编码人乳头瘤病毒11型L1蛋白的 合成的HPV6/11杂交L1 DNA 与其它申请的关联
本申请是1995年3月30日提交的现在未决的美国流水号No.08/413,572的延续，和1995年3月30日提交的现在未决的美国流水号No.08/413,571的延续。
【发明领域】
本发明涉及编码纯化的人乳头瘤病毒11型L1蛋白的合成DNA分子及其衍生物。
附图简述
图1图解用合成寡核苷酸构建HPV6/11杂交L1基因。
图2显示HPV6/11杂交体、发表的HPV6a和发表的HPV11 L1基因的核苷酸序列。
图3显示用于表达乳头瘤病毒L1外壳蛋白的双向酵母表达载体pGAL1-10。
图4是酵母中HPV11 L1mRNA的Northern分析。
图5显示通过Western分析(免疫印迹)酵母中HPV11 L1蛋白的表达。
图6显示与HPV6/11杂交DNA相比，表达自野生型(wt)HPV11的HPV11L1 VLPs的ELISA反应性。
图7为在酵母中表达的HPV11L1 VLPs的电子显微镜图片。
图8显示HPV6/11杂交基因的核苷酸序列。
【发明背景】
乳头瘤病毒(PV)感染发生于多种动物，包括人、羊、狗、猫、兔、猴、蛇和牛。乳头瘤病毒感染上皮细胞，通常在感染位点诱导良性上皮或纤维上皮瘤。PV为物种特异性感染物；人的乳头瘤病毒不能感染非人类动物。
依据它们感染的宿主乳头瘤病毒可分为不同的组。依据DNA序列同源性人乳头瘤病毒(HPV)进一步分成70多个型。PV型似乎为型-特异性免疫原，因为对一型乳头瘤病毒感染的中和免疫性没有赋予对另一型乳头瘤病毒的免疫性。
在人类，不同HPV型导致特征性的疾病。HPV1，2，3，4，7，10型和26-29型在正常和免疫受损(immunocompromised)个体中导致良性疣。HPV5，8，9，12，14，15，17，19-25，36型和46-50型在免疫折衷个体中导致扁平损伤。HPV6，11，34，39，41-44型和51-55型导致生殖或呼吸粘膜的非恶性湿疣。HPV16，18，31，33，35，45和58型导致生殖粘膜上皮发育不良并且与大多数子宫颈、阴道、外阴及肛道地原位和侵袭癌有关。
乳头瘤病毒为小的(50-60nm)、没有包被的二十面体DNA病毒，编码达8个早期基因和两个晚期基因。病毒基因组的开放阅读框(ORFs)命名为E1至E8和L1及L2，其中“E”表示早期且“L”表示晚期。L1和L2编码病毒外壳蛋白。早期(E)基因与如病毒复制，转录调节和细胞转化等功能有关。
L1蛋白是主要的外壳蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白为次要的外壳蛋白，预期分子量为55-60kDa且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测其表观分子量为75-100kDa。免疫数据表明大多数L2蛋白位于病毒壳粒中的L1蛋白内部。L1ORF在不同乳头瘤病毒中高度保守。L2蛋白在不同乳头瘤病毒中较少保守。
L1和L2基因被鉴定为免疫预防的良好目标。一些早期基因也被证明成为疫苗开发的潜在目标。在美洲产白尾棕色兔乳头瘤病毒(CRPV)和牛乳头瘤病毒(BPV)系统中研究显示以重组L1和/或L2蛋白(在细菌中或通过疫苗载体制备)的免疫保护动物免受病毒感染。乳头瘤病毒L1基因在杆状病毒表达系统或用疫苗载体的表达得到病毒样颗粒(VLP)的装配，VLP用于诱导与保护免受病毒攻击有关的高滴度的中和病毒抗体反应。此外，L1和L2基因用于产生防止和治疗动物中乳头瘤病毒感染的疫苗。
含有L1蛋白，L1+L2蛋白，或修饰的L1或L1+L2蛋白的预防和治疗PV感染和疾病的疫苗的开发和商业化由于缺乏大量的纯化病毒和纯化蛋白而被延迟。因为PV在体外不易培养，所以通过PV的体外繁殖制备所需量的L1和L2蛋白是困难的。由此产生的供给问题使对PV和PV蛋白的特征描述变得困难。因而，开发一种粗PV蛋白，尤其PVL1和L2蛋白或修饰的L1和L2蛋白的可容易更新来源将是有用的。开发纯化大量粗乳头瘤病毒蛋白至适于免疫研究和疫苗开发纯度水平的方法也将是有用的。制备大量具有天然蛋白免疫性-赋予特性，如天然蛋白构型的乳头瘤病毒蛋白也将是有用的。此外，开发分析PV蛋白的方法和测定该蛋白以及含该蛋白组合物相对纯度的方法将是有用的。这种高度纯化的蛋白在用于PV感染研究中各种试剂的制备中也将是有用的，这种试剂包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，和分析标准物。
HPV6和11是～90％良性生殖疣的原因所在且只很少与恶性生长有关(Gissmann等.，1983，美国国家科学院院报80，560-563)。HPV6a被认为是尖锐湿疣中最丰富的HPV6亚型(Brown，D.B.，等，临床微生物学杂志，31：1667-1673)。生殖疣求医(尖锐湿疣或平头湿疣)在近年来呈上升趋势。据估计～10％的普通人群(年龄15-49)具有生殖道HPV感染(Koutsky等，1988，流行病学综述，10，122-163)。虽然大多数湿疣与HPV6有关，但在喉部乳头瘤病的情况，HPV11是优势型。在呼吸道上皮细胞中HPV11的复制刺激了这些细胞的增殖，从而导致次要临床相关性的分离损伤或多重扩散性损伤及复发病。复发的呼吸乳头瘤病，一种更常折磨青少年人群的疾病，由于导致呼吸道的阻塞会成为威胁生命的疾病。最近，开发出一种允许感染性HPV11复制的动物模型(Kreider等，1985，自然317，639-640；Kreider等，1987，病毒学杂志，61，590-593)。该模型使用单克隆抗体对天然病毒颗粒和杆状病毒表达的VLPs上构型中和表位的鉴定成为可能(Christensen等1990，病毒学杂志，64，5678-5681；Christensen和Kreider 1991，病毒研究，21，169-179；Christensen和Kreider 1993，病毒研究，28，195-202；Christensen等1994，75，2271-2276)。
含有HPV11 L1蛋白的病毒样颗粒既在昆虫细胞系统又在哺乳动物细胞系统中表达。VLPs在酵母细胞中的表达具有价廉并易于在发酵罐中大规模培养的优势。然而，HPV11 L1蛋白在酵母中表达水平低。经观察此现象是HPV11 L1mRNA截短的结果。相反，HPV6 L1基因转录为全长mRNA并高水平表达。通过修改HPV6 L1 DNA以编码HPV11L1蛋白，促进全长mRNA的转录而导致HPV11 L1蛋白表达水平的升高是可能的。本发明提供了HPV6/11杂交L1基因序列以及用合成寡核苷酸构建HPV6/11杂交L1基因的方法。杂交基因根据HPV6a L1序列(Hofmann，K.J.，等.，1995，病毒学，用于发表而被接受)而设计但含有最少数目对编码HPV11 L1蛋白所必需的碱基变换。与野生型HPV11 L1基因不同的是，HPV6/11杂交基因不含有酵母识别的内部转录终止信号；由于产生的是得到的全长HPV6/11mRNA并且HPV11 L1蛋白的表达增加。
本发明是关于高度纯化的PVL1蛋白。本发明也包括制备和纯化具有天然乳头瘤病毒蛋白免疫-赋予特性的重组乳头瘤病毒蛋白的方法。本发明是关于用于乳头瘤病毒感染的预防和治疗疫苗的制备。电镜图片和结合构型抗体证实本发明的重组蛋白能够形成病毒样颗粒。
发明概述
本发明涉及编码纯化的人乳头瘤病毒11型L1蛋白的合成DNA分子及其衍生物。发明详述
本发明涉及编码纯化的人乳头瘤病毒11型L1蛋白的合成DNA分子及其衍生物。本发明的各种实施方案包括但不限于重组HPVDNA分子，互补于重组HPV DNA分子的RNA，由重组DNA分子编码的蛋白，抗重组DNA分子和有关蛋白的抗体，包括DNA，RNA，蛋白或抗体的组合物，使用DNA，RNA，蛋白或抗体以及其衍生物的方法。这样的衍生物包括但不限于由该DNA编码的肽和蛋白，该DNA的抗体或由该DNA编码蛋白的抗体，包括该DNA的疫苗或包括由该DNA编码蛋白的疫苗，包括该DNA或由该DNA编码蛋白的免疫组合物，含有该DNA或源自该DNA的RNA或由该DNA编码蛋白的试剂盒。
HPV6和11是～90％良性生殖疣的原因所在并且只很少与恶性生长有关(Gissmann等.，1983，美国国家科学院院报80，560-563)。生殖疣(尖锐或扁头湿疣)门诊近年来呈上升趋势并且据估计～10％的普通人群(年龄15-49)具有生殖道HPV感染(Koutsky等.1988，流行病学，综述，10，122-163)。虽然大多数湿疣与HPV6有关，但在喉部乳头瘤病中，HPV11是优势型。HPV11在呼吸道上皮细胞中的复制刺激了这些细胞的增殖，从而能导致分离的次要临床相关性的损伤或多重扩散损伤及复发病。复发呼吸乳头瘤病(papillomatosis)，为一种更常折磨青少年人群的疾病，由于导致呼吸道的阻塞可成为威胁生命的疾病。最近，开发出一种允许感染性HPV11复制的动物模型(Kreider等，1895，自然317，639-640；Kreider等，1987，病毒学杂志，61，590-593)。该模型使用单克隆抗体鉴定天然病毒颗粒或杆状病毒表达的VLPs上的构型中和表位成为可能(Christensen等.1990，病毒学杂志64，5678-5681；Christensen和Kreider 1991，病毒研究，21，169-179；Christensen和Kreider1993，病毒研究，28，195-202；Christensen等.1994，75，2271-2276)。
含有L1蛋白，L1+L2蛋白，或修饰的L1或L1+L2蛋白用于PV感染和疾病的预防和治疗疫苗的开发和商业化由于缺少大量纯化病毒及纯化蛋白而被延迟。因为PV不易在体外培养，所以通过PV的体外繁殖制备所需量的L1和L2蛋白是困难的。与PV体外培养有关的困难也导致对PV及PV蛋白化学、免疫学和生物学特征描述的困难。因此，开发一种粗PV蛋白，尤其PV L1和L2蛋白或修饰的L1和L2蛋白的易可更新来源将是有用的。开发纯化大量粗乳头瘤病毒蛋白至适于免疫研究和疫苗开发纯度水平的方法也将是有用的。制备大量具有天然蛋白免疫性-赋予特性，如天然蛋白构型的乳头瘤病毒蛋白也将是有用的。此外，开发分析PV蛋白的方法和测定该蛋白以及含该蛋白组合物相对纯度的方法将是有用的。这种高度纯化的蛋白在用于PV感染研究中各种试剂的制备中也将是有用的；这种试剂包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，和分析标准物。
含有HPV11 L1蛋白的病毒样颗粒既在昆虫细胞系统又在哺乳动物细胞系统中表达。VLPs在酵母细胞中的表达具有价廉且易在发酵罐中大规模培养的优势。然而，HPV11 L1蛋白在酵母细胞中以低水平表达。经观察此现象是HPV11 L1mRNA截短的结果。相反，HPV6 L1基因转录成全长mRNA并高水平表达。通过修改HPV6L1 DNA以编码HPV11 L1蛋白，促进全长mRNA的转录从而导致HPV11 L1蛋白表达的增加是可能的。本发明提供了HPV6/11杂交L1基因以及用合成寡核苷酸构建HPV6/11杂交L1基因的方法。杂交基因根据HPV6a L1序列设计但含有最少数目的对编码HPV11 L1蛋白所必需的碱基变换。与野生型HPV11 L1基因不同的是，HPV6/11杂交基因不含有酵母识别的内部转录终止信号，导致更高水平的mRNA且因而增加HPV11 L1蛋白的表达。
包括该DNA或由该DNA编码蛋白的药用组合物可按照已知的方法如通过混合药学上可接受的载体而制备。这种载体及配制方法的实例可在《Remington’s药物科学》中找到。为了形成适于有效施用的药学上可接受的组合物，这种组合物将含有有效量的该蛋白或VLP。这种组合物可以含有源自不止一种的HPV的蛋白或VLP。
本发明的治疗或诊断组合物以足以治疗或诊断PV感染的量施用于个体。该有效量可根据各种因素如个体状况、体重、性别和年龄而改变。一般地，组合物将以约1mcg至约1mg的剂量施用。
药物组合物可通过各种途径如皮下、局部、口腔、粘膜、静脉内和肌肉内提供给个体。
本发明的疫苗包括DNA、RNA或由该DNA编码的含有对诱导宿主中中和抗体形成所必需的抗原决定簇的蛋白。这种疫苗也足够安全地施用而没有临床感染的危险；不具有毒副作用；可通过有效途径施用；稳定；并与疫苗载体相容。
疫苗可通过各种途径，如口腔，肠道外，皮下，粘膜，静脉内或肌肉内施用。施用的剂量可依据个体的状态、性别、体重，和年龄；施用途径；和疫苗的PV型而改变。疫苗可以如胶囊、悬浮剂、酏剂、或液体溶液的剂量形式使用。疫苗可与免疫学上可接受的载体混合。
疫苗以治疗上有效的量施用，即，以足以产生免疫学上保护反应的量。治疗上有效的量可根据PV型而改变。疫苗可以单剂量或多剂量施用。
本发明的纯化蛋白可用于免疫原性组合物的制剂中。这种制剂，当导入合适的宿主，能在宿主中诱导免疫反应。
本发明的纯化蛋白或其衍生物可用于产生抗体。这里使用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体，以及例如能结合抗原或半抗原的Fv、Fab及F(ab)2片段的片段。
本发明的蛋白和蛋白衍生物可用于血清型HPV感染及HPV筛选。纯化的蛋白、VLP和抗体使它们形成适于对HPV检测和血清型鉴定的试剂盒。这种试剂盒将包括适于以密闭方式容纳至少一个容器的分隔承载体。载体可进一步包括试剂如L1或L2蛋白或源自重组HPV6/11或其它重组HPV型DNA分子的VLPs或抗这些蛋白的抗体。载体也可含有检测的手段如标记抗原或酶底物等。
纯化的蛋白也可用作免疫学标准物、分子量标记及分子大小标记。
已知在编码特异氨基酸的各种密码子中存在基本量的丰余。因此，本发明也涉及含有其它密码子的那些DNA序列，这些密码子编码最终翻译的相同氨基酸。为了本说明的目的，具有一个或更多个替代密码子的序列将被定义为简并变异。DNA序列的突变或基本不改变表达蛋白最终物理特性的翻译蛋白的突变也包括在本发明的范围之内。例如，以缬氨酸代替亮氨酸，精氨酸代替赖氨酸，或天冬氨酸代替谷氨酸不会导致该多肽功能性的改变。
已知编码肽的DNA序列可被改变成编码具有不同于天然产生肽特性的肽。改变DNA序列的方法包括，但不限于定点诱变。
正如这里所使用的，HPV6/11杂交基因的“功能衍生物”是具有与HPV6/11生物活性基本类似的生物活性(或功能或结构)的化合物。术语“功能衍生物”意在包括HPV6/11的“片段”，“变异体”，“简并变异体”，“类似物”和“同源物”或指其“化学衍生物”。
术语“类似物”指在功能上或者与整个HPV6/11分子或者与其片段基本类似的分子。
通过这里所述的方法获得的克隆HPV6/11DNA或其片段可通过分子克隆入含有适当启动子和其它合适转录调节元件的表达载体，并转化入原核或真核宿主细胞以制备出重组HPV11而重组表达。这种操作技术在Sambrook，J.，等，见上文，中有详尽描述，并在本领域中为已知的。
表达载体这里定义为对在适当宿主中克隆的拷贝基因转录和它们的mRNAs翻译所需的DNA序列。这种载体可用于在各种宿主如细菌、蓝绿藻、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和动物细胞中表达真核基因。特异设计的载体允许DNA在宿主之间，如细菌-酵母或细菌-动物细胞或细菌-真菌细胞或细菌-无脊椎细胞之间穿梭。一个适当构建的表达载体应该含有：用于宿主细胞中自主复制的复制起点，可选择标记，有限数目的有用限制酶位点，高拷贝数能力，和活动的启动子。启动子定义为引导RNA聚合酶结合到DNA上并起始RNA合成的DNA序列。强启动子是使mRNAs高频起始的启动子。表达载体可包括但不限于，克隆载体，修饰的克隆载体，特异设计的质粒或病毒。
多种哺乳动物表达载体可用于在哺乳动物细胞中表达HPV6/11 DNA或其片段。可适于重组HPV6/11DNA表达的商业上可得到的哺乳动物表达载体包括但不限于，pcDNA3(Invitrogen)，pMClneo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC37593)pBPV1(8-2)(ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRS-Vgpt(ATCC 37199)，pRSVneo(ATCC 37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)，和λZD35(ATCC 37565)。
多种细菌表达载体可用于在细菌细胞中表达HPV6/11 DNA或其片段。可适于重组HPV6/11 DNA表达的商业上可得到的细菌表达载体包括，但不限于pET11a(Novagen)，λgt11(Invitrogen)，pcDNAII(Invitrogen)，pKK223-3(发玛西亚)。
多种真菌细胞表达载体可用于在真菌细胞中表达HPV6/11或其片段。可适用于重组HPV6/11 DNA表达的商业上可得到的真菌细胞表达载体包括但不限于pYES2(Invitrogen)，毕赤酵母属表达载体(Invitrogen)和汉逊酵母属表达载体(Rhein Biotech，Dusseldorf，Germany)。
多种昆虫细胞表达载体可用于在昆虫细胞中表达HPV6/11DNA或其片段。可适用于HPV6/11 DNA重组表达的商业上可得到的昆虫细胞表达载体包括但不限于pBlue Bac III(Invitrogen)。
含有HPV6/11 DNA或其片段的表达载体可用于HPV11蛋白或HPV11蛋白片段在细胞、组织、器官、或动物中的表达。这里使用的动物包括人类。宿主细胞可以是原核或真核的，包括但不限于细菌如大肠杆菌，真菌细胞如酵母，哺乳动物细胞包括但不限于人、牛、猪、猴和啮齿来源的细胞系，和昆虫细胞包括但不限于果蝇和蚕来源的细胞系。商业上可得到的可适用的源自哺乳动物的细胞系包括但不限于L细胞L-M(TK-)(ATCC CCL1.3)，L细胞L-M(ATCC CCL1.2)，293(ATCC CRL1573)，Raji(ATCC CCL86)，CV-1(ATCC CCL70)，COS-1(ATCC CRL1650)，COS-7(ATCC CRL1651)，CHO-K1(ATCCCCL61)，3T3(ATCC CCL92)，NIH/3T3(ATCC CRL1658)，HeLa(ATCC CCL2)，C127I(ATCC CRL1616)，BS-C-1(ATCC CCL26)和MRC-5(ATCC CCL171)。
表达载体可通过许多技术中的任何一个导入宿主细胞，包括但不限于转化，转染，脂质转染(lipofection)，原生质融合和电穿孔。含表达载体的细胞被克隆式扩增并单独分析以测定其是否产生HPV11蛋白。HPV11表达宿主细胞克隆的鉴定可通过几种途径完成，包括但不限于与抗-HPV11抗体的免疫反应。
HPV DNA片段的表达也可用体外制备的合成mRNA或天然mRNA而完成。合成mRNA或分离自表达HPV6/11杂交DNA细胞的mRNA可在各种无细胞系统，包括但不限于小麦精子提取物和网织红细胞提取物中有效翻译，以及在细胞基础的系统，包括但不限于显微注射进蛙卵母细胞中，优选显微注射进蛙卵母细胞中有效地翻译。
HPV11蛋白在宿主细胞中表达以后，可回收HPV11蛋白以提供纯化形式的HPV11蛋白。几种HPV11纯化方法是可得到并可适用的。如这里所述，重组HPV11蛋白可通过盐析，离子交换层析、大小排阻层析，羟磷石灰吸附层析和疏水相互作用层析的各种组合或单独应用从细胞裂解液和提取物中得到纯化。
此外，重组HPV11蛋白可通过使用以对全长新生HPV11或HPV11的多肽片段特异的单克隆或多克隆抗体制备的免疫吸附柱从其它细胞蛋白中得到分离。单克隆和多克隆抗体可根据本领域已知的各种方法制备。这里使用的单克隆或单特异性抗体定义为单个抗体种类或具有对HPV11相同结合特征的多种抗体种类。这里使用的相同结合指抗体种类结合特异抗原或表位的能力。
对本领域的技术人员很明显用于制备单特异抗体的方法可用于制备对HPV多肽片段，或全长新生HPV多肽特异的抗体。具体地，对于本领域的技术人员很明显可制备对完全功能的HPV蛋白或其片段特异的单特异抗体。
本发明也涉及用于筛选调节编码HPV的DNA或RNA表达以及体内HPV11蛋白功能的化合物的方法。调节这些活性的化合物可以是DNA，RNA，肽，蛋白，或非-蛋白有机分子。化合物可通过增加或减弱编码HPV11 DNA或RNA的表达，或HPV11蛋白功能而调节。调节编码HPV11 DNA或RNA表达或HPV11蛋白功能的化合物可通过各种分析加以检测。分析可以是简单的“是/否”分析以测定是否有表达或功能的改变。分析可通过比较测试样品表达或功能与标准样品表达或功能水平而定量。
可制备含有HPV6/11杂交DNA、HPV6/11杂交DNA的片段、HPV6/11 DNA或HPV11蛋白的抗体、HPV6/11杂交RNA或HPV11蛋白的试剂盒。这种试剂盒用于检测与HPV6/11DNA杂交的DNA或检测样品中HPV11蛋白或肽片段的存在。这种特征描述用于多种目的包括但不限于法庭分析和流行病学研究。
可以合成互补于HPV6/11 DNA序列的核苷酸序列用于反义治疗。这些反义分子可以是DNA，DNA的稳定衍生物如硫代磷酸酯类或甲基磷酸酯类，RNA，RNA的稳定衍生物如2′-O-烷基RNA，或其它HPV6/11反义寡核苷酸类似物。HPV6/11反义分子可通过显微注射，脂质体包裹或通过带有反义序列载体的表达而导入细胞。HPV6/11反义治疗可对其利于降低HPV11活性疾病的治疗尤其有用。
术语“化学衍生物”描述了含有额外的在正常状态下不是基本分子一部分化学成分的分子。这种成分可以提高基本分子的溶解性、半衰期、吸附性等。或者该成分可减弱基本分子非必要的副作用或降低基本分子的毒性。这种成分的实例在多种教科书，如《Remington’s药物科学》中有描述。
根据这里公开的方法鉴定的化合物可以常规测试规定的合适的剂量单独使用以获得对HPV11或其活性的最佳抑制同时最大限度地减少可能的毒性。此外，联合施用或随后施用其它药剂可能是必要的。
优先地，本发明的化合物可以单剂量施用，或总剂量可以分成几份剂量施用。此外，用于本发明的化合物可通过各种途径包括但不限于鼻内、经皮、通过栓剂、口腔等施用。
对于用一个以上活性剂的联合治疗，其中的活性剂是分离的剂量形式，活性剂可同时施用，或者它们可以单独的交错时间施用。
根据各种因素选择使用本发明化合物的剂量服方，包括病人的类型、种类、年龄、体重、性别和医疗条件；待治疗状态的严重性；施用途径；病人的肾脏和肝脏功能；及其使用的特定化合物。一名普通的医师可容易地决定并开出对预防，抵消或抑制病情发展所需的有效药量的处方。在产生效应而设有毒性范围内获得药物浓度的最佳准确度需要依据药物对靶位点利用率动力学的服方。这包括要考虑药物的扩散、平衡、和排除。
在本发明的方法中，这里详细描述的化合物可形成活性成份，并且可与适当的药物稀释剂、赋形剂或根据意施用的形式，即，口服片剂、胶囊、酏剂、糖剂、栓剂、凝胶等适当选择的载体(这里共同指“载体”材料)混合施用，并与传统药物实践相一致。
例如，对于以片剂或胶囊形式的口腔施用，活性药物成份可与口腔、非毒性药物上可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等联合。此外，当必要或必需，也可向混合物中加入适当的粘合剂、滑润剂、崩解剂和着色剂。适当的粘合剂包括但不限于，淀粉，明胶，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，谷物增甜剂，天然及合成树胶如金合欢树胶、黄蓍胶、藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡等。这些剂量形式中使用的滑润剂包括，但不限于油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，醋酯钠，氯化钠等。崩解剂包括，但不限于淀粉，甲基纤维素，琼脂，斑脱土，黄蓍胶，树胶等。
对于液体形式活性药物成份可在适当调制的悬浮剂或扩散剂如合成及天然树胶中，例如，黄蓍胶，金合欢树胶，甲基纤维素等联合。其它可用的扩散剂包括甘油等。对于肠道外施用，无菌的悬浮剂及溶液是必需的。当需要静脉内施用时使用一般含有适当防腐剂的等渗制品。
含有活性药物成份的局部制品可与本领域众所周知的载体材料，如，乙醇，维拉木胶，尿囊素，甘油，维生素A和E，油类，矿物油，PPG2十四烷基丙酸酯等混合以形成如，乙醇溶液，局部清洁剂，清洁乳脂，皮肤胶，皮肤洗液，以及乳脂或凝胶形式的香波。
本发明的化合物也可以脂质体运输系统的形式施用，如小单室囊泡，大单室囊泡及多室囊泡。脂质体可从各种磷脂，如胆固醇，硬脂酰胺或磷脂酰胆碱中形成。
本发明的化合物也可通过使用与该化合物分子偶联的单克隆抗体作为单独的载体而运输。本发明的化合物也可与可作为定向药物载体的可溶性聚合物偶联。这样的聚合物可能包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天门冬酰胺苯酚、或以棕榈酰基取代的聚氧乙烯聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以偶联到一类在完成药物的控制释放中有用的生物可降解的聚合物上，例如，聚乳酸，聚-ε-己内酯，聚羟基丁酸，聚原酸酯，聚缩醛类，聚二氢吡喃类，聚氰基丙烯酸酯类以及交联或双亲性的水凝胶嵌段共聚物。
下面的实施例说明了本发明，然而没有将本发明限制在那里相同之处。
实施例1合成L1基因的构建
1.5kbp的HPV11 L1开放阅读框用从Midland试剂公司定购的合成DNA寡聚体构建。提供的这些寡聚体含有5′末端磷酸盐。需要总共24个寡聚体并列表如下：#241-15′GAAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT3′(SEQ IDNO：1)#24125′ATTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT3′(SEQ ID NO：2)#241-35′ACATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGGGTTACGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGG 3′(SEQ ID NO：3)#241-45′GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTACACAGTGTAGTAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGC 3′(SEQ ID NO：4)#241-55′CCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGGCACTGTA 3′(SEQ ID NO：5)#241-65′TGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATATGGTGATAGATTATTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC 3′(SEQ ID NO：6)#241-75′GGGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTAAGGGTGGTAACAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGTTCACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACA 3′(SEQ ID NO：7)#241-85′ATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGA 3′(SEQ ID NO：8)#241-95′CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT 3′(SEQ ID NO：9)#241-105′ACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTCTCGAGGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACACTCGAGCGG 3′(SEQ ID NO：10)#241-115′CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCTATAAGGACATGAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT 3′(SEQ ID NO：11)#241-12 5′GGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGACCTCTGCTCGTACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCTCTACTGCCCCTAAACGTAAGCGCACCAAAACTAAAAAGTAAGATCTTC 3′(SEQ ID NO：12)#241-135′GAAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGCAGTAGAGGGTTTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATACCGGTACGAGCAGAGGTCCGTCCCCTATATCCACTTTGTAACAAAAACTTGCGTCCCAAAGGAAACTGATCCAATTC 3′(SEQ ID NO：13)#241-145′ACTAGAAAACTTTTCTTTTAAATTAACCTCCCAAAAACTCATGTCCTTATAGGGATCTTGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTTGACAGGTAATGGCCTGTGACTGCACATACCTATAGGTATCCTCGAGCGG 3′(SEQ ID NO：14)#241-155′CCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCCATTACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTGAAAAA 3′(SEQ ID NO：15)#241-165′TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTTATAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCACATAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG 3′(SEQ ID NO：16)#241-175′GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATACCATTGTTATGTCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATTAAACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA3′ (SEQ ID NO：17)#241-185′AGAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGACGAGCGATTGTTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACAGGTTCCCCCACGGTACCCC 3′(SEQ ID NO：18)#241-195′GGGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGCAAACATTTGTTCCTTCCGTAGATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTGCAGCCATTTGTAAATAATCTGGATATTTACATACAGTGCCACATATGTCAA 3′(SEQ ID NO：19)#241-205′GAGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCATAGCACCAAAGCCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATAACACTGGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT 3′(SEQ ID NO：20)#241-215′ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGCCCAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTTATAATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT 3′(SEQ ID NO：21)#241-225′TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATTTAGTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCCCGGCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT 3′(SEQ ID NO：22)#241-235′ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATCAAAAAGAGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACACCACCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTGGCACAACAGTTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAATAAGGATGACCC 3′(SEQ ID NO：23)#241-245′ACTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATGATAAAATATGTTGGTGCGTTTAACATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAGGGTTAGGAGGAGGCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCACATTTTGTTTTGTGAGATCTTC 3′(SEQ ID NO：24)
形成互补寡聚对的寡聚体(#241-1与#241-24，#241-2与241-23，#241-3与#241-22，#241-4与#241-21，#241-5与#241-20，#241-6与#241-19，#241-7与#241-18，#241-8与#241-17，#241-9与#241-16，#241-10与#241-15，#241-11与#241-14，#241-12与#241-13，图1)在含有2.5mM Tris，pH7.5，0.25mM的EDTA的分离管中退火。管加热至98℃4分钟并且然后置于250ml烧杯中200ml 98℃的水中以缓慢冷却。当水冷却至室温时，退火的寡聚对按指定加入管中；片段A(寡聚对#241-1与24，和-2与23)；片段B(#241-3与22，-4与21，-5与20，和-6与19)；片段C(#241-7与18，-8与17，-9与16和-10与15)及片段D(#241-11与14和-12与13)。这些寡聚对混合物加热至62℃2分钟并且然后按以前缓慢冷却。每管中的内容物用制造商提供的T4 DNA连接酶(宝灵曼公司)和试剂在23℃连接过夜。
连接以后，片段B需要PCR扩增以增加全长产物的含量。该扩增需要用宝灵曼Taq聚合酶和下面的寡聚引物在应用系统热循环仪中94℃1分钟；48℃，1分钟；72℃，1分钟10个循环接着在72℃10分钟：5′GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG3′(SEQ ID NO：25)和5′GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA 3′(SEQ ID NO：26)。
连接产物和片段B PCR产物以限制酶(宝灵曼公司)按如下进行酶切：片段A以BglII和SphI酶切；片段B，以SphI和KpnI；片段C，以KpnI和XhoI；且片段D，以XhoI与BglII。酶切的片段在低熔点琼脂糖(FMC Bio Products)凝胶中分离且正确大小的片段按供应商的建议切下该条带并用AgaraseTM(宝灵曼公司)消化琼脂糖而分离。用乙醇沉淀回收片段A、B和D并且然后分别连接到以限制酶同样酶切从而和待连接的每个片段相匹配的载体pSP72(Promega公司)中。
KpnI XhoI酶切的片段C首先连接到退火的寡聚体。5′TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC3′；(SEQ ID NO：27)和5′TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCT3′(SEQ ID NO：28)。
片段C然后以XhoI重新酶切且450bp的KpnI XhoI片段与KpnI，XhoI-酶切的pSP72载体相连接。连接混合物用于转化大肠杆菌DH5菌珠感受态细胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。通过菌落杂交(J.Sambrook等.，《分子克隆：实验指南》第2版，冷泉港实验室出版社，1989)筛选转化子中含插入子的克隆。用Wizard微量制备(miniprep)试剂盒(promega公司)从阳性克隆中分离质粒DNA且然后用应用系统373A DNA测序仪测序。含有4个片段中每个正确DNA序列的克隆按照以前酶切以从pSP72载体中释放出该片段。KpnI，XhoI酶切的片段C与XhoI，BglII酶切的片段D和KpnI，BglII酶切的pSP72进行三径(three way)连接。连接产物然后用于转化大肠杆菌。将得到的转化子测序并获得正确序列的克隆(命名为CD)。CD中的750bp BglIIKpnI插入子从pSP72载体中重新切出并与BglII、SphI酶切的片段A和SphI、KpnI酶切的片段B除了加入BglII以减少无需的连接产物外按前述进行三维连接。连接产物在琼脂糖凝胶中分离，分离出1.5kbp的片段，并命名为D361-1。
实施例2序列比较
HPV6/11杂交体、HPV6a和HPV11 L1 DNA序列的核苷酸序列比较显示于图2。HPV6骨架序列中总共造成55个核苷酸替代以将其转变成编码HPV11的翻译框架。此外，在#411-413bp处添加了碱基对的插入以编码发现于HPV11中但未发现于HPV6中的额外氨基酸(酪氨酸132)。总之，这些变化允许11-型特异的、构型依赖性的中和单克隆抗体(Chemicon 8740MA6)结合HPV6/11 L1DNA在酵母中表达的L1蛋白。这表明来自HPV6/11杂交基因的蛋白似乎与天然HPV11在免疫学上难以区分。
HPV6/11杂交DNA序列与发表的HPV11 L1序列的比较显示出194个碱基对的替代。野生11型L1序列有相当多数目的替代，任何替代的组合或总体上所有的改变可能与酵母细胞中11型L1蛋白表达增加有关。
实施例3L1基因的DNA测序
按制造商(ABI，Inc.，Foster City，CA)定义以染色终止子测序反应(PRIZMTM测序试剂盒)用应用生物系统DNA测序仪#373A对HPV6/11L1基因进行测序。
实施例4HPV6/11 L1、HPV11 L1和HPV6 L1酵母表达载体的构建
通过从含有来自质粒pBM272中的啤酒糖酵母背离式GAL1-GAL10启动子的PUC18/双向GAL启动子质粒(Mark Johnston，Washington University，St.Louis，MO提供)中分离1.4kbp的SphI片段构建pGAL 1-10酵母表达载体。双向启动子两侧有一拷贝的酵母ADH1转录终止子(Bennetzen，J.L和Hall.B.D.，1982，生物化学杂志.257：3018-3025)，位于GAL1启动子和第1拷贝ADH1转录终止子之间的BamHI克隆位点和位于GAL10启动子与第二拷贝ADH1转录终止子之间的SmaI克隆位点。以SphI酶切由pBR322、酵母LEU2d基因组成的酵母穿梭载体(Erhart，E.and Hollenberg，C.P.，1983，细菌学杂志，156：625-635)和酵母2u质粒(Benjamin Hall，University ofWashington，Seattle，WA惠赠)(Broach，J.R.and Volkert，F.C.，1991，酵母环状DNA质粒，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)并与1.4kbp的SphI双向GAL启动子片段连接得到pGAL 1-10(图3)。
编码HPV11 L1蛋白(实施例1中样品D361-1)的HPV6/11杂交L1 DNA在紧接着HPV6/11 L1起始甲硫氨酸密码子的上游含有一个酵母非翻译的前导序列(Kniskem，P.J等.，1986，基因46：135-141)。pGAL1-10质粒以BamH I在GAL1启动子和ADH1转录终止子之间以BamHI酶切而线性化且与1.5kbp的HPV6/11 L1基因片段(样品D361-1)连接。筛选大肠杆菌DH5(Gibco BRL.Inc)转化子并且分离含HPV6/11 L1基因的pGAL1-10质粒且命名为D362-1。
从尖锐湿疣损伤(Darron Brown博士惠赠)中克隆野生型HPV11(wt-HPV11)DNA。提取人基因组总DNA并以限制性核酸内切酶酶切。含wt-HPV11 DNA的部分连接到待用作PCR模板的大肠杆菌克隆载体。用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)，10个循环的扩增(94℃1分钟，48℃1分钟，72℃1分钟45秒)，和下面的含侧翼BglII位点(下划线)的寡核苷酸引物通过PCR扩增wtHPV11 L1基因：有义引物：5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC
CTA GCG ACA GCA CAG-3′(SEQ ID NO：29)反义引物：5′-GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTT
CG-3′(SEQ ID NO：30)。
有义引物在紧接着wt-HPV11L1起始甲硫氨酸密码子(以黑体印刷突出显示)的上游导入酵母非-翻译前导序列(Kniskern，P.J.等.，1986，基因46：135-141)。1.5kbp的wt-HPV11 L1 PCR产物以BglII酶切，凝胶纯化并与BamHI酶切的pGAL1-10质粒连接以得到质粒，p329-1。
从HPV6a-阳性，尖锐湿疣损伤中(Darron Brown博士惠赠)提取总基因组DNA。用活检样品DNA作为模板，Vent聚合酶(NewEngland Biolabs，Inc.)、35个扩增循环(94℃1分钟，48℃1分钟，72℃1分钟45秒)的PCR扩增HPV6a L1基因，使用的是上面列出的用于wt-HPV11 L1 PCR的有义引物和具有下面序列的反义引物。
5′-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3′
(SEQ ID NO：31)1.5kbp的HPV6a L1 PCR产物以BglII酶切，凝胶纯化并与BamHI酶切的pGAL1-10质粒连接以得到质粒D128。
实施例5菌株1558的制备步骤a：酵母菌株U9的制备
酵母菌株2150-2-3(MATα，leu2-04，adel，cir°)获自LelandHartwell博士(华盛顿大学，西雅图，WA)。菌株2150-2-3细胞在5ml YEHD培养基(Carty等，J.Ind Micro 2(1987)117-121)中30℃培养过夜。细胞以无菌蒸馏水洗3次，重悬于2mL无菌蒸馏水，并且为了筛选ura3突变子，将0.1mL的细胞悬液置于6个5-氟代-乳清酸(FOA)平板的每个平板上(冷泉港实验室酵母遗传学手册)。该平板在30℃孵育。培养基每250mL蒸馏水中含有：3.5g无氨基酸和硫酸铵的Difco Yeast Nitrogen Base；0.5g 5-氟代乳清酸；25mg尿嘧啶；和10.0g右旋糖。
培养基经0.2μM膜过滤除菌并且然后与维持在50℃的250mL 4％Bacto-Agar(Difco)，10mL 1.2mg/mL的腺嘌呤溶液，和5mL L-亮氨酸溶液(180mg/50mL)混合。得到的培养基以每个培养皿20mL进行分配。
孵育5天以后，出现众多的菌落。通过重划最初FOA平板的菌落至新鲜的FOA平板且然后在30℃孵育而分离单个菌落。通过重复划盘至YEHD平板和尿嘧啶缺陷平板以测试第二套FOA平板中许多菌落中ura3突变的存在。所需的结果是在YEHD上生长良好且在尿嘧啶缺陷培养基中没有生长。得到一个表现这些特性的分离子(U9)。其在-70℃作为冷冻甘油贮存菌株(菌株#325)贮存备用。步骤b：用于酵母MNN9基因破裂载体的制备
为了制备用于MNN9基因破裂的载体，首先从酵母基因组DNA中克隆MNN9基因是必需的。这通过标准的聚合酶链式反应(PCR)技术完成。根据发表的酵母MNN9基因序列(Zymogenetics：EPO专利申请号.88117834.7，公开号.0-314-096-A2)设计用于全长MNN9编码序列PCR的5′有义引物和3′反义引物。使用下面的含侧翼HindIII位点(下划线)的寡脱氧核苷酸引物：有义引物：5′-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3′
(SEQ ID NO：32)反义引物：5′-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3′.
(SEQID NO：33)
MNN9基因的起始甲硫氨酸密码子以黑体印刷突出显示。用啤酒糖酵母菌株JRY 188的基因组DNA为模板，Taq DNA聚合酶(PerkerElmer)和25个扩增循环(94℃1分钟，37℃2分钟，72℃3分钟)进行PCR。得到的1.2kbp的PCR片段以HindIII酶切，凝胶纯化，并且与HindIII酶切的碱性磷酸酶处理的pUC13(Pharmacia)连接。得到的质粒命名为p1183。
为了以酵母URA3基因破裂MNN9基因，质粒pBR 322-URA3(其含有亚克隆到pBR322 HindIII位点的编码酵母URA3基因的1.1kbpHindIII片段)以HindIII酶切并且将带有有功能URA3基因的1.1kbp的DNA片段凝胶纯化，以T4 DNA聚合酶末端补平，并且然后与PmlI酶切的质粒pl 183(PmlI在MNN9编码序列之间酶切)连接。得到的质粒pl199含有由有功能的URA3基因破裂的MNN9基因。步骤c：含有破裂MNN9基因的U9衍生菌株1372的构建
为了破裂菌株U9(#325)中的MNN9基因，30μg的质粒pl 199以HindIII酶切以产生线性的mnn9∷URA3破裂盒。菌株325细胞以HindIII酶切的pl 199 DNA通过原生质球方法(Hinnen等.，1978，美国国家科学院院报75：1929-1933)加以转化并且在缺陷尿嘧啶和含有1.0M山梨醇的合成琼脂培养基中筛选转化子。该合成培养基每升蒸馏水中含有：琼脂，20g；酵母氮源(nitrogen base)(无氨基酸)，6.7g；腺嘌呤，0.04g；L-酪氨酸，0.05g；山梨醇，182g；葡萄糖，20g；和亮氨酸缺陷溶液#2，10ml。亮氨酸缺陷溶液#2每升蒸馏水含有：L-精氨酸，2g；L-组氨酸，1g；L-亮氨酸，6g；L-异亮氨酸，6g；L-赖氨酸，4g；L-甲硫氨酸，1g；L-苯丙氨酸，6g；L-苏氨酸，6g；L-色氨酸，4g。
平板30℃孵育5天后出现众多菌落。从10个菌落中制备染色体制品并且然后以EcoRI加HindIII酶切。DNA酶切产物然后用带有MNN9基因的1.2kbp的HindIII片段(从质粒pl 199中分离)作为探针通过Southem印迹(J.Sambrook等.分子克隆：实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989)而加以分析。鉴定出一个在Southern印迹中表现出预期DNA带迁移以及由mnn9突变子经常显示的极端块(extremeclumpiness)的分离转化子。步骤d：用于酵母HIS3基因破裂载体的构建
为了构建其中的啤酒糖酵母HIS3基因被URA3基因破裂的破裂盒，质粒YEp6(K.Struhl等.，1979，美国国家科学院院报，USA 76：1035)以BamHI酶切并且带有HIS3基因的1.7kbp的BamHI片段以凝胶纯化，以T4 DNA聚合酶末端补平，并且与预先以BamHI酶切和T4 DNA聚合酶处理的pUC18连接。得到的质粒(命名为pl501或pUC18-HIS3)以NheI酶切(在HIS3编码序列中酶切)，并将载体片段凝胶纯化，以T4 DNA聚合酶末端补平，并且然后以牛肠碱性磷酸酶处理。通过以HindIII酶切从质粒pBR322-URA3中分离URA3基因并且将带有URA3基因的1.1kbp的片段进行凝胶纯化，以T4 DNA聚合酶末端补平，并与上面的pUC18-HIS3 NheI片段连接。得到的质粒(命名为pUC18-his∷URA3或pl505)含有一个其中的酵母HIS3基因由有功能的URA3基因所破裂的破裂盒。步骤e：构建通过HIS3基因破裂酵母PRB1基因的载体
带有啤酒糖酵母PRB1基因的质粒FP8ΔH由Camegie-Mellon大学的E.Jones博士提供(C.M.Moehle等.，1987，遗传学115：255-263)。以HindIII加上XhoI将其酶切并将带有PRB1基因的3.2kbp的DNA片段凝胶纯化并以T4 DNA聚合酶处理将其末端补平。质粒pUC18以BamHI酶切，凝胶纯化并且通过以T4 DNA聚合酶处理将其末端补平。得到的载体片段与上面的PRB1基因片段连接以得到质粒pUC18-PRB1。含有HIS3基因的质粒YEp6以BamHI酶切。将得到的带有有功能HIS3基因的1.7kbp BamHI片段进行凝胶纯化且然后以T4 DNA聚合酶处理将其末端补平。质粒pUC18-PRB1以EcoRV加上NcoI在PRB1编码序列中间进行酶切并去除蛋白酶B的活性位点和侧翼序列。带有在pUC18中PRB 1编码序列残余5′和3′-部分的5.7kbp的EcoRV-NcoI片段进行凝胶纯化，以T4 DNA聚合酶处理将其末端补平，以牛肠碱性磷酸酶去磷酸化，并且与上述的末端补平的HIS3片段连接。得到的质粒(命名为pUC18-prbl∷HIS3，保存号为#1245)在上面删除的PRB1基因部分的位置含有有功能的HIS3基因。步骤f：含有MNN9和PRB1两种基因破裂的
U9相关酵母菌株的构建
含有MNN9基因破裂的U9相关菌株1372在实施例5c中描述过。菌株1372的克隆分离子经过FOA平板(如在实施例5a中描述)以筛选ura3突变子。获得许多菌株1372的ura3分离子并且筛选出一个用于随后HIS3基因破裂的特别分离子(菌株12930-190-S1-1)。pUC18-his3∷URA3基因破裂载体(pl505)以XbaI加上EcoRI酶切以产生线性his 3∷URA 3破裂盒并用于通过醋酸锂方法(酶学方法，194：290(1991))对菌株12930-190-S1-1的转化。在尿嘧啶缺陷合成琼脂培养基上筛选Ura+转化子，为克隆分离而重新划盘于相同的培养基，且然后重新铺板于尿嘧啶缺陷或组氨酸缺陷的培养基中以筛选那些Ura+及His-分离子。筛选出一个PRB1基因随后破裂的分离子(菌株12930-230-1)。PRB1基因破裂载体(pUC18-prb1∷HIS3，保存号#1245)以SacI加上XbaI酶切以产生线性的prb1∷HIS3破裂盒并用于通过醋酸锂方法对菌株12930-230-1的转化。在组氨酸缺陷的琼脂培养基上筛选His+转化子并重新划盘于相同的培养基中以克隆分离。从许多得到的His+分离子中制备基因组DNA，以EcoRI酶切，且然后在0.8％琼脂糖凝胶中电泳。然后用下面的寡脱氧核苷酸引物通过PCR制备的放射标记的PRB1基因617bp探针进行Southern印迹分析：5′TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3′(SEQ ID NO：34)；和5′CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3′(SEQ ID NO：35)
获得11个表现出与2.44kbp prb1∷HIS3 DNA片段预期探针杂交的分离转化子。这与野生型PRB1基因与1.59kbp片段的探针杂交构成对照。选择其中一个含所述prb1∷HIS3破裂的分离转化子供进一步使用并命名为菌株#1558。
实施例6HPV11 L1和HPV6 L1在酵母中的表达
用质粒D362-1(pGAL1-10+HPV6/11 L1)，p329-1(pGAL1-10+wt-HPV11 L1)，D128(pGAL1-10+HPV6 L1)和pGAL 1-10通过原生质球方法(Hinnen等.，1978，美国国家科学院院报75，1929-1933)转化酵母菌株#1558(MATa，leu 2-04，prb1∷HIS3，mnn9∷URA3，ade1，cir°)。以质粒D362-1转化的#1558酵母菌株命名为菌株#1782。为了RNA研究，将酵母克隆分离转化子在含0.1M山梨醇和2％葡萄糖或半乳糖的YEH复合培养基(Carty等.，1987，J.Ind.Micro.2，117-121)中30℃培养26小时。收获细胞以后，用所述的热酸性酚方法(hot acidicphenol method)(当今分子生物学方法，第2卷，当前方法，1993)提取酵母RNA。为了蛋白分析，相同的分离转化子在含有0.1M山梨醇，2％葡萄糖和2％半乳糖的YEM复合培养基中30℃培养70小时。收获细胞以后，用玻璃珠破碎细胞沉淀并通过免疫印迹分析，分析细胞裂解液中HPV11 L1或HPV6 L1蛋白的表达。
实施例7酵母表达的PHV L1 RNAs的Northern印迹分析
含10μg总RNA的样品通过以乙二醛和DMSO处理而变性(当前的分子生物学方法，第1卷，当前方法，1993)并经磷酸盐缓冲的，1.2％的琼脂糖凝胶电泳。将RNA转移至尼龙膜且以与HPV11和HPV6L1 DNA序列互补的32P-标记的寡核苷酸检测。
Northern印迹显示于图4。在培养于葡萄糖培养基中的样品中没有检测到相应于全长HPV L1 RNA预期大小的带(1，3和5道)。由于葡萄糖抑制酵母GAL 1启动子的转录，故此结果是预料之中的。相反，培养于诱导GAL1启动子转录的半乳糖培养基中的样品显示出强烈的HPV L1 RNA信号。HPV6 L1转录为全长RNA(2道)而大多数野生型(wt)-HPV11 L1转录为截短的形式(4道)。该结果表明酵母转录终止信号位于wt-HPV11 L1 ORF中间而在HPV6 L1序列中不存在。HPV6/11杂交基因转录的RNA似乎为全长(6道)。在pGAL1-10对照酵母样品中没有检测到HPV特异的RNA(7道)。
实施例8酵母表达的HPV L1蛋白的Western分析
含20μg细胞总蛋白的样品在变性条件下经10％Tris-甘氨酸凝胶
(Novex，Inc)电泳并电印迹至硝酸纤维素滤膜上。用产生的抗trpE-HPV11 L1融合蛋白的兔子抗血清作为一级抗体(Brown，D.R.等.，1994，病毒学201：46-54)以及用辣根过氧化物酶(HRP)-交联的驴抗-兔Ig(Amersham，Inc)作为二级抗体对L1蛋白作免疫检测。滤膜用化学发光ECLTM标记试剂盒(Amersham，Inc)处理。除了pGAL 1-10阴性对照(4道)外，在所有样品中均检测到50-55 kDa的L1蛋白带(图5)。此外，由HPV6/11杂交基因表达的HPV11L1蛋白的量(3道)似乎是wt-HPV11基因(2道)或HPV6 L1基因(1道)表达L1蛋白量的～10倍多。
实施例9酵母表达的HPV11 L1 VLPs的ELISA
ELISA用于测定酵母克隆表达wt-HPV11或HPV6/11杂交体而产生VLPs的相对量。ELISA也用于证明在源自HPV6/11杂交DNA的VLPs中维持有导致强烈中和抗体反应的构型表位。此构型表位通过从作为Chemicon Mab8740的Chemicon Intemational(Temecula，CA)得到的单克隆抗体H11.B2(Christensen等1990，病毒学杂志.64，5678-5681)来定义。简言之，ELISA平板(Maxisorb，Nunc Inc.，Naperyille，IL)孔覆盖一层在100μL PBS中含有HPV6/11(杂交体)或wt-HPV11VLPs的逐渐减少量的总酵母蛋白。CsCl纯化的wt-HPV11病毒粒子(D.Brown博士惠赠)和对照酵母蛋白用作对照。在以TTBS(50rmMTris，pH7.6，150mM NaCl，0.1％Tween 20)中250mcl 10％的奶粉室温封闭平板2小时之前，将平板在4℃孵育过夜。平板以PBS/0.1％Tween 20洗一次以后，将平板孔与100mcl在TTBS中的1％奶粉里以1∶1000稀释的抗-HPV11病毒粒子单克隆抗体Chemicon MAB8740室温孵育1小时。平板以PBS/Tween20洗3次且然后与100mcl在1％奶粉+TTBS中以1∶1000稀释的偶联到碱性磷酸酶上的抗小鼠Ig(Kierkegard&Perry，Gaithersburg，MD)在室温孵育1小时。平板再以PBS/Tween 20洗3次后加入100mcl磷酸酶底物(在二乙醇胺缓冲液中的对硝基苯磷酸盐)。平板在室温孵育30分钟。通过加入50mcl3N的NaOH而终止反应。将平板在ELISA平板计数器中405nm处读数。通过从对照酵母蛋白获得的背景读数而校正的2孔中平均OD405nm读数对孔中酵母总蛋白作图且显示于图6。与wt克隆相比HPV6/11杂交酵母克隆产生10倍多天然VLPs的量。此外，在这些VLPs中显示出为Chemicon Mab 8740识别的强烈中和表位。
实施例10 电子显微镜研究
为了EM分析(Structure Probe，West Chester，PA)，每个样品(粗始澄清裂解液或纯化的VLPs)的一部分置于200-目碳覆盖的铜网上。一滴2％的pH7.0的磷钨酸(PTA)置于铜网上20秒。铜网气干后进行透射电镜检查。所有的显微镜以100kV的递增电压用JEOL 100CX透视电子显微镜(JEOL USA，Inc)完成。产生的显微图片最终放大为100,000x。如图7所示，在所有的HPV11样品中观察到45-55nm直径大小范围的VLPs但在酵母对照样品中未能观察到。
实施例11HPV6/11 L1(菌株#1782)的发酵
菌株1782平板培养的表面培养物无菌转移至无亮氨酸的液体培养基，其中含有(每L)：8.5g无氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮基质；0.2g腺嘌呤；0.2g尿嘧啶；10g琥珀酸；5g硫酸铵；和0.25g L-酪氨酸；该培养基在灭菌前以NaOH调pH至5.0-5.3。在250rpm摇床中28℃培养25hr以后，在-70℃贮存前，通过加入无菌甘油至终浓度17％(w/v)而制备冷冻培养瓶(每冻瓶(cryovial)1mL)。用于菌株1782发酵的接种物培养于同样的培养基(每个2-L烧瓶750mL)中并通过转移两个冷冻培养瓶中的融化内容物至2L的烧瓶并于250rpm摇床上28℃孵育25hr而开始发酵。菌株1782的发酵使用Chemap 23L发酵桶，接种后的工作体积18L。使用的生产培养基含有(每L)：20g Difco酵母提取物；10g Sheffield Hy Soy蛋白胨(peptone)；20g葡萄糖；20g半乳糖；灭菌之前将培养基调至pH5.3。2-L接种瓶中的全部内容物(500mL)转移至孵育于28℃、9L气流每分钟(air per min)、500rpm、3.5磅(psi)压力的发酵罐中。摇速按需要增加以维持溶解的氧气水平大于40％的饱和度。发酵的进程通过脱机的葡萄糖测量(Beckman葡萄糖2分析仪)和在线质谱测量(Perkin-Elmer 1200)加以监测。孵育66hr以后，细胞密度达到每L9.32g细胞干重。回收细胞之前合并这两个发酵的内容物(共17.5L培养基)。培养物通过中空纤维过滤(于Amicon DC-10过滤系统中的Amicon H5MP01-43萃取柱)浓缩至大约2L，以2L磷酸盐缓冲盐透滤，并在重悬于500mL离心瓶之前进一步浓缩(至大约1L)。通过4℃8,000rpm(Sorval GS3转头)离心20分钟收集细胞沉淀。弃上清以后，沉淀物(共358g细胞湿重)贮存于-70℃备用。
实施例12重组HPV11型L1外壳蛋白的纯化
如果没有说明，所有的步骤在4℃完成。
细胞冻存于-70℃。冷冻的细胞(湿重＝180g)于20-23℃融化并重悬于900mL的“破裂缓冲液”中(50mM MOPS，pH7.2，500mM NaCl，1mM CaCl2)。加入蛋白酶抑制剂AEBSF和胃蛋白酶抑制剂A至终浓度分别为0.1mM和1.7μM。细胞悬液以大约16,000磅(psi)的压力在M110-Y Microfluidizer(Microfluidics公司，Newton，MA)中四轮而裂解。向裂解的细胞悬液中加入足量体积的10％的Triton X100清洁剂(Pierce，Rockford，IL)至0.5％的TX100的浓度。将悬液搅动20小时。以12,000xg离心Triton X100-处理的裂解液40分钟以去除细胞残渣。回收含L1蛋白的上清液。
用300K的切向流过滤膜盒(Filtron，Northborough，MA)在5倍体积20mM磷酸钠，pH7.2，0.5M NaCl透滤上清液。通过放免分析和Western印迹显示由滤膜存留的物质中含有L1蛋白。
存留物用于以20mM磷酸钠，pH7.2，0.5M NaCl平衡的SPSpherodex(M)树脂(IBF，Villeneuve-la-Garenne，France)高分辨吸附柱(11.0cm ID×5.3cm)。在以平衡缓冲液冲洗和以20mM磷酸钠，pH7.2，1.0M NaCl一步洗以后，L1蛋白以20mM磷酸钠，pH7.2，2.5MNaCl一步洗加以洗脱。在冲洗和洗脱过程中收集级份。通过Bradford方法分析柱级份的总蛋白。然后用western印迹和以胶状考马斯检测的SDS-PAGE分析级份。也通过放免分析分析级份。
合并表现L1蛋白类似纯度和丰富度的SP Spherodex级份。
通过western印迹和以胶状考马斯检测的SDS-PAGE分析终产物。估计L1蛋白的一致性＞90％。L1蛋白的同一性通过western印迹来确证。终产物经0.22μm的滤膜无菌过滤并保存于4℃。该过程得到100mg的总蛋白。
电子显微镜分析通过Structure Probe(West Chester，PA-)而完成。部分样品置于200目碳覆盖的铜网上。一滴2％，pH7.0的磷钨酸置于铜网上20秒。在TEM检测之前铜网让空气干燥。所有的显微镜用JEOL100 CX透射电子显微镜(JEOL USA，公司)以1000kV的加速电压而完成。得到的显微照片最终放大倍数为100,000x。总蛋白的Bradford分析
总蛋白用商业上可得到的Coomassie Plus试剂盒(Pierce，Rockford，IL)加以分析。样品在Milli-Q-H2O中稀释至适当的水平。标准和微量分析(microassay)方法中分别需要0.1mL和1.0mL的体积。对于两种方法，用BSA(Pierce，Rockford，IL)制作标准曲线。分析根据制造商的建议而完成。用Cricket Graph软件在Macintosh IIci计算机上绘制标准曲线。SDS-PAGE和Western印迹分析
所有的凝胶，缓冲液和电泳仪获自Novex(San Diego，CA)并根据制造商的建议跑胶。简言之，样品在Milli-Q-H2O中稀释至相同的蛋白浓度并与含200mM DTT的样品孵育缓冲液1∶1混合。样品于100℃孵育15分钟并上样到预先铺好的12％的Tris-甘氨酸凝胶中。样品以125V电泳1小时45分钟。凝胶用商业上获得的试剂盒(一体化分离系统，Natick，MA)通过胶状的考马斯染色而显色。
对于western印迹，蛋白以25V40分钟转移至PVDF膜。以Milli-Q-H2O洗膜并空气干燥。一抗为产生的抗TrpE-HPV11 L1融合蛋白(D.Brown博士惠赠)的多克隆兔抗血清。抗体溶液通过在杂交缓冲液(于6.25mM磷酸钠中的5％的去脱牛奶，pH7.2，150mM NaCl，0.02％NaN3)中稀释血清而制备。在20-23℃孵育至少1小时。杂交以更换三次PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)洗，每次1分钟。二级抗体溶液通过在杂交缓冲液中稀释羊-抗兔IgG碱性磷酸酶交联的偶合物抗血清(Pierce，Rockford，IL)而制备。在相同的条件下继续孵育至少1小时。杂交按以前冲洗并用一步NBT/BCIP底物(Pierce，Rockford，IL)检测。
实施例13免疫原性组合物的制备
纯化的VLP′s根据已知的方法，如通过添加药物上可接受的载体、稳定剂、或疫苗佐剂而制备。通过结合生理上可接受的组合物如，PBS，盐水或蒸馏水可制备本发明免疫原性的VLP′s供疫苗使用。为了获得必要的免疫原性效应，免疫原性VLP’s以约0.1-100mcg，优选为约1～约20mcg的剂量施用。每种制剂中VLP的量可根据各种因素，包括但不限于个体的身体状况，体重、年龄和性别而变化。VLP制剂的施用可通过各种途径，包括但不限于口腔、皮下、局部、粘膜和肌肉内。这种VLP制剂可包括单一型的VLP(即，来自HPV11的VLP)或VLP′s混合物(即，来自HPV6、HPV11、HPV16及HPV18的VLP′s)。
抗菌防腐剂，如乙汞硫代水杨酸钠，可以任选存在。如果必要，本发明的免疫原性抗原可与疫苗稳定剂和疫苗佐剂联合使用。典型的稳定剂有特异性的化合物，如多价阴离子，如肝素，肌醇六硫酸酯，硫酸化的β-环糊精，较少特异性的赋形剂如，氨基酸、山梨醇、甘露醇、木糖醇、甘油、蔗糖、葡聚糖、海藻糖和在溶液状态，如中性pH、高离子强度(大约0.5-2.0M盐)二价阳离子(Ca2+，Mg2+)的变通。佐剂的实例有Al(OH)3和Al(PO4)。本发明的疫苗可冷冻保存或以冻干形式保存。
实施例14抗VLP抗体的制备
纯化的VLP用于产生抗体。这里使用的术语“抗体”既包括多克隆又包括单克隆抗体以及其能结合抗原或半抗原的片段，如Fv，Fab和F(ab)2片段。该抗体用于各种方法中，包括但不限于重组VLP的纯化、天然L1或L2蛋白的纯化，和试剂盒。试剂盒将包括适于以密闭方式容纳至少一个容器的分隔化承载体。该承载体将进一步包括试剂如抗-VLP抗体或适于检测HPV或HPV片段的VLP或抗HPV抗体。该承载体也可含有用于检测的手段如标记的抗原或酶底物等。抗体或VLP或试剂盒用于多种目的，包括但不限于法庭分析和流行病学研究。