血小板替代物和适于其制备的缀合方法 【发明领域】
本发明涉及血小板替代物，即含有纤维蛋白原的组合物，并且还涉及特别是将纤维蛋白原结合列特定的载体上的缀合方法。
【发明背景】
含有活性药物和载体的共价结合的缀合物可用作将药物运送到例如特定的作用位点的手段。已有人提出将白蛋白作为这种载体。WO-A-9618388公开了白蛋白微颗粒、其制备方法以及作为载体的用途。
大分子和蛋白对人血清白蛋白微胶囊(HSA)的共价连结会产生许多问题。由于蛋白和微胶囊表面的接触不好，因此不能获得足够的结合位点来进行交联。而且，当使用短的或零长度的交联剂例如乙醇醛或EDC时，分子内交联要比分子间交联难控制。这会使微胶囊的装载量很低并且会使蛋白失活。
Agam和Livne在一系列论文Blood 55：186-191(1983)、Thromb.Haemostasis 51：145-9(1984)和59：504-6(1988)、和Eur.J.Clin.Invest.(1991)中提出，包被在固定的血小板上的纤维蛋白原会增加血小板的聚集，在患有血小板减少症的大鼠中，包有纤维蛋白原的红细胞使出血时间缩短。固定法包括使用甲醛的方法。
Coller等人在J.Clin.Invest.89：546-555(1992)中描述了“凝血红细胞”，它是一种自体固有的、半人造地血小板输血替代物。为了避免使用新鲜的血小板所带来的局限性和缺陷，使用双官能交联剂将红细胞结合在含有RGD细胞识别序列的肽上。
在血栓形成和止血国际协会第XV次会议(1995年六月11-16日在Jerusalem，Israel举行的)的摘要中，Yen等报告了有潜在止血能力的“凝血球”，即交联的HSA微球，平均直径为1.1-1.3μm，其中人纤维蛋白原共价结合在其表面上。在血小板减少症兔子模型中，耳朵出血时间缩短了。据报道这种HSA微球是用US-A-5069936中的方法制备的，即用戊二醛作为交联剂的溶解/去溶剂化过程，使用乙醇来沉淀，加入表面活性剂来修饰交联蛋白分子的表面。这些步骤不能控制微球的大小，可能使结合蛋白降解，并且不适于大批量生产血小板替代物。
US-A-5069936公开了不同生物分子的共价结合，但是没有包括纤维蛋白原。其提出用聚醛作为共价交联剂。实施例12和14分别用戊二醛来结合抗体和酶(碱性磷酸酶)。
WO-A-9639128(在1996年12月12公开)也公开了“凝血球”。但是没有提供具体的制备例。
纤维蛋白原是含有RGD(S)序列的粘着性糖蛋白。它和其它糖蛋白(包括纤连蛋白和胶原)可介导癌细胞结合到内皮下层上。这些糖蛋白与在癌细胞中发现的整联蛋白如纤连蛋白受体和血小板上的GPIIb/IIIa受体相互作用；参见Dardik et al，Int.J.Cancer 70：201-7(1997)。
对癌症进行手术治疗的一个主要问题是会增加癌细胞向循环系统扩散的危险性。这是患有前列腺癌的病人手术后发病率增加的原因之一。人们希望消除癌细胞在循环系统中的转移，或抑制其在血管表面的沉积。
发明简述
根据本发明的一个方面，一种将肽(表示任何肽、多肽、蛋白或其缀合物)如纤维蛋白原结合到微胶囊上的新方法允许蛋白和微胶囊之间插入间隔物(例如小肽或脂肪酸)。更具体的是，本发明利用了这一事实，即载体如HSA含有游离巯基，双官能化合物能与其反应，其中双官能化合物含有能与要结合的活性组分(药物)选择性反应的基团。
根据本发明，可使交联反应被控制，这是因为载体如HSA上的游离巯基的连接基团具有特异性。可控制的交联反应是本发明的一个重要方面，因为其与结合分子的活性直接相关。
根据应用的需要，间隔物可包括可被酶裂解的肽、易于被酸或碱裂解的键，并且具有不同的长度。间隔物的长度可以是本发明的另一重要方面，因为它可以决定与靶受体的结合能力，例如纤维蛋白原结合GPIIb/IIIa的结合能力。
根据本发明的另一个方面，例如通过使用这种新方法，提供了一种可用作血小板替代物的新的可药用产品。这种产品含有与纤维蛋白原结合的、基本上不使纤维蛋白原的活性丧失的不溶性载体，例如被稳定的白蛋白。结合可以是非化学结合，例如通过吸收作用的结合，或化学结合，例如使用长至少10nm的连接体来进行的结合。
本发明第一次提供了纯的、稳定的、治疗可接受的血小板替代物。纯化可在没有化学交联剂和/或表面活性剂的条件下实现。这些血小板替代物适于治疗血小板减少症。
本发明的另一个特点是由于将纤维蛋白原用作靶试剂，本发明的产品可用于结合其它活性物质。这类物质的选择与作用部位(通常是伤口处或其它出血部位)以及所明确的问题的性质有关。发明描述
本发明使用的载体优选在能使粒径和粒径分布得到良好控制的条件下通过喷雾干燥来制备。例如，为了使颗粒能穿过毛细血管，优选的粒径最大为6μm，例如1-4μm。
WO-A-9218164、WO-A-9615814和WO-A-9618388完全公开了合适的材料和制备方法，以及通过加热或化学交联来稳定微颗粒的方法，这些专利在本发明中引作参考。正如在后面的公开物中所解释的那样，所描述的条件不影响官能团，例如白蛋白的巯基，因此官能团仍保持着与生物分子反应的能力。
本发明使用的微颗粒可具有在上述两篇出版物中描述的物理学特性，例如是光滑的和球形的，并且含有空气。为了获得不溶性、交联的微胶囊，可将喷雾干燥产物与化学交联剂反应。然而，加热和γ-辐射是优选的，还可以将干粉产物进行灭菌处理。
在本发明的一个实施方式中，可在没有连接体的条件下将纤维蛋白原(或其它RGD肽)结合到载体上，例如通过吸收作用。这可通过将肽沉淀列微球的表面上来实现，例如通过控制pH值和其它条件，这对本领域普通技术人员来说是显而易见的。然后将过量/未结合的纤维蛋白原洗掉。
在本发明的另一个实施方式中，使用常规的双官能试剂如聚醛来使纤维蛋白原结合到载体上。乙醇醛是优选的。间隔物的另一实例是4-(碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基丁二酰亚胺酯(水不溶性)。其长度约为1nm。
在本发明的第一个方面所述的结合步骤中，结合肽优选至少包括纤维蛋白原。其它实例有凝血因子VIII、凝血因子IX、其它血液因子、凝集级联反应(coagulation cascade)蛋白、血栓溶解剂、抗体、α-1-抗胰蛋白酶。通过将例如纤维蛋白原和凝血因子VIII联合使用，本发明的产品能有效地治疗血友病。此外，或作为替代物代替溶解血栓的药物如尿激酶，用超声来处理血凝块。对于这种处理，本发明中含有空气的微胶囊是特别合适的。
本发明中使用的双官能化合物(如Y1-Y-Y2)可通过将较简单的化合物Y1-Y3-Y4与Y5-Y6-Y2反应来得到，其中Y1是巯基-特异性反应基团，Y4和Y5一起反应使得Y3和Y6一起形成间隔基团Y，Y2是药物反应基团。因此，例如在ICH2COOH中，Y1是巯基反应团I和/或Y4是COOH。更具体地，加入EDC(可加入N-羟基丁二酰亚胺来促进EDC催化的酰胺化反应，反应生成活泼的丁二酰亚胺酯)可使碘乙酸活化。然后将被活化的物质与肽或含有游离氨基(Y5)和末端羧基(Y2)的分子一起温育。合适的肽含有如3-6个氨基酸如甘氨酸或丙氨酸。
然后用EDC活化中间体缀合物上的羧基。将活化的间隔物与蛋白一起培养，则间隔物上的羧基与蛋白侧链上的赖氨酸的氨基形成了一个肽键。间隔物上只有一端能结合到蛋白上，因此，此时没有发生交联反应。大多数血清蛋白不含有游离巯基，但HSA是个例外，因此避免了发生蛋白分子内交联。
例如，间隔物含有能选择性地与位于HSA微胶囊的半胱氨酸-34残基上的游离巯基反应的N-末端碘乙酰基官能团。间隔物还可以含有能被例如1-乙基-3，3-二甲氨基丙基碳二亚胺(EDC)活化、并且能连在肽的氨基上的游离羧基。
用EDC来活化间隔物可在pH为6、0.05M 4-吗啉代乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)中进行。为了避免发生任何纤维蛋白原的吸收作用，一旦纤维蛋白原已经与活化的N-碘乙酰基肽如Gly-Leu-Phe反应，立即将缓冲液换成pH为8的0.1M硼酸钠缓冲液。在此较高的pH下不会发生纤维蛋白原的吸收作用。纤维蛋白原与HSA微胶囊的任何结合都是由于，HSA微胶囊的游离巯基与间隔物N-末端上的碘分子所毗连的碳原子反应的结果。巯基-碘相互作用的最佳pH值是8。
为了增强纤维蛋白原(例如)经间隔物与微胶囊的结合，可使用Traut试剂(2-亚氨基四氢噻吩)来增加微胶囊游离巯基的含量。这种试剂将赖氨酸上的ε-氨基变成巯基，使得可与间隔物结合并且因此与纤维蛋白原结合的游离巯基的数量增加了。
通过在与要结合的蛋白结合之前，将含有巯基的氨基酸或肽(例如半胱氨酸、还原的谷胱甘肽)交联在微胶囊上，可增加微胶囊的载量。可使用化学交联剂如亚氨基四氢噻吩(imiothiolane)来引入疏基(和增加其数量)。如果其它蛋白表面上被引入巯基的话，也可以用它们来制备微胶囊，以作为利用其具有HSA所固有的特性(即游离巯基)的替代物。
将蛋白和间隔物与含有游离巯基的HSA微胶囊一起温育。在WO-A-9615184和WO-A-9618388中描述了通过喷雾干燥制备这种官能团没有损失的微胶囊的方法。
间隔物与蛋白之间的摩尔比应高列能使足够的基团结合到蛋白上与微胶囊交联，但是也应低至不使蛋白失活的程度。用这种具体的方法制备到了间隔物ICH2CO(A)nCOOH，其中(A)n代表n个相同或不同氨基酸的残基。根据具体应用，选择n来控制间隔物的长度，例如10-600nm(1-60埃)，通常是至少50nm。
上述制备步骤可在主要是基于水的溶剂系统中进行。反应生成的副产物可容易地除去。
交联技术应当能可控制地把肽和蛋白连在微胶囊上，较好地保持蛋白的活性，并且能调节间隔物的长度和分裂度。
如上所述，本发明中含有纤维蛋白原的产品可在肿瘤位点起作用。因此，通过例如用本发明中的特定方法或如WO-A-9618388所述的方法连接上细胞毒性剂，这些产品可用于治疗肿瘤。合适的细胞毒性剂包括氨甲蝶呤、阿霉素、顺铂或5-氟-2’-脱氧尿苷。
通过将本发明的产品作为载体使用来直接与细胞作用或参与纤维蛋白在细胞附着位点的聚集和沉积，药物可对肿瘤细胞进行靶攻击。
本发明的产品可用于负载细胞毒性剂或联合负载细胞毒性剂和靶向试剂。还用于对分散在循环系统中的肿瘤细胞进行靶攻击，这是通过与细胞的糖蛋白受体进行特异的相互作用(寻找并且破坏)或通过参与在附着位点上进行的血小板聚集过程来实现的。在这两种情况下，细胞毒性药物都集中在攻击肿瘤细胞的位点。
或，通过将本发明的产品包裹在肿瘤细胞的表面，并且阻断激活血小板的位点/机制，也可以抑制肿瘤细胞在循环系统中或甚至在附着位点上的聚集。因此这使得人体的天然防御系统能帮助消除肿瘤细胞。
也可传输含有例如GPIb受体(与Von willebrands因子相互作用)或者胶原或其它内皮下基质组分的受体的产品，以通过将内皮下基质覆盖来潜在地阻断肿瘤细胞的结合位点。本发明的产品应当保持在伤口位点上使其与血小板相互作用，但是也应限制任何被固定的肿瘤细胞侵入血管壁。
本发明的一个重要优点是纤维蛋白原(或其它RGD肽)的活性可基本保持。可通过血纤维蛋白肽A(FPA)的ELISA测定来确定活性纤维蛋白原的含量。
在FPA的分析中，将恒定量的过量血纤维蛋白肽A抗体与样品(或标准样品)一起温育，结果生成了抗原-抗体复合物。剩余的过量抗体的浓度与样品(或标准样品)中FPA的量成反比。
为了测定抗体的浓度，将等分级分的培养物转移到涂有过量FPA的反应器中，随后进行温育。获得的壁-结合的抗原-抗体复合物与用过氧化酶标记的抗-lgG抗体形成了夹心复合物。用这些复合物的量可直接测定出样品中FPA的浓度。
通过过氧化物酶与H2O2/邻苯二胺(发色体)的酶反应和随后在492nm进行的分光光度测定，可测定获得的夹心复合物的量。由于结合的酶的活性与抗原浓度成反比，因此当样品中FPA的浓度增加时，所测得的吸光度就会减小。用浓度已知的标准样品建立一条参照曲线，对测定结果进行求值。
本发明的血小板替代物通常含有至少0.01％、优选至少0.015％、更优选至少0.02％、最优选至少0.025％的活性纤维蛋白原。为了避免聚集，纤维蛋白原的含量不能太高，例如高达1、1.5、2或2.5％。对于所含有的纤维蛋白原，应当至少有50％、优选至少70％、更优选至少90％是有活性的。活性纤维蛋白原的含量可根据纤维蛋白原的总含量来测定，而纤维蛋白原的总含量又可用如ELISA的方法来测定。纤维蛋白原的总含量还可通过用放射标记例如用125I来测定，并且用常规方法计算。
纤维蛋白原可以是源自血液的、转基因的或重组的、其全长的或任何有活性的片段。其活性片段已被公开，特别是被上述的Coller等人公开。
作为治疗剂，本发明的产品可以以其本身、或与本领域普通技术人员所知的合适的载体混合来给药。产品给药的量主要是根据创伤或其它要治疗的疾病的严重程度来确定的。剂量一般是1.5×109个微胶囊/kg体重。
下面的实施例是对本发明的举例说明。
实施例中使用的纤维蛋白原是全长的、源自血液的、商业上可获得的、进行过两次病毒灭活的产品。
实施例中使用的HSA微胶囊是通过喷雾干燥制备的，并且随后通过加热来使其稳定，(如WO-A-9615814所述)。在使用前，将微胶囊用1％吐温80浸润，然后用PFPW充分洗涤以除去吐温80和赋形剂。
PFPW＝不含热原的纯化水。
DTNB＝5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。
用DTNB进行Ellman分析来测定游离巯基的含量。这种试剂参与测试蛋白中游离巯基的巯基交换过程，并且释放可在412nm处进行UV/VIS分光光度测定的物质(TNB)。实施例1
在甲醇和蒸馏水的混合液中，碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(IAAE)与四丙氨酸(AAAA)室温下反应1小时。与蒸馏水中的AAAA相对照，以1.2摩尔的比例加入EDC，时间为5分钟。然后加入重新悬浮在蒸馏水中的纤维蛋白原。室温搅拌1小时，加入微胶囊，混合物在室温下继续搅拌16小时。
为了除去所有未反应的纤维蛋白原和间隔物，反应后用蒸馏水洗涤微胶囊共6次，再把微胶囊悬浮在蒸馏水中，得到的最终微胶囊浓度为100mg/ml。
与微胶囊(20mg)相比，计算出纤维蛋白原(54mg)的用量为0.5摩尔当量。这被认为是在微胶囊中游离巯基含量可能的得到最大装载量。
ELISA结果显示：每100mgHSA载有纤维蛋白原0.5mg。用5mg标记的微胶囊和0.15单位凝血酶进行的玻片试验得到阳性结果。加入凝血酶后立即发生聚集。
在没有IAAE、AAAA或EDC存在的情况下，还应用同样量的微胶囊和纤维蛋白原进行了对照试验。该样品的ELISA结果显示：每100mg HSA中载有纤维蛋白原0.06mg。这是在没有应用交联剂的情况下发生的。该样品也给出阳性的玻片试验结果，但一直到加入凝血酶12秒钟后才出现聚集。实施例2
重复实施例1中的步骤，但为了优化IAAE和AAAA的反应，接着应用反相HPLC。为此，有必要研究当把所有IAAE转变成产品时所需要的AAAA量。所有未反应的IAAE可能参加进一步合成中不需要 的副反应。因此，反应的AAAA量从1增加到4摩尔当量，而保持IAAE的用量不变。实施例3
重复实施例1的步骤，但为了研究给定量纤维蛋白原所需要的间隔物量，应用IAAE与AAAA的比例为1∶4，并应用相对于AAAA的1.2摩尔当量的过量EDC。应用存在的IAAE的摩尔数计算出所用的间隔物用量，因为IAAE是制备间隔物的活性组份和限定因素。这样，IAAE-AAAA-EDC与纤维蛋白原的比例从1∶1增加到1∶5。
ELISA结果表明：当纤维蛋白原与IAAE-AAAA-EDC的比例是1∶2时，能可再生地得到最高装载量的纤维蛋白原。计算出每100mgHSA中载有0.06克纤维蛋白原，应用玻片试验时样品在5秒钟内发生聚集。实施例4
在进一步的优化实验中，重复实施例1但减少纤维蛋白原的量。改变IAAE-AAAA-(EDC)-纤维蛋白原与微胶囊的比例，分别是0.5，0.3，0.1，0.05和等当量。
ELISA结果表明：除1∶0.01的比例外，所有样品具有可接受的纤维蛋白原装载量。样品的变化范围是每100mg HSA中有0.1-0.2mg纤维蛋白原，实验显示：减少纤维蛋白原到仅仅0.05摩尔当量时，得列高达0.5摩尔当量的装载值。实施例5
由于实施例4所得到的结果是非常统一的，因此进行了两个实验。表1显示：在第一个实验中研究纤维蛋白原装载的用量，所用的物质比例如下：
IAAE∶AAAA(1∶4)
IAAE-AAAA-EDC∶纤维蛋白原(2∶1)
IAAE-AAAA-(EDC)-纤维蛋白原∶微胶囊(0.3∶1)
表2概括第二个实验中所需要的量，该实验各物质用量同第一个实验，但作了下列改变：
IAAE-AAAA-(EDC)-纤维蛋白原∶微胶囊(0.05∶1)
表1 试剂 用量 纳摩尔数 IAAE 52μg 182 AAAA 210μg 695 EDC 160μg 834 纤维蛋白原 31mg 91 微胶囊 20mg 303
表2 试剂 用量 纳摩尔数 IAAE 8.6μg 30.4 AAAA 35μg 115.8 EDC 26.6μg 139 纤维蛋白原 5.2mg 15.2 微胶囊 20mg 303
在这两个实验中，在pH8的0.1M磷酸钠和0.15M氯化钠的缓冲液中，微胶囊与间隔物室温下反应16小时。然后用PFPW充分洗涤微胶囊，再使微胶囊重新悬浮得到浓度为100mg/ml的最终微胶囊。
比例为0.3和0.05的样品得到的ELISA结果显示：在每100mgHSA中，它们分别载有0.38和0.42mg纤维蛋白原。两种样品的玻片试验结果均给出阳性结果，并在加入凝血酶约两分钟后发生聚集。实施例6
制备1mg/ml四丙氨酸。称取3mg四丙氨酸(Sigma)加入到7ml的螺帽小玻瓶中，溶入3ml PAPW，旋涡振荡混合。
制备3mg/ml碘乙酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯(IAAE)。称取3mgIAAE(Sigma)加入到7ml螺帽小玻瓶中，溶入1ml甲醇，旋涡振荡混合。
把70μl四丙氨酸移液到7ml螺帽小玻瓶中，在把5.7μl IAAE移入其中，旋涡振荡混合。IAAE与四丙氨酸的摩尔比为1∶4。
用葡萄糖配制2.3g微胶囊。混合物由大约800mg蛋白质和1600mg葡萄糖组成。在1％(v/v)的吐温80(Sigma)中制备浓度为50mg/ml的蛋白质。
上述内容物旋涡振荡混合，室温下静置约30分钟，使微胶囊下沉。取400μl等份量加入到Eppendorf中，旋涡振荡混合。室温下在BeckmannGS-15中使该样品以3000rpm的速度离心2分钟(相对离心力RCF＝1502弧度/秒)。然后用1ml的PFPW洗涤3次。得到的粒状物室温保存到需要时为止。
在20ml 0.1M生理盐水/0.025M磷酸钠缓冲液(pH7.2)中重新配制成一小瓶人纤维蛋白原，产生纤维蛋白原的理论浓度为60mg/ml。加入4ml缓冲的35％(w/v)的PEG溶液制成相对于PEG1000的5.8％(w/v)的纤维蛋白原溶液。仅仅通过倒转混合得到的溶液，然后在冰块上冷却15-20分钟。离心得到的沉淀物(4000rpm，4分钟，BeckmanGS15)。移去上清液并测量其体积。
加入7％(w/v)PEG/0.1M生理盐水/0.025M磷酸钠缓冲液(pH7.2)洗涤粒状物。应用一半体积的起始的原纤维蛋白原洗涤该粒状物。该粒状物重新悬浮在缓冲液中，并用cuvette搅拌器混合。得到的溶液以4000rpm的速度离心4分钟。从洗涤的粒状物中移去上清液并测量体积。在20ml 0.025M磷酸钠缓冲液/0.1M生理盐水(pH7.2)中重新组成粒状物。测量纯化的纤维蛋白原溶液体积。应用BCA分析确定总蛋白浓度。在280nm处读取紫外吸收计算出纤维蛋白原的浓度。由于已知1％(w/v)的纤维蛋白原溶液在波长280nm处的消光系数为15.5，因此可计算出纤维蛋白原的浓度。(参见Haemostasis and Thrombosis第1卷，第3版，492页，R.F.Doolittle)。
在PFPW中，制备新鲜的1mg/ml EDC。称取3mg EDC(Sigma)加入到7ml螺帽小玻瓶中，再溶入3ml PFPW。旋涡振荡混合。从混合器中移去含有已反应间隔物的螺帽小玻瓶。取53μl EDC加入到反应混合物中。EDC与四丙氨酸的摩尔比为1∶1.2。旋涡振荡混合约5分钟。
加入10.3mg纤维蛋白原，在258μl中以40mg/ml。纤维蛋白原与HSA微胶囊的摩尔比是0.1∶1。IAAE与纤维蛋白原的摩尔比是2∶1。倒转该螺帽小玻瓶并混合约60分钟。
把20mg洗过的微胶囊重新悬浮在缓冲液中，即pH为8的0.1M磷酸氢二钠/0.15M氯化钠缓冲液中。用12N的盐酸调整pH值。在微胶囊中加入613μl缓冲液。再把它加入到387μl反应混合物中。这样得到最终体积为1ml。室温下搅拌过夜。该反应约16小时。
从搅拌盘中移去螺帽小玻瓶。以4500rpm的速度离心1分钟(RCF＝3379弧度/秒)。移去上清液进行ELISA分析。
在1ml PFPW中洗涤pellet共6次。同时保存洗涤液使ELISA确定重量平衡。粒状物重新悬浮在200μl PFPW中。为ELISA(100μl)和玻片试验测定(100μl)提供样品。
产品样品在4℃下保存。实施例7
制备1小瓶调配的微胶囊，其含有约1g蛋白质和2g甘露醇。照射后的小瓶在4℃下储存。在1％(v/v)吐温80中制备50mg/ml浓度的蛋白质。旋涡振荡混合该内容物，室温下静置约30分钟，沉淀出空胶囊。
对于1g制剂，把20ml等分物在旋涡振荡混合后加入到50mlBeckmann离心管中。室温下以5000rpm的速度在Beckman Avanti J-25上离心3分钟(相对离心力RCF＝4648弧度/秒)。然后用20ml的PFPW洗涤2次，同时在室温下以3300rpm的速度离心2分钟(RCF＝2025弧度/秒)。
最后用20ml 10mM磷酸缓冲液(pH＝6.0)洗涤微胶囊，室温下以3300rpm的速度离心2分钟。该粒状物重新悬浮在20ml的10mM磷酸缓冲液(pH6.0)，然后转移到带有电磁搅拌器的70ml Sterilin容器中。
在WFI中再生纤维蛋白原产生理论的纤维蛋白原浓度为40mg/ml。在滚筒混合器中轻轻搅拌悬浮液20分钟。过量纤维蛋白原在低温nalgene小瓶中急剧冷冻并储存(-20℃)。
对于1g制剂，在搅拌下把纤维蛋白原(0.25ml，浓度40mg/ml)加入到微胶囊中。纤维蛋白原与HSA微胶囊的摩尔比是0.002∶1。混合物搅拌约4小时。
从搅拌盘中移开容器，把内容物转移到50ml的Beckmann管中。室温下以3300rpm的速度离心2分钟(RCF＝2025弧度/秒)。弃去上清液。在20ml的WFI中洗涤粒状物3次。弃去洗涤液。应用WFI使该粒状物重新悬浮至10ml。提供500μl样品用于ELISA、玻片试验测定和库尔特粒度测定。
完成库尔特粒度测定时，加入原甘露醇(153mg/ml)和原磷酸缓冲液(250mM)配制样品，达到等渗甘露醇(51mg/ml)，25mM磷酸缓冲液(pH7.0±0.2)和微胶囊数目为1500兆/毫升。实施例8
把HSA微胶囊(50mg，0.757μ摩尔)重新悬浮在pH8.05的0.1M硼酸钠缓冲液(832μl)中，再加入溶解在pH8.05的0.1M硼酸钠缓冲液(168μl)中的2-亚氨基四氢噻吩(520μg，3.78μmol)。室温下搅拌反应物1小时，然后用蒸馏水洗涤微胶囊(5×5ml)。最后用pH8.05的0.1M硼酸钠缓冲液洗涤，并重新悬浮在同样的缓冲液中(2ml)。对照
纤维蛋白原(20mg，0.058μmol)重新悬浮在pH6.03、0.05M的MES缓冲液(1.2ml)中，室温下搅拌2小时。在pH8.05(2ml)、0.1M硼酸钠缓冲液(2ml)中加入HSA微胶囊(50mg，0.757μmol)。在室温下继续搅拌反应2小时。实施例
N-碘乙酰Gly-Leu-Phe(3mg，5.95μmol)重新悬浮在pH6.03、0.05M的MES(1.2ml)中，加入EDC(2mg，10.4μmol)，室温下搅拌反应5-7分钟。加入纤维蛋白原(20mg，0.058μmol)，室温下搅拌混合物2小时。加入含有HSA微胶囊(50mg，0.757μmol)的pH8.05、0.1M硼酸钠缓冲液(2ml)，在室温下继续搅拌反应2小时。
从每个对照和实验反应中移去样品用于游离硫羟基测定。用蒸馏水(2×5ml)洗涤剩余的对照和实验物质，然后重新悬浮达到HSA微胶囊的浓度为100mg/ml。
在该实施例中，HSA微胶囊中游离硫羟基的含量增加，每纳摩尔HSA含有的SH从0.211纳摩尔增加到1.73纳摩尔。未看到对照样品(没有间隔物)活性有任何影响。然而，经修饰的微胶囊和已经与间隔物共同培养的纤维蛋白原反应时，通过玻片试验得到了活性样品。玻片试验活性增加到5-15秒，并且HSA微胶囊有更高含量的游离硫羟基。运表明：增加游离HSA微胶囊游离硫羟基的含量导致最终产品的活性增加，这是由于增加间隔物的结合因此达到这样的纤维蛋白原。实施例9
EDC(69.8：1，0.5mg/ml水溶液)加入到N-碘乙酰基四甘氨酸(125.5：1，0.5mg/ml水溶液)，室温下搅拌该混合物5分钟。加入纤维蛋白原(186：1，55.5mg/ml溶液)，反应在室温下搅拌1小时。
载有阿霉素的微胶囊，在每摩尔HSA中含有0.56摩尔药物(100mg)，重新悬浮在1.619ml水中，将其加入到活化的纤维蛋白原溶液中。室温下搅拌混合物16小时。
以3500rpm的速度离心2小时，弃去上清液收集微胶囊。微胶囊用水洗涤(4×5ml)，重新悬浮在lml水中，得到最终的HSA浓度约100mg/ml。
测定样品的活性，发现纤维蛋白原的加入并不导致微胶囊中任何阿霉素的损失。并且这种双重装载的微胶囊显示凝血酶的活性，这表明：尽管阿霉素的存在，结合的纤维蛋白原还保持活性。应用ELISA测定存在的纤维蛋白原水平。这些结果显示合理装载的纤维蛋白原。