第三代PCI治疗性球囊支架系统、制备方法及应用.pdf

本发明涉及“第三代PCI治疗性球囊支架系统、制备方法及应用”，属于生物医学工程领域。治疗性球囊支架治疗系统，包括导管和球囊，其特征在于：所述支架为裸支架，所述球囊表面附着有治疗性的药物和/或细胞涂层。当球囊扩张支架通过导管置入冠状动脉内后，球囊通过瞬间压力张开，使球囊上的药物或细胞层紧帖血管内壁，可以修复经球囊扩张而损伤的血管内膜。本发明很好的结合了第一代、第二代支架系统的优点，使球囊一次性携带药物进入血管内，而支架为裸支架，只引起支撑血管的作用，很好的解决了第二代支架系统持续性药物造成损伤血管的长期不愈，有效的防止了血栓的形成，抑制再狭窄的发生。

1、  治疗性球囊支架系统，包括导管和球囊，其特征在于：所述支架为裸支架，所述球囊表面附着有治疗性的药物和/或细胞涂层。

2、  根据权利要求1所述的治疗性球囊支架系统，所述药物和/或细胞涂层的厚度为0.01微米-200微米，药物含量为0.01mg-100mg。

3、  根据权利要求1所述的治疗性球囊支架系统，所述药物为紫杉醇及其衍生物，雷帕霉素，CD34抗体，CD133抗体，KDR抗体或/和VIII因子抗体，所述细胞为EPC细胞或/和EC细胞。

4、  根据权利要求3所述的治疗性球囊支架系统，所述EPC来源于自体或异体的血液，脐血，脐动脉血，脐静脉血，静脉，骨髓或脂肪组织。

5、  根据权利要求1所述的治疗性球囊支架系统，所述药物和/或细胞涂层通过粘合剂涂层粘贴在球囊表面，所述粘合剂涂层厚度为0.01微米-200微米，所述粘合剂包括可溶性明胶，多聚氨基甲酸乙酯胶，热敏性多聚水凝胶和/或聚异丙基丙烯酰胺凝胶(IPAAM)。

6、  根据权利要求1所述的治疗性球囊支架系统，所述支架的材料为不降解或可降解材料。

7、  根据权利要求6所述的治疗性球囊支架系统，所述支架的材料为钴铬合金，316L不锈钢，钛镍合金，镁合金，多聚乳酸或羟磷灰石结晶。

8、  根据权利要求1所述的治疗性球囊支架系统，还包括导管，导丝和穿刺针，所述导管，导丝和穿刺针上附着有治疗性的药物和/或细胞涂层。

9、  根据权利要求1-7任一所述的治疗性球囊支架系统制备方法，包括如下步骤：(1)球囊表面涂布粘合剂涂层，(2)于去离子水中浸泡后风干，(3)将溶解于有机溶剂中的紫杉醇涂布于球囊表面，(4)将支架压握于涂布好的球囊表面。

10、  根据权利要求1-8任一所述的治疗性球囊支架系统在治疗缺血性心脏病中的应用。

第三代PCI治疗性球囊支架系统、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，特别是涉及一种治疗性球囊及支架系统。
背景技术
治疗缺血性心脏病目前最为常见的方法是PCI(经皮冠状动脉介入治疗术)。该介入治疗方法经过十几年的发展，从球囊金属裸支架系统到第二代药物洗脱性球囊支架系统，是一个比较大的技术进步，第一代支架的问题主要是支架植入血管后再狭窄的发生率比较高。第二代支架成功地降低了再狭窄的发生率，然而由于药物持续性作用于受损血管表面抑制了血管内膜的修复导致经球囊扩张损伤的血管迁延不愈，为此发展新一代抑制血栓形成又降低再狭窄的第三代血管支架成为临床治疗缺血性心脏病的必然选择。第二代支架系统的血栓问题虽然发生率不是很高，但是一旦发生血栓脱落会导致患者猝死。为此解决血栓问题成为临床研究的一大热点。
本项发明专利即第三代PCI治疗性球囊支架系统，正是为了解决血栓及再狭窄的严重副作用，而研制的新一代治疗性球囊支架系统。
发明内容
本发明针对上述产品的缺陷，提供一种治疗性球囊支架系统，在球囊表面附着有药物或血管内皮细胞或血管内皮祖细胞，有效抑制血栓形成及抑制再狭窄的发生。
本发明还提供该系统的制备方法。
治疗性球囊支架治疗系统，包括导管和球囊，其特征在于：所述支架为裸支架，所述球囊表面附着有治疗性的药物和/或细胞涂层。
所述药物和/或细胞涂层的厚度为0.01微米-200微米，药物含量为0.01mg-100mg。
所述药物为紫杉醇及其衍生物，雷帕霉素，CD34抗体，CD133抗体，KDR抗体或/和VIII因子抗体，所述细胞为EPC细胞或/和EC细胞。
所述EPC来源于自体或异体的血液，脐血，脐动脉血，脐静脉血，静脉，骨髓或脂肪组织。
所述药物涂层通过粘合剂涂层粘贴在球囊表面，所述粘合剂涂层厚度为0.01微米-200微米，所述粘合剂包括可溶性明胶，多聚氨基甲酸乙酯胶，热敏性多聚水凝胶和/或聚异丙基丙烯酰胺凝胶(IPAAM)。
所述支架治疗系统还所括导管，导丝和穿刺针，所述导管，导丝和穿刺针上附着有治疗性的药物和/或细胞涂层。
所述支架的材料为非降解材料或可降解材料。
所述支架的材料为钴铬合金，316L不锈钢，钛镍合金，镁合金，多聚乳酸或羟磷灰石结晶。
所述治疗性球囊支架系统的制备方法，包括如下步骤：(1)球囊表面涂布粘合剂涂层，(2)于去离子水中浸泡后风干，(3)将溶解于有机溶剂中的紫杉醇涂布于球囊表面，(4)将支架压握于涂布好的球囊表面。
上述治疗性球囊支架在治疗缺血性心脏病中的应用。
血管内皮细胞受损是冠状动脉再狭窄发生的主要原因。本发明在球囊表面涂层上种植血管内皮祖细胞(EPC)层或是血管内皮细胞(EC)层或治疗性药物层(如图5)，当球囊扩张支架通过导管置入冠状动脉内后，球囊通过瞬间压力张开(如图4)，使球囊上的药物或细胞层紧贴血管内壁，可以修复经球囊扩张而损伤的血管内膜。本发明很好的结合了第一代、第二代支架系统的优点，使球囊一次性携带药物进入血管内，而支架为裸支架，只起支撑血管的作用，很好的解决了第二代支架系统持续性药物造成损伤血管的长期不愈，有效的防止了血栓的形成，抑制再狭窄的发生。
我们成功地从外周血中分离和纯化了EPC，并在体外进行EPC的培养传代，且将其种植于球囊表面，。EPC可以来源于自体或异体的血液，脐血，脐动脉血，脐静脉血，静脉，骨髓或脂肪组织。血管内膜内含有丰富的EPC、EC细胞，是修复损伤的血管内皮细胞的最佳选择。EPC膜表面存在特异性的抗原受体如CD34+，FIKI(血管内皮生长因子受体2阳性)，CD133抗体或VIII因子抗体，这些特异性抗原受体能结合血液中的EPC、EC，将其吸附于表面。当球囊表面种植有这些抗体时，在体内血液循环过程中，球囊表面能捕获循环中的EPC或EC细胞。
为增加药物层的牢固性，球囊表面处理非常关键。可应用明胶，多聚氨基甲酸乙酯，多聚热敏性凝胶高分子新材料等对球囊表面进行处理，保证药物紧密结合于球囊表面，不至于脱落。
球囊表面由于被覆血管内皮祖细胞(EPC)或血管内皮细胞(EC)，在植入球囊扩张的同时，随着球囊的扩张，EPC也到达了受损的血管内膜处，EPC分裂增生形成新的血管内皮细胞，故可快速修复损伤的血管内皮细胞，有效地消除了由于血管内皮细胞损伤引发的血管平滑肌细胞的增生与迁移，避免了血栓形成及血管再狭窄的发生，可解决药物洗脱性支架(DES)的不足。上述药物和/或细胞同样可以被覆于导管(如图3)、导丝、及各类穿刺针的表面。
本发明从人外周血液中分离培养出血管内皮祖细胞(EPC)，应用血管组织工程技术将体外培养的EPC种植于球囊表面(种植前，球囊用高分子材料进行涂层处理，以增加其黏附性)，使支架球囊形成一完整的单层内皮细胞层；然后将这种新型的治疗性球囊置入血管内，进行扩张，EPC在受损的血管表面，修复受损的血管内膜，为此，从根本上解决了抑制血栓形成及血管再狭窄发生。该技术属于最新型第三代球囊支架系统，具有极其广阔的市场前景。
附图说明
图1：球囊表面高倍示EPC，
图2：球囊表面的EPC细胞，
图3：球囊导管，
图4：扩张的球囊与支架，
图5：横断面药物球囊支架示意图，
其中：1-球囊，2-药物/细胞涂层，3-支架。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
下列实施例中所用抗体是市场所购，所用试剂均采用常规方法配制，所用试剂原料也是市场购得。
实施例1制备紫杉醇涂层球囊
1.1溶解紫杉醇：
配制75％的酒精，取20ML，称取10Mg紫杉醇加入75％酒精中，搅拌摇匀。
1.2球囊表面涂布明胶：
取10％的明胶20ML，将球囊浸泡其中，静置30M。
1.3紫杉醇涂层球囊：
将涂布明胶的球囊放入超声喷涂仪中，使其旋转，取10ML配制的紫杉醇，摇匀后，采用喷涂仪器，均匀喷涂于球囊表面。调节喷涂时间，以控制喷涂的厚度和药量，可制成不同厚度和载药量的球囊。
实施例2制备细胞涂层球囊(EPC涂层)
2.1外周血液中分离MNC(单核细胞)：
从外周血管中抽取5-60ML血液，加复方枸櫞酸钠注射液(ACD-A)按1∶10加入抗凝，1∶1加入Histoque-1077细胞分离液，以400g/Min在室温离心10-30Min，用PBS清洗三次。
2.2CD34+细胞的分离纯化：
采用磁性活化细胞分选系统纯化CD34+细胞。1×105-1×1010个MNC(单核细胞)悬浮于30ul，4℃去磁化PBE缓冲液中(含2mmol/LEDTA，0。5％牛血清白蛋白)，加50ul偶联于磁珠的鼠抗人CD34抗体，4℃孵育30Min。用上述缓冲液洗二次，100×g离心5Min，除去未结合抗体，用500ul PBE缓冲液悬浮。分离磁柱置于磁场中分选出磁珠阳性细胞(MNCCD34+)。
2.3鉴定检测：
2.3.1免疫组织化学检查：
分离的单核细胞培养7天后，贴壁细胞片用4％多聚甲醛固定。10％马血清中和非特异性单克隆抗体结合位点，鼠抗人vWF、KDR、CD34、CD133单克隆抗体分别与受体结合。用IgG1-κ设阴性对照。PBS冲洗二遍，生物素标记的马抗鼠IgG1孵育，再用抗生素免疫过氧化酶处理即可观察。
2.3.2流式细胞分析：
培养7天后的细胞用0.25％胰蛋白酶37℃消化10-15Min。加入含20％胎牛血清的M199培养液，调整细胞浓度为5×106-1×1010细胞/L，取40uL分别加入FITC标记的CD34抗体和PE标记的AC133抗体孵育20Min，用流式细胞仪分析。
2.3.3AC-LDL实验——细胞凋亡检测：
培养7天后的贴壁细胞加入DiI-Ac-LDL(乙酰化低密度脂蛋白)15mg/L，37℃孵育24h。在荧光显微镜下计数阳性细胞。
PI(碘化丙锭)和annexinV双染色标记细胞，后行流式细胞仪分析，PI-/annexinV+为凋亡细胞。结果显示仅有少数凋亡细胞。
2.4球囊表面涂布粘合剂
在支架表面涂一层可溶性明胶，其浓度为20mg/ml，厚度为：1-20um。自然风干后涂一层多聚氨基甲酸乙酯胶，浓度为30mg/ml，厚度为：1-20um。然后再涂一层热敏性多聚水凝胶，浓度为40mg/ml，厚度为：1-30um，聚异丙基丙烯酰胺凝胶(IPAAM)，浓度为50mg/ml，厚度为：1-50um。
2.5细胞传代培养种植于球囊表面：
将已涂布好的支架完全置于去离子水中浸泡5-60Min，在无菌条件下取出风干。将EPC和/或EC接种于含有20％胎牛血清的M199培养液(400g/L)支架上，再加入青霉素(1×105U/L)，链霉素(100mg/L)，VEGF(血管内皮生长因子)(10ug/L)，抗坏血酸(10-4mol/L)，L-谷氨酸(1.6mmol/L)。将含有球囊的培养基置于37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中。4天后更换培养基，每5天换液一次。20天形成一层膜贴于支架表面，EPC接种密度1×1002个/cm2。经扫描电镜(X1000)，可见EC呈“铺路石”样形态于支架上。(见图1、图2)
实施例3制备抗体涂层球囊(CD34+抗体)
3.1明胶，聚异丙基丙烯酰胺凝胶制备
将20g明胶，50g N-异丙基丙烯酰胺，40ul四甲基二乙胺，50g N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)及50ml聚二乙醇致孔剂溶解于1L去离子水中，等完全溶解后，加入30ml过硫酸氨，同时通入N2，再加入10ml戊二醛并快速搅拌均匀。
3.2涂胶于球囊表面
将球囊置入正在快速搅拌的胶液中，室温下静置2小时，取出球囊。
3.3抗体吸附于球囊表面(如图6)
将涂胶球囊置于含12mg/mlCD34+抗体中，在10℃下静置50分钟，取出支架，在15℃下放置2小时，紫外线照射消毒即可获得抗体涂层球囊。
实施例4制备抗体涂层球囊(CD133抗体)
4.1明胶，聚异丙基丙烯酰胺凝胶制备
将22g明胶，45g N-异丙基丙烯酰胺，40ul四甲基二乙胺，50g N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)及50ml聚二乙醇致孔剂溶解于1L去离子水中，等完全溶解后，加入30ml过硫酸氨，同时通入N2，再加入10ml戊二醛并快速搅拌均匀。
4.2涂胶于球囊表面
将球囊置入正在快速搅拌的胶液中，室温下静置2小时，取出球囊。
4.3抗体吸附于球囊表面
将涂胶支架置于含15mg/mlCD133抗体中，在15℃下静置40分钟，取出球囊，在10℃下放置3小时，紫外线照射消毒即可获得抗体涂层球囊。
实施例5紫杉醇和抗体或EPC混合涂层球囊的制备
5.1根据实施例1将紫杉醇涂布于球囊表面：方法见实施例1.
5.2根据实施例3将抗体涂布于球囊表面：方法见实施例3.
5.3根据实施例2将EPC涂布于球囊表面：方法见实施例2.
实施例6制备超薄型钴铬合金支架
6.1设计支架：根据支架图形设计软件，选择支架图形。
6.2材料选择：选择钴铬合金管材，管壁厚度50um-75um.
6.3切割支架：根据支架软件图形选择，切割支架.
6.4抛光，清洗等后处理.
6.5将支架压握于上述涂附有涂层的球囊表面.