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1、10申请公布号CN104039349A43申请公布日20140910CN104039349A21申请号201280057730422申请日2012112311075261520111123EPA61K39/385200601A61K47/34200601A61K9/0020060171申请人PLS设计有限责任公司地址德国汉堡申请人慕尼黑赫姆霍兹环境和健康研究中心有限责任公司72发明人T格伦瓦尔德CB施密特韦伯74专利代理机构中国专利代理香港有限公司72001代理人杜艳玲梁谋54发明名称用于治疗过敏反应的药物组合物57摘要本发明涉及药物组合物，其由一种或多种制备物组成并包含生理学有效剂量的至少一。
2、种IL4和/或IL13抑制剂和至少一种过敏原，以及基质，其中至少所述抑制剂是溶解或包埋于所述基质上，或者至少所述抑制剂是包被的或吸附于所述基质上，其中选择所述基质以使得所述抑制剂能够延长性释放。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014052386PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0048842012112387PCT国际申请的公布数据WO2013/075846EN2013053051INTCL权利要求书2页说明书43页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书43页附图8页10申请公布号CN104039349ACN104039349A。
3、1/2页21药物组合物，其由一种或多种制备物组成，且包含生理学有效剂量的至少一种IL4和/或IL13抑制剂和至少一种过敏原，以及基质，其中至少所述抑制剂是溶解的或包埋于所述基质中，或者至少所述抑制剂包被或吸附于所述基质上，其中选择所述基质以使得所述抑制剂能够延长性释放。2根据权利要求1的组合物，其中所述抑制剂选自拮抗性IL4和/或IL13衍生物、对IL4和/或IL13和/或它们的前体具有特异性的可溶性细胞因子受体构建体、对IL4和/或IL13和/或它们的前体和/或它们的受体具有特异性的单克隆抗体、这些抗体的结合片段、对IL4和/或IL13和/或它们的前体和/或它们的受体具有特异性的蛋白质构建体。
4、以及对IL4和/或IL13和/或它们的前体和/或它们的受体具有特异性的适配体组成的组。3根据权利要求1或2的组合物，其中包含至少两种不同的抑制剂，其中至少一种抑制剂抑制IL4且至少一种其它抑制剂抑制IL13，或者其中包含至少一种抑制IL4和IL13二者的抑制剂。4根据权利要求13之一的组合物，其中所述抑制剂具有小于7天的血浆半衰期，优选小于1天，最优选小于6或5个小时。5根据权利要求14之一的组合物，其中所述抑制剂是具有一至三个突变的人IL4突变体，优选在位置R121、Y124和S125的至少一个。6根据权利要求15之一的组合物，其中所述基质是生物可降解的或非生物降解的有机聚合物，优选生物可降。
5、解的，更优选热胶凝的，特别是选自基于苯乙烯异丁烯的嵌段共聚物、烯烃聚合物、聚乙烯、聚丙烯、聚环氧乙烷PEO、聚环氧丙烷PPO、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙烯丙烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯POLYETHYLENETERAPHTHALATE、聚氨酯、聚脲、硅橡胶、聚酰胺、聚碳酸酯、聚醛、天然橡胶、聚酯共聚物、苯乙烯丁二烯共聚物乙烯乙酸乙烯酯、聚原酸酯、聚亚胺基碳酸酯、脂肪族聚碳酸酯、聚己酸内酯PCL、聚D,L乳酸PDLLA、聚L乳酸PLLA、所述乳酸的丙交酯、聚磷腈聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET（POLYETHYLENETERAPHTHOLATE）、聚对苯二甲酸丁二。
6、醇酯PBT、PEBAX、NYLON、聚原酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、白蛋白、单甲氧基聚乙二醇MPEG或上述任一种的共聚物或混合物，包括聚乳酸羟基乙酸共聚物PLGA、L丙交酯和D,L丙交酯的共聚物、由MPEG和PCL，MPEG和PCLRANPLLA，MPEG和PLGA组成的二嵌段共聚物、由PLGAPEGPLGA，PEGPLGAPEG，PEGPCLPEG组成的三嵌段共聚物、由PEO和PLLA组成的二嵌段和三嵌段共聚物、泊洛沙姆。7根据权利要求6的组合物，其中所述聚合物是热胶凝的，且其中高于其开始胶凝的胶凝温度在20和40之间，优选在25和30之间。8根据权利要求6或7之一的组合物，其中在体内环境中聚合。
7、物90重量的降解和/或抑制剂从聚合物中90重量的释放在110天内完成，优选在12天内完成。9根据权利要求18之一的组合物，其中另外包含佐剂，其中所述佐剂优选选自脂质体、铝盐、MONTANIDE乳剂、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF、基于胰岛素的佐剂、病毒颗粒和聚磷腈，最优选选自磷酸铝或氢氧化铝凝胶。10根据权利要求15之一的组合物，其中所述基质是根据权利要求9的佐剂。11根据权利要求110之一的组合物，其中权利要求书CN104039349A2/2页3所有组分混合作为单一的制备物，或者所述基质和所述抑制剂混合作为第一制备物，且所述过敏原和佐剂混合作为第二制备物。12根据权利要求111之一的组。
8、合物，其中所述组合物制备为适合于用于通过皮下注射施用的盖伦制剂。13根据权利要求112之一的组合物在制备用于治疗免疫病症，特别是过敏反应的药物中的用途，优选其中所述药物以治疗有效剂量施用给需要治疗免疫病症的人。14制造根据权利要求112之一的药物组合物的方法，其中所述组分以生理有效量彼此混合，以获得根据权利要求11的组合物，其中任选地盖仑化合物与所述制剂另外混合。15用于治疗免疫病症，特别是过敏反应的方法，其中根据权利要求112之一的组合物以治疗有效剂量施用给需要治疗的人。权利要求书CN104039349A1/43页4用于治疗过敏反应的药物组合物发明领域0001本发明涉及在体内阻断IL4和IL。
9、13介导途径，和同时对T细胞进行过敏原刺激以增加对过敏原临床耐受的诱导的方法。0002发明背景和现有技术包括速发型I型超敏反应在内的过敏性疾病是由特定免疫系统的不平衡应答导致的。在I型超敏反应中，TH2细胞与过敏原呈递细胞接触后上调其表面上的CD40配体。CD40配体与B细胞上的CD40的相互作用伴随着TH2相关细胞因子如IL4、IL5和IL13的产生，而且随后免疫球蛋白的类别转换导致介导多种临床症状的IGE抗体的产生。0003但是，过敏原特异的TH2细胞的存在不足以使过敏反应发生，因为这些细胞在健康个体中也存在。对于过敏反应的发病机理来说，重要的是能够抑制TH1和TH2细胞的增殖和细胞因子表。
10、达，并能够作用于抗原呈递细胞APC的过敏原特异的调节性T细胞TREG的数量。0004调节性T细胞被宽泛地分类为自然T调节性T细胞NTREG和诱导的或适应性调节性T细胞ITREG。自然调节性T细胞是自体抗原特异性的CD4T细胞，其表达FOXP3转录因子和大量的CD24。它们在胸腺中被选择并在外周成为调节性T细胞。外周中的幼稚CD4TH细胞能够发育成调节性T细胞并因此而被称为诱导的或适应性调节T细胞。FOXP3转录因子的表达被认为是调节性T细胞诱导的关键因素。包括1型调节性T细胞TR1和TH3细胞的这些细胞能够产生IL10或TGF或这二者，这些细胞通过它们行使其大部分抑制作用其综述参见SCHMID。
11、TWEBER,2005NANDAKUMAR等,2009。0005调节性T细胞对免疫应答的抑制通过多种途径发生其综述参见SCHMIDTWEBER,2005ROUSE,2007NANDAKUMAR等,2009。IL10直接和间接地抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的活性。它还使IGG4升高。TGF是B细胞向IGA同种型的转换和促进因子，并因此控制外周耐受。最重要的是，TGF已被证明促进FOXP3表达，并抑制TH1驱动的转录因子TBET和TH2驱动的转录因子GATA3。IL10也被证明在体外促进FOXP3表达，但是只有IL4和IL12被中和。这两个细胞因子代表了T细胞分化的决定信号，且分别诱导。
12、转录因子GATA3和TBET。0006通常，TREG介导的抑制似乎是抗原特异性的，虽然负责的细胞因子被分泌并因此可能对于多种T细胞都是可用的。但是，最近的研究表明细胞因子和细胞因子受体可能成为APCS和T细胞之间形成的免疫突触的一部分其综述参见SCHMIDTWEBER,2005。因此，可溶性细胞因子可以以抗原特异性的方式穿梭到邻近的细胞中，并且TREGS可以将特定的靶细胞转变为无应答、无凋亡的状态无细胞免疫应答。0007在促成过敏性炎症发生的细胞因子中，IL4和IL13在哮喘和其它过敏性疾病的发病机理中起着关键作用。这两个细胞因子代表着多效性细胞因子，并与IGE同种型转换的诱导、通过B淋巴细胞。
13、的IGE的分泌，和通过上调B淋巴细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IGE受体的IGE介导应答的增加相关。但是IL4和IL13还具有一些不同的不重叠的功能。例如，IL4能够驱动幼稚TH细胞向TH2淋巴细胞分化，导致产生效应物细胞因子说明书CN104039349A2/43页5例如IL4、IL5、IL9和IL13。IL13对于上皮细胞的成熟、粘液的产生、细胞外基质蛋白的生成、呼吸道平滑肌细胞收缩性的增加和嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和T细胞的募集具有重要的作用。0008IL4通过与细胞表面特定的I型和II型受体相互作用行使其活性其综述参见GESSNER等,2000。I型受体包含140KDA的结合链SWISS。
14、PROT登录号P24394、IL4R也被称为CD124和由多个细胞因子受体共享的IL2R的共用链C。在没有共用链的情况下，IL4可以使用II型IL4受体，所述受体包含IL4R和IL13结合链，IL13R1。这种受体复合物也是IL13的功能性受体，并且这解释了IL4和IL13的大部分生物学效果的重叠，虽然这两个细胞因子仅显示出25的同源性。I型受体复合物可以仅由IL4形成，并似乎负责介导不表达IL13R1的T细胞中的IL4应答。II型受体复合物可以由IL4或IL13形成并激活。I型受体复合物在造血细胞中占主导地位，而II型受体复合物在造血细胞和非造血细胞二者上表达。IL4和IL13与II型受体复。
15、合物的结合序列的不同之处在于，IL4在结合第二亚基之前首先以高亲和力与IL4R结合，而IL13首先以低亲和力与IL13R1结合，然后该复合物募集IL4R形成高亲和力的结合位点。0009第二IL13结合蛋白，IL13受体2IL13R2，以高亲和力结合IL13，但不结合IL4。但是，据信IL13R2是非信号传导的，因此充当诱饵受体。已证明用IFN对上皮细胞的处理通过从胞内储存的转移增加IL13R2的表面表达，表明IL13R2通过与IL4R/IL13R1复合物竞争IL13在应答和调节TH1/TH2平衡中起着关键作用。0010缺乏跨膜域和胞内域的可溶性IL4受体SIL4R存在于生物流体中。然而SIL4。
16、R的确切功能还有待阐明，它甚至可通过与细胞表面上的IL13R1形成复合物来增强IL13应答，由此使IL13和IL13R1的弱相互作用稳定。当在支气管成纤维细胞中进行试验时，在对次优剂量的IL13的应答中，SIL4R的存在增加IL13刺激的嗜酸性粒细胞趋化因子的产生。此外，SIL4R可以作为载体蛋白，IL4可以从其上随时间解离。因此，SIL4R可以为IL4抵抗蛋白质降解提供某种保护。0011特异性免疫治疗特异性过敏原免疫治疗IT是仅有的广泛使用的疗法，其能够重建对于过敏原的临床耐受，并与过敏原特异性TREG细胞的再诱导相关。对在健康个体对过敏原暴露的正常免疫应答中的和在特异性免疫治疗中的过敏原的。
17、外周耐受主要是足够的TREG数量的结果。因此，在特应性患者中，特异性免疫治疗的主要原则是增加能够控制过敏原特异性效应物T细胞的TREGS的数量。0012成功的IT伴随着T细胞记忆由促过敏TH2表型向外周的产生IL10的T细胞表型和除了IL10阳性细胞之外也表现出FOXP3表达的局部表型的转变。先前已证明免疫治疗可以导致长期受益，并且中断后疾病缓解持续3年。然而，考虑到影响特异性免疫治疗方法效果的各种因素，临床结果在很大程度上有所不同并不令人惊讶。当患者是针对季节性过敏原单独致敏的，免疫治疗有效，但是如果患者是特应性的或者患者对长期过敏原应答，免疫治疗则功效较低或无效。0013一个问题似乎是衍生。
18、自天然来源的过敏原提取物中的个别过敏原的量，这是因为在一些提取物中，重要的过敏原存在的量不够。但是，成功的特异性免疫治疗要求应用高过说明书CN104039349A3/43页6敏原剂量以促进已知作为IGE依赖性应答的负反馈调节剂的低亲和性的FCRIICD23的结合。如果以足够的量存在，则被施用的过敏原不仅被特异性IGE结合，还被其它免疫球蛋白类别结合。在调节免疫应答和预防IGE介导的应答中，IGG与过敏原的复合物是重要的。已知存在三种类型的FC受体。FCRI和FCRIII，主要在髓系的细胞上表达，可以介导促炎性功能例如吞噬作用、抗体依赖性的细胞毒性和炎性介质的释放。FCRII在髓细胞和淋巴细胞上。
19、表达，将抑制信号传递到细胞内。活化的树突细胞是强力的T细胞刺激物，并表达抑制的和活化的FCRS二者。鉴于这些事实，近来的进展或用于特异性免疫治疗的重组过敏原似乎是一种有前景的方法，因为它们允许设计包含最适浓度的所有重要过敏原的过敏原组合物。此外，重组过敏原允许对它们的表面结构进行定点修饰以减少B细胞表位的密度。这种过敏原修饰的目的是减少过敏原性，同时保留其免疫原性。对具有大大降低的IGE反应性的修饰的重组过敏原（其显示线性T细胞表位的全谱，但与相应的天然过敏原相比其表面结构不同）的评价，证明这种分子能够减少对天然过敏原的特异性的IGE发展NIEDERBERGER等,2004KARAMLOO等,。
20、2005。0014然而，尽管近来有所改进，特异性免疫治疗的效果还需要进一步优化。用于增加能够控制过敏原特异性效应物T细胞的TREGS的数量的合适方法还有待确定。因此本领域中需要确定影响TREGS诱导的关键因素，并需要设计更有效的过敏原耐受性治疗。0015本发明的技术问题因此，本发明的技术问题是要提供用于治疗过敏性反应的方法，其中对过敏原的临床耐受的诱导得到改善，特别是其中IL3和/或IL13抑制剂施用的系统性副作用被减少，并且与之结合，用于平衡特异性免疫系统应答的T细胞刺激被增强。特别是，该技术问题是要提供药物组合物，及其用途，制造这种组合物的方法以及实现这些目的的治疗方法。0016发明简述为。
21、了解决这些技术问题，本发明提供了权利要求中所定义的主题。本发明在下面进行详细说明。0017在暴露于过敏原的健康个体的正常免疫应答中以及在特异性免疫治疗中，对过敏原的外周耐受主要由足够的TREG数量导致。因此，特应性患者中特异性免疫治疗的主要原则是增加能够控制过敏原特异性效应物T细胞的TREGS的数量。在体外条件下，过敏原和缺乏TH1或TH2驱动因子已被证明对于TREGS的诱导是必需的。由于IL4和IL13在过敏性炎症的发展中具有重要的作用，本发明提供了在体内同时抑制IL4和IL13介导效果，同时对T细胞进行过敏原刺激以增加对过敏原的临床耐受的诱导的方法。0018优选的适合于本发明方法的IL4和。
22、IL13介导效果抑制剂包括但不限于A拮抗性IL4和IL13衍生物，B可溶性IL4和IL13受体构建体，C对IL4和IL13具有特异性能够阻断它们的生物学活性的单克隆抗体、其片段或其它蛋白质构建体，D对IL4和IL13受体复合物具有特异性，能够阻断IL4和IL13与它们的受体亚基相互作用的单克隆抗体、其片段或其它蛋白质构建体，E对IL4和IL13具有特异性能够阻断它们的生物学活性的适配体，和F对IL4和IL13受体复合物具有特异性，能够阻断IL4和IL13与它们的受体亚基相互作用的适配体。0019在一个实施方案中，本发明公开了用于在过敏原呈递部位对IL4和IL13介导效果进行延长性抑制并对过敏原。
23、进行延长性呈递的方法。为了获得在过敏原呈递部位对说明书CN104039349A4/43页7IL4和IL13介导效果的有效的和延长的抑制，本发明公开了用于从位于过敏原呈递部位的储存库持续释放这种抑制剂或这种抑制剂的组合的方法。0020在具体实施方案中，本发明公开了用于延长性递送T细胞分化决定信号的抑制剂的基质。优选的基质包括但不限于适合作为大量的这种抑制剂或抑制剂组合的储存库的生物可降解聚合物，其允许释放足够量的所述抑制剂或抑制剂组合以在延长的一段时间中有效局部抑制IL4和IL13介导途径，并且其与用于根据本发明方法的耐受性诱导的佐剂和一种或多种过敏原是化学和物理相容的。0021在优选的具体实施。
24、方案中，生物可降解的可注射原位成型凝胶系统被用于IL4和IL13介导途径抑制剂的控制释放。这种原位成型凝胶系统水凝胶经过溶胶凝胶溶胶的转变，其在室温下是是自由流动的溶胶，并在体温下是不流动的凝胶。与其它生物可降解聚合物相比，可注射的热胶凝聚合物具有几个优点，包括易于制备、对生物活性分子例如IL4和IL13介导途径抑制剂的高封装效率以及在制备过程中无有害的有机溶剂。0022在另一个实施方案中，本发明公开了用于将IL4和IL13介导效果抑制剂的高局部浓度主要限制在过敏原呈递部位以减少由于该抑制剂与远离过敏原呈递部位的靶标相互作用而引起的副作用。在一个具体实施方案中，使用提供相对短的血清半衰期的IL。
25、4和IL13介导效果抑制剂，该血清半衰期足以使得该抑制剂在从位于过敏原呈递部位的储存库释放后有局部活性，且允许在从过敏原呈递部位扩散开和运送走的时候快速地从循环中被除去。提供这种特性的优选的抑制剂包括但不限于A具有15KDA的分子量的拮抗性IL4和IL13衍生物，B能够抑制IL4和IL13介导效果的小抗体片段或其它蛋白质构建体，和C能够抑制IL4和IL13介导效果的小分子量适配体。在另一个具体实施方案中，使用的IL4和IL13介导效果抑制剂在它们从位于过敏原呈递部位的储存库释放后易于被内源酶灭活，并且其可以根据本发明方法的需要被衍生化以调节它们对于酶失活的敏感性。提供这种特性的优选的抑制剂包括。
26、但不限于适配体，其对于受内源核酸酶降解的敏感性可以通过对碱基和骨架序列进行化学修饰来调节。0023在另一个实施方案中，本发明公开了适用于本发明方法的佐剂。在优选的实施方案中，所使用的佐剂为要被施用的过敏原提供了储存库效果，且引发TH2型免疫应答。虽然主要引发TH2型免疫应答的佐剂可能干扰TREGS的诱导，在存在IL4和IL13介导途径抑制剂的条件下，这种佐剂比那些主要引发TH1型免疫应答的佐剂更适合于本发明的治疗目的。优选的引发TH2型免疫应答的佐剂包括但不限于铝盐、MONTANIDE乳剂基于角鲨烯的油包水乳剂和聚磷腈。引发组合的TH1和TH2型免疫应答的佐剂也可用于本发明的方法，如果这些佐剂。
27、为包含一种或多种过敏原、佐剂、IL4和IL13介导途径抑制剂和介导这些抑制剂的延长性释放的基质的组合物提供了有利的性质的话。引发组合的TH1和TH2型免疫应答的佐剂包括但不限于基于角鲨烯的水包油乳剂、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF和基于菊粉和病毒颗粒的佐剂。0024在另一个实施方案中，本发明公开了可用于本发明方法的疫苗组合物。在一个具体实施方案中，疫苗组合物包含生物可降解的热胶凝聚合物溶液，其含有一种或多种可溶性IL4和IL13介导途径抑制剂。这种液体制剂在注射后，随着制剂温度上升至体温，会自发地形成凝胶。因此，注射的凝胶形成不流动的储存库，使一种或多种可溶的IL4和说明书CN10403。
28、9349A5/43页8IL13介导途径抑制剂从其中缓慢且持续地释放几天。组合物中IL4和IL13介导途径抑制剂的量以这样的方式平衡，在聚合物复合体COMPOSIT在体温下胶凝后，所释放的抑制剂的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。对于胶凝的聚合物复合体部位处的延长性过敏原呈递来说，一种或多种过敏原或过敏原提取物被吸附到铝盐上或被乳化以形成基于角鲨烯的油包水乳剂MONTANIDE乳剂，并被注射到胶凝的聚合物复合体附近。0025在另一个具体实施方案中，疫苗组合物包含生物可降解的热胶凝聚合物溶液，该溶液含有一种或多种可溶性IL4和IL13介导途径抑制剂和一种或多种过敏原或过敏原提取物，该过敏原或过敏。
29、原提取物被吸附到铝盐上、或被乳化以形成基于角鲨烯的油包水乳剂MONTANIDE乳剂或与水溶性的聚磷腈聚合物佐剂预先混合。组合物中的每种组分的量以这样的方式平衡A在注射到体内后，该生物可降解的热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及B在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。0026在又一个特定的技术方案中，疫苗组合物包含生物可降解的热胶凝聚合物溶液，该溶液含有一种或多种过敏原或过敏原提取物、一种或多种可溶性佐剂例如GMCSF和一种或多种可溶性IL4和IL13介导途径抑制剂。组合物中的每种组分的量以这样的方式平衡A在注射到体内后，该生物可降。
30、解的热胶凝聚合物形成不流动的凝胶，其它组分包埋于其中，以及B在聚合物复合体在体温下胶凝化之后，所释放的组分的量对于本发明方法的治疗目的是足够的。0027在另一个实施方案中，本发明公开了用于将疫苗组合物掺入到适合于施用的药物组合物中的方法。0028在再一个实施方案中，本发明公开了使用本发明的疫苗组合物诱导过敏原耐受的治疗方法。0029本发明的具体优选实施方案随着下面的更详细描述和权利要求将会变得显而易见。0030发明详述基于现有的知识，过敏原耐受由外周诱导的调节性T细胞介导，如通过过敏患者外周血中产生过敏原特异性IL10的T细胞的不足所证明其综述参见SCHMIDTWEBER等,2005SCHMI。
31、DTWEBER等,2006。特应性患者中特异性免疫治疗的主要原则是增加能控制过敏原特异性效应物T细胞的TREGS的数量。FOXP3转录因子的表达被认为是诱导调节性T细胞的关键因素。我们和其它人已证明在人中TCR受体的触发对于诱导FOXP3表达和抑制性T细胞是必需的SCHUBERT等,2001MANTEL等,2006。我们证明由IL4诱导的GATA3抑制FOXP3的表达，而FOXP3是诱导型TREGITREG分化所需要的MANTEL等,2007。我们已在体内和体外证明了这种功能性拮抗作用，并且已确定了对此的机制基础是GATA3以IL4依赖性的方式结合FOXP3启动子并随后抑制FOXP3的转录。其。
32、结果是在产生过量IL4的相关条件下，这种拮抗作用破坏对TREGS和耐受的诱导。0031在体外条件下，抗原和TH1或TH2驱动因子的缺乏已被证明对于TREGS的诱导是必需的。根据该观察结果，已假设TREGS的产生代表了一种默认途径，其需要T细胞受体活化，正如任何其它T细胞分化那样，但是需要缺少效应物T细胞的决定信号。但是，已知在过敏原注射后，由于TH2记忆T细胞的活化，IL4局部释放，并且IL4在接种过程中说明书CN104039349A6/43页9还会持续释放。因此，在本发明中，所设计的方法在体内阻断IL4介导途径和同时对T细胞进行过敏原刺激，以增加对过敏原临床耐受的诱导。0032由于已知IL1。
33、3也与IGE同种型转换的诱导、通过B淋巴细胞的IGE的分泌和IGE介导应答的增强有关，本发明的方法还包括在体内阻断IL13介导途径和同时对T细胞进行过敏原刺激。虽然T细胞缺少IL13结合受体成分且对IL13不应答，几项研究表明IL13的阻断能进一步增加对过敏原临床耐受的诱导。0033最重要的是，本发明公开了用于延长性抑制IL4和IL13介导效果并同时延长过敏原呈递的方法。由于T细胞分化以及由此的免疫记忆的发展需要T细胞受体TCR结合经过1248H，并且长期持续记忆可能甚至需要重复的暴露，因此过程的延长是必要的。相应地，对IL4和IL13介导效果的抑制需要至少在与过敏原从注射的过敏原佐剂复合物中。
34、被释放的时间相同的时间阶段中，最有可能是与其一样长的时间中有效。否则，所释放的过敏原分子可能诱导TH2驱动因子，从而抑制TREGS的诱导。本发明公开了用于从位于过敏原呈递部位的储存库中稳定释放IL4和IL13介导效果抑制剂的方法。0034本发明还公开了用于在过敏原呈递部位建立高局部浓度的IL4和IL13介导效果抑制剂的方法，这与抑制剂的延长的存在同样重要。由于IL4可以抗原特异性的方式穿梭到抗原呈递细胞和T细胞之间形成的免疫突触中，在免疫突触微环境中对IL4介导效果的有效抑制需要高的局部抑制剂浓度。虽然T细胞不表达IL13R1，介导IL13诱导效果的II型受体复合物在与抗原呈递细胞和T细胞之间。
35、形成的免疫突触紧邻的造血细胞和非造血细胞二者上表达。因此，可以假设对IL13介导效果的有效抑制也需要高的局部抑制剂浓度。0035然而，抑制剂的高局部浓度通过全身施用非常难以实现，而且大剂量的治疗常常伴随着增强的副作用。例如，IL4突变蛋白IL4/Y124D位点124的酪氨酸替换为天冬氨酸以与野生型IL4同样的亲和力与IL4R结合，但是仅有05的激动活性LETZELTER等,1998。这种IL4突变蛋白是IL4介导效果的强有力的抑制剂，但是在体内实验中已证明IL4/Y124D在全身施用后显示出急性毒性，与野生型IL4在猴中类似。与野生型IL4和IL4/Y124D介导的毒性相关的细胞事件包括VCA。
36、M1血管细胞黏附分子1的上调、血清中MCP1单核细胞趋化蛋白1的上调、循环单核细胞的增加连同循环淋巴细胞的同时减少，和红细胞压积的增加WO97/47744。在人中使用IL4的临床试验中已观察到在全身施用后有类似的细胞运输WONG等,1992。这些结果表明IL4/Y124D的这些毒性是由除了T细胞之外的细胞介导的激动剂活性造成的。根据已知的IL4对于内皮细胞的效果，所观察到的IL4/Y124D的毒性表明这种IL4突变蛋白与内皮细胞上表达的新的IL4受体复合物之间有相互作用WO97/47744。这个实例证明有必要将IL4和IL13介导效果抑制剂的高局部浓度主要限制在过敏原呈递部位。0036本发明的。
37、方法通过公开使用具有相对短的半衰期的IL4和IL13介导效果抑制剂的方法解决该问题。这种抑制剂在从过敏原呈递部位的储存库释放后具有局部活性，并在其从过敏原呈递部位被扩散开和运送走的时候从循环中被快速除去。例如，美国专利6,028,176和6,313,272公开了具有强拮抗活性但是在体内具有大约36小时的相对短的血浆半衰期的IL4突变蛋白。0037因此，本发明公开的方法提供了在过敏原呈递部位的延长时间阶段的高局部浓度说明书CN104039349A7/43页10的抑制剂，而且由于其快速清除，其伴随从过敏原呈递部位向外的有限半径的抑制活性。因此，抑制剂介导的可能的副作用被显著减少。0038IT细胞分。
38、化决定信号的抑制剂对于本发明来说，用于IL4和IL13的效果的局部抑制的几个方法PRINCIPLES是合适的其综述参见LONG,2009。优选的方法包括但不限于拮抗性细胞因子衍生物、可溶性细胞因子受体构建体、单克隆抗体、其片段或者对IL4和IL13或它们各自的受体具有特异性的其它蛋白质构建体、以及抗细胞因子和抗细胞因子受体的适配体的施用。可以使用任何作为IL4、IL13或IL4/IL13拮抗剂发挥作用并适合于根据本发明方法施用的化合物。拮抗剂不需要完全破坏IL4或IL13诱导的生物学活性才是有用的。更确切地说，所给出的拮抗剂可以降低IL4和/或IL13的生物学活性。在本发明的方法和组合物中可以。
39、使用两种或更多种拮抗剂的组合。0039最优选的IL4和IL13抑制剂是那些A提供小到中等分子大小并在水性环境中具有高溶解性以快速扩散到免疫突触中的，B可以大量包埋在适合于在延长的时间中持续释放抑制剂的基质中的，C可以从形成储存库的基质中足量释放以在过敏原呈递部位提供高局部浓度的，和D具有相对短的血浆半衰期以减少由于抑制剂和远离过敏原呈递位点的靶标的相互作用而导致的可能的副作用的抑制剂。0040可用于本发明的治疗目的的绝大部分抗IL4和抗IL13的方法PRINCIPLES已被公开并在用于治疗哮喘的动物模型和临床试验中进行评价其综述参见LONG,2009。但是，根据本发明方法的这些抑制剂的应用还未。
40、被公开。0041许多IL4和IL13介导途径抑制剂，包括拮抗性细胞因子衍生物、可溶性细胞因子受体构建体、抗细胞因子和抗细胞因子受体的抗体，已被开发以在哮喘患者中中断或减少TH2依赖性的过敏性炎症。治疗的目的是使患者的免疫应答向细胞毒性T细胞介导的免疫应答，例如以TH1型免疫表型为特征的免疫应答转变。相反，本发明的治疗目的不是由TH2型免疫表型向TH1型免疫表型转变，而是在不含TH1或TH2驱动因子的局部微环境中诱导TREGS，尽管存在引发TH2型免疫应答的过敏原和佐剂。0042除了用于治疗哮喘的应用外，专利WO2009/081201A2公开了IL4R抑制剂的临床应用，其用于A过敏反应的治疗以抑。
41、制IGE合成包括例如特应性皮炎和食物过敏，B移植的治疗以防止移植排斥，和C抑制迟发型超敏反应或接触性超敏反应。但是，所提出的临床应用的细节尚未被公开。0043通常，已公开的IL4抑制的应用中的基本原理是患者的TH2型免疫应答向TH1型免疫应答的转变。例如，IL4介导途径抑制剂用于癌症治疗的应用是基于这样的设想，促进TH1型免疫应答有时对于患者是有利的WO02/04009A2。而且，美国专利NO2011/0002013A1公开了IL4拮抗剂可用作过敏反应免疫治疗的佐剂和疫苗的佐剂，特别是当引导指向TH1应答的免疫应答对所讨论的疾病的治疗或预防将会有益时。所建议的IL4拮抗剂作为过敏反应免疫治疗的。
42、佐剂的应用的细节也未被公开。0044II白介素变体对T细胞分化决定信号的抑制在本发明的一个实施方案中，能拮抗IL4和IL13活性的白介素变体被用作抑制剂。可以使用任何作为IL4、IL13或IL4/IL13拮抗剂发挥作用并适合用于根据本发明方法施用的白介素变体。基于白介素的拮抗剂不需要完全破坏IL4或IL13诱导的生物学活说明书CN104039349A108/43页11性才是有用的。更确切地说，所给出的拮抗剂可以降低IL4和/或IL13的生物学活性。0045拮抗性IL4突变体已有描述KRUSE等,1992MULLER等,1994美国专利6,028,176美国专利5,723,118。在人IL4的四。
43、个螺旋束中，D螺旋上的酪氨酸Y124形成与共用链C的重要接触。当Y124突变为天冬氨酸Y124D时，得到的分子以与野生型IL4相同的亲和性与IL4R结合，但是仅具有05的激动活性LETZELTER等,1998。类似地，人IL4的121位点的精氨酸与IL13R1相互作用。R121突变产生的突变体可以结合IL4R，但是是IL4和IL13诱导应答二者的拮抗剂KRUSE等,1993。但是，也可以考虑通过IL4的其它突变或者额外突变产生适用于本发明方法的IL4变体。例如，通过IL4的125位点的丝氨酸的突变，产生能够结合IL4R的突变体，但是是IL4和IL13诱导应答二者的拮抗剂KRUSE等,1993。。
44、适用于本发明方法的是具有单突变、双突变和三突变的拮抗性白介素4变体，单突变包括但不限于氨基酸位点R121、Y124和S125；双突变和三突变包括但不限于上列氨基酸位点的组合。优选的是具有相对短的半衰期的拮抗性IL4变体，以限制远离过敏原呈递部位的副作用。0046已证明当皮下施用或通过雾化吸入施用时，人IL4的双突变体R121D/Y124D保护过敏性食蟹猴免于遭受过敏原诱导的呼吸道高反应性。进一步，将这种双突变体在猴中皮下施用6周或更长时间减少皮肤风疹WHEAL反应和过敏原特异性IGE的循环浓度。最近在临床研究中已经评价了IL4的双突变体R121D/Y124D对于哮喘患者中对过敏原激发的晚期哮喘。
45、反应的效果WENZEL等,2007。该研究证明对IL4和IL13的双重抑制可以积极影响实验性过敏原激发之后的晚期哮喘反应进程。在患有特应性哮喘或特应性湿疹的参与者中，使用双突变体进行的治疗几乎不伴有不良事件，无论是通过皮下注射至多30MG，进行至多13周还是通过吸入至多60MG，进行至多4周施用。但是，应当强调，根据本发明方法的这种双突变体在过敏反应免疫治疗中的应用还未被公开。0047超过10年前，动物实验已经证明在体内IL4/IL13受体系统的抑制可以完全消除对过敏原的体液免疫应答和过敏症状的发生GRUNEWALD等,1999。在用卵清蛋白OVA免疫小鼠之前和之后用小鼠IL4突变体Q116D。
46、/Y119D人IL4双突变体R121D/Y124D的小鼠等价物处理BALB/C小鼠完全抑制OVA特异性IGE和IGG1的合成。此外，特异性IGG2A、IGG2B和IGG3的合成被抑制，这可以指示对OVA的耐受的发生。通过在存在ALUM作为佐剂的条件下腹腔注射10GOVA进行免疫。在第0天，在OVA免疫前和免疫后2小时通过腹腔注射施用小鼠IL4突变体，每次剂量50G。从第1至8天，继续每天两次腹腔注射30G突变体进行处理。作者推断小鼠IL4突变体Q116D/Y119D在体内抑制抗原特异性体液免疫应答和由IGE或IGG1介导的过敏性症状，并且因此对于特应性病症和其它TH2主导的疾病的治疗应当是有利。
47、的。虽然该研究的结果接近于本发明的方法和治疗目的，GRUNEWALD等1999的研究没有公开如何在在过敏原呈递部位在延长时间阶段内提供高局部浓度的抑制剂，同时由于其快速清除，具有离开过敏原呈递部位的有限半径的抑制活性。GRUNEWALD等1999报道了通过在用OVA免疫之前开始应用小鼠IL4突变体Q116D/Y119D从而对OVA过敏原耐受的明显诱导，这与对于已存在过敏反应的患者的免疫治疗不能相比。对于在具有TH2型免疫表型的个体中对过敏原耐受的诱导来说，仅有本发明的方法能提供了合适的方法，以确保在不含TH1或THR驱动因子的局部微环境中充分诱导TREGS，尽管存在过敏原。说明书CN10403。
48、9349A119/43页120048可用于本发明方法的IL13突变体包括但不限于IL13突变体E13K，它是人IL13的强有力的拮抗剂，并且还能部分抑制人IL4的应答KIOI等,2004。IL13第13位的谷氨酸与IL4R结合，且将其突变为赖氨酸降低其与IL4R的结合。虽然IL13E13K防止IL4R与IL13R1结合，但由于可利用可选的IL4R复合物，IL4RC，无法实现对IL4应答的完全抑制。0049在优选的实施方案中，人IL4双突变体R121D/Y124D被用于根据本发明的方法进行对IL4和IL13介导途径的抑制。人IL4双突变体能够拮抗IL4的活性以及IL13的活性GRUNEWALD等。
49、,1998TONY等,1994。0050III可溶性细胞因子受体构建体对T细胞分化决定信号的抑制在本发明的一个实施方案中，可溶性细胞因子受体构建体被用于本发明的方法，以抑制IL4和IL13介导途径。优选的构建体包括但不限于IL4R的可溶性胞外域，及其保留有IL4结合能力的变体、片段和衍生物。人以及小鼠IL4受体和它们的核苷酸序列已有描述美国专利5,599,905IDZERDA等,1990人IL4受体MOSLEY等,1989小鼠IL4受体。编码的人IL4受体包含N末端信号肽，后面接着是胞外域、相应于氨基酸208381的跨膜区域和相应于氨基酸232800的胞质区。由可变MRNA构建体，例如可以是由于转录后的不同MRNA剪接事件产生的构建体，和产生能结合IL4的多肽的构建体，产生的IL4受体多肽属于本文所公开的IL4受体多肽。IL4受体变体包括那些具有通过一个或多个取代、缺失或插入而不同于天然序列，但保留了IL4受体蛋白的生物学活性的氨基酸或核苷酸序列的变体。本发明还包括具有或不具有相关的天然糖基化模式的IL4受体蛋白。糖基化模式可以根据用于生产蛋白质的宿主细胞的类型而有所不同。另一种选择是通过定点突变使N糖基化位点失活。IL4受体蛋白的衍生物包括那些与天然蛋白相比显示出不。