治疗组合物的制备 发明背景
1.发明领域
本发明涉及具有包含与寡核苷酸共价结合的多肽的结构并且可用作免疫调节剂的新型化合物，所述化合物可用来治疗各种病毒感染和免疫系统疾病。
2.相关技术的描述
由蛋白胨、肽、蛋白质和核酸组成的抗病毒剂的概念起源于1934。在经过若干年的实验之后，这样的抗病毒剂通过应用牛血清白蛋白并结合蛋白胨和核糖核酸而被修饰，产生无毒、无过敏原特性且容易与组织液和血清混合的抗病毒生物环境因子。所使用的因子被称为“脂肽-核酸化合物”1，由Chemico Laboratories，Inc.注册，商标为RETICULOSE(Physician Desk Reference，第651页，1960)。据报道RETICULOSE可作为抗病毒剂，用来治疗各种人类病毒感染，例如流感、疱疹、甲型肝炎和乙型肝炎。于是认为RETICULOSE至少通过增加白细胞生成、抗体合成和增强吞噬作用而作为抗病毒剂发挥作用。在美国最早于1964允许销售RETICULOSE。
RETICULOSE的生产方法一直由生产商作为商业秘密而保密，直到美国专利5,849,196公布为止，所述专利公开了RETICULOSE的生产方法。
正如在美国专利5,849,196中所公开的，用来生产RETICULOSE的原料按重量计由40-50％酪蛋白、1-10％血白蛋白、15-40％牛肉蛋白胨、10-25％RNA和5-25％氢氧化钠组成。将这些原料悬浮于水中，得到蛋白质(酪蛋白、蛋白胨和血白蛋白)与水的比率按重量计约等于4.3-100。在所述原料混合物经高压灭菌处理之后，将所得的溶液过滤，调pH至约8.5，然后至7.8，此后将中和溶液再次过滤。在将溶液稀释后，将pH进一步调至约7.5。这样的过程得到肽和核酸的混合物，其分子量在约1-25KDa的范围内。
正如美国专利5,849,196所公开的，RETICULOSE常规组成中高于15KDa的组分在治疗诸如HIV、流感病毒、单纯疱疹病毒等的病毒性疾病时更加有效，而约1-15KDa范围内的组分可作为吞噬作用抑制剂发挥作用。
然而，常规方法有多个缺点：1)所述方法并不保证每次制备产生具有相同比率地终组分，从而产品是不可再现的；2)常规方法产生各种各样的终组分，如果可能的话，使得生产的质量控制变得极其困难，因为太多参数需要测定；3)高分子量组分例如25KDa组分(从本质上讲为肽)的存在，增加超敏反应或免疫反应的危险，使得产品稳定性较低。因此，最好具有避开常规RETICULOSE缺陷而同时保持其治疗特性的产品。最好从这样的产品也能鉴定并分离出有效成分或组分，以便可以进一步研究制品R的作用模式，从而可以开发出新的治疗药。
发明概述
因此，本发明的一个目的涉及从美国专利申请顺序号09/344,095中介绍的组合物—制品R中鉴定并分离的新型化合物。所述新型化合物具有包含与寡核苷酸共价结合的多肽的结构。
本发明的另一个目的涉及一种表现出治疗效应的新型肽。
本发明的再一个目的涉及这些新型核苷酸-肽和/或肽化合物的治疗应用，可用来治疗诸如病毒感染或免疫系统障碍的疾病。
根据以下详述并结合附图考虑，本发明的其它目的和特征将变得显而易见。然而，应该知道设计的附图仅仅是为了说明本发明，而不是用来限制本发明，本发明仅受所附权利要求书的限制。还应该知道附图不一定是按照比例绘制，除非另有说明，它们仅仅用来概念性地说明本文中描述的结构和方法。
附图简述
在图中：
图1显示制品R的代表性紫外吸收分布图；
图2显示从反相HPLC分析获得的制品R的代表性色谱图；
图3显示制品R的BioGel P-2分级分离图；
图4显示在16％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离的BioGel P-2分级分离图中级分I的组分；
图5显示在16％SDS-PAGE上分离的制品R的两种主要肽组分的相对质量(Mr.)；
图6是16％SDS-PAGE，显示各种各样的分解代谢酶对制品R的影响；
图7是一幅流式细胞术频率分布图，显示制品R对葡聚糖-FITC吞噬作用的影响；
图8是一幅流式细胞术频率分布图，显示制品R对葡聚糖-BoDipyFL吞噬作用的影响；
图9是肽-A的质子NMR谱；
图10是肽-A的碳/氢HSQC谱；
图11是肽-B的质子NMR谱；
图12是肽-B的磷-31 NMR谱；
图13是肽-B的碳/氢HSQC谱；
图14是肽-B的C-13 NMR谱；
图15显示肽-B的结构；
图16显示肽-B中丝氨酸18和二核苷酸之间的键合性质；
图17显示与二核苷酸连接的肽的通用结构；
图18是肽-B的质谱数据；
图19显示制品R肽组分浓度对U937细胞分泌IL-8和MCP-1的影响；
图20显示制品R的分离肽A和肽B对U937细胞分泌IL-8和MCP-1的影响。
目前优选实施方案的详细描述
制品R的制备
一般而言，制品R依照以下方法来制备。
首先，将原料酪蛋白、牛肉蛋白胨、RNA、BSA和氢氧化钠按比例按重量计为35-50％(酪蛋白)、15-40％(牛肉蛋白胨)、10-25％(RNA)、1-10％(BSA)和5-25％(氢氧化钠)悬浮于合适体积的蒸馏水中。所有原料都是可常规获得的，或者可以容易地由本领域技术人员制备。虽然任何RNA都适用于本发明的计划目的，但是优选植物RNA，最优选酵母RNA。总蛋白与蒸馏水量之比一般约1.5-2.5至约100(重量)，优选约2.2至约100(重量)。这意味着每次将1.5-2.5克总蛋白悬浮于约100毫升蒸馏水中。
一般而言，所有原料或者是市售的，或者可以容易地由本领域技术人员制备。
然后将如上制备的悬浮液在以下条件下高压灭菌：在大约5-15lbs.、优选8-10lbs.的压力下，在例如约150-300°F、优选约200-230°F范围的升高温度下，在约2-10小时的时间内、优选超过3小时。正如本领域技术人员已知的，在这样的条件下，RNA可以完全水解成核苷酸。高压灭菌后，让溶液冷却至室温，然后让其在3-8℃的温度下静置至少12小时，以沉淀不溶性成分。或者，可以将冷却溶液在低于8℃的温度下离心，以除去沉淀。
然后使所得的溶液在诸如氮气或氩气的惰性气体、在约1-6psi的压力下通过2微米和0.45微米滤器过滤。以相似的方式，使溶液通过优选0.2微米致热原保留滤器再次过滤。
在上述过滤后，可以再让溶液冷却至3-8℃达至少约12小时，然后以与如上所述相同的方式再次过滤。
然后采用本领域技术人员已知的方法，例如Kjeldahl方法，J.G.C.D.Kjeldahl，Z.Anal.Chem.，第22卷，第366页(1883)及其改进方法，分析所得滤液的总氮含量。根据所述分析，然后将滤液用冷蒸馏水稀释至具有优选总氮含量在165-210mg/ml范围内的合适体积。
然后用HCl将稀释溶液的pH调节至生理上可接受的pH，优选至约7.3-7.6，此后，使稀释溶液在如上所述的惰性气体下通过0.2微米滤器再次过滤。
如此生产的制品R基本上含有来自RNA完全水解的低分子量核苷酸、核苷和游离核酸碱基及来自蛋白质部分水解的小肽。此外蛋白质的碱水解产生游离氨基酸也是可能的。
不用说过滤技术的应用可基本上除去细菌或者其大小与细菌相似或比细菌大的其它颗粒。因此，任何滤器无论其生产商或由其制得的材料都适用于计划目的。本发明方法中所使用的所有滤器对于本领域技术人员而言是非常容易获得的。
然后将终滤液在惰性气体下灌入合适的管形瓶中，例如2ml或10ml玻璃管形瓶中，然后封口。对于最终灭菌，将装料管形瓶高压灭菌，此后待用。
在使用时，如例如美国专利5,807,839、5,807,840和5,902,786中所述方法，将制品R胃肠外或局部给予有需要的患者，所述专利的内容通过引用全文结合到本文中。然而，制品R的应用并不限于上述专利中所公开的那些应用。
对制品R组成的分析揭示出，制品R含有两种主要成分，它们在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为具有分子量分别为5.2KDa和4.3KDa的两个条带，即肽-A和肽-B。肽-A是一种新的单肽，而肽-B包含一种与寡核苷酸共价结合的单肽。这两种组分的量按重量计基本相等。
对这两种组分的功能分析表明，它们两个均能够诱导U937细胞产生白介素-8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，尽管肽-B的活性比肽-A的活性高。这两种组分的组合活性与制品R相当，表明这两个肽-核苷酸组分可能是负责制品R的所有生物活性的关键成分。
制品R的表征
紫外吸收光谱：图1是在1cm光程长度石英微量比色杯(100μl容量)中采用Shimadzu Model UV-1201 UV-VIS分光光度计测量的制品R的代表性紫外吸收光谱。用蒸馏水将制品R稀释100倍。在220-320nm之间记录光谱，在260nm显示最大吸收，而在235nm显示波谷。260nm的吸光度(A)与280nm的吸光度之比为1.998(±10％)，而260nm的A与230nm的A之比为1.359(±10％)。
HPLC分布图：图2是采用Hewlett Packard 1100 HpLC系统(Hewlett Packard Co.)从反相HPLC分析获得的制品R的代表性色谱图，所述系统包括一个双泵(G1312A型)、一个二极管阵列检测器(G1315A型)、一个柱恒温槽(G 1316A型)、一个恒温自动进样器(G1329A型)、一个样品恒温槽和一个真空脱气器(G 1322A型)；以及一个不锈钢YMC-pack ODS-AQ S-5uM柱(YMC，Inc.3223 Burnt MillDr.，Wilmington，NC 28403)，柱的大小为250×10mm ID，孔径大小为120A。由0.1M乙酸∶三乙胺构成的流动相如下制备：将6.0ml冰乙酸溶于1000ml HPLC级水中。用三乙胺滴定搅拌的乙酸溶液至pH 4.8。让该溶液在室温下平衡过夜，然后通过0.45μM孔径大小和52mm直径滤器过滤。必要时，在使用前加入三乙胺，使该溶液的pH再调节至pH 4.8。通过HPLC流动系统中安装的真空脱气器，使流动相脱气。对于每次注射，通过自动进样器，将8μl制品R样品注射到温度设定在30℃的柱中。然后，用0.1M乙酸∶三乙胺流动相(pH 4.8)以1ml/分钟的速率在92-102巴的泵压力下，从所述柱等度洗脱样品。每个样品在160分钟时记录色谱图(260nm的UV吸光度)，通过二极管阵列检测器收集数据，然后运用Hewlett-Packard HPLC ChemStation软件对该数据进行分析。产生描记曲线图，运用SigmaPlot程序进行统计学分析。在这些条件下的反相HPLC产生13个特征性HPLC峰：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和M，每个峰都具有特征性UV吸收分布图(数据未显示)。
BioGel P-2凝胶过滤分布图：图3显示大小为2.6cm×55cm填充大小的BioGel P-2(Bio-Rad Laboratories Inc.)柱上制品R的分级分离图。将制品R上样至所述柱后，用0.1×PBS、优选无钙离子(Ca++)和镁离子(Mg++)的DULBECCO氏PBS以0.5毫升/分钟的流速洗脱该柱。1×PBS含有1.47mM KH2PO4、2.67mM KCl、138mM NaCl和8.1mMNa2HPO4 7H2O。让洗脱液通过″Uvcord SII″监测器，该监测器与REC101记录仪相连并且与254nm滤光片拟合，在″Frac 200″流分收集器中每个流分在12分钟时收集洗脱液。在这些条件下的凝胶过滤色谱法得到9个流分：I、Ia、II、IIa、IIb、III、IIIa、IV和IVa。将每个单独的峰与在表I中所示的相应流分体积相同或非常接近时洗脱的已知核苷酸、核苷和游离核酸碱基进行比较。具有相似值的已知化合物示于注释栏中。
表I
峰 实验值 注释
λ最大 λ最小 A260/A280 A260/A230
峰I ～275nm ～255nm 0.976 0.300 主要为肽和肽缀合
物
峰Ia ～260nm ～240nm 1.636 0.943 核蛋白和/肽核酸
峰Is ～270nm ～245nm 1.258 0.939 主要成分为CMP
峰IIα ～260nm ～230nm 2.893 3.12 主要成分为AMP、
UMP
峰IIβ ～250nm ～225nm 1.509 1.988 主要成分为GMP
峰IIa ～250nm ～230nm 1.257 1.176 混合组分
峰IIb ～270nm ～250nm 1.142 0.941 主要成分为胞苷
峰III ～260nm ～230nm 2.695 3.664 主要成分为尿苷
峰IIIa ～260nm ～225nm 5.15 4.24 主要成分为尿嘧
啶、腺苷
峰IV ～260nm ～225nm 5.406 3.892 主要成分为腺嘌呤
峰IVa ～245nm ～225nm 1.016 1.285 主要成分为鸟嘌呤
然后浓缩流分，在16％凝胶上通过SDS-PAGE(参见下文)对其进行分析。凝胶的银染色证明，仅流分I主要显示表观分子量为4.3KDa、5.2KDa的两条主要银染条带和次要7.6KDa条带，如图4中所示。
相对质量(Mr.)：图5显示在16％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离的并且采用NOVEX的′SilverXpress′染色试剂盒、依照生产商建议的方案通过银染色染色的制品R的两种主要肽组分的相对质量(分子量)。将制品R解析为表观分子量为约4.3KDa和约5.2KDa的两条主要银染条带。在过载的SDS-PAGE凝胶上也显现分子量约为7.6KDa的次要银染组分，可能有痕量的其它银染肽，其分子量在约5KDa至约14KDa的范围内。通用蛋白质染色—考马斯蓝对4.3KDa条带的染色非常弱。这三个条带-4.3KDa、5.2KDa和7.6KDa构成所述肽的约90％以上。因此，制品R基本上由分子量低于8KDa的分子组成。
表II显示所述5.2KDa和所述4.3KDa组分的氨基酸组成。在具有自动水解的PE Bio-system 420分析仪上，应用标准苯基异硫氰酸(PTIC)化学，对所述5.2KDa条带(样品A)和所述4.3KDa条带(样品B)进行氨基酸分析。
表II
氨基酸 样品A 样品B
Res/mol Res/mol
As(x) 1.01 2.03
Gl(x) 4.98 1.97
Ser 0.00 2.02
His 0.00 0.00
Gly 0.99 3.99
Thr 0.00 0.00
Ala 2.01 0.99
Arg 1.03 1.03
Tyr 2.04 2.05
Val 4.01 3.02
Met 1.02 0.00
Trp 0.00 0.00
Phe 1.05 1.02
Ile 1.03 1.98
Leu 3.98 0.00
Lys 2.01 0.00
Pro 5.97 0.97
所述肽的生化特性：如下所述，使用各种分解代谢酶，分析制品R的银染肽组分的某些生化特性：
用蛋白酶K(ICN Biochemicals)进行处理：蛋白酶K是一种非特异性广谱蛋白酶，可切割脂族氨基酸、芳族氨基酸和疏水性氨基酸C末端的肽键。它可以以50μg/ml在1小时内完全切割所有血清肽。将制品R样品在具有10mM Tris-HCl，pH 7.6、0.5％SDS、1mM CaCl2、100μg/ml蛋白酶K的反应缓冲液中于40℃保温30分钟，然后在如上所述的16％凝胶上进行SDS-PAGE。在这样的条件下，制品R的银染色并未显示显著变化。然而，当蛋白酶K的量增加至800μg/ml且保温时间延长至1小时时，所述5.2KDa条带消失，但是所述4.3KDa条带却无明显的变化。
用胰蛋白酶(Boehringer Mannheim，USA)进行处理：胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在pH 7.5-9.0下可特异性地切割C末端的赖氨酸和精氨酸的肽键。将制品R样品在具有100mM Tris-HCl，pH 8.0、0.1％SDS和250μg/ml测序级胰蛋白酶的反应缓冲液中于25℃保温19小时，然后在16％凝胶上进行SDS-PAGE。尽管在这样的反应条件下，血清蛋白质将分解为小于4.3KDa的肽，但是制品R的银染组分均不受胰蛋白酶的影响。
用胰凝乳蛋白酶(Boehringer Mannheim，USA)进行处理：胰凝乳蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可特异性地水解C末端的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的肽键。它也以相较低的速率切割C末端的亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的肽键。将制品R样品在含有100mMTris-HCl，pH 7.6、10mM CaCl2和250μg/ml测序级胰凝乳蛋白酶的反应缓冲液中于25℃保温19小时，然后在16％凝胶上进行SDS-PAGE。胰凝乳蛋白酶处理显著降低所述5.2KDa和所述7.6KDa条带的强度，但对所述4.3KDa条带没有明显的影响。
用链霉蛋白酶(Boehringer Mannheim，USA)进行处理：链霉蛋白酶是一种非特异性蛋白酶，既作用于天然蛋白质又作用于变性蛋白质。它实际上能将所有蛋白质分解成它们的单个氨基酸。所述制剂含有各种类型的内肽酶如srine和金属蛋白酶、外肽酶如羧肽酶、中性蛋白酶以及中性和碱性磷酸酶。将制品R样品在含有100mM Tris-HCl，pH7.4、10mM CaCl2、0.1％SDS和2mg/ml链霉蛋白酶(得自S.griseus)的反应缓冲液中于40℃保温75分钟，然后在16％凝胶上进行SDS-PAGE。在这样的链霉蛋白酶处理后，所有的银染组分都消失了。
用N-糖苷酶F(Boehringer Mannheim，USA)进行处理：N-糖苷酶F切割所有类型的天冬酰胺结合的N-聚糖，条件是在肽键中存在氨基和羧基，并且寡糖具有最小长度的壳二糖核心单位。将制品R样品在含有0.4X Dulbecco氏PBS(其中1×PBS含有1.47mM KH2PO4、2.67mMKCl、138mM NaCl和8.1mM Na2PO4 7H2O)、0.1％SDS、0.5％NP40和50单位/ml重组N-糖苷酶F的反应缓冲液中于37℃保温4小时，然后在16％凝胶上进行SDS-PAGE。N-糖苷酶F处理没有改变16％凝胶上任一制品R条带的强度。对N-糖苷酶F的抗性表明缺乏天冬酰胺结合的N-聚糖，其通常在糖蛋白中观察到。
用核糖核酸酶A(ICN Biochemicals，USA)进行处理：核糖核酸酶A是一种作用于单链RNA的嘧啶特异性内切核糖核酸酶。将制品R样品在含有10mM Tris-HCl，pH 7.4、3mM MgCl2和Img/ml牛胰核糖核酸酶A的反应缓冲液中于37℃保温约1小时，然后在16％凝胶上进行SDS-PAGE。核糖核酸酶A没有改变经16％SDS-PAGE凝胶分离的任一制品R条带的强度。对核糖核酸酶A的抗性排除存在与肽相连的RNA片段的可能性。
用碱性磷酸酶(Life Technologies，USA)进行处理：小牛胸腺碱性磷酸酶(CIAP)是一种水解DNA、RNA和核苷酸的5′-磷酸基团的磷酸单酯酶。将制品R样品在由所述酶的生产商提供的反应缓冲液和200单位/ml CIAP中于37℃保温约1小时，然后在16％凝胶上进行SDS-PAGE。CIAP没有改变经SDS-PAGE分离的任一制品R条带的强度。
通过分解代谢酶进行上述处理的总结在以下表III中提供，所述处理的结果示于图5中，其中″-″表示染色条带没有明显改变，而″+″表示染色条带明显改变。
表III
制品R中肽组分的酶敏感性(SDS-PAGE)
4.3KDa 5.2KDa 7.6KDa
蛋白酶K(100μg/ml) - +/- ？*
800μg/ml) - + ？*
胰蛋白酶(250μg/ml) - - -
胰凝乳蛋白酶(250μg/ml) - + +
链霉蛋白酶(2mg/ml) + + +
N-糖苷酶F(50单位/ml) - - -
核糖核酸酶A(1mg/ml) - - -
碱性磷酸酶(200单位/ml) - - -
*该条带未明确地鉴定出来，因为在该区域存在所述酶片段。
这些酶消化模式的复杂性提示，制品R的所述肽组分可以与诸如单核苷酸和/或糖的其它分子缀合，或者在分子内/分子间存在交联。
RNA凝胶电泳：核酸的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳都不产生任何溴化乙锭染色条带，表明在制品R中没有RNA片段。
制品R对吞噬作用的影响：图7和图8是代表细胞相关荧光的流式细胞术频率分布图，显示在制品R分别处理24小时和8天后，制品R对葡聚糖-FITC或葡聚糖-BoDipyFL吞噬作用的影响。用人单核细胞系U937测试制品R对吞噬作用的影响。将U937细胞在具有5％制品R或作为对照的5％PBS的培养基中在葡聚糖-FITC试验前培养24小时或者在葡聚糖-BoBipyFl试验前培养8天。为了测量吞噬作用，将细胞如图5所示用诸如荧光标记葡聚糖-FITC的吞噬标记于37℃连续培养5分钟、15分钟、30分钟和45分钟或者如图6所示用葡聚糖-BoDipyFL于37℃连续饲养5分钟、15分钟、25分钟和40分钟。基本上按照Sallusto，F.等(Sallusto，F.等(1995)，J.Exp.Med.，182：389-400，所述文献通过引用全文结合到本文中)介绍的方法，用流式细胞术分析监测吞噬摄入后细胞相关荧光的数量。在这些试验中，已经从实验样品的数值中减去本底值，并且用碘化丙锭排除法从所述数据中除去死细胞。
图7和图8分别显示对数荧光对PBS对照(紫色)、制品R处理(绿色)和与细胞结合的本底葡聚糖(黑色)的细胞数的覆盖。在每个时间点紫色曲线(PBS对照)基本上与绿色曲线(制品R)重叠，表明制品R不抑制人单核细胞的吞噬作用。
制品R的其它生物学功能：制品R的某些其它已知的生物学功能在以下文献中有描述：美国专利第5,807,840号、第5,807,839号和第5,902,786号；美国专利申请顺序号08/838,077、08/838,069、08/835,793、08/835,794、08/833,950、08/837,992、08/837,988、08/838,070、08/834,190、08/835,791、08//838,134、08/839,651、08/835,796、08/964,250、08/964,427、08/923,516、08/923,343、08/922,888、09/189,172、09/007,565、09/316,624、09/316,374、09/257,739和Hirschman等，J.Investig.Med.1996；44：347-351公开内容。这些专利、专利申请和出版物通过引用全部结合到本文中。
结论
因此确定按照本发明所述方法制备的制品R组合物包含分子量不超过14KDa、基本上不超过8KDa的核苷酸和肽。制品R的肽组分不均匀分布并且通常位于分子量为4.3KDa、5.2KDa的两个主要银染条带和7.6KDa的次要条带。
制品R的UV吸收光谱通常在260nm显示最大吸收，而在235nm显示波谷，并且特征性260nm的吸光度与280nm的吸光度之比为1.998，而260nm的吸光度与230nm的吸光度之比为1.359。
制品R的HPLC分布图包含A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和M的流分，如图2所示。
制品R的BioGel P-2凝胶过滤分布图包含I、Ia、II、IIa、IIb、III、IIIa、IV和IVa的流分，如图3所示。
比较常规组成的Reticulose和制品R
将按照本发明公开说明书制备的制品R的组成与常规组成RETICULOSE的就其分子量(MW)和波长为230nm、260nm和280nm时的紫外(UV)吸光度(A)进行比较，如表IV所示。尽管已经报道RETICULOSE的分子量低于15KDa的组分可抑制吞噬作用，但是本申请证明制品R不抑制吞噬作用。
表IV
MW UV I/PH*
A260/280 A260/230
制品R ＜14KDa 1.998 1.359 不抑制
RETICULOSE 1-25KDa 2.839 1.198 抑制
*分子量低于15KDa的分子抑制吞噬作用
因此，制品R与RETICULOSE在其组成和生物学功能方面显著不同。
表V是本发明治疗组合物制品R和常规组合物RETICULOSE制备中所使用的原料相对量的比较。
表V
10升中用于起始反应
的原料 RETICULOSE 制品R
酪蛋白(克) 250克 140
牛肉蛋白胨(克) 150克 68.4
血清白蛋白(克) 15克 13
RNA(克) 80克 88
NaOH(克) 75克 66
在制品R制备的起始反应中使用约221克蛋白质，而在RETICULOSE制备的起始反应中使用约415克蛋白质。因此，RETICULOSE制备的起始蛋白质浓度是制品R制备的起始蛋白质浓度的两倍。
为了进一步研究制品R组合物的结构和活性，分离并纯化所述两种主要肽组分，即所述5.2KDa肽(下文称为″肽-A)和所述4.3KDa肽(下文称为″肽-B″)。开发一种分离制品R混合物并且纯化所述两种肽中每种的方法。这种方法包括凝胶过滤，然后冻干，离心过滤和透析。这种方法产生适用于测序法和NMR和质谱结构研究的肽-A和肽-B样品。肽-A和肽-B在制品R组合物中以大致相等的量存在，通过Lowry(劳里)蛋白质分析测定，这两种肽的总量约为4.8-5.3mg/ml。
制品R肽的纯化
将制品R(6ml)冻干，冻干块溶于1.5mL Nanopure水的总体积中，以形成4倍浓缩液。将BioGel P-b柱(16×51cm)用0.05X无Ca++和Mg++的Dulbecco氏磷酸缓冲盐溶液(PBS)平衡。将经浓缩的制品R加样至所述柱上。所述柱用0.05×PBS洗脱，收集1ml流分。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，然后通过对凝胶进行银染色，测试各流分中肽-A和肽-B的存在。
合并含有肽-A的流分，然后冻干。含有肽B的流分并不是完全不含肽A。合并含有＞80％肽-B的流分，然后冻干。将上述步骤重复若干次，直至获得供结构研究用的足量的单种肽。
将冻干肽-A的混合物溶于Nanopure水中，浓缩，然后通过Centriplus 3(MWCO-3kDa)过滤装置(Millipore Corporation，USA)经离心进一步纯化。用BioRad DC蛋白质测定试剂盒分析所述浓缩物的蛋白质含量。肽-A的纯度再次通过SDS-PAGE检查，将样品冻干，冻干块于4℃冷藏待用，以进行结构研究。
将冻干肽-B的混合物溶于少量Nanopure水中，在Spectra/PorDispo透析仪(MWCO-lkDa)(得自Spectrum Microgen，USA)中对10mMTris-HCl，pH 7.4透析。如上关于肽-A的所述方法，通过使用BioRad DC蛋白质测定试剂盒和SDS-PAGE来分析所述透析液中肽-B的蛋白质含量和纯度。将透析液冻干，肽-B的冻干块于4℃冷藏待用，以进行结构研究。通过NMR光谱法、Edman法的N末端测序和质谱法对肽-A进行分析。
在如肽纯化小节中所述的方法透析后，可获得作为冻干块的肽-A样品。对于NMR研究，将所述样品溶于重水中。对于质谱研究，将所述材料溶于PBS缓冲液中。
肽-A的NMR分析
将5.2mg肽-A样品(通过劳里总蛋白质测定测定)溶于5mm NMR试管中的0.5mL D20中。将该试管涡旋混合30秒。在Bruker 300MHz仪器上记录谱线。
D2O中肽-A的质子NMR是一种多肽的典型复杂谱。脂族残基和芳族残基均在所述谱中观察到(图9)。
对所述样品未能获得令人满意的13C碳NMR谱，因为低样品浓缩所致。然而，可以记录提供样品中除叔碳原子(缺乏连接氢原子的基团，例如羰基)之外所有碳原子化学位移的2D-HSQC(异核单量子相干)谱(图10)。这在Bruker 500MHz仪器上进行12小时，以获得过夜数据。二维HSQC实验使质子化学位移与相应的连接所述质子的碳原子化学位移相关联。该实验导致阐明了肽A的氨基酸含量。(参见表VI-HSQC谱相关性-肽A)。HSQC 2D-谱指示作为肽A组分的以下氨基酸的存在：芳族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸、亚氨基酸脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺。未能检测到色氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、组氨酸或羟脯氨酸。
根据以下来源的数据作出共振化学位移：K.Wuthrich，NMR ofProteins and Nucleic Acids，John Wiley，1986和J.N.S.Evans，Biomolecular NMR Spectroscopy，Oxford University Press，1995)。
对于肽-A样品也记录31P谱；12小时的过夜记录没有产生磷共振信号。因此，肽-A不是磷酸化肽。
表VI-HSQC谱相关性-肽-A
交叉峰(ppm)
质子 碳 定位
7.28 128.8 CI Tyr
7.22 128.4 Cl Tyr
7.18 127.8 C2，6 Tyr
7.05 130.2 C4 Phe
6.75 115.7 C3，5 Tyr
4.60 55.2 -H Asp
4.52 54.1 -C Met
4.32 56.1 -C Glu
4.24 50.4 -C Ma
4.22 54.4 -C Arg
4.18 60.8 -C Val
3.87 43.0 -C Gly
3.55 48.3 -C Pro
2.24 30.3 β-C Pro
2.18 31.8 β-C Met
2.13 33.5 β-C Gln
1.74 36.7 β-C Ile
1.72 29.4 β-C Arg
1.48 40.0 β-C Leu
1.24 16.2 -C Ile
0.88 18.5 -C Val
0.84 23.2，21.6 -C Leu
0.80 10.9 -C Ile
肽-A的N末端肽测序
通过Edman降解分析对肽-A进行N末端肽测序。所得的序列为
KVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLG
或
HZN-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-
Gln-Arg-Asp-MetPro-Ile-Gln-Ala-Phe-Leu-Leu-Tyr-GIn-Glu-
Pro-Val-Leu-Gly-OH
用于序列比较的蛋白质序列数据库BLAST(可通过NCBIINIH在线获得)的检查提供与该序列的实际匹配，该序列对应于牛β-酪蛋白中的氨基酸残基178-208-一条长216个氨基酸的肽(A.F.Stewart，J.Bonsing，C.W.Beattie，F.Shah，I.M.Willis和A.G.Mackinlay，completenucleotide sequences of bovine alpha-s2 and beta-casein cDNAs：Comparisons with related sequence in other species(牛α-s2和β-酪蛋白cDNA的完全核苷酸序列：与其它物种中相关序列的比较)MoI.BioI.Evol.4，231-241 1987)。该序列似乎是肽-A的正确序列，因为制品R来源于牛酪蛋白。此外，在NMR研究和氨基酸分析中，该序列的氨基酸组成同鉴定为肽-A组分的氨基酸一样。
所述肽结构具有六个间插的脯氨酸残基和四个碱性谷氨酰胺残基。由于肽链中的脯氨酸残基可以诱导肽链弯曲，因此肽A具有高度折叠的结构是可能的，该结构导致其高度化学稳定性和其对蛋白酶和肽酶的不应特征。
对肽-A的质谱研究
肽A样品的许多质谱得自Borealis实验室和CommonwealthBiotechnologies。电喷雾和MALDITOE(Matrix-assisted Laser DesorptionIonization-Time ofFlight)两种方法均可用来获得质谱。
MALDI-TOF质谱法具有使其有效作为测序技术的补充技术的若干特征(K.R.Williams，S.M.Samandar，K.L Stone，M.Saylor和J.Rush，MALDI-MS as a complement to internal protein sequencing.，载于：TheProtein Protocols Handbook，J.M.Walker编著，1996，Humana Press，Totowa，NJ，第541-555页)。MALDI-MS具有高灵敏度并且通常解析代表肽结构中连续肽键断裂的片段，使得可以测序和/或证实通过Edman N末端测序方法检测的序列。对质谱离子(mass ions)而言，MALDI-MS通常给出的质量准确度为+0.25％，这对于作出定位是令人满意的。
以下表(表VII)显示得自肽-A的质谱片段，与上述的31个氨基酸肽结构相一致。根据Edman N末端序列分析，所观察到的质谱片段也证实先前未确定的、在位置11、15和20定位的氨基酸残基分别为P、R和Q。
表VII-肽-A的MALDI质谱数据
片段 预期的质谱离子 观察到的质谱离子
/MPIQAF 688.87 690.3
/VPQKAVPY/ 884.07 884.5
884.2
/DMPIQAFL-NH3 900.09 900.9
/AFLLYQEP-28 935.11 935.9
KVLPVPQKAV/ 962.06 961.90
/PQKAVPYPQ-NH3 993.15 992.8
/PQKAVPYPQ/ 1010.19 1009.3
/PIQAFLLYQ 1075.30 1075.70
1075.40
/LPVPQKAVPY/ 1094.35 1095.70
/YPQRDMPIQ-NH3 1113.28 1112.1
1113.0
/PQKAVPYPQR-NH3 1149.34 1150.0
/PQKAVPYPQR/ 1166.37 1166-80
/VPQKAVPYPQR-28 1237.50 1236.5
/PQKAVPYPQRD/ 1281.46 1280.9
/MPIQAFLLYQE-28 1307.60 1308.20
1307.1
/VPQKAVPYYPQRD/ 1380.60 1381.02
1380.05
/PIQAFLLYQEPV/ 1400.67 1399.60
/DMPIQAFLLYQE-28 1422.69 1423.1
/KAVPYPQRDMPIQ-28 1497.81 1499.9
/MPIQAFLLYQEPV/ 1503.42 1503.85
1503.42
/KAVPYPQRDMPIQ/ 1525.82 1526.31
/VPYPQRDMPIQAF-NH3 1527.79 1527.46
/MPIQAFLLYQEPV/ 1531.86 1532.05
/PYPQRDMPIQAFL-NH3 1541.82 1541.84
/VPYPQRDMPIQAF/ 1544.82 1544.63
KVLPVPQKAVPYPQ/ 1546.90 1545.32
/DMPIQAFLLYQEP/ 1547.82 1549.47
/VPYPQRDMPIQAFL/ 1558.85 1560.28
/VLPVPQKAVPYPQR/ 1574.92 1575.22
/QRDMPIQAFFLY-NH3 1588.88 1589.0
/LPVPQKAVPYPQRD/ 1590.87 1590.26
/QRDMPIQAFLLYQ/ 1605.91 1606.05
/AVPYPQRDMPIQAF/ 1615.90 1614.94
/DMPIQAFLLYQEPV-NH3 1629.92 1630.35
/PYPQRDMPIQAFLL-28 1644.00 1643.31
/PYPQRDMPIQAFLL/ 1672.01 1673.13
/PYPQKAVPYPQRDMP/ 1678.02 1678.15
/PQRDMPIQAFLLYQ-NH3 1685.99 1686.95
/QKAVPYPQRDMPIQA-28 1697.02 1698.67
/PVPQKAVPYPQRDMP/ 1706.03 1706.7
/QKAVPYPQRDMPIQA/ 1725.03 1725.6
/AVPYPQRDMPIQAFL/ 1729.06 1730.07
/QRDMPIQAFLLYQE/ 1735.02 1735.57
VPYPQRDMPIQAFLL-NH3 1754.11 1755.83
/DMPIQAFLLYQEPVL/ 1760.11 1762.11
/VPYQRDMPIQAFLL/ 1771.14 1770.88
/LPVPQKAVPYPQRDMP/ 1790.17 1789.61
/KVLPVPQKVPYPQRDM-NH3 1801.15 1799.50
/KVLPVPQKAVPYPQRD/ 1818.16 1772.92(-CO2，-H)
/YPQRDMPIQAFLLYQ/ 1866.20 1864.68
/QKAVPYPQRDMPIQAF/ 1872.21 1874.98
/VLPVPQKAVPYPQRDMP-28 1890.31 1890.61
/RDMPIQAFLLYQEPVL-NH3 1899.27 1897.0
/PQRDMPIQAFLLYQEP/ 1929.26 1929.92
/VPYPQRDMPIQAFLLY/ 1934.32 1936.39
/QKAVPYPQRDMPIQAFL/ 1957.36 1955.81
/PYPQRDMPIQAFLLYQ/ 1963.32 1962.80
KVLPVPQKAVPYPQRDMPI/ 2159.64 2207.32(+2Na，+2H)
/AVPYPQRDMPIQAFLLYQE/ 2262.69 2263.52
/PVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQ-28 2664.40 2664.36
/KAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVL/ 2700.23 2724.23(+Na)
KVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVL/ 3462.18 3462.67
KVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAFLLYQEPVLG 3536.24 3536.84
3583.48(+2Na)
因此，肽-A的质谱数据与来源于如上所示的β-酪蛋白的31个氨基酸序列相一致。
因此，肽-A—制品R的一种组分为长31个氨基酸、来源于牛β-酪蛋白、分子量为3536.24Da的肽。它为一种缺乏任何半胱氨酸-半胱氨酸交联的直链肽。值得注意的是，其结构为整个分子中间插有六个脯氨酸残基和四个碱性谷氨酰胺残基。由于脯氨酸残基可以诱导肽链弯曲，因此所述结构可能是一种高度折叠的肽。
肽-B的结构研究
通过NMR光谱法、Edman法的N末端测序、C末端测序和质谱法对肽-B进行分析。
如小节4.2中所述，纯化肽-B样品可在透析后作为冻干块而得到。对于NMR研究，将所述样品溶于重水中。对于质谱研究，将所述材料或者溶于Nanopure水中或者溶于0.1×PBS缓冲液中。通过用高碘酸盐处理并且用DIG-半抗原(Boehringer Mannheim)标记，肽B也给出针对糖肽/核肽的阳性反应。让DIG-半抗原结合的肽-B与抗DIG过氧化物酶反应，然后用TETON(4-三亚乙基三氧基-1-萘烷醇)处理，产生蓝色沉淀，表明在糖肽/核肽复合物中糖部分与肽部分连接。
肽-B的NMR谱分析
肽-B的质子NMR谱(图11)显示肽化合物的特征性信号，但是在任何芳族氨基酸非典型谱的芳族区中以及在5.7-6.05ppm区之间的区域中也具有另外的非典型峰，类似于在二腺苷二核糖核苷酸中芳族质子和核糖糖残基残基的那些区域。质子共振信号的定位示于表VIII中。所述谱中外非肽峰以1∶1摩尔比与所述肽一起出现，表明在肽和腺苷腺苷二核苷酸之间的1∶1摩尔复合物。
磷谱(图12)显示三种信号，在3.96ppm处指示从典型核苷间磷酸二酯键合预期的那些原子多少有点向低磁场移动的两个磷酸二酯磷原子的分裂峰和核苷酸间磷酸二酯键合特征性的2.46ppm的另一个峰。这表明与非典型核苷酸间键合的两个其它磷酸二酯键一起的核糖二核苷酸单位中核糖单位之间的一个传统3′→5′磷酸二酯键合。因此，通过在丝氨酸或酪氨酸残基上的羟基到二核苷酸的糖部分上的羟基可能存在一个共价磷酸二酯键合。
因此，肽-B由与二腺苷核糖二核苷酸连接的肽单位组成，因为它显示对应于氨基酸和腺嘌呤单位的NMR信号。根据HSQC谱(图13，表X)鉴定的氨基酸为4个甘氨酸残基、3个缬氨酸残基、3个天冬氨酸残基、2个异亮氨酸残基、2个丝氨酸残基、2个酪氨酸残基以及丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和谷氨酸各1个。这些数据综合起来表明，长21个氨基酸的肽与腺嘌呤二核糖核苷酸连接有可能通过二磷酸二酯型键合来连接。
肽-B的C-13 NMR谱(图14，表IX)在对应于腺嘌呤的芳族区(118-160ppm)中和在其中核糖环碳原子产生信号的70-90ppm的区域中同样显示任何氨基酸的非典型峰，这可以归因于两个腺苷亚单位。
还认为二腺苷二核苷酸可以与肽部分连接成离子型复合物，而不是共价连接的。为了确定是否存在这种情况，进行解离通过与所述肽离子键合连接的可能的二核苷酸单位的实验。肽B样品通过加入5MNaCl产生2M NaCl离子强度。这种高离子强度溶液应该解离离子复合物。将所述溶液于4℃保温1小时，然后针对Float-a-Lyzer袋(MW截留值--1kDa)中500mL 1M NaCl的10mM Tris-HCL，pH 7.9溶液透析2小时。然后将透析液于40℃针对500mL 0.5M NaCl的10mM Tris-HCl，pH 7.9溶液再次透析2小时。于4℃针对2.5L 10mM Tris-HCl，pH 7.9最终透析16小时过夜提供可加样至预先用10mM Tris-HCl平衡的Macroprep DEAE支持柱上的肽-B溶液。将洗脱液冻干。然后通过质子和磷NMR再次分析该产物，得到与未经处理的肽-B相同的谱。这表明在所述肽和寡核苷酸部分之间是通过氨基酸残基上的羟基磷酸二酯键连接的共价复合物，而不是离子型复合物。
肽-B的N末端序列分析
通过Edman降解分析对肽-B进行N末端肽测序。将样品溶于1mLNanopure水中，将50μL经溶解的样品加样至测序柱上。进行30个循环的测序，导致鉴定出一种长21个氨基酸的序列：
GEIPDAGGR1VDYYVGFSD(X)(X)
该序列C末端的20和21氨基酸不能明确地确定。在NCBI/BLAST数据库中搜索该序列，但是对任何匹配序列没有命中。因此，肽-B似乎是一种先前未曾描述的化合物。
表VIII-肽B的质子NMR峰定位(在H2O溶液中)
化学位移 峰定位
0.897 δ-CH3 Ile(2个ile残基)
0.909
0.933
0.947 γ-CH3，Val，γ-CH3 Ile(3个Val残基，2个lIe残基)
0.949
0.946
0.964
1.409 β-H Ala
1.476
1.490 γ-CH2 Ile(2个Ile残基)
1.676 γ-CH2Arg
1.866 β-HAsp(3个Asp残基)
1.885
1.920
2.011 β-H Pro
2.071 β-H Glu
2.164 β-H Val(3个Val残基)
2.178
2.191
2.284 β-H Pro
2.299 γ-CH2 Glu
2.961 β-H Tyr
3151 β-H Phe
3.696 δ-H Pro
3.706 核糖5′CH2OH
3.878 β-H Ser(2个Ser残基)
3.885
3.901 α-H Gly(4 Gly残基)
3.912
3.923
3.931
4.158 α-H Val(3个Val残基)
4.178
4.166 α-H Glu
4.323
4.359 α-H Arg
4.425 α-H Pro
5.863 核糖5′
5.886 核糖3′
5.894
5.938 核糖2′
5.948
6.006 核糖1′
6.021
6.794 3，5-H Tyr
7.088
7.144 2，6-H，Tyr
7,266 2，6-H，Phe
7.282 3，5-H，Phe
7.305 4-H，Phe
7.740 腺嘌呤环H-2
7.756
7.791 腺嘌呤环H8
7.806
表IX-肽B的C13 NMR峰定位(在D2O中)
化学位移(ppm) 峰定位
17.7 Ala(β-C)
18.5 Val(γ-C)
23.2 Pro(γ-C)
25.7 Arg(γ-C)
28.7 Arg(β-C)
28.8 Glu(β-C)
30.6 Pro(β-C)
38.4 Tyr(β-C)/Phe(β-C)
39.8 Asp(β-C)
40.8 Asp(β-C)
41.7 Arg(δ-C)
43.5 Gly(α-C)
43.9 Gly(α-C)
48.2 Pro(反式，δ-C)
51.2 Ala(α-C)
53.1 Asp(α-C)
53.4
57.4 Phe(α-C)，Tyr(α-C)
57.6
60.0 Ile(α-C)
60.8 Val(α-C)
62.0 核糖5′CH2OH
62.3 Ser(β-C)
62.4
72.0 腺苷(核糖C2′)
74.2 腺苷(核糖C3′)
83.7 腺苷(核糖C4′)
84.2
90.4 腺苷(核糖Cl′)
95.2
116.2 Tyr(C3，C5)
128.4 Tyr(C1)，Phe(C-4)
128.6
131.2 Tyr(C2，C6)
141.8 腺嘌呤(腺苷环C8)
142.4
158.1 腺嘌呤(腺苷环C4/C2)
172-177 氨基酸C＝O基团
182.8 Glu(δ-C)
表X-HSQC谱相关性-肽-B
交叉峰
化学位移(ppm)
质子 碳 定位
7.79 158.1 腺苷C/H2
7.80 159.4
7.74 141.8 腺苷C/H8
7.76 142.4
7.30 128.4 Phe C4
7.28 128.6 Phe 2，6
6.79 116.2 Tyr 3，5
6.01 95.2 腺苷1′
5.95 90.4 Adensone 1′
4.81 72.0 腺苷2′
4.60 74.2 腺苷3′
4.38 53.3 α-C Leu
4.28 70.1 腺苷2′
4.20 83.7 腺苷4′
4.16 84.2 腺苷4′
4.17 60.8 α-C/H Val
3.91 43.5 α-C/H Gly
3.89 62.3 β-C/H Ser
3.70 62.0 腺苷5′-CH2OH
2.96 39.4 β-C/H Tyr
2.28 34.1 β-C/H Pro
2.17 30.6 β-C/H Val
2.07 28.8 β-C/H Glu
1.89 25.7 γ-C/H Arg
1.41 17.7 β-C/H Ala
0.93 19.3 γ-C/H Val
0.92 22.8 γ-C/H Leu
0.89 15.7 γ-C/H Ile
0.80 11.3 δ-C/H Ile
肽-B的C末端序列分析和结构推断
在Commonwealth Biotechnologies，Inc.，采用羧肽酶Y消化，对肽-B进行C末端肽序列分析。使用肽-B的量为3.8mg。将样品与以酶与肽-B的终摩尔比为1∶20加入的羧肽酶Y(Sigma C 3888)一起保温。将样品在室温和时间逐渐增加(0mm 30mm、1hr、2hrs、5hrs和16hrs)的条件下保温，取出20μL等份样品，分别进行氨基酸分析。将酶自溶样品作为整个方案的对照。通过加入5μL冰乙酸终止酶消化。将每种样品干燥(speed-vac)，然后溶于50μL氨基酸加样缓冲液中，然后进行氨基酸分析。
观察到氨基酸的时间依赖性释放，在约7皮摩尔时达到等当量。最先释放和最先达到等当量的残基是Val，接下来是Ser和Asp。因此，三个C末端残基可以被鉴定为-DS V-OH。这表明在倒数第二个、位置20定位的氨基酸(X)是丝氨酸残基。除这三个C末端氨基酸残基之外没有进行测序，表明从C末端开始定位的第四个残基(X)、位置18测序的一种可能的空间位阻。这可以认为是由于所述二核苷酸部分与位置18的氨基酸共价连接。
由于根据磷NMR谱，指示没有对应于典型核苷酸间3′→5′-磷酸二酯键合的两个磷酸二酯信号，因此似乎可能是位置18的氨基酸将具有含羟基的侧链；即或者是丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或者是酪氨酸残基，其被磷酸化为磷酸二酯键。由于在肽-B的NMR谱中没有观察到苏氨酸或羟脯氨酸残基信号并且根据N末端序列位置在位置13和14上有两个酪氨酸残基，因此这将表明位置18必定是丝氨酸残基。这将表明与位置18的丝氨酸残基的羟基上的二核苷酸可能共价连接的21个氨基酸肽的可能肽序列是：
*
GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV
1 18 21
或
1 5 10 15
*NH2..Gly-Glu-Ile-Pro-Asp-Ala-Gly-Gly-Arg-Ile-Val-Asp-
Tyr-Tyr-Val-Gly-Phe-Ser
20
Asp-Ser-Val-OH
该21个氨基酸肽区段的分子量为2216.4。在质谱中，观察到与该结构相符的片段(参见表XI)。在质谱研究中，整个肽-B结构显示的分子量为2955，表明MW 740结构与所述肽共价连接。
NMR研究表明两个腺嘌呤单位通过3′→5′-磷酸二酯键合相互连接，如在RNA结构中。因为观察到与游离2′羟基相符的2′-核糖碳和氢信号的两个腺嘌呤单位，所以不包括2′→5′-键合。通过3′-5′磷酸二酯键连接的二腺苷二核苷酸形成MW 595的片段。这留下的分子量为144，对应于两个额外的非核苷酸间磷酸二酯键合。
所述二腺苷二核苷酸单位可以在其3′或5′游离羟基通过二磷酸酯键与所述肽丝氨酸羟基连接。因为观察到所述腺嘌呤核糖单位其中一个的游离5′-羟基，所以指示3′-连接(在HSQC谱中于3.7ppm和62.0ppm的交叉峰)。
在腺苷二核苷酸结构中存在游离的5′-羟基由肽-B对小牛胸腺碱性磷酸酶水解的抗性加以进一步说明。该酶容易水解DNA、RNA和核苷酸中的5′-磷酸基团。
图15的结构与在所述结构中研究获得的、如下概述的肽-B的数据相符：
a.所述结构是一种长21个氨基酸、在位置18的丝氨酸残基的羟基上与二腺苷二核苷酸单位通过3′-位置上的二磷酸二酯键合共价连接的线性肽。
b.质谱数据与已知结构和N末端和C末端测序数据相一致。观察到与非肽二核苷酸加合物的损失相一致的质谱片段以及顺序离子片段证实在所述线性肽部分中的定位氨基酸序列。
c.该结构可以解释在31P-NMR谱中观察到的三个磷二酯键合，所述结构包括一个常规的核苷酸间3′-5′磷酸二酯键合和两个由所述肽上的丝氨酸羟基和所述二核苷酸部分上的3′羟基之间的二磷酸二酯键合产生的信号。
图16显示在丝氨酸18通过二磷酸二酯键合与二腺嘌呤二核苷酸单位键合的性质。
然而，本发明并不限于上述的核苷酸-肽结构。据信上述核苷酸-肽结构中的所述肽和所述寡核苷酸之间的二磷酸二酯键合对于制品R的活性是关键性的。因此，在不违背本发明的情况下，本发明包括根据上述结构本领域技术人员能够推断的以上结构的所有其它变异体。图17显示上述核苷酸-肽的通用结构，其中B1和B2为嘌呤或嘧啶，例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶或5-氟尿嘧啶；R1和R2为氢或羟基；X为羟基化氨基酸残基，例如丝氨酸残基、苏氨酸残基或酪氨酸残基；且Y为与所述二核苷酸连接的肽的其余部分(肽残基)，不包括羟基化氨基酸残基。所述肽的长度可以有所变化，但是一般含有不超过50个氨基酸。在这样的肽中需要至少一个羟基化氨基酸残基，但是这个残基的位置可以是在沿所述肽的任何位置上，包括所述肽的N末端和C末端。所述肽中的其它氨基酸残基可以选自任何已知的氨基酸，而所述二核苷酸可以是核糖二核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对肽-B的质谱研究
肽-B样品的质谱得自Commonwealth Bioteclinologies，Inc.，、Borealis Laboratories和Louisiana State University。MALDI-TOF和电喷雾这两种技术均可用于这些分析。下表(表XI)显示所观察的质谱片段离子和结构定位。
表XI-肽-B的质谱数据
表XI-肽-B的质谱数据
片段 预期的质谱离子 观察到的质谱离子
/IVDYY/ 654.74 655.7
/DAGGRIV/ 669.76 671.8
/YYVGFS-28 689.79 688.8
/IPDAGGRIV/ 880.04 879.82
/YYVGFSDS-H2O 901.95 901.97
/PDAGGRIVDY/ 1045.14 1044.18
1044.87
/GGRIVDYYVG-28 1053.21 1053.1
GEIPDAGGRIV/ 1066.20 1066.32
/EIPDAGGRIVD-28 1096.23 1096.63
/VDYYVGFSDS-H2O 1116.18 1118.34
/EIPDAGGRIVD/ 1124.24 1123.74
1123.90
/AGGRIVDYYVG/ 1151.58 1150.0
/RIVDYYVGFS/ 1201.37 1202.85
1202.82
/GGRIVDYYVGF/ 1228.40 1228.61
/IVDYYVGFSDS-H20 1229.34 1229.45
/GGRIVDYYVGF-28 1230.41 1230.44
/EIPDAGGRIVD/ 1124.24 1123.74
GEIPDAGGRIVD/ 1181.30 1181.03
/GGRIVDYYVGF/ 1228.46 1229.12
1228.61
/GGRIVDYYVGF-28 1200.39 1198.11
/IPDAGGRIVDYY-28 1293.87 1293.87
/IPDAGGRIVDYY-NH3 1304.45 1302.00
/PDAGGRIVDYYV/ 1307.45 1308.42
GEIPDAGGRIVDY/ 1344.46 1342.09
1342.04
142.7
/PDAGGRIVDYYVG-NH3 1347.47 1346.77
/PDAGGRIVDYYG/ 1364.51 1364.02
1365.0
/AGGRIVDYYVGFS/ 1386.56 1386.02
/IPDAGGRIVDYYV-28 1392.60 1391.12
/GRIVDDYYVGESDS 1460.59 1459.63
1461.56
/GRIVDDYYVGFSDS-H20 1441.68 1440.06
1440.41
/IPDAGGRIVDYYVG/ 1477.67 1475.01
/DAGGRIVDYYVGFS-H2O 1483.63 1482.43
1482.45
GEIPDAGGRIVDYY/ 1507.63 1545.32(+K)
/EIPDAGGRIVDYV-NH3 1532.70 1533.93
/PDAGGRIVDYYVGF/ 1511.68 1510.41
/PDAGGRIVDYYVGFS-2NH3 1564.72 1565.6
1566.16
/AGGRIVDYYVGFSD-H2O 1570.71 1569.89
/AGGRIVDYYVGFSDS/ 1588.72 1588.58
1587.01
1589.0
/GEIPDAGGRIDYYV G-NH3 1589.76 1591.53
GEIPDAGGRIVDYYV/ 1606.76 1608.01
/GEIPDAGGRIVDYYVG-28 1635.80 1635.82
GEIPDAGGRIVDYYVG/ 1663.81 1664.61
/DAGGRIVDYYVGFSDS-28 1675.80 1675.95
1674.56
/EIPDAGGRIVDYYVGF/ 1753.96 1751.00
GEIPDAGGRIVDYYVGF-NH3-28 1765.97 1765.6
/PDAGGRIVDYYVGFSDS-28 1772.92 1772.92
/AGGRIVDVYVGFSDSV-NH3 1688.84 1688.69
GEIPDAGGRIVDYYVGF/ 1810.91 1890.61(+2K)
GEIPDAGGRIVDYYVGFS/ 1898.06 1898.61
/EIPDAGGRIVDYYVGFSD/ 1956.13 1957.64
GEIPDAGGRIVDYYVGFSDS/ 2100.28 2100.17
GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV/ 2199.35 2199.68
2200.17
2236.71(+K)
2245.93/2246.10(+2Na)
GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV-NH3 2182.35 2183.12
2183.68
GEIPDAGGRIVDYYVGFSDSV.OH(M+) 2216.29 2217.11
2217.18
2244.12(+K)
2259.48(+2Na)
2252.27(+2H2O)
2262.24(+2Na)
M-腺嘌呤，-H2O 2802.73 2803.09
M-V(C末端) 2857.86 2859.53
M-(NH-V)(C末端) 2842.85 2842.14
M-腺嘌呤 2819.74 2821.70
M-2H2O 2918.81 2918.69
2940.33(+Na)
M 2954.82 2956.19
2994.99(+K)
3000.63(+2Na)
所述质谱数据支持肽-B的定位结构，此外通过出现在质量分别为1664.61、1898.61和2199.68的片段独立证实了所述肽结构中位置16的甘氨酸残基和位置18和位置20的丝氨酸残基。
获得的肽-B的代表性质谱示于图18中。
因此，由长21个氨基酸直链肽组成的肽-B通过位置18的丝氨酸残基的羟基通过二磷酸二酯基团与腺苷酰基(3′-5′)腺苷部分的3′-末端共价连接。这使Pcptide-B成为一种肽-核酸缀合物。
总之，将制品R解析成其组分化合物，然后通过一系列结构化学分析进行鉴定。所述方法包括系统性凝胶洗脱法、HPLC分析、SDS-凝胶电泳、酶学研究、紫外光谱分析、NMR谱分析和质谱分析。
根据这些研究，可以得出以下结论：制品R的有机组分是衍生自RNA受控水解的13种核苷/核苷酸化合物和两种肽。
分子量为3536的较长肽(称为肽-A)是来源于牛β-酪蛋白的3 1个氨基酸片段。它具有6个间插的脯氨酸残基，所述脯氨酸残基可能导致所述肽的紧密折叠，导致其化学稳定性和对酶促水解的稳定性。它在其结构中也具有4个碱性谷氨酰胺残基。
较短的肽即一种肽-寡核苷酸缀合物(称为肽-B)具有在位置18的丝氨酸残基上与二腺嘌呤(3′-5′)二核糖核苷酸通过3′-位置上的二磷酸二酯键合连接的长21个氨基酸的链。该核肽缀合物具有与740MW非肽加合物连接的MW 2215肽部分，得到的总MW为2955。迄今为止所述肽-B结构在科学文献中尚未描述。
另外，制品R含有在生产工艺中由氢氧化钠与盐酸的中和作用产生的无机成分氯化钠。
因此，在制品R制剂中存在16种已鉴定的组分化合物-3种核苷、2种核苷二磷酸和8种核苷一磷酸、加上2种肽(其中一种为肽-核酸缀合物)和氯化钠。
制品R肽-A和肽-B的生物活性
U937细胞—一种得自hystiocytic淋巴瘤、在特定条件下生长的人前单核细胞系已经显示通过增加其产生白介素-8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)而对Product ft应答。
使用市售的定量ELISA测定来检测对制品R存在作用下培养U937细胞分泌IL-S和MCP-1的情况。使用在这些测定中的阳性应答作为制品R生物活性的指标。该试验也可以用来证明制品R中纯化肽组分的生物活性。
制品U肽的硫酸铵沉淀：将制品U样品冻干，然后再溶于20％的原始样品水溶液中(浓缩5倍)。向该溶液中加入硫酸铵结晶，至达到60％硫酸铵饱和(390mg/ml溶液)，温和混合使结晶溶解。在冰上保温30mm至1hr后出现蛋白质沉淀，以16,000xg于40℃离心30分钟。将沉淀溶于5％的原始样品水溶液。通过BioGel P-2柱，经凝胶过滤色谱使溶液脱盐。该柱用0.1X磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗脱。合并仅含有蛋白质的流分并冻干。
通过凝胶ruhranon色谱法分离制品R的两种主要肽：将BioGelP-10柱(1.6cm×52cm)用0.1X浓度的PBS平衡。将2ml 2X浓缩制品R加样至该柱上，以25mI/hr的流速用同一缓冲液洗脱。收集4mm.流分。所有含蛋白质的流分通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。分别合并主要含有肽A和肽B的流分，然后冻干。肽A合并物含极少量其它肽污染物，然而，肽B合并物虽然高度富集，但仍含有作为主要污染物肽A。所述合并物中肽纯度的合理估计为对于肽A而言＞90％，而对于肽B而言＞75％。
U937细胞培养：U937人hystiocytic淋巴瘤细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。将细胞解冻，在补充于56℃热灭活30分钟的10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1x青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中在对数生长(5-9×105细胞/mL)时保持。
制品R或分离肽处理：将细胞(1.0×105/ml)在含有制品R、分离纯化肽溶液、混合肽溶液或Dulbecco氏PBS的生长培养基中培养2天。离心后，用趋化因子ELISA试剂盒对培养上清液进行分析。培养基中制品R的终浓度为10％(v/v)。将经硫酸铵沉淀的肽在培养基中重建，得到10mg/ml溶液。也使用培养基作为稀释剂来制备两种2倍稀释液。在U937细胞培养中以10％的终浓度使用这些溶液。将单独冻干的肽在无内毒素的水中重建，得到2mg/ml溶液(这相当于制品R中每种肽的近似浓度)。以4mg/ml的终浓度制备两种肽的等摩尔混合物。在培养基中以10％的终浓度使用这两种肽，以进行所述测定。
分泌的IL-8和MCP-1的测量：分别采用人IL-S ELISA试剂盒(Endogen.Inc.)和Quantikine人MCP-1 ELISA试剂盒(R&D Systems，Inc.)，按照生产商的说明(对MCP-1 ELISA稍加修改)，通过ELISA测定培养上清液中IL-8和MCP-1的浓度。在PowerWave 200 Microplate.Scanning Spectrophotometer上测量吸光度。用每个生产商供应的标准蛋白质的稀释液产生四参数逻辑斯谛拟合标准曲线，并且通过外推法确定每种上清液中趋化因子的浓度。
结果和结论：通过硫酸铵沉淀、冻干和在PBS中重建来分离制品R的肽组分。分析它们增加0937细胞分泌IL-8和MCP-1的能力。用以10mg/ml开始、浓度逐渐降低的肽溶液进行两种不同的测定。两种测定结果的平均值示于图19图中。对于IL-8和MCP-1两者分泌，反应是剂量依赖性的。对于IL-8测定，10％的10mg/ml肽溶液能够诱发与10％完全制品R相似的反应。(same lot from which the peptides wereprecipitated)。对于MCP-1，10％的10mg/ml溶液不能诱发与完全制品R相当的总反应。
为了进一步分析制品R的肽组分正调节U937细胞分泌IL-8和MCP-1的能力，通过凝胶过滤色谱制备肽A和肽B的富集制剂。分析单独的以及以等摩尔量混合的(4mg/ml溶液)、在培养基中以10％的终浓度的肽A和肽B溶液(2mg/ml)(制剂B更多地被肽A污染，反之亦然)。两个独立测定的结果示于图20中。肽B溶液保持制品R正调节U937细胞分泌IL-8的能力的大部分，而肽A溶液仅诱发较少的反应。混合肽溶液达到与制品R相同的活性。这些结果表明需要存在这两种肽，以便获得制品R的全部活性。就MCP-1而论，肽-A、肽-B和这两种肽的混合物的每种都不能诱发制品R对MCP-1正调节相同的反应，表明对于制品R的全部活性需要某些其它的制品R组分。这两种肽的混合物分别比每种肽的活性高，并且肽B的活性略高于肽A的活性，再次表明对于制品R的全部活性需要这两种肽的存在。注意到，在两种情况下，肽-B比肽-A诱导更高水平的IL-8或MCP-1的分泌。由于肽-B含有与所述肽共价结合的二核苷酸，因此这样的结构可以负责肽-B的更高水平的生物活性。
以下实施例仅用来说明制备制品R的方法，不应解释为对本发明的限制。
实施例
在合适的容器中，在约2.5升USP注射用水中，于约3-7℃悬浮约35.0g酪蛋白、约17.1g牛肉蛋白胨、约22.0g核酸(酵母RNA)、约3.25g牛血清白蛋白，温和搅拌，直至所有组分已适度溶解。搅拌下小心加入约16.5g氢氧化钠(试剂级ACS)，继续搅拌直至氢氧化钠完全溶解。在约9lbs压力和200-230°F下高压灭菌一段时间，直至RNA被完全消化，例如约4小时。达到规定时间时，停止高压灭菌，让反应瓶和内容物缓慢冷却至环境温度。然后，于约3-8℃冷却至少6小时。使用诸如氮气或氩气的惰性气体，让所得溶液在低压(1-6psi)下通过2微米和0.45微米滤器。以相似的方式，让所述溶液通过0.2微米致热原保留滤器再次过滤。所得的滤液即为样品，测定其总氮。然后进行计算，以确定待加入到滤液中的注射用冷却水的量，得到经稀释的滤液，氮含量介于约165-210mg/100ml，终体积约为5升。然后或者用浓HCl(试剂级ACS)或者用1.0当量NaOH调pH至至约7.3-7.6范围。然后使经稀释的溶液在低压惰性气体下通过0.2微米滤器再次过滤。然后在惰性气体氛围下，将终滤液灌入2ml玻璃安瓿中，然后封口。收集安瓿，对于最终灭菌，于240°F和在14-16磅压力下高压灭菌约30分钟。灭菌循环后，将装有制品R的安瓿冷却并洗涤。
所有数量都正负15％的pH、体积和分析校正的变化。
尽管制品R作为药用制剂的部分给予是可行的，但是优选将其单独给予，但是因为一种或多种其它药物独立给予，因此本发明药物可与其它药物在大致相同的时间给予。如果制品R作为药用制剂的部分给予，则本发明的制剂包含至少一种如上限定的给予成分及其一种或多种可接受的载体和任选的其它治疗组分。所述载体在与制剂中的其它组分相容的意义上必须是“可接受的”并且对于其接受者是无害的。
因此，尽管已说明和描述并指出本发明应用于其优选实施方案的基本新特征，但是不用说在不偏离本发明的精神的情况下，本领技术人员可以对所述装置的形式和细节以及其操作进行各种省略和替换和变化。例如，特别是指以大致相同的方式进行大致相同的功能以得到相同的结果的那些成分和/或方法步骤的所有组合都在本发明范围内。此外，还应该认识到，结合本发明任何公开的形式或实施方案说明和/或描述的结构和/或成分和/或方法步骤可以作为设计选择的通用主题结合到任何其它公开或描述或建议的形式或实施方案中。因此本发明仅受所附权利要求书范围的限制。
序列表
<110>FRIEDLAND，BERNARD
HIRSCHMAN，SHALOM Z.
TARAPOREWALA，IRACH B.
<120>治疗组合物的制备
<130>4493-2CIP2
<140>09/764,017
<141>2001-01-17
<150>09/344,095
<151>1999-06-25
<150>08/735,236
<151>1996-10-22
<160>3
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>1
Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp
1 5 10 15
Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly
20 25 30
<210>2
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>2
Gly Glu Ile Pro Asp Ala Gly Gly Arg Ile Val Asp Tyr Tyr Val Gly
1 5 10 15
Phe Ser Asp Ser Val
20
<210>3
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<220>
<221>MOD RES
<222>(20)..(21)
<223>序列中不能明确确定的残基
<400>3
Gly Glu Ile Pro Asp Ala Gly Gly Arg Ile Val Asp Tyr Tyr Val Gly
1 5 10 15
Phe Ser Asp Xaa Xaa
20