分组成。 两组基团随后可任选地用 MS/MS 进行分 析。 同时也对一种内标物进行 MS/MS 分析。 所述内标物是 B 的同位素标记类似物，其 中用氘代替了甲基上的氢原子。 或者， B2 上的脱保护末端氨基是可与一种固体载体反应 的，使得可使用免疫测定法任选地检测产物的有无。 脱保护的末端氨基也可用荧光试剂 衍生化以用于 HPLC、或其它合适的检测方法。
图 6 示出了示例性的本发明方法，描绘了与现有技术方法相比更有利的、使用质谱法对酶反应进行的检测。 本发明方法免除了使用非极性底物及其相应的内标物产生 的许多固有的步骤。 更特别的是，本发明方法不再需要清除其带入会损害质谱仪的非极 性溶剂和 / 或洗涤剂的步骤。 这些步骤包括 ：用氯仿萃取酶产物的液 - 液萃取步骤、除 去洗涤剂的硅胶分离步骤以及固相萃取 (SPE) 步骤。 这些现有技术中额外的步骤增加了 统计误差。 由于根据目前发明的本发明底物与现有技术相比极性更大，所以在此可使用 极性溶剂，示例性地包括纯甲醇或纯乙醇。
包括所述底物、酶产物和内标物在内的所有试剂都可任选地用反相 HPLC 进行 纯化并用 ESI-MS 进行表征，既可在线 HPLC-MS 测定或可通过收集合适的级分脱机测 定。
实施例
实施例 1 ：
对于每个样品而言，将 3mm 直径的固片从滤纸上的干燥血样区域切入 96- 孔微 量滴定板的孔中。 然后将所述血样圆片直接用含有最终浓度为 5μmol/L 的针对法布里病 的底物和最终浓度为 0.1μmol/L 的内标物的测定溶液进行培养。 向所述测定溶液中再加 入最终浓度为 0.5mol/L 的乙酸钠缓冲液。 将含有血样圆片的测定混合物在恒温空气振动 器中在轨道振动 (150rpm) 下于 37 摄氏度培养 15 至 24 小时。 培养期之后，将等分的纯 甲醇加入每个试管或孔中以终止酶反应。 将培养的反应混合物用纯甲醇稀释，然后送入 质谱仪。 对于质谱分析，电喷雾源以正离子模式运行，并以母离子扫描模式对离子进行 检测。 酶产物的量可通过产物相对于内标物的离子丰度率减去空白样品的计算得到。
实施例 2 ：
一个替代实施方案中，使用本发明底物获得的反应产物通过免疫测定法定量。 将滤纸上的血斑在缓冲液中重建以释放活性组分。 将一种或一系列本发明底物加入反应 室并反应过夜 ( 约 14 小时 )。 加入 pH 值为 10.4 的 6 倍体积的甘氨酸 /NaOH 淬灭反应。 将每个反应的样品加入强结合性照射 (high-binding irradiated) 的微量滴定板的孔中并培养 过夜，以使反应产物与板孔充分结合。 将类似缓冲液 / 样品中的具有标准曲线的产物也 加入该滴定板中作为定量基准。 完全结合至板表面后，使用洗瓶、洗板器或任意其它的 自动或非自动洗板系统将所述孔用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤两次。 然后加入封端剂—— 其示意性地包括于 PBS 中的 3％牛血清白蛋白或本领域已知的任意其它的合成或天然封 端剂——封闭能够结合蛋白质的所有其它位点。 将所述封端剂室温培养两个小时。 将孔 用 3 倍的 PBS 洗涤。 然后将一种 ( 多种 ) 第一抗体加入孔中识别并结合剩余的底物、或 产物。 将所述一种或多种抗体在孔中培养至少 2 小时。 将板洗涤四次以除去未结合的抗 体。 如果第一抗体进行了标记，则所述板即可用于检测。 任选地，将标记的第二抗体置 于板孔中，再培养 2 小时，之后洗涤 4 次，然后通过合适的方法，例如通过荧光或光吸收 酶标仪 (plate reader) 进行检测。
实施例 3 ：
一个替代实施方案中，使用本发明底物获得的反应产物通过免疫测定法定量。 将滤纸上的血斑在缓冲液中重建以释放活性组分。 将一种或一系列固定于编码颗粒上的 本发明底物加入反应室中，优选地为一个微板孔，并反应过夜 ( 约 14 小时 )。 将类似缓 冲液 / 样品中的具有标准曲线的酶加入单独一批编码颗粒中，以作为定量基准。 使用 pH值为 10.4 的 6 倍体积的甘氨酸 /NaOH 淬灭该反应。 然后将第一抗体加入所述孔中以识 别并结合剩余的底物、或产物。 将抗体培养至少 30 分钟。 如果第一抗体进行了标记， 则测试即可进入检测阶段。 任选地，将标记的第二抗体置于板孔中再培养 30 分钟。 通 过流式细胞仪进行检测。
实施例 4 ：
一个优选的实施方案中， B2 上的活性氨基可用于多种标记方法。 其中，荧光标 记是最有效的检测方法之一，因为它具有极高的灵敏性、相对于标准物定量的能力，并 且在板测定 (panel assay) 中，其可与具有其它荧光团的其它底物结合而用于多种溶酶体 酶。 一个代表例中，B2 侧链胺用氟代异硫氰酸酯 (FITC) 进行特异性标记。 通过将 FICT 分子引入至 B2 基团的末端胺而对图 1 的本发明底物进行衍生。 将纯化 / 冻干的底物以 5mg/mL 的浓度重新悬浮于 pH 值为 9.0 的 0.1M 的碳酸氢钠缓冲液中。 将 5mg FITC 染料 在暗处溶解于 0.5mL DMSO 中，然后立即与底物进行反应。 在温和涡旋下，加入 0.1ml 的底物溶液的染料溶液，并在室温下黑暗培养 1 小时。 将游离的未反应的染料在经磷酸 盐缓冲盐水预平衡的 10×300mm 的 Spehadex G 柱上通过凝胶过滤除去。 采用质谱或本领 域已知的其它方法确定最终产物的浓度。将标记底物任选地进行浓缩并等分储存于 -20℃ 下直至进一步使用。
将标记底物用于检测葡糖脑苷脂酶活性及戈谢病的反应。 针对每个患者样品或 对照样品，从滤纸上干燥血样区域中切下 3mm 直径的圆片置入微型离心管或 96- 孔微量 滴定板的孔中。然后将血样圆片直接用测定溶液培养，测定溶液含有最终浓度为 5μmol/ L 的本发明标记底物和最终浓度为 0.1μmol/L 的内标物。 将含有血样圆片的测定混合物 在恒温空气振动器中在轨道振动 (150rpm) 下于 37℃下培养 15 至 24 小时。 培养期之后， 向每个试管或孔中加入等分纯甲醇以终止酶反应。 将所述反应样品加入含有 HPLC 流动 相 ( 甲醇∶水∶乙酸为 82 ∶ 18 ∶ 0.1 体积 / 体积 / 体积 ) 的第二个管中。 将 20-μl 等 分的淬灭反应溶液在 4.6×250-mm SymmetryC18 反相 HPLC 柱 (Waters， Milford， MA) 上使用 82 ∶ 18 ∶ 0.1 体积 / 体积 / 体积的甲醇∶水∶乙酸作为流动相以 1.3ml/min 的速 率溶剂成分不变地进行分离。 使用荧光检测器 (L-7480 型 ；Hitachi， Naperville， IL) 在 介质增益灵敏度下持续检测荧光强度。 样品中标记产物的量通过将其峰面积与由已知浓 度的标记产物组成的外标物的峰面积进行对比而确定。 反应产物的浓度可容易地确定， 葡糖脑苷脂酶的活性可通过使产物摩尔数除以单位反应时间确定。
实施例 5 ：
一个替代实施方案中，使用本发明底物获得的反应产物通过免疫测定法定量， 其中使用了一种以裂解的本发明底物为靶标的特异性抗体。 将滤纸上的血斑重新溶解于 缓冲液中以释放出活性组分。 将一种或一系列本发明底物加入反应室中并反应过夜 ( 约 14 小时 )。 使用 pH 值为 10.4 的 6 倍体积的甘氨酸 /NaOH 淬灭反应。 预先准备一个经 过对硝基苯 - 氨酰基 B1-B2 部分具有特异性的小鼠抗体涂覆的孔微量滴定板。 然后加入封 端剂——其示意性地包括于 PBS 中的 3％牛血清白蛋白或本领域已知的任意其它合成或天 然封端剂——封闭能够结合蛋白质的所有其它位点。 将各反应样品加入孔微量滴定板的 孔中，并培养 2 小时至整夜，以使反应产物与板孔充分结合。 将类似缓冲液 / 样品中的具 有标准曲线的对照产物加入板中作为定量基准。 完全结合至板表面后，使用洗瓶、洗板器或任意其它的自动或非自动洗板系统将所述孔用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤两次。 然 后向孔中加入一种 ( 多种 ) 第一抗体以识别并结合替代的表位的产物。 将所述一种 ( 多 种 ) 抗体在孔中培养至少 2 小时。 将板洗涤四次以除去未结合的抗体。 如果第一抗体进 行了标记，则所述板即可用于检测。 任选地，将标记的第二抗体置于板孔中再培养 2 小 时，然后洗涤 4 次，并通过合适的方法，例如通过荧光或可见光酶标仪进行检测。
本说明书中提及的所有专利或出版物均代表本发明所属技术领域技术人员的水 平。 这些专利和出版物在此通过引用的方式纳入本文，其纳入程度就如同每个单独的出 版物均被明确地单独指出以引用的方式完整纳入本文一样。
本领域技术人员容易理解的是，本发明可很好地改变以适于实现所述目的并获 得所述结果和优点，以及那些固有的结果和优点。 本发明实施例以及本文所述的方法、 过程、处理方式、分子和特异性化合物均是目前优选实施方案的代表，是示例性的，而 无意于限制本发明的范围。 很明显，在权利要求范围所限定的本发明的主旨范围内，也 可存在并包括其它实施方案。