生产苏氨酸和异亮氨酸的方法 【技术领域】
本发明涉及一种用于发酵工业的技术，并且还涉及一种属于埃希氏杆菌属的能生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的细菌，和一种使用该细菌生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法。背景技术
如L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的工业生产传统上是通过使用如棒状杆菌属细菌的微生物和具有生产这种L-氨基酸能力的属于埃希氏杆菌属的细菌来发酵生产。作为这些氨基酸生产菌株，可使用分离自自然界的菌株，其人工诱变菌株或其重组菌株，其中通过基因重组增强L-氨基酸生物合成酶以提高产率。
特别地，作为生产L-苏氨酸的方法，在日本专利平开公开号5-304969中已经公开了利用属于埃希氏杆菌属的细菌突变株的方法，在日本专利公开号1-29559，2-109985，56-15696和日文出版的国际专利号3-501682中公开了利用重组大肠杆菌菌株的方法，在日本专利平开公开号62-239996中公开了利用棒状杆菌属细菌的突变株的方法，在日本专利平开公开号61-195695中公开了利用棒状杆菌属细菌的突变株的方法。进一步地，在日本专利平开公开号55-131397，59-31691，56-15696和日文公开的国际专利号3-501682中公开了生产L-苏氨酸的方法，该方法利用了由含有苏氨酸操纵子的重组质粒转化地菌株。
进一步地，作为生产L-异亮氨酸的方法，在日本专利平开公开号5-130882中公开了利用大肠杆菌的方法，在日本专利平开公开号2-458中公开了利用大肠杆菌的重组菌株的方法，在日本专利公开号3-62395中公开了利用棒状杆菌属细菌的突变株的方法，在日本专利公开号5-47196中公开了利用棒状杆菌属细菌的重组菌株的方法。也已知L-异亮氨酸的生产能力可通过以下方法获得：导入含有编码大肠杆菌天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因的thrABC操纵子，其中L-苏氨酸抑制基本被脱敏，并导入含有编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的ilvGMEDA操纵子，其中L-异亮氨酸抑制基本被脱敏，并且由其中除去了衰减所需的区域(见日本专利平开公开号8-47397)。
同时，大肠杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因是已知的(Fujita，N.，Miwa，T.，Ishijma，S.，Izui，K.和Katsuki H.J.生物化学杂志95，909-916(1984))，并且还公开了一种磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和利用其基因的方法，其中天冬氨酸对该酶的反馈抑制基本被脱敏(WO95/06114)。进一步地，也已知增强磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的例子，其目的是提高棒状杆菌属细菌的L-谷氨酸生产能力(日本专利平开公开号60-87788)。而且，也公开了通过同时增强磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因与其它酶基因来改良氨基酸生产能力的技术。例如，已经报道了一个例子，其中通过在棒状杆菌属细菌中增强谷氨酸脱氢酶基因、柠檬酸合成酶基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来提高L-谷氨酸的生产能力，其中所述细菌中缺失了α-酮戊二酸脱氢酶基因(WO96/06180)。至于大肠杆菌，已经公开了即使将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因导入大肠杆菌的L-苏氨酸生产菌株B-3996，L-苏氨酸的生产能力也没有明显提高，其中所述菌株被含苏氨酸操纵子的重组质粒转化(WO95/06114)。
另外，也公开了通过增加微生物细胞中的烟酰胺核苷酸转氢酶(下文也称为“转氢酶”)的酶活性，并且增加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产能力来提高如氨基酸的物质的生产能力(WO95/11985)。在该参考文献中，也提及通过在被含有苏氨酸操纵子的重组质粒转化的大肠杆菌中增强转氢酶基因来提高L-苏氨酸的生产能力的例子。至于通过提高转氢酶活性来提高生产能力的氨基酸，提及了L-异亮氨酸。发明内容
本发明的一个目的是提高埃希氏杆菌属细菌的L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力。
本发明的发明人发现通过提高磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性和转氢酶活性可明显增加L-苏氨酸或L-异亮氨酸的生产能力，并且进一步发现通过增强天冬氨酸酶活性可进一步提高生产能力。因此完成了本发明。
也就是说，本发明提供了下列内容：
(1)属于埃希氏杆菌属的细菌，其能产生L-苏氨酸或L-异亮氨酸，其中增强了细胞内磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性和转氢酶活性。
(2)如(1)所述的属于埃希氏杆菌属的细菌，其中增强了由苏氨酸操纵子或其部分编码的一种或多种酶的活性，并且所述细菌具有生产L-苏氨酸的能力。
(3)如(2)所述的属于埃希氏杆菌属的细菌，其中苏氨酸操纵子由thrABC组成。
(4)如(1)所述的属于埃希氏杆菌属的细菌，其中增强了由ilv操纵子或其部分编码的一种或多种酶的活性，并且所述细菌具有生产L-异亮氨酸的能力。
(5)如(1)至(4)中任何一项所述的属于埃希氏杆菌属的细菌，其中增强了天冬氨酸酶的活性。
(6)如(1)至(5)中任何一项所述的属于埃希氏杆菌属的细菌，其中通过增加编码每种酶的基因或操纵子的拷贝数，或修饰表达调节序列以增强基因或操纵子的胞内表达来提高每种酶的活性。
(7)如(6)中所述的属于埃希氏杆菌属的细菌，其中基因源自属于埃希氏杆菌属的细菌。
(8)一种用于生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的方法，其包括在培养基中培养如(1)至(7)中任何一项所述的属于埃希氏杆菌属的细菌以在培养基中生产和积累L-苏氨酸或L-异亮氨酸，并且从培养基中收集L-苏氨酸或L-异亮氨酸。
根据本发明，能提高属于埃希氏杆菌属的细菌的L-苏氨酸或L-异亮氨酸的生产能力。附图说明
图1示出了含有aspA基因的质粒pMW118∷aspA的构建。
图2示出了含有pntAB基因和ppc基因的质粒(pPTS)的构建。
图3示出了含有aspA基因和ppc基因的质粒(pAPW)的构建。
图4示出了含有aspA基因、pntAB和PPc基因的质粒(pAPT)的构建。
图5示出了质粒pHSGSK的构建。
图6示出了质粒pdGM1的构建。
图7示出了质粒pMWGMA2的构建。
图8示出了质粒pMWD5的构建。
图9示出了pMWD5-aspA、pMWD5-THY、pMWD5-ppc、pMWD5-PTS和pMWD5-APT的构建。具体实施方式
以下将详细描述本发明。
本发明的属于埃希氏杆菌属的细菌是一种具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的能力，并且具有增强的细胞内磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下文中简称为“PEPC”)活性和转氢酶(下文中也简称为“THY”)活性的，属于埃希氏杆菌属的细菌。
作为属于埃希氏杆菌属的细菌，可具体使用Neidhardt等人的著作(Neidhardt，F.C.等，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，American Society for Microbiology，华盛顿，1208，表1)中所提及的细菌。例如，可使用大肠杆菌。
本文所用术语“具有生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸的能力”指的是，当在培养基中培养感兴趣的细菌时，其显示了在培养基中积累L-苏氨酸或L-异亮氨酸的能力。这种L-苏氨酸或L-异亮氨酸的生产能力可以是野生型菌株具有的性质或通过繁殖赋予或增强的性质。
在本发明的属于埃希氏杆菌属的细菌中，可进一步增强胞内天冬氨酸酶(L-天冬氨酸脱氨酶，以下称为“AspA”)的活性。
为了增强属于埃希氏杆菌属的细菌中的PEPC、THY或AspA活性，可在合适的质粒上克隆编码PEPC、THY或AspA的基因，并且用所得的质粒转化用作宿主的属于埃希氏杆菌属的细菌。这样可增加转化子中编码PEPC、THY或AspA的基因(下文依次分别简称为“ppc基因”、“pntAB基因”和“apsA基因”)的拷贝数，结果，增强了PEPC、THY或AspA的活性。
将ppc基因、pntAB基因和apsA基因以ppc基因和pntAB的组合，或这些基因与apsA基因的组合导入属于埃希氏杆菌属的细菌。可将这些基因作为一种质粒(其中克隆了两到三种此类基因)，或可共存的两到三种质粒(其中分别克隆了基因)导入宿主。
也可使用作宿主的原始亲代菌株的染色体DNA上存在多拷贝的ppc基因、pntAB基因或apsA基因以增强PEPC、THY或AspA的活性。为了将多拷贝的ppc基因、pntAB基因或apsA基因导入属于埃希氏杆菌属的细菌的染色体DNA上，可使用以多拷贝存在于染色体DNA上的序列，例如，重复DNA，存在于转座因子末端的反向重复等。或者，也可将ppc基因、pntAB基因或apsA基因掺入转座子，并且允许其转移以将多拷贝的每个基因导入染色体DNA中。通过任一种方法，都增加了转化子菌株细胞内ppc基因、pntAB基因或apsA基因的拷贝数，结果，增强了PEPC、THY或AspA的活性。
除了基于上述的基因扩增外，也可通过其它方法获得PEPC、THY或AspA活性的提高，即使ppc基因、pntAB基因和apsA基因的表达调节序列，如启动子被更强的所取代(见日本专利平开公开号1-215280)。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子、tet启动子、amyE启动子、spac启动子等是强启动子。这些启动子的替代增强了ppc基因、pntAB基因或apsA基因的表达，因此增强了PEPC、THY或AspA的活性。表达调节序列的增强可与ppc基因、pntAB基因或apsA基因拷贝数的增加相结合。
作为ppc基因、pntAB基因或apsA基因来源的生物体可以是任何具有PEPC、THY或AspA活性的生物体。特别优选属于原核生物的细菌，例如，属于肠杆菌属、克雷白氏杆菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、埃希氏杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属或芽胞杆菌属的细菌。作为特别的例子，可提及大肠杆菌。可从上文提及的这些微生物的染色体DNA中获得ppc基因、pntAB基因或apsA基因。
大肠杆菌的ppc基因可得自具有该基因的质粒，即质粒pS2(Sabe，H.等人，基因，31，279(1984))或pT2。通过用AatII与AflII消化pS2，能获得含有ppc基因的DNA片段。也可通过用SmaI与ScaI消化pS2获得含有ppc基因的DNA片段。携有pT2的大肠杆菌F15菌株(AJ12873)于1993年7月15日保藏在日本工业技术院生命工学工业技术研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮政编码：305-8566)(目前为独立的行政公司，隶属国立高级工业技术研究院的国际专利生物保藏机构(Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮政编码：305-5466)，保藏号为FERM P-13752。然后，根据布达佩斯条约的规定，于1994年7月11日将该菌株转移至国际保藏单位，保藏号为FERM BP-4732。
通过用SmaI和HindIII消化含有基因的质粒pMW∷THY(WO95/11985)能获得pntAB基因。带有pMW∷THY的大肠杆菌AJ12929菌株于1993年10月4日保藏在日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码：305-8566，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，保藏号为FERM P-13890。然后，根据布达佩斯条约的规定，在1994年9月14日将该菌株由上述的原始保藏单位转移到国际保藏单位，保藏号为FERM BP-4798。大肠杆菌转氢酶由两个亚单位组成，其分别由pntA和pntB编码。
但是无需特别地限制本发明的属于埃希氏杆菌属的细菌，只要其具有L-苏氨酸或L-异亮氨酸生产能力即可，其特别的例子包括，例如通过增强由苏氨酸操纵子或其部分编码的酶活性而赋予L-苏氨酸生产能力的属于埃希氏杆菌属的细菌，以及通过增强由ilv操纵子或其部分编码的酶活性而赋予L-异亮氨酸生产能力的属于埃希氏杆菌属的细菌。
例如，苏氨酸操纵子或其部分可以是thrABC或其部分。例如，ilv操纵子或其部分可以是ilvGMEDA或其部分。
作为具有L-苏氨酸生产能力的大肠杆菌，特别提到大肠杆菌VKPM B-3996(1987年11月19日保藏在全联邦抗生素科学中心，Nagatinskaya街3-A，1113105莫斯科，俄联邦登记号为RIA1867，见美国专利号5,175,107)，大肠杆菌AJ11335(日本专利平开公开号55-131397)等。VKPMB-3996菌株携有质粒pVIC40(国际专利公开号WO90/04636)，所述质粒通过将苏氨酸生物合成系统基因(苏氨酸操纵子：thrABC)插入具有链霉素抗性标记的广宿主范围载体质粒pAY32(见chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，质粒，1986，16，161-167)来获得。由该操纵子中的thrA编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的L-苏氨酸反馈抑制被脱敏。
作为具有L-异亮氨酸生产能力的属于埃希氏杆菌属的细菌，提及了大肠杆菌KX141(VKPMB-4781，见欧洲专利公开号519,113)和大肠杆菌AJ12919(日本专利平开公开号8-47397)。ilv操纵子被扩增的VKPM B-3996菌株也是优选的L-异亮氨酸生产菌。
苏氨酸操纵子含有thrA、thrB和thrC基因，它们依次分别编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I、高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶。至于这些酶，优选L-苏氨酸对天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的抑制基本被脱敏。
ilvGMEDA操纵子含有ilvG、ilvM、ilvE、ilvD和ilvA基因，并且它们依次分别编码乙酰羟酸合酶的同工酶II的大亚单位、小亚单位、转氨酶、二羟酸脱水酶和苏氨酸脱氨酶。因为ilvGMEDA操纵子的表达受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的控制(衰减)，可在L-异亮氨酸生产菌中去除或突变衰减所需的区域，以使该细菌对产生的L-异亮氨酸对表达的抑制脱敏。至于ilvGMEDA操纵子，可提及源自属于埃希氏杆菌属细菌的操纵子，特别是源自大肠杆菌的ilvGMEDA操纵子。在WO96/26289中详细描述了ilvGMEDA操纵子。至于ilvGMEDA操纵子，优选应该去除衰减所需的区域，在由这个操纵子编码的酶中，L-异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的抑制应基本被脱敏(见日本专利平开公开号8-47397)。
可以按照与PEPC、THY和AspA相同的方式增强由苏氨酸操纵子或ilv操纵子或其部分编码的酶活性。
在用于本发明的微生物中，如果负责生物合成目的氨基酸所涉及途径的酶的基因被增强，或导入了编码受反馈抑制的酶的脱敏型(抑制作用被脱敏的类型)酶的基因或操纵子，可进一步提高L-氨基酸的生产能力。
通过在培养基中培养属于埃希氏杆菌属的，其中必要时可按上文所述增强PEPC、THY以及AspA，且具有在培养基中生产L-苏氨酸或L-异亮氨酸之能力的细菌，以在培养基中生产和积累苏氨酸或异亮氨酸，并且从培养基中收集苏氨酸或异亮氨酸，来生产苏氨酸或异亮氨酸。
用于培养的培养基可以是含有碳源、氮源、无机离子和必要时还含有其它有机组分的常用培养基。
至于碳源，可以使用如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物的糖；如甘油和山梨糖醇的醇；或如延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸的有机酸。
至于氮源，可以使用如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵的无机铵盐；如大豆水解物的有机氮；氨气；或氨水。
至于有机微量营养物质，需要添加适当量的必需物质，如维生素B1、酵母浸膏等。除此之外，还要添加少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
优选在需氧条件下培养16-72小时。在培养期间将培养温度控制在25℃至45℃间，并且将pH控制到5至8。可使用无机的或有机的，酸性的或碱性的物质以及氨气等来调节pH。
通常从发酵液中收集L-苏氨酸或L-异亮氨酸是通过离子交换树脂技术、沉淀和其它已知技术组合来进行的。
下文中将参照下列实施例对本发明作进一步地具体解释。
实施例1：产生含有各种基因的质粒
(1)产生含有aspA基因的质粒(pMW118∷aspA)
通过使用大肠杆菌W3110菌株的染色体DNA作为模板和下列的引物的PCR来扩增含有aspA基因的DNA片段。
引物1：5’-TGATCAGCGAAACACTTTTA-3’(SEQ ID NO：1)
引物2：5’-CAGCAAACTATGATGAGAA-3’(SEQ ID NO：2)
将获得的经扩增片段插入pMW118(Nippon Gene)的SmaI裂解位点以获得pMW118∷aspA(图1)。
(2)产生含有pntAB基因和ppc基因的质粒(pPTS)
用SmaI和HindIII消化在WO95/11985中述及的含有pntAB基因的质粒pMW118：THY，并且收集含有pntAB的DNA片段。然后，用XbaI消化在WO95/16042中述及的含有ppc基因的质粒pppc。使两者的末端成为平端后，进一步用HindIII消化，并且将上述含pntAB的DNA片段插入裂解位点以获得质粒pPTS(图2)。
(3)产生含有aspA基因和ppc基因的质粒(pAPW)
用SacI消化pMWI18∷aspA，并且使两者的末端都成为平端。进一步用HindIII消化以获得含aspA的DNA片段。然后，用XbaI消化上述的pppc，并且使两者的末端都成为平端。进一步用HindIII消化，并且将上述的含aspA的DNA片段插入裂解位点以获得pAPW(图3)。
(4)产生含有apsA基因、pntAB基因和ppc基因的质粒(pAPT)
通过用SmaI和HindIII消化pMW∷THY得到含pntAB的DNA片段。然后，用XbaI消化上述pAPW，并且使两者的末端都成为平端。进一步用HindIII消化，并且将上述pntAB插入裂解位点以获得pAPT(图4)。
(5)产生含有ilvGMEDA操纵子的质粒(pMWD5)
由WO96/26289中公开的，含有ilvGMED操纵子的质粒pMWD5制备含有ilvGMEDA操纵子的DNA片段。按下述构建质粒pMWD5。
从大肠杆菌MI162中提取染色体DNA。用限制性酶HindIII裂解染色体DNA。发现包括ilvGM基因的HindIII-HindIIIDNA片断的长度是4.8kb。因此，将长度约为4.8kb的HindIII-HindIII DNA片段和通过用HindIII消化质粒载体pBR322(购自Takara Shuzo有限公司)获得的DNA片段连接在一起。
将所得DNA-连接混合物导入大肠杆菌MI162中，该菌株为乙酰羟酸合酶缺陷菌株。选择通过转化能补偿乙酰羟酸合酶缺陷的菌株，从选择的菌株中分离质粒结构。质粒的分析结果表明：含有ilvGM基因和ilvE基因5’-末端部分的4.8-kb DNA片断被插入pBR322的HindIII位点。该质粒被称为pBRGM7。
参照基因，97，21，(1991)，Pro.Natl.Acad.Sci.U.SA.，78，922，(1981)和细菌学杂志，149，294，(1982)中描述的ilvGM基因的DNA序列来合成SEQ ID NO：3和NO：4中所示的合成寡核苷酸。使用这两个寡核苷酸作为引物，以MI162菌株的染色体DNA为模板，通过PCR方法来扩增DNA。经扩增的片段被称为片段(A)。
类似地，参照基因，97，21，(1991)，Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，78，922，(1981)和细菌学杂志，149，294，(1982)中描述的DNA序列来合成SEQ ID NO：5和NO：6中所示的合成寡核苷酸。使用这两个合成的DNA作为引物，以MI162菌株的染色体DNA为模板，通过PCR方法来扩增DNA。经扩增的片段被称为片段(B)。
将通过用SmaI消化片段(A)获得的大片段与通过用SmaI消化载体pUC18(Takara Shuzo有限公司)获得的DNA片段相连接来制备质粒pUCA。将通过用KpnI消化片段(B)获得的大片段与通过用HincII和KpnI消化载体pHSG399(TakaraShuzo有限公司)获得的DNA片段相连接来制备质粒pHSGB。
用KpnI消化质粒pUCA，用DNA聚合酶I(Klenow片段)的大片段制备平端片段，并且用PstI消化，最后，分离出含有片段(A)的DNA片段。用HindIII消化质粒pHSGB，用DNA聚合酶I(Klenow片段)的大片段制备平端片段，并且用PstI消化，最后，分离出含有片段(B)的DNA片段。通过连接这两个DNA片段来制备质粒pHSGSK。
pHSGSK中源自片段(A)和(B)的SmaI-KpnI片段被称为片段(C)。片段(C)对应于通过用SmaI和KpnI消化4.8-kb的HindIII-HindIII片段所获得的片段，其含有启动子、SD序列和ilvG基因的上游区，但是缺失了自前导序列至衰减子的0.2kb DNA序列。图5简述了pHSGSK的构建图。
通过用SmaI和KpnI消化质粒pHSGSK获得片段(C)，通过用SmaI和KpnI消化质粒pBRGM7获得大DNA片段，连接这两个片段。获得的质粒被称为pdGM1。pdGM1携有包括ilvGM基因的4.6-kb HindIII-HindIII片段，其缺失了衰减所必需的区域。缺失了衰减所必需区域的ilvGM基因被表示为“attGM”。图6简述了pdGM1的构建图。
在日本专利申请平开号2-458(1990)中描述的质粒pDRIA4可通过组合穿梭载体pDR1120和包括编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因和源自大肠杆菌K-12的ilvD基因3’-末端部分的BamHI-BamHI片段来制备，所述穿梭载体允许在属于埃希氏杆菌属的微生物和属于短杆菌属的微生物中自我复制。日本专利申请平开号2-458(1990)描述了BamHI-BamHI片段的长度是2.3kb；但是，目前发现该片段的长度为2.75kb。质粒pDRIA4不存在于黄色短杆菌AJ12358(FERM P-9764)或黄色短杆菌AJ12359(FERM P-9765)的染色体DNA之中。可根据常规方法从这些菌株中制备质粒pDRIA4。
从质粒pDRIA4的2.75-kb BamHI-BamHI DNA片段中，制备包括编码苏氨酸脱氨酶的ilvA基因的HindIII-BamHI片段，其中L-异亮氨酸的抑制作用被释放，将该片段与通过用HindIII和BamHI裂解载体pMW119(NIPPON GENE)获得的DNA片段相连接。所得质粒被称为pMWA1。
将通过用HindIII裂解质粒pMWA1获得的DNA片段与通过用HindIII裂解质粒pdGM1获得的DNA片段相连接。根据对经连接质粒的限制性位点的位置所作的分析，选择ilvGM和ilvA基因的转录方向相同的质粒，称之为pMWGMA2。pMWGMA2包括缺失了衰减子的ilvGM基因、ilvE基因的5’-末端部分和ilvD基因的3’-末端部分。图7简述了pMWGMA2的构建图。
制备大肠杆菌MI162的染色体DNA，并用SalI和PstI裂解来制备DNA片段的混合物。另一方面，通过用SalI和PstI裂解载体pUC19(Takara Shuzo有限公司)来制备DNA片段。将DNA片段的混合物与通过裂解pUC19获得的DNA片段连接，获得DNA混合物。将DNA混合物导入转氨酶B-缺陷菌株AB2070(大肠杆菌基因存储中心提供。细菌学杂志，109，703，(1972)，CGSC2070)，选择支链氨基酸需求被恢复的转化子。作为由该菌株制备质粒的结果，发现质粒携有相互连接的，通过用SalI和PstI裂解质粒pUC19获得的DNA片段，和包括ilvE基因的SalI-PstI DNA片段。该质粒被称为pUCE1。pUCE1包括ilvM基因的3’-末端部分、ilvE基因和ilvD基因的5’-末端部分。
通过用HindIII部分消化pMWGMA2来制备DNA片段混合物。另一方面，通过用HindIII裂解pUCE1来制备含有ilvE基因部分和ilvD基因5’-末端部分的1.7-kb HindIII-HindIII DNA片段。使用通过连接这两个DNA片段得到的DNA混合物转化二羟酸脱水酶(ilvD基因产物)缺陷菌株AB1280，并从转化子中选择恢复支链氨基酸需求的菌株。在由所得转化子制备的质粒中，通过用HindIII仅裂解pMWGMA2的attGM和ilvA之间的HindIII位点获得的DNA片段，和得自pUCE1的包括ilvE基因部分和ilvD基因部分的1.7-kb HindIII-HindIII DNA片段相连接，ilvGMEDA操纵子被重构。该质粒被称为pMWD5。图8简述了pMWD5的构建图。
源自载体pMW119的所得质粒pMWD5携有ilvGMEDA操纵子，其中缺失了衰减所必需的区域。
按上述获得的质粒pMWD5(Apr)是含有pMW119作为载体并携有ilvGMEDA操纵子的质粒，所述操纵子中除去了衰减所必需的区域。
(6)产生含有ilvGMEDA操纵子和aspA基因的质粒(pMWD5-aspA)
用SacI和HindIII消化pMW118∷aspA，使其成为平端以获得含有aspA的DNA片段。用AflII消化pMWD5，使其成为平端，并将上述含有aspA的DNA片段插入裂解位点以获得pMWD5-aspA(图9)。
(7)产生含有ilvGMEDA操纵子和pntAB基因的质粒(pMWD5-THY)
用SmaI和HindIII消化pMW∷THY，使其成为平端以获得含有pntAB的DNA片段。用AflII消化pMWD5，使其成为平端，并将上述含有pntAB的DNA片段插入裂解位点以获得pMWD5-THY(图9)。
(8)产生含有ilvGMEDA操纵子和ppc基因的质粒(pMWD5-ppc)
用SacI和XbaI消化pppc，使其成为平端以获得含有ppc的DNA片段。用AflII消化pMWD5，使其成为平端，并将上述含有ppc的DNA片段插入裂解位点以获得pMWD5-ppc(图9)。
(9)产生含有ilvGMEDA操纵子、pntAB基因和ppc基因的质粒(pMWD5-PTS)
用SacI和HindIII消化pPTS，使其成为平端以获得含有ppc和pntAB的DNA片段。用AflII消化pMWD5，使其成为平端，并将上述含有ppc和pntAB的DNA片段插入裂解位点以获得pMWD5-PTS(图9)。
(10)产生含有ilvGMEDA操纵子、aspA基因、pntAB基因和ppc基因的质粒(pMWD5-APT)
用SacI和HindIII消化pAPT，使其成为平端以获得含有ppc、pntAB和aspA的DNA片段。用AflII消化pMWD5，使其成为平端，并将上述含有ppc、pntAB和aspA的DNA片段插入裂解位点以获得pMWD5-APT(图9)。
实施例2：利用携有多个质粒的大肠杆菌生产氨基酸
(1)生产L-苏氨酸
将实施例1中获得的多个质粒各自导入大肠杆菌VKPM B-3996。在下列条件下培养这些菌株。
使用具有表1所示组成的培养基，在114-116rpm的搅拌速度下，于37℃培养38小时。分开制备并消毒表1中提及的组份A、组份B和组份C，然后将其冷却，并以组份A占16/20、组份B占4/20的体积比与30克/升的组份C混合。培养基中积累的L-苏氨酸量的测量结果示于表2。发现在属于埃希氏杆菌属的L-苏氨酸生产细菌中，可通过增强胞内THY活性和PEPC活性来提高L-苏氨酸的生产率。另外，也发现可通过增强AspA活性来进一步提高L-苏氨酸的生产率。
表1：苏氨酸生产培养基A (g/l)(NH4)2SO4 16KH2PO4 1MgSO4·7H2O 1FeSO4·7H2O 0.01MnSO4·4H2O 0.01酵母浸膏(Difco) 2 L-甲硫氨酸 0.5用KOH调节pH到7.0并且在115℃下高压灭菌10分钟(16/20体积)B将20％葡萄糖在115℃下高压灭菌10分钟(4/20体积)C根据日本药典，将CaCO3在180℃下干灭菌2天(30g/L)抗生素(100μg/L的链霉素和50μg/L的氨苄青霉素)
表2宿主质粒L-苏氨酸积累量(g/L)B-3996pMW11814.0pppc14.5pMW∷THY15.0pMW118∷aspA14.0pPTS16.8pAPT17.2
(2)生产L-异亮氨酸
将实施例1中获得的多个质粒各自导入大肠杆菌VKPMB-3996。在下述条件下培养这些菌株。
于37℃，在用于生产L-异亮氨酸的培养基(含有40克葡萄糖、16克硫酸铵、1克磷酸二氢钾、1克七水硫酸镁、0.01克七水硫酸亚铁、0.01克四水氯化锰、2克酵母浸膏和40克的碳酸钙，1升水，pH＝7.0)中培养24小时。由高效液相层析来定量包含在培养基中的L-异亮氨酸。结果示于表3。
发现在属于埃希氏杆菌属的L-异亮氨酸生产细菌中，可通过增强胞内THY活性和PEPC活性来提高L-异亮氨酸的生产率。进一步，也发现可通过增强AspA活性来进一步提高L-异亮氨酸的生产率。
表3宿主质粒L-异亮氨酸积累量(g/L)B-3996pMWD510.0pMWD5-ppc9.9pMWD5-THY10.4pMWD5-aspA10.0pMWD5-PTS10.8pMWD5-APT11.2
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>生产苏氨酸和异亮氨酸的方法<130>OP1188<140><141>2001-08-<150>JP 2000-244921<151>2000-08-11<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>1tgatcagcga aacactttta 20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>2cagcaaacta tgatgagaa 19<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>3taacatcact gagatcatgt tg 22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>4tcttttcttg catcttgttc g 21<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>5tctgtttctc aagattcagg ac 22<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>6cgccggtaaa ccaaaaccc 19