本发明涉及将金属螯合物部分限定在脂质体膜上的脂质体剂。
通常，先前推荐的膜限定螯合物包括线型螯合剂基团，如DTPA，
带有一个或两个用于连接亲脂性锚基的螯合官能团，其实例包括二棕榈
酰磷脂酰乙醇胺(PE)：Karlik等人的DTPA-酐螯合剂(见Mag.Res.
Med.19：56-66(1991))，Hnatowich等人的DTPA-二硬脂酰
胺(见J.Nucl.Med.22：810-814(1981))，Tilcock等人的DTPA
-硬脂酰酯(见Mag.Res.Med.27：44-51(1992))和Unger等
人的各种携带螯合剂的双亲脂基(见WO-92/21017)。
除了携带双亲脂锚基的线型螯合剂外，Unger(同上)也建议使用
在环上相对的两个氮原子上携带亲脂基的N4大环螯合剂。所描述的制备
双锚定螯合物的合成途径产生非1，7-二酰胺类的产物混合物。制备1，7
-二取代同分异构体的合成途径要复杂得多。例如，由Dumont描述的
方法(Tetrahedron Lett.35(22)，3707)。此外，螯合效率受到十
分不利的影响。由于脂质体是通过RES从身体中清除并因此而暴露于肝
细胞内的酸性环境中，所以，高度稳定的配合物必须避免长期保留钆。
我们发现，通过使用与具有仅与环上一个原子连接的亲脂性锚基的大环
螯合剂部分连接的膜可以使金属消除最佳化。
因此我们发现，通过使用与大环螯合剂部分连接的膜可以使金属的
利用和消除最佳化，其中，所述大环螯合剂部分具有仅与环上一个原子
连接的亲脂性锚基，优选地，在脂质体形成后，通过可生物降解键，将
大环螯合剂和锚基彼此偶联。
因此，一方面，本发明提供脂质体剂，它包含具有连接在其膜上、
螯合的、诊断或治疗上有用的金属离子的脂质体，结合所述金属离子的
螯合剂具有大环螯合剂部分和与其环上一个原子连接的亲脂性膜缔合部
分。
另一方面，本发明也提供包含脂质体膜形成化合物和造影增强化合
物的组合物，其中后者中包含大环螯合剂部分和与其环上一个原子连接
的亲脂性膜缔合部分；由此可生产脂质体组合物。
本发明尤其重要的是提供使造影增强组分从肝脏的消除作用加强的
脂质体组合物。最终，脂质体通过RES识别，通过吞噬作用吸收到细胞
中并沉积在肝脏中。螯合物从肝脏中消除的机理尚不清楚。水不溶性疏
水物质，如GdDTPA-SA无期限地保留在肝脏中。大多数水溶性配合
物从肝脏消除的半衰期为6-8天。然而，我们发现，在造影剂结构中
掺入某些部分能加速从肝脏消除。例如，带有苯环的钆螯合物与简单的
脂族配合物相比，前者改善了从肝脏的消除。通过在苯环上存在一个或
多个可离子化的基团(如羧酸根或磺酸根)可实现消除的更进一步改善。
可以将消除增强基团以锚定基(anchoring group)，连接基的形式或
作为锚定基或连接基的生物降解产物的形式引入造影剂结构中。
在造影增强化合物中的大环螯合物部分最好是亲水性的，并且当在
脂质体中时，可以带静电荷或不带。结果，螯合物部分将定位在脂质
层或脂质体膜层的外面。尽管本发明允许螯合物定位在脂质体膜的外面
或在水性脂质体核心腔内，但特别优选螯合物部分优先选择性地、主要
地或基本上全部定位在脂质体的外面。这尤其适用于所螯合的物种是作
为正的、T1-MR造影剂的情况。
另一方面，本发明提供制备本发明脂质体造影剂的方法，所述方法
包括下列步骤之一：(a)将包含水性载体介质、脂质体膜形成化合物
和可任选地金属化的具有连接在一个大环环原子上的疏水性膜缔合基的
大环螯合剂化合物的组合物转变为脂质体组合物并且如果需要，在此之
后，将所述螯合剂化合物金属化；和(b)将可任选地金属化的大环螯
合剂化合物偶联到具有引入到脂质体的脂质体膜内的疏水性部分的锚化
合物上并且如果需要，在此之后，将所述螯合剂化合物金属化。
可通过下面进一步讨论的常规方法来实现脂质体的形成和螯合剂的
金属化并且也可以通过常规的偶联反应，利用适当地官能化，和活化(如
果需要)的螯合剂和锚化合物，可任选地与双官能连接剂一起来实现螯
合剂：锚的偶联。
本发明脂质体造影剂组合物可用于诊断成像方法中，因此，另一方
面，本发明也提供产生人或非人、优选哺乳动物身体增强的图像的方法，
它包括将造影剂非肠道给予到所述动物身体中，特别是给予到全身脉管
系统中和至少在所述动物身体的部分部位产生图像，其改善包括所给予
的所述造影剂为本发明脂质体剂。
再进一方面，本发明也提供利用大环螯合剂或螯合物或其盐来生产
用于诊断成像的本发明脂质体造影剂。
由于已公知，可生产生物可耐受性脂质体，并且由于在体内，本发
明脂质体造影剂将仅生物降解成脂质体组分(膜和成核物质)和造影增
强物质或其代谢物，设计具有容易鉴定的代谢物并且其生物分布和生物
消除也容易研究的脂质体剂比设计大分子脂质体剂更简单和更直接。
因此，本发明脂质体剂中的螯合剂为双官能团物质，它具有螯合部
分和通过键或连接基部分连接在其上的膜锚定部分。其有利之处是，连
接基部分将结合可生物降解的键，使得低分子量的螯合物分子可以在脂
质体降解前或降解后，从脂质体中释放出来，以便于促进其生物消除。
为了实现该目的，尤其优选螯合物部分，任选地与其连接基部分降解后
残余物一起为水溶性的。
这种锚-可生物降解的连接基-大环螯合剂化合物，其盐和螯合
物本身是新的并且构成本发明的另一方面。
特别优选连接基部分至少部分产生于将大环螯合剂偶联到亲脂性锚
分子上的反应中。因此，尽管可在脂质体形成前制备亲脂性锚-大环螯合
物，但特别优选通过将大环螯合剂，或者更优选通过将金属化的大环螯
合剂偶联到已结合入脂质体膜中的分子上就地来制备这样的化合物。
因此，特别优选的一类螯合剂分子为通式(I)的那些：
An-L-Ch(R)n (I)
其中An为疏水性膜缔合基团，L为连接到Ch的环原子上并且可在可生
物降解键处断开的连接基部分，并且Ch为携带或未携带一个或多个亲水
性或部位指定基团R的大环螯合剂部分(即，n为0或正整数)。
在另一实施方案中，螯合剂是两亲性化合物，如PCT/GB95/00833
(在此附上所申请正文的复本并将其内容参考结合入本文中)中所述，
即式(II)化合物：
(R)nCh-L′-Ar-(AH)q (II)
其中(R)nCh为上述定义的亲水性大环螯合剂部分，L′为连接到Ch的环
原子上的氧取代或氧未取代的C2-25亚烷基连接基部分，其中至少一个
CH2部分被氧杂、氮杂或硫杂基置换并且可任选地被生物可降解基团M
间隔开，Ar为任选地由另一个芳环取代的芳环或者为带有稠合在其上
的另一个芳环的芳环，q为正整数，优选1或2，并且各AH为质子酸
基(protic acid group)，例如，碳、硫或磷的含氧酸。
适宜的螯合剂部分Ch(R)n为下式基团：
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其中：p为3、4、5或6，优选4；
各m为2、3或4，优2；
各R1为氢原子，亲水性基团，或部位指定基团；
并且各X为R1基或金属配位基，但连接到R1基上的一个碳或氮原
子提供与连接基部分连接的键。
优选的配位基的实例包括由羧基、磷酸根或硫酸根基取代的，并且
可任选地由一个或多个R1基进一步取代的C1-3线型烷基。特别优选的
是羧甲基和膦酰基甲基。
优选的亲水性基团包括羟基化的和/或烷氧基化的烷基，例如，羟甲
基，2-羟乙基，3-羟丙基，2，3-二羟丙基和2-羟基乙氧基乙基。
在本文所提到的螯合部分和连接基部分中，除另有说明外，烷基或
亚烷基部分最好包含1-6个碳原子。
因此，优选的螯合剂部分包含下式基团：
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(其中各m为2、3或4，优选2；各R2为氢或烷基，所述烷基至少由
一个羟基、烷氧基、氨基、氧、羧基、磺酸、溴代酰基、异硫氰酸酯或
定位基团取代和可任选地被饱和或不饱和的碳环或杂环取代或者结合入
饱和或不饱和的碳环或杂环；和各Z为CO2H、PO3H、CPN(R2)2或者
R2基，至少有2个并且最好是3个全部为COOH或PO3H基；并且一个
R2基为与连接基部分连接的键)。
特别优选的螯合剂基团包括DO3A和DOTA基，例如：
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或
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(其中，各Z为COOH或PO3H，优选COOH并且各R2为氢或亲水基，
例如C1-4单或多羟基烷基)。
特别优选，螯合剂基团为简单的下式DO3A基：
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和DO3A单酰胺，如WO95/24225和PCT/GB95/00833中所述。
用于将螯合剂部分限定在脂质体膜上的疏水性“锚”基可以是任何
能够发挥该作用的疏水性基团。
通常，它包含一个或多个，例如1、2、3或4个，但优选1或2
个亲脂链，或者单环或多环的，饱和或不饱和的基团，后者可以是取代
的或未取代的，其取代基为直链或支链，不饱和或饱和的C1-12烷基，
氟原子或碳、硫或磷的含氧酸基或其酯或酰胺，例如C1-20烷基酯或烷
基酰胺，其中烷基可任选地为不饱和的或氟化的。当上述式(II)螯合
剂中的单链锚基在脂质体中时，它可以折叠，显现出在膜表面上的(R)nCh
和Ar(AH)q基，其中折叠的连接基L′作为膜缔合锚。
适宜的环状基团的实例包括苯基，联苯基，萘基，5-7元含O，
N或S的杂芳基，甾基等。适宜的直链疏水基的实例包括C12-18饱和的，
不饱和的或氟化的，例如全氟化的烷基。
很多适宜的锚定基是文献中已知的。例如见Kinsky，Biochim
Biophys Acta 769：543(1984)，Kung，Biochim Biophys Acta
862：435(1986)，Gregoriades，Biochem Soc.Trans.17：128(1989)，
Wessig，Biochim Biophys Acta 1003：54(1989)，Dancy，J.Immunol
122：638(1979)，Carroll，J.Med.Chem 29：1821(1986)，Unger，WO
92/21017和Herslf，WO91/21384。
优选的可以该方式用作锚定基的磷脂实例包括磷脂酰乙醇胺
(PE)的C4-14α，ω-烷烃-二羧酸酰胺，例如带有二油酰基、二棕榈
酰基或其它两个脂肪酸链的PE(如N-琥珀酰、N-谷氨酰基和N-
十二碳烯基-PE)和胆固醇的酰胺。
在本发明的优选实施方案中，脂质体形成后，将锚基偶联到螯合剂
部分。为了实现该目的，使用能够结合入脂质体膜中并将官能团(用于直
接或间接与螯合剂连接)留在膜外面的锚化合物。
这样的化合物宜包括在锚基和螯合剂连接基之间的间隔基部分，该
部分尤其宜为两亲性的。该化合物的实例包括下式II-V化合物：
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Ar′-O-Y-Z1 (III)
![]()
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(其中各R3独立地为C12-18饱和的，不饱和的或全氟化的烷基；
w为0或1；
各X1独立地为键，氧或硫原子或NH基；
r为0，1，2或3；
s为0或1；
X2为键，氧或硫原子或NH或-OPO3H-基；
Y为(CH2)t，(CH2CH2O)t，(CH2)tX1-Ar′-X1(CH2)t或(NHCH2CO)t
基；
各t为整数0-12；
各Ar′为苯基，联苯基，萘基或5-7元含O、N或S的杂芳基，
并可任选地被COOH，SO3H，PO3H，PO2H或COOR3基取代；
Z1为CO2H，NH2，COO-琥珀酰亚胺，马来酰亚胺，硫醇，
COCH2R4，Ar′NCS，Ar′N3，Ar′NCO或CHO基；和
R4为OTs，OMs，I，Br或Cl基)。
在锚：螯合物轭合物(chelate conjugates)中的连接基可以是具有
连接疏水性锚基(一个或多个)作用的带有螯合基团的任何基团，它藏
入脂质体膜中，螯合基部分在膜外。根据生产携带螯合物的脂质体的方
式，连接基可以含或可以不含产生锚化合物：螯合物化合物轭合物的基
团，然而，情况通常是这样。类似地，它们可以或可以不，但最好包含
亲水性，或更优选两亲性部分，该部分将螯合基与膜表面隔开。此外，
连接基最好包含可生物降解的官能团，它可分开并释放螯合物分子(本
文所使用的术语分子包括带电和不带电的种类)，促进其生物消除，或
者，也许在治疗过程中，促进治疗金属在治疗部位的释放。
适宜的，可生物降解的官能团的实例包括酯、氨基甲酸酯、双酯和
二硫键。双酯键，即式-O-CO-O-CH2-O-CO-O-键，其
中的一个或两个末端氧可以省略并且其中的亚甲基可被取代，特别适于
作可生物降解键。
因此，连接基部分宜包含直链或支链C2-20亚烷基链，它可以或可
以不由N，O，S和P原子或由饱和或不饱和的碳环或杂环终止或间隔
并且可任选地被氧或氟原子或由羟基、胺、烷氧基、亚氨基、烷基或芳
基取代，所述烷氧基、亚氨基、烷基或芳基本身可任选地被羟基、胺或
C1-5烷氧基取代。
如果连接基与锚或螯合物部分的环上杂原子连接，那么连接基的末
端原子通常为碳。就DO3A和类DOTA的N4C12大环而言，在锚：螯合
物偶联反应中，最好通过环上氮，例如，通过N-羧甲基或环上NH基
连接，尽管不优选，但也可以通过环上碳连接，例如，利用C-芳烷基
取代的螯合物，如Meares等人推荐的那些螯合物(见Bioconjugate Chem.
3：563(1992))。
用于这样的偶联反应的螯合物分子最好携带反应侧链(优选在环氮
上连接)，该侧链携带反应基如羧基，硫醇，NCS或胺基。携带该基团
的链宜为C1-20亚烷基，它可任选地被芳基或被N、O或S原子间隔并
且可任选地被氧、烷基或氟取代，例如-CONHCH2CH2NH2，
CONHCH2CH2NHCO(CH2)3COOH。诸如这些之类的基团可很容易地在
DOTA或DO3A N-羧甲基或-NH-部位形成。
就上述式(II)螯合剂而言，优选的连接基结构L′的实例包括
(CH2)dO，其中Ar为双环时d为1-15，而Ar为单环时d为6-15，
优选的Ar(AH)q基包括4-羧基苯基和3，5-二羧基苯基。特别优选的
式(II)螯合剂包括下列物质：
名称
(R)nCh
L′
Ar(AH)q
DO3A DOBA
DO3A DOIA
DO3A DOmBA
DO3A OOBA
DO3A HOBA
DO3A DOoBA
DO3A
DO3A
DO3A
DO3A
DO3A
DO3A
(CH2)10O*
(CH2)10O*
(CH2)10O*
(CH2)8O*
(CH2)6O*
(CH2)10O*
4-羧苯基
3，5-二羧苯基
3-羧苯基
4-羧苯基
4-羧苯基
2-羧苯基
*氧与Ar连接
当然，被螯合剂部分螯合的金属的选择依赖于所需要的本发明脂质
体剂的最终用途，但通常选自顺磁，重金属或放射性金属本身或多原子
簇(polyatomic clusters)。
除了锚：螯合物分子外，脂质体剂通常应包括脂质体膜形成化合物，
即脂质并且尤其为磷脂，以及构成脂质体核心及其外环境，通常为水性
介质的物质。
脂质体本身为具有脂质层包围的中央空间的球形泡囊。本发明尤其
涉及分别具有单一脂质双层或多脂质双层包围的水性核心的单层脂质体
或多层脂质体。
当脂质，特别是磷脂在水性介质中分散时，脂质体自发地形成并且
可通过常规技术生产本发明脂质体剂的脂质体结构。在WO92/21017
(Unger)和Papahadjopolous在Ann Rep.Med.Chem.14：250-260
(1979)中提到了这些常规技术，包括反相蒸发，冰冻-熔化，洗涤渗
析，均化作用，声处理，微乳化作用和当干燥的脂质膜水合时自发形成。
本发明可使用多层脂质体或者可以通过已知的方法，将多层脂质体转化
为层数低的脂质体或单层脂质体。也可以直接制备单层脂质体。
典型地，脂质体制剂大小不均匀并且可通过已知的方法，例如挤压，
冰冻-熔化，机械碎裂，均化作用和声处理，将本发明所用的脂质体制
成所需直径的大小。本发明所使用的脂质体最好为20-5000nm直径的
单层或多层脂质体。
可将脂质体冷冻干燥来增加贮存期限并且可通过在使用前与水性缓
冲剂一起剧烈振摇，将冷冻干燥的脂质体重新配制。脂质体制剂中可包
含在冷冻干燥方法中，用于稳定脂质体物质的试剂。
小于200nm的脂质体可在制成后，通过在0.2μm的滤器上过滤来灭
菌。
典型地，用作脂质体膜形成分子的脂质方磷脂或氢化的磷脂如天然
或合成的磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，溶血
卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰甘油(PG)，
磷脂酰肌醇(PI)，鞘磷脂，心磷脂，磷脂酸(PA)，脂肪酸，神经
节苷脂，葡糖脂(glucolipids)，糖脂，单、二或三甘油酯，神经酰胺
或脑苷脂类，例如在WO-92/21017中描述的那些脂质体膜形成化合
物。
成膜脂质也可以包括可聚合的脂质，例如，含甲基丙烯酸酯的脂类，
含硫醇和二硫化物的脂类，含二烯酸酯的脂类，含苯乙烯基的脂类和含
diacetylanic的脂类，如Johnston在Liposome Technology Vol。I，
Gregoriades Ed.，pages 123-129(1983)和Singh在Phospholipid
Handbook，Cevc Ed.，Dekker，pages 233-291(1993)及其参考文献中所描
述的那些脂类。在脂质体构成中应用可聚合的脂类提供了一条增加脂质
体稳定性的途径。
例如，脂质体膜中也可以含有甾族化合物和其它混入其中的化合物
来影响脂质体的生物分布。适宜的甾族化合物包括例如胆固醇，胆固醇
衍生物，胆甾烷，胆酸，和胆汁酸，但优选胆固醇。
包含甾族化合物可以改变脂质体膜的流动性并且这影响生物分布。
因此，转变温度越高的脂类导致其血液半衰期越长，并且包含胆固醇导
致其刚性更大和可渗透双层更少。可以观察到，加入胆固醇可降低RES
-摄入。
通过使用具有生物分布调节功能的侧基(pendant)的磷脂衍生物，
通过使用具有与脂质体膜相关联的疏水性“锚”部分的生物分布调节剂
或通过将生物分布调节剂与存在于脂质体膜上的锚分子(如上关于螯合
限定中所述)偶联，可以结合生物分布调节剂。
特别优选的生物分布调节剂包括在体内减少蛋白质与脂质体的结合
并因此延长血中脂质体半衰期的化合物，特别是两亲性聚合物。在这点
上，聚亚烷基氧基聚合物，如聚乙二醇(PEG)和神经节苷脂，如Gm1
是有效的。
掺入相对于脂质体膜形成物质重量1-10％的PEG-PE衍生物明
显地延长血半衰期。
由全氟化的磷脂制备的脂质体(见Santaella，FEBS Letters 336：
481-484(1993)和Angew，Chem.Int.Ed.Eng.30：567-568
(1991))也可以延长血半衰期。
通过掺入其上结合了对肿瘤相关性抗原、卵磷脂或肽具有特异性的
单克隆抗体或抗体片断的脂质可以获得对特定器官或组织的靶向活性。
脂质体生物分布也明显地依赖于表面电荷，并且本发明脂质体最好
可包含相对于脂质体膜形成物质重量1-10％的带负电荷的磷脂，如磷
脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酸和磷脂酰肌醇。
如上所述，可通过几种方法将所螯合的金属限定在脂质体上，例如：
(i).通过将限定在预先形成的脂质体表面上的螯合基金属化；
(ii).通过将螯合物部分偶联到预先形成的脂质体的锚分子上；
(iii).通过使用包括螯合物：锚分子在内的脂质混合物来形成脂
质体。
三种方法均为本发明的内容。这些方法由于避免了疏水性螯合物的
合成和纯化(见方法(iii))和由于避免了不想要的、金属与脂质体之间较
弱的(体内容易逆转)结合(见方法(i))，简化了制备膜结合剂的步骤。
如上所述，优选地，通过将金属化的螯合物分子偶联到预先制备好
的脂质体中的锚分子上来制备本发明脂质体。在该方法中，螯合物仅结
合到脂质体膜的外部。用衍生化的螯合物制备的脂质体具有结合到膜内
和膜外的配合基。膜的水渗透性或大量水通过膜的扩散速率将决定内部
顺磁离子的驰豫性(relaxivity)。就结合紧且稳定的脂质体来说，其内
部钆的驰豫性可能很低。因此，当螯合基仅仅限定在脂质体外部时，金
属的利用率是最佳的，即脂质体中每个金属离子均具有高驰豫性。
螯合物仅仅连接到脂质体的外部对于结合放射性核素，特别是α-
发射体来说也是有利的，因为脂质体膜不必被α-射线穿透。
因此，可通过常规方法，由磷脂混合物来制备脂质体，其中所述磷
脂混合物包含锚化合物，即具有限定到反应官能团上的疏水性锚部分的
化合物，所述反应官能团提供与螯合物部分结合的结合点。然后，可通
过已知方法，将脂质体制成需要直径的大小。然后，将反应官能团偶联
到螯合物上可相容的官能团上，并且例如，通过凝胶渗透色谱法，渗析
或超滤作用，可以很容易地除掉未反应的低分子量试剂。
锚化合物的含量宜为脂质体膜形成化合物总重量的5-50％，优选
10-30％。事实上，螯合物在外部直接与反应基团偶联的偶联率可
能非常高，例如大约90％。
锚化合物上的反应基可以仅为在脂质体膜脂质上的伯胺，它可以与
螯合物分子的非配位羧基反应。通常，大多数公知的将螯合物偶联到大
分子如蛋白质上的方法可用于将螯合物连接到脂质体上。然而，表面化
学将受到脂质体稳定性的限制，因此需要监测反应混合物的pH和重量克
分子渗透压浓度。通过下列图解来举例说明偶联方法的几个实例：
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作为将螯合物偶联到脂质体锚基上的另一种方法，可以在脂质体形
成前，将锚基偶联到螯合物上。在水溶液中，将螯合剂金属化，然后通
过常规方法，使用混合溶剂，将螯合物偶联到锚分子上。然后，利用包
括螯合物：锚分子在内的脂质混合物来制备脂质体。这避免了当将螯合
物在脂质体表面就地金属化时可能发生的金属离子与脂质体非特异性结
合的问题，以及在脂质体形成前，将水不溶性螯合剂金属化时带来的溶
解性问题。在脂质体形成过程中，金属离子也可以作为保护基来保护可
能存在的活性螯合基。
为了制备本发明造影剂组合物，在生理上可耐受的液体载体，例如
水溶液中制备脂质体，其中，所述液体载体中可包含一种或多种添加剂，
如pH调节剂，螯合剂，抗氧化剂，张力调节剂，冷冻保护剂，其它的造
影剂等。
适宜的，调节pH的组分的实例包括生理上可耐受的酸，碱和缓冲
剂，如乙酸，枸橼酸，富马酸，盐酸，苹果酸，磷酸，硫酸或酒石酸，
氨，碳酸铵，二乙醇胺，二异丙醇胺，氢氧化钾，碳酸氢钠，硼酸钠，
碳酸钠，氢氧化钠，三乙醇胺(trolamine)，磷酸铵，硼酸，枸橼酸，
乳酸，偏磷酸钾，磷酸二氢钾，醋酸钠，磷酸二氢钠，枸橼酸钠，乳酸
钠，磷酸钠，Tris和N-甲基葡糖胺。
适宜的螯合剂的实例包括EDTA，DTPA，DTPA-BMA及其盐
和配合物，尤其是钙，钠或葡甲胺盐，例如乙二胺四乙酸二钠，乙二胺
四乙酸，EDTA钙。
适宜的抗氧化剂的实例包括抗坏血酸，抗坏血酸棕榈酸酯，半胱氨
酸，一硫代甘油，叔丁对甲氧酚，二叔丁对甲酚，连二磷酸，棓酸丙酯，
硫酸氢钠，甲醛合次硫酸钠，偏硫酸氢钠，硫代硫酸钠，二氧化硫或生
育酚。
适宜的张力调节剂的实例包括氯化钠，葡萄糖，蔗糖，甘露糖醇，
山梨糖醇和右旋糖。优选地将这些张力调节剂用于使制剂与血液等渗或
接近等渗。
适宜的抗菌剂的实例包括氯苄烷铵，苯甲醇，氯丁醇，间甲酚，对
羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯和timerosal。
适宜的冷冻保护剂，即在冷冻干燥和再配制过程中发挥辅助作用的
试剂包括氯化钠，山梨糖醇，甘露糖醇，葡萄糖和聚乙二醇。
如上所述，液体载体可包含第二种造影剂。这使得第二种造影剂被
包裹在脂质体内部水性环境中。在外部水性环境中的造影剂可以被除掉
或者也可以不被除掉。这可用来制备双重造影剂〔例如，在WO89/09625
中的描述〕。例如，T2*敏感剂(susceptability agent)，如可溶性镝配
合物如DyDTPA-BMA可包裹在脂质体中，而T1驰豫剂，例如钆配合
物如GdDO3A结合到膜的外面。第二种造影剂包括例如水溶性MRI、
X-线、闪烁照相和光显像剂。
其它可包裹在脂质体内的造影剂的其它实例包括重金属簇及其螯合
物，如WO91/14460和WO92/17215中所述。该脂质体例如可用作X线
造影剂，特别是(Ct)2L3簇(其中Ct为金属簇，例如W3或W4簇，并且L
为配位体)。
选择本发明脂质体造影剂中所螯合的金属以提供在所选择的成像方
式中所需要的造影剂。就MRI和磁成像而言，这通常涉及驰豫时间(即
T1，T2或T2*)调节中心如顺磁金属离子和多原子簇离子的螯合作用。
就X线成像和CT成像而言，通常所螯合的金属为原子序数为37或更
高的，高原子序数(因此使得X线截面大)金属离子，或多原子簇离子。
就光成像而言，金属螯合物部分为具有特征性吸收或发射峰的发色
团或荧光团。就SPECT，PET和闪烁照像而言，需要螯合适宜的金属离
子放射性发射体。
因此，在MRI领域，本发明尤其包含结合造影增强剂的多种配合物
的脂质体造影剂，其中所述造影增强剂结合到脂质体膜的双层上。造影
增强剂可以是任何磁性金属离子，金属离子簇或微晶。这尤其包括原子
序数为21-29，42，44或57-71的离子或簇离子。典型地，正MRI
造影剂可包含金属离子Eu(III)，Gd(III)，Dy(III)，Ho(III)，
Cr(III)，Fe(III)，或Mn(II)。典型地，负造影剂包含Tb(III)，
Sm(III)，和尤其是Dy(III)离子，
放射性同位素和脂质体的结合可用于闪烁照相成像或作为治疗剂。
特别优选的放射性同位素如下：99mTc，51Cr，201Tl，67Ga，68Ga，111In，168Yb，
140La，90Y，88Y，153Sm，156Ho，165Dy，64Cu，97Ru，103Ru，186Re，188Re，203pb，
211Bi，212Bi，213Bi，214Bi。根据所要求的治疗或诊断应用来决定金属离子的
选择。
就X线而言，通常螯合非放射性重金属离子。本发明包括使用原子
序数大于37的金属离子，特别是原子序数大于50的金属离子。特别优
选多核的金属离子簇，如WO91/14460中所述。
就作为光显像剂的应用而言，本发明的造影剂最好应该包含在近IR
(670-1300nm)，优选在1300nm附近具有吸收或发射作用的吸收或
荧光部分。消光系数应该尽可能地大，优选大于或等于105cm-1M-1。
就能够产生回声的，即能够作为超声造影剂的本发明脂质体造影剂
来说，优选具有层之间分离的、二或低聚层状结构。包含具有可离子化
基团(如羧酸根)链的脂质，其同心磷脂双层间的距离应该相对大些。
这应该增加脂质体的声反射作用。为了该目的，本发明包括掺入脂质衍
生物。
或者，可使用全氟化的脂质作为脂质体的组分。为了增加脂质体的
血共呜时间，使用全氟化脂质可增强脂质体的声学特性。
如上所述，可能的疏水性锚，即造影增强剂中的膜缔合部分可包含
磷脂，长的烷基链或包含多个长的烷基链的分子，它包括脂肪酸的酯或
酰胺，甾族化合物，芳基或多芳基。当沉积在肝脏中时，锚定基可用于
促进造影增强部分(例如螯合物)的消除。通过保持整个分子疏水性
和亲水性的平衡，例如通过在造影增强部分中包含可离子化的基团如羧
酸，膦酸或磺酸，可控制消除。在该方法中，可模似容易从肝脏中排泄
掉的、生物学相关化合物的结构。或者，疏水性锚可包含可聚合的基团，
使得通过将疏水性锚与囊泡的主体脂质聚合，能够形成更稳定的脂质
体。
在造影增强剂中造影增强部分与膜缔合部分之间的连接基可以是相
对不易发生生物降解的基团(如烷基，芳基或醚基)或者可以是可水解
的基团，例如包括羧酸或碳酸酯，二硫化物，缩醛，缩酮或硫酯，氨基
甲酸酯，酰胺，内酰胺，硫脲或脲基团。连接部分可包含发挥链作用的
间隔基，如饱和和不饱和的烷基链和/或环状结构，如脂环族，芳族，多
芳族和杂环基。为了使造影剂的偶联功效和驰豫性最佳，可改变间隔基
的长度和柔韧性。连接基可以是疏水性的，其结果是它包埋于脂质双层
中，或者是亲水性的，其结果是它延伸到水性介质中，因此，连接基在
控制造影增强部分代谢和消除途径中可发挥重要作用。
可选择脂质体的组成和大小以便于控制脂质体剂的生物分布。例
如，通过掺入具有带电极性首基的脂质，可制备带正或负表面电荷的脂
质体。当通过静脉施用时，表面电荷影响脂质体剂的生物分布〔见
Paphadjopolous Biochim.Biophys.Acta.1103：185-197(1992)〕
-RES吸收带负电荷的脂质体比吸收中性或带正电荷的脂质体更快，而
带正电或负电荷的脂质体在肺中的蓄积程度比中性脂质体大。
此外，脂质体的直径影响其生物分布和药物动力学。小脂质体的循
环时间比大脂质体的长。枯氏(Kupffer)细胞摄入大脂质体的速度快，
而肝细胞摄入小脂质体的速度快。注射后，非常大的脂质体(＞100μm)
被捕获在肺中。
脂质膜的亲水性也影响脂质体的循环时间。将亲水性或两亲性聚合
物如聚乙二醇轭合到膜表面，由于减小了巨噬细胞的吞噬细胞速率，使
得循环时间增加到8000％。
通过将配位体，碳水化合物，抗原，蛋白质，氨基酸，低聚肽，酶，
激素，抗体和抗体片断结合到脂质体的外表面，可获得具有靶向活性的
脂质体。一旦识别受体部位，脂质体结合到靶细胞上〔见Jones，Adv.Drug
Deliv.13：215-250(1994)，US-A-4603044，J.Med.Chem.，
29：1821-1826(1986)，Ann.N.Y.Acad.Sci.，689：427-43
(1993)，Liposomes Technology，Gregoriadis，ed.vol.II，(1983)，
及其参考文献〕。本发明也提供将多部位定向靶试剂，优选相对低分子
量部分如肽或抗体片断连接到脂质体外表面。
本发明造影剂可以在使用特定成像技术时，以足够产生所需造影效
果的量给予待成像病人。为了获得充分的造影增强作用，通常以每公斤
病人体重给予0.001-5.0mmol螯合的成像金属离子剂量是有效的。就
大多数MRI应用而言，优选的成像金属离子剂量范围为0.001-1.2，
例如0.01-0.5mmol/kg体重，而就X线应用而言，为了获得X线衰减，
通常0.5-1.5mmol/kg的剂量是有效的。就大多数X线应用而言，优选
的剂量为0.8-1.2mmol镧系元素或重金属/kg体重。
就X线应用而言，为了获大光子能量范围，在该范围，本发明造影
剂是最有效的，可使用均聚螯合物混合物形式或杂聚螯合物形式的两个
或更多个螯合金属。
本发明脂质体剂提供对先有技术的几点改善。
就血池成像(其中血滞留时间比ECF剂的长得多)和肝成像(其中
螯合物通过细胞摄入并且暴露于溶酶体的酸性环境中)来说，金属交换
速率是非常重要的。本发明应用大环螯合剂基团是重要的，因为它增强
了配合物的稳定性。此外，螯合物部分，如DO3A-Gd(III)可以是
中性的或选择性带电，并且这在控制生物分布中可能是有利的，因为脂
质体的表面电荷决定其体内命运。
将预先金属化的螯合物结合到按照制备本发明脂质体优选方法预先
制备的脂质体上，可以很容易地将未结合的螯合物从脂质体上除掉并使
其再循环，并且由于已将金属离子结合到螯合物上，这样阻止了金属离
子与脂质体或轭合的寻靶剂(conjugated targeting agents)的非特异
性结合。
本发明造影剂可以特别有效地消除螯合的金属。先有技术没有满足
这个要求。在小鼠体内研究胶囊剂和膜结合剂中放射性螯合物的消除。
本文实施例13具有比胶囊包封的GdDO3A配合物更好的消除半衰期
(3.2天与6天)。
本发明另一方面的内容在于利用可生物降解连接基产生定时释放螯
合部分的机制。这特别适用于治疗剂，即所螯合的金属具有治疗作用的
药剂。这样的治疗剂而不是诊断剂或造影剂也构成本发明部分。
本文所提到的全部出版物均引入本文供参考。
参考下列非限定性实施例进一步描述本发明。
在实施例中，通过将脂质体样品消化，再进行ICP分析来测定钆浓
度。通过将样品消化再采用钼酸盐，用分光光度计测定磷酸盐浓度来测
定脂质的浓度。利用具有两层适宜的Poretics聚碳酸酯膜的Lipex挤出机
挤出脂质体。利用Malvern Zetasizer 4，通过激光光散射测定脂质体的
大小分布。
从Avanti Polar Lipids获得所用的磷脂。将它们贮存在氩环境下
的冰箱中。从Aldrich获得胆甾醇并且从Sigma获得胆甾醇半琥珀酸
酯。从Aldrich获得1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺
盐酸盐(EDAC)并贮存在冰箱中。按照Torchilin的方法制备二棕榈酰
PE-戊二酰〔见Phospholipid Handbook，Marcel Dekker，Inc.，G.Cevc
编辑，第8章〕，按照Carroll的方法制备6-(胆甾烯基)-7-氧杂庚
-1-醇〔见J.Med，Chem.，29：1821，1986〕并且按照Koswer的方
法制备胆甾醇-O-甲苯磺酸酯〔见JACS，78，4347-4355
(1956)〕。
实施例1
1，4，7-三叔丁氧基羰基甲基-10-甲氧基羰基-甲基-1，4，7，10
-四氮杂环十二烷
将1，4，7-三叔丁氧基羰基甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷氢溴
酸盐(25.0g，42mmol)混合在乙腈中并用TMG(70ml)处理。一次
加入溴乙酸甲酯(6.5g，42mmol)并将混合物回流3小时。在室温下再
搅拌18小时后，通过旋转蒸发除掉溶剂和过量的TMG。将残渣溶解在
CHCl3中，用水洗涤并干燥(Na2SO4)。将溶剂蒸发掉，得到标题产物，
为灰白色油状物(23g，95％)。1H NMR(CDCl3)1.4(s，27H)，2.8(s，
16H)，3.2(s，6H)，3.4(s，2H)，3.6(s，3H)。
实施例2
1，4，7-三叔丁氧基羰基甲基-10-(N-(2-氨基乙基)-酰
氨基-甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷
将实施例1的甲酯(23.0g，40mmol)溶解在甲醇(500mL)中并
用乙二胺(200mL)处理。将混合物在室温下搅拌3天。通过旋转蒸发
除掉溶剂和过量的乙二胺，并将残渣溶解在氯仿中，用水洗涤，并干燥
(Na2SO4)。将溶剂蒸发掉，得到标题产物，为粘稠油状物(18g，
75％)。1H NMR(CDCl3)δ1.4(s，27H)，2.5-3.0(m，20H)，3.3(m，8H)，
6.0(br s，1H)。
实施例3
1，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲
基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷〔AE-D03A〕
通过在室温下与纯TFA(200ml)反应3小时，将实施例2的酯
(10.0g，16mmol)脱保护。除掉TFA后，将残渣溶解在1M NaOH中
并装载在离子交换柱〔AG 1×8(OH-)，200mL〕上。用水洗涤
柱子并用1.5M HOAc洗脱产物。将含标题产物的流分浓缩，得到7.0g
(93％)白色固体。1H NMR(D2O)δ2.9-3.6(br mult.)
元素分析C18H34N6O7HOAc：
计算值：C，47.14；H，8.11；N，16.49。
实测值：C，47.40；H，7.98；N，16.48。
实施例4
1，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲
基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷钆(III)〔GdAE-DO3A〕
将实施例3化合物(1.0g，2.38mmol)溶解在水(37ml)中。通过
加入1M NaOH将pH调至5。分次加入醋酸钆(III)直至金属略过量
(通过二甲酚橙判断)。在加入醋酸钆过程中，保持pH在5-6。将反
应混合物在室温下搅拌过夜。加入配位体(50mg)并不断搅拌直至二甲
酚橙试验显阴性。真空除掉水。将残渣在Sephadex G-10上层析，除
掉无机盐。用MS(FAB)分析流分：MH+＝602。
实施例5
1，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲
基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N-半琥珀酰胺
将在吡啶(20ml)中的实施例3化合物(6.1g，13.6mmol)加热直
至完全溶解。加入琥珀酸酐(1.5g，15mmol)，并将混合物加热1小时。
将溶液冷却并加入丙酮来沉淀产物。用丙酮充分洗涤白色固体并真空干
燥，得到5.0g标题产物(67％)。
实施例6
1，4，7-三(羧甲基)-10-(N-(2-氨基乙基)酰氨基-甲
基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N-半琥珀酰胺钆(III)
(A)将实施例5化合物(1.9g，3mmol)溶解在水(30ml)中。
用1N NaOH将pH调至5.0。滴加氯化钆(III)(～1.4/10mL)的水
溶液直至金属略过量并保持几小时。再加入钆(50mg)并将反应混合物
搅拌直至二甲酚橙试验显阴性。蒸发除掉水，并用乙醇将残渣洗涤几次。
通过反相(C18)制备HPLC，用2％甲醇/水作为流动相来纯化标题产
物。
(B)也可以通过另一种方法来制备标题化合物：将在DMSO
(10ml)中的实施例3化合物(240mg，0.4mmol)在80℃下加热直至
完全溶解。加入琥珀酸酐(40mg，0.4mmol)并将混合物加热6小时。
冷却至室温后，加入丙酮来沉淀标题产物。用丙酮洗涤白色粉末并真空
干燥。MS(FAB)：MH+683.2，MNa+705.1。
实施例7
13-胆甾烯基-3，6，9，12-四氧杂-十二烷-1-醇
将胆甾醇甲苯磺酸酯(2.0g，3.7mmol)和四乙二醇(6.42ml，
37mmol)溶解在二噁烷(100mL)中并在70℃下加热6小时。将溶剂
蒸发掉，并将残渣溶解在甲苯中，用水充分洗涤。将有机层干燥
(Na2SO4)，并浓缩为油状物。通过在短的二氧化硅柱上层析，用0-
20％甲醇/氯仿梯度洗脱来纯化粗品，得到1.0g(49％)标题产物，为
灰白色油状物。
实施例8
13-胆甾烯基-3，6，9，12-四氧杂-十二烷-1-酸
通过滴加至略过量的Jones试剂，将在丙酮(20mL)中的实施例7
化合物(0.5g)氧化。用异丙醇处理反应混合物并通过硅胶塞过滤。
通过TLC和NMR鉴定该标题产物粗品是纯的。
实施例9
GdDO3A-硬脂酰胺
将实施例3化合物(100mg，1.6mmol)溶解在DMSO(10mL)中
并用硬脂酰氯(51mg，1.6mmol)处理。将反应混合物在60℃下加热2
小时，并在室温下搅拌过夜。加入水(50mL)并将产物提取到氯仿(3
×100mL)中。将提取液干燥并浓缩，得到标题产物，为白色固体。
MS(FAB)868.5MH+。
实施例10
GdAE-D03A胆甾烯基氨基甲酸酯
将实施例3化合物(300mg，0.8mmol)溶解在DMSO(20mL)中
并用胆甾醇氯甲酸酯(225mg，0.5mmol)处理，将反应混合物在80℃
下加热5小时。将混合物在室温下放置直至析出无色结晶。
MS(FAB)：MH+1014.5，MNa+1036.5。
实施例11
LaD03A-琥珀酰基-PE
将LaD03A-琥珀酰胺(130mg，0.2mmol)溶解在DMSO(3ml)
中。加入二环己基碳化二亚胺(39mg，0.2mmol)，再加入N-羟基琥
珀酰亚胺(22mg，0.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，并
加入PE(130mg，0.2mmol)的氯仿(20ml)液。6小时后，将反应混
合物过滤，用水洗涤，干燥并蒸发，得到标题化合物。TLC(65 CHCl3/
25 MeOH/4H2O/1甲酸)Rf＝0.2。MS(FAB)：MH+1400.7，
MNa+14227。
实施例12
GdAE-D03A-戊二酰基-PE
用N-羟基琥珀酰亚胺(25mg，0.21mmol)和二环己基碳化二亚胺
(50mg，20.25mmol)来处理氯仿(5mL)中的Egg PE-戊二酰
(100mg，0.11mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并过滤除掉脲。
加入在甲醇(1ml)中的实施例4化合物(100mg，0.16mmol)和1mL
三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌6小时，并蒸发至干。将残渣溶解
在氯仿(10ml)中并放到透析囊中。将反应物用醋酸钠缓冲液(1L，
50mM，pH 5.5，12小时)，Tris缓冲液(1L，pH 8，50mM，5小时)和
去离子水(1L，5小时)透析。通过加入甲醇，将在氯仿层中形成的
少量沉淀溶解。将溶液干燥(Na2SO4)并蒸发，得到标题产物，为白色
蜡样固体(150mg，89％)。TLC(65 CHCl3/25 MeOH/4 H2O/1
甲酸)Rf＝0.2。MS(FAB)：MNa+1459。
实施例13
在真空下，将Egg PC(52μmol)和Egg PE-戊二酰(48μmol)
在氯仿中的混合物蒸发为薄膜。将该脂质混合物溶解在乙醚(3ml)中并
用23mL缓冲剂(25mM MES，100mM NaCl)处理。通过声处理混合
物得到乳浊液。将乙醚蒸发掉形成凝胶。通过涡流旋转并蒸发掉残存的
溶剂来破坏凝胶。再加入1mL缓冲液并继续蒸发直至除掉全部痕量的溶
剂。在室温和快速搅拌下，用GdAE-D03A(140mg)和EDAC
(130mg)将脂质体处理过夜。通过使产物通过Sephadex G-75柱
(1×8英寸)，除掉未反应的试剂，将脂质体通过两个100nm的膜挤
出三次。分析最终混合物，得到[Gd]＝1.14mM，[P]＝5.04mM。根据
P/Gd比，得到47.1％的PE-戊二酰。驰豫性(水，20MHz)r1＝18±2
(mMsec)-1。
实施例14
利用合成实施例13时所描述的方法。使用Egg PC(20μmol)和
二油酰基PE-琥珀酰(17μmol)。分析最终混合物，得到[Gd]＝0.56mM，
[P]＝3.8mM。根据P/Gd比，得到30％的PE-戊二酰。驰豫性(水，
20MHz)r1＝18±2(mMsec)-1。
实施例15
利用合成实施例13时所描述的方法。使用Egg PC(10μmol)和
二油酰基PE-十二烷酰(8μmol)。将脂质体挤出(3×200nm，
3×50nm)。分析最终混合物，得到[Gd]＝0.66mM，[P]＝3.49mM。
根据P/Gd比，得到43％的PE-戊二酰。驰豫性(水，20MHz)r1＝
17±2(mMsec)-1。
实施例16
利用制备实施例13时所使用的方法和Egg PC(56μmol)和Egg
PE(53μmol)的混合物。在室温和快速搅拌下，用EDAC(100mg)
和GdAE-D03A-琥珀酰胺(80mg)将脂质体处理过夜。除掉未反应
的试剂后，将脂质体挤出(3×200nm和3×50nm)。分析最终混合
物，得到[Gd]＝0.39mM，[P]＝5.87mM。根据P/Gd比，得到14％的
PE-戊二酰。驰豫性(水，20MHz)r1＝27±2(mMsec)-1。
实施例17
按照制备实施例13时所使用的方法，从Egg PC(13μmol)和胆
甾醇半琥珀酸酯(16μmol)来制备脂质体。用EDAC(25mg)和GdAE
-D03A(25mg)来处理脂质体。除掉未反应的试剂后，将脂质体挤出
(3×200nm和3×50nm)。分析最终混合物，得到[Gd]＝0.26mM，
[P]＝2.93mM。根据P/Gd比，得到7.2％的PE-戊二酰。驰豫性(水，
20MHz)r1＝21±2(mMsec)-1。
实施例18
按照制备实施例13时所描述的方法，从Egg PC(80μmol)和
6-(胆甾烯基)-7-氧杂庚-1-醇(80μmol)来制备脂质体。用
EDAC(70mg)和GdAE-D03A(40mg)来处理脂质体。除掉未反
应的试剂后，将脂质体挤出(3×200nm和3×50nm)。分析最终混
合物，得到[Gd]＝0.39mM，[P]＝3.34mM。根据P/Gd比，得到11％
的PE-戊二酰。驰豫性(水，20MHz)r1＝19±2(mMsec)-1。
实施例19
按照制备实施例13时所描述的方法，从Egg PC(68μmol)，Egg
PE-戊二酰(55μmol)和Brain PS(6μmol)来制备脂质体。用GdAE
-D03A(40mg)和EDAC(75mg)来处理脂质体。除掉未反应的试
剂后，将脂质体挤出(3×200nm和3×100nm)。分析最终混合物，
得到[Gd]＝0.51mM，[P]＝4.15mM。根据P/Gd比，得到29％的PE
-戊二酰。驰豫性(水，20MHz)r1＝18±2(mMsec)-1。
实施例20
按照合成实施例13时所描述的方法，从胆甾醇半癸二酸酯
(130μmol)和Egg PC(130μmol)来制备脂质体。用GdAE-D03A
(120mg)和EDAC(120mg)来处理脂质体。通过凝胶层析除掉未反
应的试剂并将脂质体挤出。
实施例21
将实施例10化合物(71mg，6μmol)加到在氯仿中的二油酰PC
(15mg，20μmol)中。将溶剂真空蒸发。将残渣溶解在乙醚(1ml)中。
加入水(1ml)，并将混合物进行声处理直至形成乳浊液。将乙醚真空
缓慢蒸发。形成粘稠的凝胶。再加入水(1ml)并将凝胶涡流搅拌直至
凝胶破坏形成囊。将产物挤出(3×200nm和3×50nm)。
实施例22
将实施例12化合物(25mg，17.4μmol)和Egg PC(13.7，18μmol)
溶解在氯仿(3ml)中。将溶液真空蒸发至干。将残渣溶解在乙醚(3ml)
中并过滤。加入MES缓冲剂(3ml)并将混合物声处理直至形成乳浊液。
真空蒸发并不时地涡流搅拌除掉乙醚。
实施例23
将实施例9化合物(50μmol)和氢化Egg PC(150μmol)溶解
在氯仿(10ml)和甲醇(2ml)的混合物中。在75℃下蒸发掉溶剂。
在75℃振摇下，将残余薄膜在MES缓冲液中水合。冰冻-熔化四次后，
在75℃下，将脂质体挤出(3×100nm)。
实施例24
药物动力学
在开始研究前数日，将导管插入大鼠颈静脉中。在注射样品前抽取
300μl血样并放到含肝素的已称重试管中。在0时注射试验化合物。在24
小时内，经过一定的时间间隔抽取血样(300μl)。在第7天将动物处
死，摘出肝，脾和肾脏。用硝酸和过氧化氢来消化血和器官样品并通过
ICP来分析钆浓度(μg/g)。
实施例 7天后器官中的滞留量
产物 剂量μgGd/kg t1/2min. 肝％ 脾％ 肾％
13 831 98 9.9 1.3 0.7
13 1190 111 7.4 0.6 0.6
19 1764 69 24.0 11.8 0.5
20 1310 58 34.8 8.9 0.8
实施例25
生物分布
用153Gd标记(2-氨基乙基)-D03A。如实施例13，将螯合物偶
联到1∶1 Egg PC/Egg戊二酰脂质体(100nm)上。将放射性标记的
脂质体注射到小鼠的尾静脉中。每个时间点使用三只小鼠。在第1天，
第3天和第7天计数血、肝、脾、肾和皮肤样品。计算各器官中存留的
注射剂量的百分数并列表如下。肝脏的消除半衰期为3.2天。
器官滞留量(％注射剂量)
1天 3天 7天
血 0.60 0.54 0.51
肝 18.22 9.91 4.88
脾 0.86 0.79 0.69
肾 1.03 0.74 0.64
皮肤 1.68 1.19 0.80
实施例26
GdDOTA-DOBA的合成
(i)对(10-溴癸氧基)苯甲酸甲酯的合成
将1，10-二溴癸烷(18.01g，60mmol)，对羟基苯甲酸甲酯(9.12g，
60mmol)和K2CO3(8.28g，60mmol)在丙酮(90mL)中的混合物回
流搅拌20小时。将白色固体滤出并用丙酮洗涤。将滤液和洗涤液合并，
并浓缩成白色固体。通过在硅胶柱上层析，用己烷/氯仿溶剂梯度洗脱，
从中分离出所需产物(10.8g，48.4％)。1H NMR(CDCl3，δ)：7.95(d)，
6.88(d)，3.98(t)，3.85(s)，3.39(t)，1.80(m)，1.52(m)，1.42(m)和1.29(m)。
FABMS：371(MH+)。
(ii)对(10-N-邻苯二甲酰亚氨基癸氧基)苯甲酸甲酯的合
成
在60℃和氮环境下，将对(10-溴癸氧基)苯甲酸甲酯(10.44g，
28.12mmol)和邻苯二甲酰亚胺钾(5.47g，29.53mmol)在无水DMF
(175ml)中的混合物搅拌14小时。真空除掉溶剂并将残渣溶解在CHCl3
中，用水(4×15ml)洗涤。合并洗涤液并用CHCl3(100ml)提取一
次。用MgSO4干燥合并的有机层并将溶液浓缩，得到粗品并通过在硅胶
上层析，用己烷/氯仿溶剂梯度洗脱来纯化(11.8g，96％)。
1H NMR(CDCl3，δ)：7.95(d)，7.81(m)，7.68(m)，6.86(d)，3.97(t)，3.85
(s)，3.64(t)，1.76(m)，1.65(m)，1.54(m)，1.42(m)，1.29(m)。FABMS：
438(MH+)。
(iii)对(10-氨基癸氧基)苯甲酸甲酯的合成
在65℃下，将对(10-N-邻苯二甲酰亚氨基癸氧基)苯甲酸甲
酯(8.52g，19.48mmol)溶解在甲醇(75ml)中。加入肼的一水合物
(1mL，20.62mmol)并将溶液在氮环境下回流22小时。将溶液冷却至
室温并将沉淀过滤。将溶液浓缩并将残渣与沉淀物合并，用氯仿
(500ml)处理。将溶液用水洗涤并将洗涤液用氯仿(2×100ml)提
取。将合并的有机层用MgSO4干燥并浓缩，得到产物(5.62g，97％)。
1H NMR(CDCl3，δ)：7.95(d)，6.88(d)，3.97(t)，3.86(s)，2.64(t)，1.78
(m)，1.53(m)，1.43(m)，1.28(m)。
(iv)对(10-氯乙酰氨基癸氧基)苯甲酸甲酯的合成
将上述(iii)得到的粗产物(5.62g，18.84mmol)和三乙胺(2.6ml，
18.7mmol)溶解在氯仿(90ml)中并在冰浴中冷却。在搅拌下滴加氯
乙酰氯(1.5ml)的氯仿(40ml)溶液。加完后，将溶液在冰浴中搅拌
15分钟并温热至室温，搅拌20小时。将溶液用水(4×80ml)洗涤。
干燥(MgSO4)并浓缩，得到产物(6.71g，93％)该产物不必进一步纯
化即可使用。1H NMR(CDCl3，δ)：7.95(d)，6.87(d)，6.54(s，br)，4.01
(d)，3.96(t)，3.86(s)，3.28(q)，1.76(m)，1.55(m)，1.45(m)，1.29(m)。
13C NMR(CDCl3，δ)：130.71，130.66，121.52，113.23，75.37，67.33，50.95，
41.85，39.04，28.56，28.53，28.47，28.43，28.33，28.25，25.94，25.11。
(v)10-(对甲氧基羰基-苯氧基癸基氨基甲酰基甲基)-1，4，7，
10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三叔丁基醋酸酯的合成
将D03A-三叔丁基酯(9.31g，15.63mmol)和三乙胺溶解在DMF
(90ml)中并向溶液中加入上述(iv)得到的氯乙酰胺(6.0g，
15.63mmol)，将该溶液在60℃和氮环境下加热19小时。真空除掉溶
剂并将残渣溶解在氯仿(200ml)中。将溶液用水(3×100ml)洗涤，
经MgSO4干燥并浓缩，得到粗产物(10.97g)，为油状物。
(D03A＝1，4，7-三羧甲基-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)。
实施例27-31
利用下列反应流程，制备D03A-D0BA(实施例26化合物)类似
物
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(其中R11为卤素，例如Br；X11为CH2或O；并且d为正整数)。
实施例27-31化合物的合成在所有情况下均是直接的并且可重
复。
实施例序号 -L′-Ar(AH)q 缩写名称
27 间羧基苯氧基-(CH2)10 D03A-DOmBA
28 邻羧基苯氧基-(CH2)10 D03A-D0oBA
29 3，5-二羧基苯氧基-(CH2)10 D03A-D0IA
30 对羧基苯氧基-(CH2)6 D03A-HOBA
31 对羧基苯氧基-(CH2)8 D03A-OOBA
实施例32
具有膜结合Gd D03A-DOBA的脂质体
在总重量克分子渗透压浓度为282mOs的175mM葡萄糖，100mM
蔗糖介质中，利用90mol％卵磷脂酰胆碱和10mol％Gd DO3A-DOBA
来制备110nm大小的脂质体。
T1驰豫性：17mM-1s-1
Gd浓度： 7.87mM
脂质浓度：65.9mM
以0.03mmol/kg剂量静脉注射后的血半衰期(大鼠)：20-90分钟
组织滞留量(以注射剂量的百分数表示)：
时间 肝 肾 脾
30m 53.22 1.87 0.74
1h 27.95 0.34 0.91
3h 7.31 0.26 0.85
1d 4.27 0.34 1.60
7d 1.85 0.36 0.61
类似地，制备携带实施例27-31螯合剂的钆螯合物的脂质体。
实施例33
双重造影剂
如实施例32，利用Gd DO3A-DOBA作为膜缔合螯合物，卵磷
脂酰胆碱作为成膜脂质和葡萄糖/蔗糖水溶液来制备200nm大小的脂
质体，以Dy/Gd比为2的比率将溶解的Dy DTPA-BMA掺入脂质体
中，得到双重造影剂。
T1驰豫性＝14.6mM-1s-1
T2*驰豫性＝16.6mM-1s-1