顺铂纳米胶束前药及其制备方法.pdf

一种纳米药物技术领域的顺铂纳米胶束前药及其制备方法，其组分及含量为：顺铂5～30％以及叶酸修饰的高分子载体95～70％，该顺铂纳米胶束前药的化学结构如右式，其中：a和b分别为大于等于10且小于等于60的整数，x为大于等于23且小于等于92的整数，FA为叶酸，m＝0、1或2。本发明粒径分布窄、在血液中能长效循环、对肺癌组织具有双重靶向性的、释药速率可调的顺铂纳米胶束载药系统，以期改善顺铂的水溶性，提高其载药量，同时最大限度减低其毒副作用。

1、  一种顺铂纳米胶束前药，其特征是，其组分及质量百分比为：顺铂5～30％以及叶酸修饰的高分子载体95～70％；化学结构如下：

其中：a和b分别为大于等于10且小于等于60的整数，x为大于等于23且小于等于92的整数，FA为叶酸，m＝0、1或2。

2、  根据权利要求1所述的顺铂纳米胶束前药，其特征是，所述的络合物环为：6，7，8圆环。

3、  根据权利要求1所述的顺铂纳米胶束前药，其特征是，所述的顺铂纳米胶束前药的胶束粒径为70～100nm，在所述胶束外部附有若干分子量为1000～10000的聚乙二醇，在聚乙二醇的末端附有叶酸分子。

4、  根据权利要求1所述的顺铂纳米胶束前药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步、合成单端叶酸修饰的聚乙二醇氨基衍生物FA-PEG-NH₂；
第二步、合成聚琥珀酰亚胺PSI；
第三步、FA-PEG-NH₂部分开环PSI制成FA-PEG-g-PSI；
第四步、合成氨基丙二酸；
第五步、氨基酸全部开环FA-PEG-g-PSI制成FA-PEG-g-PAspM；
第六步、组装顺铂纳米胶束前药。

5、  根据权利要求4所述的顺铂纳米胶束前药的制备方法，其特征是，所述第一步具体步骤为：首先取聚乙二醇二氨、叶酸和N，N-二环己基碳二亚胺溶解于二甲基亚砜中，然后加入吡啶后在室温下以氮气保护环境搅拌反应48小时，再用蒸馏水稀释过滤后将滤液依次进行分子量为1000的透析冷冻处理和纯化处理，制得FA-PEG-NH₂。

6、  根据权利要求4所述的顺铂纳米胶束前药的制备方法，其特征是，所述第二步具体步骤为：首先将L-天冬氨酸溶于环丁砜中并加入磷酸，然后在氮气保护的环境下使用油水分离器除水，再依次进行加热回流处理和冷却抽滤处理，获得聚琥珀酰亚胺固体。

7、  根据权利要求4所述的顺铂纳米胶束前药的制备方法，其特征是，所述第三步具体步骤为：将第二步中制备获得的聚琥珀酰亚胺固体溶解于二甲基甲酰胺中并置于氮气保护环境下；将第一步中制备获得的FA-PEG-NH₂另外溶于二甲基甲酰胺中制成叶酸纳米载体-二甲基甲酰胺溶液，再将叶酸纳米载体-二甲基甲酰胺溶液滴入聚琥珀酰亚胺-二甲基甲酰胺溶液中，然后依次进行加热回流处理、冷却抽滤处理，制得叶酸纳米载体。

8、  根据权利要求4所述的顺铂纳米胶束前药的制备方法，其特征是，所述第四步具体步骤为：将乙酰胺基丙二酸二乙酯溶于无水乙醇中形成乙酰胺基丙二酸二乙酯-乙醇溶液，然后通入氯化氢气体后在室温下反应24小时，制成氨基丙二酸二乙酯盐酸盐，再将氨基丙二酸二乙酯盐酸盐溶于氢氧化钾溶液中，依次进行加热回流处理和冰水冷却处理，最后用乙酸调节pH值至6，并进行冷却抽滤处理后用氨-乙醇溶液进行二次结晶处理，得氨基丙二酸。

9、  根据权利要求4所述的顺铂纳米胶束前药的制备方法，其特征是，所述第五步具体步骤为：取第三步中制得的FA-PEG-g-PSI水溶液加入第四步中制得的氨基丙二酸中，滴入三乙胺后在避光环境下室温搅拌24小时，然后用盐酸调节pH值至5并依次进行冷却抽滤处理和分子量为3500的透析冷冻处理，最后进行冷冻干燥处理，获得叶酸纳米胶体束。

10、  根据权利要求4所述的顺铂纳米胶束前药的制备方法，其特征是，所述第六步具体步骤为：将顺式二氯二氨合铂和FA-PEG-g-PAspM载体溶于水中，在37℃避光温和环境下搅拌48小时，然后进行透析冷冻处理，制得顺铂纳米胶束前药FA-PEG-g-PAspM-CDDP。

顺铂纳米胶束前药及其制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种药物技术领域的药品及其制备方法，具体是一种顺铂纳米胶束前药及其制备方法。
背景技术
顺铂(顺式二氯二氨合铂，CDDP)为一种周期非特异性药物，能与DNA结合形成交联键，从而破坏DNA的复制功能而抑制细胞分裂。临床实践证明顺铂具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药物有协同作用、且无交叉耐药等特点，为当前联合化疗中最常用的药物之一，广泛用于卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、乳腺癌、食道癌、非小细胞肺癌和胃癌等。然而，顺铂低的水溶性，重度消化道反应、骨髓抑制、听神经毒性，尤其易对肾脏造成不可逆损伤等限制了其临床疗效的进一步提高。
经过对现有技术的检索发现，将顺铂通过化学键载于生物相容性良好的α，β-聚(L-天冬酰胺)氨基酸衍生物载体上，在改善顺铂水溶性的同时其细胞毒副作用也大大降低(吕正荣，余家会，卓仁禧，王旭利，杨复华，高等学校化学学报，19(1998)，817-820；王成运，宫彦宝，刘顺英，罗淑芳，黄进，余家会，高等学校化学学报，8(2008)1665-1670)；吴自荣等以γ-聚谷氨酸/顺铂大分子药物治疗裸鼠乳腺癌，发现大分子顺铂药物能有效降低顺铂的毒性，并提高其抗癌活性(Haifeng Ye，Li Jin，Rongzhang Hu，Zhengfang Yi，Jing Li，YelinWu，Xuguang Xi，Zirong Wu，Biomaterials，27(2006)，5958-5965)，但这两种载体的载药量都很低，不超过10％。Kataoka等将顺铂与聚乙二醇-聚谷氨酸(PEG-b-Glu)两嵌段共聚物组装成纳米胶束，载药量得到了大大提高，可达30％左右，顺铂纳米胶束药物对裸鼠实体瘤模型的治疗效果良好，显示出较好的临床应用前景(Nobuhiro Nishiyama，Souichiro Okazaki，Horacio Cabral，MasakiMiyamoto，Yukio Kato，Yuichi Sugiyama，Kazuto Nishio，Yasuhiro Matsumura，and Kazunori Kataoka，Cancer Research，63(2003)8977-8983；NobuhiroNishiyama，Masayuki Yokoyama，Takao Aoyagi，Teruo Okano，Yasuhisa Sakurai，and Kazunori Kataoka，Langmuir，15(1999)377-383)，但胶束粒径在30nm以下，影响被动靶向效果。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种顺铂纳米胶束前药及其制备方法，利用顺铂诱导接枝共聚物高分子发生纳米尺度分子自组装的原理，组装一类粒径70-100nm且可控、粒径分布窄、在血液中能长效循环、对肺癌组织具有双重靶向性的、释药速率可调的顺铂纳米胶束载药系统，以期改善顺铂的水溶性，提高其载药量，同时最大限度减低其毒副作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及的顺铂纳米胶束前药，其组分及质量百分比为：顺铂5～30％以及叶酸修饰的高分子载体95～70％，该顺铂纳米胶束前药的化学结构如下：

其中：a和b分别为大于等于10且小于等于60的整数，x为大于等于23且小于等于92的整数，FA为叶酸，m＝0、1或2。
所述的络合物环为：6，7，8圆环
所述的顺铂纳米胶束前药的胶束粒径为70～100nm，在所述胶束外部附有若干分子量为1000～10000的聚乙二醇，在聚乙二醇的末端附有叶酸分子。
本发明涉及的顺铂纳米胶束前药的制备方法，包括以下步骤：
第一步、合成单端叶酸修饰的聚乙二醇氨基衍生物(FA-PEG-NH₂)：首先取聚乙二醇二氨(NH₂-PEG-NH₂)、叶酸和N，N-二环己基碳二亚胺溶解于二甲基亚砜中，然后加入吡啶后在室温下以氮气保护环境搅拌反应48小时，再用蒸馏水稀释过滤后将滤液依次进行分子量为1000的透析冷冻处理和纯化处理，制得FA-PEG-NH₂。
所述的透析冷冻处理是指：用透析袋将滤液置于在去离子水中透析72h后冷冻干燥；
所述的纯化处理是指：用DEAE-sepharose阴离子交换柱对冷冻后的滤液进行纯化；
第二步、合成聚琥珀酰亚胺(PSI)：首先将L-天冬氨酸溶于环丁砜中并加入磷酸，然后在氮气保护的环境下使用油水分离器除水，再依次进行加热回流处理和冷却抽滤处理，获得聚琥珀酰亚胺固体。
所述的加热回流处理是指：加热至60度环境下回流反应24小时；
所述的冷却抽滤处理是指：室温环境下自然冷却后采用水泵减压装置进行抽滤，将滤液再以甲醇或无水乙醚进行沉淀，最后将沉淀物在真空环境下进行干燥。
第三步、FA-PEG-NH₂部分开环PSI(FA-PEG-g-PSI)：将第二步中制备获得的聚琥珀酰亚胺固体溶解于二甲基甲酰胺中并置于氮气保护环境下；将第一步中制备获得的FA-PEG-NH₂另外溶于二甲基甲酰胺中制成叶酸纳米载体-二甲基甲酰胺溶液，再将叶酸纳米载体-二甲基甲酰胺溶液滴入聚琥珀酰亚胺-二甲基甲酰胺溶液中，然后依次进行加热回流处理、冷却抽滤处理，制得叶酸纳米载体。
所述的聚琥珀酰亚胺-二甲基甲酰胺溶液中聚琥珀酰亚胺的浓度为50g/L；
所述的叶酸纳米载体-二甲基甲酰胺溶液中叶酸活性物质的浓度为62.5g/L；
第四步、合成氨基丙二酸：将乙酰胺基丙二酸二乙酯溶于无水乙醇中形成乙酰胺基丙二酸二乙酯-乙醇溶液，然后通入氯化氢气体后在室温下反应24小时，制成氨基丙二酸二乙酯盐酸盐，再将氨基丙二酸二乙酯盐酸盐溶于氢氧化钾溶液中，依次进行加热回流处理和冰水冷却处理，最后用乙酸调节pH值至6，并进行冷却抽滤处理后用氨-乙醇溶液进行二次结晶处理，得氨基丙二酸。
所述的乙酰胺基丙二酸二乙酯-乙醇溶液中乙酰胺基丙二酸二乙酯的浓度为1mol/L；
所述的氯化氢气体的用量为34g；
所述的氢氧化钾溶液的浓度为10mol/L，其用量为200mL；
所述的乙酸的质量百分比浓度为30％；
所述的二次结晶处理是指：用氨-乙醇混合溶液重结晶；
第五步、氨基酸全部开环FA-PEG-g-PSI(FA-PEG-g-PAspM)：取第三步中制得的FA-PEG-g-PSI水溶液加入第四步中制得的氨基丙二酸中，滴入三乙胺后在避光环境下室温搅拌24小时，然后用盐酸调节pH值至5并依次进行冷却抽滤处理和分子量为3500的透析冷冻处理，最后进行冷冻干燥处理，获得叶酸纳米胶体束。
第六步、组装顺铂纳米胶束前药：将顺式二氯二氨合铂和FA-PEG-g-PAspM载体溶于水中，在37℃避光温和环境下搅拌48小时，然后进行透析冷冻处理，制得顺铂纳米胶束前药(FA-PEG-g-PAspM-CDDP)。
采用邻苯二胺铂络合物/紫外吸收法测定本发明制备获得的顺铂纳米胶束得到其中铂(II)的含量为28％，动态光散射测得粒径为89nm。改变PEG的分子量或接枝率可得到不同粒径的纳米胶束。
本发明相比现有技术其优点在于：(1)通过改变PEG的分子量或接枝率可得到不同粒径的纳米胶束，从而优化被动靶向效果；(1)通过改变FA-PEG-NH₂对PSI的开环氯可控制纳米胶束表面叶酸的数目，从而优化主动靶向效果。
附图说明
图1为顺铂纳米胶束前药组装体的示意图。
图2为FA-PEG-NH₂的NMR谱图。
图3为FA-PEG-g-PSI的NMR谱图。
图4为FA-PEG-g-PAspM的NMR谱图。
图5为FA-PEG-g-PAspM-CDDP的粒径及粒径分布图；
其中：(a)PEG1000，70nm；(b)PEG2000，89nm；(c)PEG4000，105nm；(d)PEG6000，115nm。
图6为实施例1的释药性能对比示意图；
其中：(a)FA-PEG-g-PAspM-CDDP；(b)FA-PEG-g-PAspG-CDDP；(c)FA-PEG-g-PAspA-CDDP。
图7为实施例1毒性对比示意图；
其中：(a)CDDP；(b)PBS；(c)FA-PEG-g-PAspM-CDDP。
图8为实施例1癌细胞生长抑制效果示意图；
其中：1：PBS；2：FA-PEG-g-PAspM-CDDP，折合CDDP 5mg/kg；3：FA-PEG-g-PAspM-CDDP，折合CDDP 10mg/kg。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1制备含有顺铂28％的顺铂纳米胶束前药，该顺铂纳米胶束前药的化学结构如下：

其中：a＝5、b＝95、x＝45、m＝0、FA为叶酸、。
如图1所示，所述的顺铂纳米胶束前药的胶束粒径为89nm，在所述胶束外部附有若干分子量为1000～4000的聚乙二醇1，在聚乙二醇1的末端附有叶酸分子2。
本实施例通过以下步骤制备获得：
第一步、合成FA-PEG-NH₂：
1.1)取NH₂-PEG-NH₂(Mw2K，1.0g，0.5mmol)，叶酸(FA，0.22g，0.5mmol)，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC，0.12g，0.6mmol)溶解于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，
1.2)加入20μL吡啶，室温下，N₂保护搅拌反应48h。反应液用10mL蒸馏水稀释，过滤，除去副产物N，N-二环己基脲(DCU)，将滤液用截留分子量为1000透析袋在去离子水中透析72h后冷冻干燥。
1.3)最后用DEAE-sepharose阴离子交换柱进一步纯化，得FA-PEG-NH₂0.5g，其¹H NMR表征如图2所示。
第二步、合成PSI：
2.1)称取25g L-天冬氨酸，溶于60mL环丁砜中，加入0.6mL磷酸，氮气保护，使用油水分离器除水，加热回流24h。冷却至室温，抽滤，除不容物，用甲醇重沉淀，抽滤，真空干燥，得产品18g。
第三步、合成FA-PEG-g-PSI：
3.1)将第二步中制备获得的PSI(1g，10.2mmol)溶于20mL二甲基甲酰胺中，通氮气保护；
3.2)取第一步中制备获得的FA-PEG-NH₂(2.5g，1.02mmol)溶于40mL二甲基甲酰胺中并将其滴入PSI溶液中，滴后，将其加热至60度，反应24小时。
3.3)冷却至室温，抽滤，浓缩下层液，用无水乙醚重沉淀，抽滤，真空干燥，得产品FA-PEG-g-PSI 2g，其¹H NMR如图3所示。改变PSI与FA-PEG-NH₂的摩尔比可得不同叶酸含量的载体。
第四步、合成氨基丙二酸：
4.1)取乙酰胺基丙二酸二乙酯(0.2mol)溶于200ml无水乙醇，通入34g氯化氢气体，室温反应24h。蒸出多余HCl，
4.2)生成的氨基丙二酸二乙酯盐酸盐溶于200mlKOH(2mol)溶液中，加热回流15min，冰水浴冷却，用30％的乙酸调PH＝6，加入200ml乙醇，得沉淀，抽滤，的粗产品，用氨-乙醇混合溶液重结晶，得氨基丙二酸(Mal)0.13mol。
第五步、合成FA-PEG-g-PAspM：
5.1)取第三步中制得的FA-PEG-PSI(1.0g，10mmol)溶于30ml水中，加入氨基丙二酸(Mal)15mmol，滴入三乙胺至混合物全部溶解(约15ml)，避光，室温搅拌24h。用浓盐酸调PH＝5，抽滤，除不容物，浓缩下层液，装入透析袋中(M＝3500Da)透析三天，换蒸馏水三次。浓缩，除蒸馏水，冷冻干燥得FA-PEG-g-PAspM0.8g，其¹H NMR表征如图4所示。同法，分别用谷氨酸，天冬氨酸开环FA-PEG-PSI可得FA-PEG-g-PAspG，FA-PEG-g-PAspA。
第六步、组装顺铂纳米胶束前药
6.1)将15mg顺铂和20mgFA-PEG-g-PAspM溶于10mL水中，37℃避光温和搅拌48h，透析3天，冷冻干燥，即可得顺铂纳米胶束前药FA-PEG-g-PAspM-CDDP，用邻苯二胺铂络合物/紫外吸收法测定铂(II)的含量为28％，动态光散射测得粒径为89nm。改变PEG的分子量可得到不同粒径的纳米胶束(图5)。
本实施例的释药性能实验如下：
将10mL FA-PEG-g-PAspM-CDDP(90μg/mL)装入透析袋中，再置于480mL PBS(pH＝7.4，NaCl＝0.15g/L)的烧杯中，于37℃搅拌透析，每隔1小时取出1mL透析液并补充1mL水，用邻苯二胺铂络合物/紫外吸收法测定铂(II)的含量。其释药性能如图6所示，其中：(a)为FA-PEG-g-PAspM-CDDP，(b)为FA-PEG-g-PAspG-CDDP，(c)为FA-PEG-g-PAspA-CDDP。
结论：调节顺铂与载体间络合物环的大小可调控顺铂纳米胶束的释药速率，释药速率依次为(a)FA-PEG-g-PAspM-CDDP(6圆环)＜(b)FA-PEG-g-PAspG-CDDP(8圆环)＜(c)FA-PEG-g-PAspA-CDDP(7圆环)
本实施例的毒性实验如下：
健康活泼的ICR小鼠(5-7周，20-23g)随机分成3组(组间鼠重大致相同)，每组10只。将CDDP，FA-PEG-g-PAspM-CDDP(折算为CDDP按5mg/kg的量静脉注射，每两天注射一次，连续注射3次，对照组注射PBS，如图7所示为实施例1毒性对比示意图，其中：(a)为顺铂CDDP，(b)为PBS磷酸缓冲溶液，(c)为FA-PEG-g-PAspM-CDDP纳米胶束。
结论：给药后，CDDP组小鼠的体重迅速减轻，12天内体重减轻约40％；FA-PEG-g-PAspM-CDDP纳米胶束组小鼠的体重逐渐增加，18天以后，小鼠依然较健康，没有出现死亡现象，与PBS组结果相似，说明FA-PEG-g-PAspM-CDDP纳米胶束的毒性比游离CDDP低得多。
本实施例抑制肺癌生长实验如下：
选取健康活泼的BALB/c-nu裸鼠，鼠龄4-6周，体重18-20g，于其前背皮下接种肺癌癌细胞M109，接种细胞密度为1×10⁸个/mL，每只鼠接种量为100μL。当肿瘤长到约5mm左右时(设定为第0天)，荷瘤裸鼠被随机分成3组(组间鼠重大致相同)，每组8只。将CDDP，FA-PEG-g-PAspM-CDDP(折算为CDDP)分别按5mg/kg，10mg/Kg的量静脉注射，每两天注射一次，连续注射3次，对照组注射PBS，每两天用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，并按下式计算肿瘤体积V：
V＝3.14(a×b²)/6
其中a，b分别为肿瘤最大和最小尺寸，如图8所示为实施例1癌细胞生长抑制效果示意图，其中：1为PBS，2为制备所得顺铂纳米胶束前药，折合顺铂CDDP 5mg/kg，3为制备所得顺铂纳米胶束前药，折合顺铂CDDP 10mg/kg。
结论：FA-PEG-g-PAspM-CDDP对裸鼠肝肿瘤有明显的抑制作用，且呈一定的浓度依赖关系，当FA-PEG-g-PAspM-CDDP以10mg/kg(折合成CDDP的剂量)给药时，20天时间内肿瘤生长缓慢(曲线3)；当FA-PEG-g-PAspM-CDDP以5mg/kg给药时，10天时间内肿瘤生长缓慢，10天以后，肿瘤生长较快(曲线2)；磷酸缓冲溶液没有抑制肿瘤生长的效果(曲线1)。