背景技术
随着PCR(Polymerase Chain Reaction)技术在基础研究、临床
诊断等各个领域的广泛应用，人们逐渐意识到仅仅停留在PCR的定性
应用上的诸多局限性。生命科学研究，已超出了最初“有/无”的简
单的定性范围，而需要更精准的“多/少”的定量概念。以HIV、HBV、
HCV等病毒研究为例，定量PCR检测病毒基因，可协助判断潜伏的感
染者及无症状携带者的情况，并可从测定结果来判断药物的治疗效
果、推测复发的可能性；至于mRNA的RT-PCR定量更能进一步反映病
毒的转录水平、活动性、复制性等指标。
LARC(Liver and Activation-Regulated Chemokine)是1997
年日本学者Hieshima发现并鉴定的一个新的CC类趋化蛋白。LARC
在生理状态下在人肝脏中有一定水平的表达，是肝脏中的一看家趋化
蛋白；LARC可趋化活化T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞、B淋巴细胞等
免疫活性细胞表面，在乙肝病毒感染的病毒特异性细胞免疫，尤其是
CTL杀伤肝细胞、清除病毒的免疫应答过程中有重要的角色。LARC的
表达水平与其相关疾病如乙型肝炎的免疫状态、转归、预后等的判断
具有重要意义。由于LARC与大多数趋化蛋白一样，具有瞬时分泌、
含量微弱、局部表达、而不进入循环等的特点，无法用传统的定量方
法对其进行精确的定量，所以，需要建立一个良好的分子水平的定量
系统，对LARC转录及翻译进行较为准确的定量，用较为精准的量化
概念反映该分子的表达水平。
目前常用的对趋化因子进行定量的方法有酶联免疫吸附试验
(ELISA)、免疫组织化学实验和定量RT-PCR/PCR法等。其中ELISA方
法较为迅速简便，但需要体液如血清、分泌物等为检测对象，且精确
度和敏感性较差，而趋化蛋白恰恰又是一种分泌水平相对微弱的蛋白
质，这势必限制了该方法的应用。免疫组化实验能直观地对趋化蛋白
的表达进行定位、定量研究，但对抗体的要求较高、且仅局限于对一
些胞内分泌型趋化蛋白的检测，而大多数趋化蛋白往往具有广泛弥散
性分泌的特点。定量PCR技术是根据PCR的产物量来推断其原始模板
量的方法。常用的定量方法主要有外标法(external standard)、内
标法(internal standard)和实时荧光法(real time)三种。外标法具
有操作简便、快速等特点，但由于PCR反应是一指数变化过程，反应
过程中任一参数如模板起始量、引物浓度、DNA聚合酶活性、反应温
度、循环时间、循环数等的微小变化都会显著改变终产物的量，反应
前几个循环的不均一性、各反应管不同的升降温效率等将造成无法避
免的管间差异，使定量结果的可靠性大为降低。内标法是在定量系统
中设立内参照，将参照基因与待测基因在同一反应管内共同进行扩
增，这样可在很大程度上消除“管间差异”带来的误差。
发明内容
本发明的目的是建立能对LARC转录及翻译水平进行相对精确的
定量cQRT-PCR系统，用较为准确的量化概念反映LARC的表达水平。
本发明通过构建含有与LARC特异性引物互补序列的特定内参照
质粒，以同一对引物在同一反应管中竞争扩增LARC，从而对LARC的
表达水平进行定量，建立了定量检测趋化因子LARC表达水平的
cQRT-PCR技术。并通过对已知量的LARC水平、HBV不同感染状态下
体外培养细胞及病人活检肝组织标本中LARC表达量的研究和测定，
验证了本方法具备了较高的可靠性和准确性。
本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：
1、构建及鉴定PAL-2质粒 自HepG22.2.15细胞中扩增得到目的
基因LARC，以T4DNA连接酶克隆到载体pBS-VH62-ANK质粒中。以P2/P3
为引物(P2：5’GTC
GAA TTC CAT TCT AGA AAA GCC ACA G 3’，P3：
5’CG
G AAT TCC CAT GTG CTG TAC CAA G 3’)，自新质粒中扩增出
的PCR产物，经与DNA marker、LARC阳性对照电泳比较，是为324bp
的目的基因LARC；进一步以EcoR I对质粒进行酶切，产物经电泳分
析，证实目的基因已插入到空载体pBS-VH62-ANK中；DNA测序最终
确证了上述结果，将该质粒命名为PAL-2(P-pBS，A-ANK，L-LARC，
2-HepG22.2.15)(图1，2)。
2、构建及鉴定PAL-2-IS.4质粒取人工合成的一对互补的42bp
外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，以连接酶克隆
到经Af1 III酶切的质粒载体PAL-2中，得到用作内参照的质粒
PAL-2-IS。以P2/P3为引物对质粒进行PCR初步鉴定，产物与
PAL-2(324bp)，电泳条带比对照PAL-2的稍后，提示前者插入了42bp
的IS(CATGTAAACATTCTCTTCGACATTCTCTTCAACATTCTCTTC)；该质粒可
被Af1 III酶切成线型。最终经测序确认新质粒已插入了IS片段，
质粒5’及3’端双侧序列与野生型LARC相同，但中间序列多了42bp，
是用于内对照的质粒，命名为PAL-2-IS.4(P-pBS，A-ANK，L-LARC，
2-HepG22.2.15，IS-Insert Sequence，4-4号阳性克隆)。
3、建立检测LARC表达的竞争性RT-PCR技术以2.50pg/10μl
的PAL-2与不同已知浓度的PAL-2-IS.4共扩增，产物经琼脂糖凝胶
电泳，紫外成像凝胶处理系统扫描分析，结果各个电泳条带的光密度
值与DNA的起始浓度成正比。根据各扩增条带的光密度值，用光密度
比值法，即以内参照的不同浓度为横坐标，待测模板与内参照模板光
密度扫描值的比值为纵坐标作图，得到一直线回归方程y＝ax+b(图
5)；当y＝1，即PAL-2-IS.4与PAL-2扩增产物的光密度值一致时的
x值，便是待测样品中LARC cDNA的起始浓度，计算出的PAL-2浓度
为2.38pg/10μl，与实际浓度无显著性统计学差异(95％可信限)。
4、验证本发明方法的准确性
1)检测HBV不同感染状态下LARC表达水平，代表HBV不
同感染状态的肝细胞分别为：“正常”肝细胞L02、HBV慢性持续性感
染肝细胞HepG22.2.15，并以HBV双体DNA体外转染HepG2细胞，建
立HBV短暂(急性)感染肝细胞模型。自1×106的不同细胞株中抽提到
的总RNA，cQRT-PCR方法对各株细胞中LARC表达的定量结果显示(表
1)：HBV不同感染状态下LARC的表达水平是不同的，分别为：“正常”：
2.65±0.02pg/10μl/106细胞、HBV“急性”感染：3.43±0.02pg/10
μl/106细胞、HBV“慢性”持续感染；1.22±0.04pg/10μl/106细
胞；且这三种状态下LARC的表达水平存在显著性差异，即HBV“急
性”感染肝细胞＞“正常”肝细胞＞HBV“慢性”感染肝细胞(p＜0.05)。
2)检测正常及慢性肝炎活检肝标本中LARC表达量，对数例
正常人的肝脏组织标本及经病理诊断证实为慢性乙型肝炎的肝脏活
检标本分别抽提总RNA，在同一RNA起始水平，以相同的竞争性RT-PCR
方法对LARC mRNA的表达进行定量，结果表明，慢性乙型肝炎患者肝
脏中LARC的表达水平呈现出个体差异，其含量界于2.372-4.6pg/10
μl之间，但均普遍显著低于其在正常肝脏组织中的平均表达量8.74
pg/10μl(p＜0.01)；提示人体肝脏中存在着基础分泌量的LARC，HBV
慢性感染状态下，病毒可通过某种途径下调LARC的表达。
本发明具有如下特点
1、本发明是一种定量检测LARC表达水平的竞争性逆转录PCR
(cQRT-PCR)
2、本发明RT-PCR系统中含特定的内参照质粒(PAL-2-IS.4)
3、该质粒DNA内含一比正常(野生型)LARC大42bp、但其5’
和3’末端序列与LARC基因的5’和3’末端序列同源的特定基因
序列
4、本发明cQRT-PCR技术可检测包括细胞和组织标本中LARC
的表达量
5、本方法可用于人、小鼠、大鼠等哺乳类动物LARC基因表达
水平的检测
6、本方法可用于某些疾病如慢性乙肝等疾病的诊断、预后判
断及各种治疗和预防效果的评价
附图说明
图1是质粒PAL-2构建示意图：HepG22.2.15细胞中获得的LARC
纯化产物与pBS-VH62-ANK质粒DNA分别经EcoR I酶切，1％低熔点
琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切产物。将得到的两个片段以T4DNA连接
酶连接，取5μl连接产物转化感受态菌DH5α。所得质粒命名为PAL-2。
图2是质粒PAL-2的鉴定Aa.：以P2为引物的测序结果；Ab：
以P3为引物的测序结果；D：PAL-2的DNA序列。
图3是内参照质粒PAL-2-IS的构建示意图人工合成一对互补
的42bp外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，利用克
隆于PAL-2的LARC基因内源性Af1 III位点经Af1 III酶切后，加
入IS退火产物，以T4DNA连接酶连接，转化感受态菌DH5α。获得内
参照质粒PAL-2-IS(P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15，IS
-Insert Sequence)。
图4是质粒PAL-2-IS.4的测序鉴定粗体为插入片断的DNA序
列，下划线为Af1 III酶切位点
图5是竞争性定量RT-PCR检测LARC表达水平在同一PCR反应
体系中，同时扩增固定浓度的PAL-2和不同浓度梯度的内参照
PAL-2-IS.4，两者的共扩增产物电泳后，对各条带的光密度值进行扫
描分析，得到PAL-2的推算浓度。A.PAL-2与PAL-2-IS.4的共扩增，
B.光密度比值法。
表1 HBV不同感染状态肝细胞株中LARC的表达量
编号 细胞 回归方程 r p LARC的浓度(pg/10μl)
a L02 y＝0.29x+0.23 0.96 ＜0.01 2.65
b HepG22.2.15 y＝0.55x+0.31 0.94 ＜0.01 1.22
c HepG2-2 y＝0.51x-0.16 0.90 ＜0.01 2.29
d HepG2-4 y＝0.37x+0.13 0.92 ＜0.01 2.34
e HepG2-6 y＝0.49x-0.09 0.90 ＜0.01 2.23
f HepG2-7 y＝0.62x-0.47 0.92 ＜0.01 2.35
g HepG2-pEHH-2 y＝0.36x-0.16 0.93 ＜0.01 3.21
h HepG2-pEHH-4 y＝0.35x-0.16 0.90 ＜0.01 3.30
i HepG2-pEHH-6 y＝0.32x-0.09 0.91 ＜0.01 3.40
j HepG2-pEHH-8 y＝0.32x-0.10 0.91 ＜0.01 3.47
k HepG2-pEHH-10 y＝0.32x-0.08 0.92 ＜0.01 3.37
l HepG2-pDEH-12 y＝0.35x-0.13 0.89 ＜0.01 3.26
表2 慢性肝炎及正常肝脏标本中LARC的表达量
编号 回归方程 r p LARC的浓度 LARC的起始浓度
(pg/10ul) (pg/10ul)
a y＝1.78x-2.26 0.89 ＜0.01 1.83 4.575
b y＝1.72x-0.92 0.91 ＜0.01 1.11 2.773
c y＝1.73x-0.94 0.90 ＜0.01 1.13 2.826
d y＝1.74x-1.99 0.91 ＜0.01 1.72 4.3
e y＝1.37x-0.29 0.93 ＜0.01 0.95 2.372
f y＝1.71x-1.93 0.89 ＜0.01 1.71 4.275
g y＝1.70x-1.88 0.92 ＜0.01 1.10 2.74
h y＝1.52x-0.18 0.90 ＜0.01 1.66 4.15
i y＝1.76x-2.03 0.91 ＜0.01 1.75 4.374
j y＝1.61x-0.70 0.92 ＜0.01 1.05 2.629
k y＝1.47x-1.70 0.91 ＜0.01 1.84 4.6
l y＝0.28x+0.02 0.95 ＜0.01 3.54 8.83
m y＝0.30x-0.06 0.94 ＜0.01 3.44 8.6
n y＝0.30x-0.05 0.97 ＜0.01 3.51 8.775