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1、10申请公布号CN104039811A43申请公布日20140910CN104039811A21申请号201280057886222申请日2012112361/563,11020111123USC07K7/06200601C07K7/08200601A61K47/4220060171申请人株式会社普罗赛尔制药地址韩国首尔市72发明人申基德李刚真林善喜李秉圭金钟来74专利代理机构北京德崇智捷知识产权代理有限公司11467代理人王金双54发明名称具有改善的细胞渗透性的新的大分子转导结构域的研发及其使用方法57摘要本发明涉及一种改善的大分子转导结构域（MTD），其帮助渗透生物活性分子的细胞膜，具有增。
2、强的细胞渗透性。特别地，根据本发明改善的MTD与现有的MTD相比，可以更加有效地从体内和体外传递多种类型的生物活性分子，并且由此可被有效地用于基因改变生物活性分子以具有细胞渗透性的方法中或者用于将生物活性分子传输至细胞内的方法中等。另外地，改善的MTD对于研发改进的MTD的使用在药物传递系统中成为可能的新的药物和不断改进的药物，重组蛋白质疫苗或DNA/RNA治疗剂，基因或蛋白质治疗，以及药理学或医学有用的蛋白质制备或医学、药理学和药物组合物是非常有用的。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014052386PCT国际申请的申请数据PCT/KR2012/009997201211238。
3、7PCT国际申请的公布数据WO2013/077680KO2013053051INTCL权利要求书1页说明书36页序列表13页附图15页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书36页序列表13页附图15页10申请公布号CN104039811ACN104039811A1/1页21由通式1表达的肽通式1A1A2MTD其中A1为蛋氨酸（M，MET），A2为选自由精氨酸（R，ARG）、组氨酸（H，HIS）和赖氨酸（K，LYS）构成的组的氨基酸，并且MTD具有选自由序列编号为1至7构成的组的氨基酸序列。2根据权利要求1所述的肽，其是将生物活性分子介导转运至细胞内的肽，并具有选自。
4、由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列。3编码权利要求1或2所述的肽的多核苷酸。4根据权利要求3所述的多核苷酸，其具有选自由序列编号为36至56构成的组的碱基序列。5一种基因设计具有细胞渗透性的生物活性分子的方法，包括将具有选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列的肽连接至生物活性分子。6根据权利要求5所述的方法，其中，所述连接为将生物活性分子连接至肽的N端、C端或两端。7根据权利要求5所述的方法，其中，所述连接为将肽的氨基酸在反向上连接至生物活性分子的C端。8根据权利要求5所述的方法，其中，所述连接通过肽键或化学键来完成。9根据权利要求8所述的方法，其中，所述化学键选自由二硫键、二。
5、胺键、硫胺键、羧基胺键、酯键和共价键构成的组。10根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由蛋白质、多肽和肽构成的组。11根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段构成的组。12根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由酶、激素、载体蛋白、免疫球蛋白、抗体、结构蛋白、运动功能蛋白、受体、信号蛋白、储藏蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内蛋白、外蛋白、分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、裂解蛋白、具有二硫键的蛋白、蛋白复合物、化学修饰的蛋白和朊病毒构成的组。13根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子选自由核。
6、酸、编码核酸序列、MRNA、反义RNA（MIRNA或SIRNA）分子、碳水化合物、脂质和糖脂构成的组。14根据权利要求5所述的方法，其中，所述生物活性分子为治疗药物或毒性化合物。15一种将生物活性分子输送至个体细胞内的方法，包含将生物活性分子被连接至其的具有选自由序列编码为15至35构成的组的氨基酸序列的肽施用至个体。权利要求书CN104039811A1/36页3具有改善的细胞渗透性的新的大分子转导结构域的研发及其使用方法技术领域0001本发明涉及改进的大分子转导结构域MTD及其制备方法，编码改进的MTD的多核苷酸，使用改进的MTD通过基因工程而令生物活性分子具有细胞渗透性的方法，以及使用改进。
7、的MTD而将生物活性分子导入细胞的方法，所述改进的MTD由于对常规MTD的氨基酸序列的改进而具有比常规MTD更加改善的细胞渗透性，其帮助将生物活性分子递送至细胞。背景技术0002细胞膜由于不可渗透性而作用为蛋白质、核酸、肽和不溶化合物进入细胞的障碍物。在细胞内药物转导中的这种问题必须在疾病的治疗、预防和诊断领域中被解决。通常，将生物活性分子渗透至细胞内的方法包括电穿孔，使用脂质体的膜融合，使用磷酸钙、例如为聚乙烯亚胺PEI的阳离子聚合物或DEAE右旋糖苷的转染，病毒转染，和单细胞显微注射。此外，最近对于有效的细胞内药物转导来说，采用例如为纳米颗粒的药物递送系统的内噬作用的技术已被使用，但是由于。
8、免疫系统内的快速损失所导致的传递效率的降低，或者由于与细胞的相互作用所导致的位阻，需要对实现有效的细胞内药物递送进行更多的研究。因此，目前对于通过生物膜和细胞的核膜来递送例如蛋白质、核酸等大分子而不损坏细胞膜的方法存在持续的需求。0003在1988年，GREEN和LOEWENSTEIN小组GREEN和LOEWENSTEINCELL55,11791188188以及FRANKEL和PABO小组FRANKEL和PABOCELL55,11891193188分别发现了转导结构域将HIV1的转录相关蛋白质、TAT渗透通过细胞膜并反式激活病毒基因，该HIV1是导致获得性免疫缺陷综合症AIDS的病毒。表现出细。
9、胞渗透性的TAT结构域为TAT蛋白质的第48至第57的碱性氨基酸序列GRKKRRQRRR，并且发现该序列在渗透细胞膜中扮演着重要的作用VIVES等,JBIOLCHEM272,16010160171997；FUTAKI等,JBIOLCHEM276,583658402001；WADIA,JS和SFDOWDY,CUMOPINBIOTECHNOLOL1315262002；WADIA等,NATUREMEDICINE103,3103152004。0004作为另一个例子，由16个肽组成的触角足突变同源域衍生的穿膜肽PENETRATINRQIKIYFQNRRMKWKK可被使用JOLIOT等,PROCNATLA。
10、CADSCIUSA88186418681991；DEROSSI等,JBIOLCHEM269,10444104501994；JOLIOT,A和APROCHIANTZ,NATCELLBIOL63189962004；并且除了穿膜肽，具有类似序列和机理和肽序列被广泛地称为蛋白质转导结构域PTD。已经发现这样的PTD的细胞内物质转导的机理通过扰乱细胞表面上的细胞膜并将物质递送至细胞内，或者通过由在细胞表面上存在的膜蛋白的多种不同的葡聚糖的负电荷和构成将要被递送至细胞内的PTD的碱性氨基酸残基的正电荷之间的静电作用导致的内噬作用而在核内体内累积物质，而不是通过直接将物质渗透至细胞膜内来执行JSWADIA,。
11、等,NATMED103103152004；说明书CN104039811A2/36页4INAKASE,等BIOCHEMISTRY464925012007；HLAMAND,等,BIOCHIMBIOPHYSACTA2011。然而，这样的PTD的物质转导机理在将例如为肽、蛋白质、核酸等的物质转导至活体的深层组织中是困难的。特别地，肽或蛋白质在核内体内累积，并且当在细胞内结合至溶酶体的时候，容易通过溶酶体的蛋白酶而被降解。据此，当使用PTD转导足够高浓度的肽或蛋白质的时候，能够作用于细胞质内目标的有效组分可以由核内体发出，其在使用PTD的蛋白质转导中成为问题FMILLETTI,DRUGDISCOVERY。
12、TODAY178508602012。0005随后，在2000年，由纤维原细胞生长因子FGF的单肽衍生的MTSAAVLLPVLLAAP被合成并制造DAEWOONGJO等,NATBIOTECH第19卷,2001。MTS由12个疏水氨基酸组成，其中一个缬氨酸和两个亮氨酸存在于连续具有两个丙氨酸、并且包括脯氨酸的序列之间，并且与常规PTD具有截然不同的特性。此外，目前作为更加改进的转导结构域，具有比PTD和MTS更加改善的将材料传递至细胞内的效率、以及不同结构和静电特征的新的细胞膜可渗透肽被研发，并且肽为大分子转导结构域MTD参见WO2008/093982。0006当使用本发明人在技术上研发的MTD的。
13、时候，不像转导至HIVTAT细胞内，内噬作用和能量在物质的细胞内转导中都是不需要的，并且用于与细胞膜直接相互作用的细胞膜的刚性和完整度用作为重要的因素，并且由此也可执行细胞之间的连续转导。出于这种原因，MTD对于将目标蛋白质递送至细胞内是高效的，并且与常规的细胞膜可渗透肽TAT相比能够递送至活体内的深层组织中。此外，衍生自分泌蛋白或细胞膜蛋白的单一序列的疏水MTD通过改进主要由三个部分组成的单肽的疏水区域的序列来制备，所述的三个部分包括N端的疏水区域和C端的分泌蛋白切割位点、形成螺旋结构以具有细胞膜靶标活性的疏水区域。MTD直接渗透通过细胞膜，而不损坏细胞，并允许例如为蛋白质的大分子被递送至细。
14、胞内以表现出它们自身的功能。0007然而，因为MTD通常由疏水氨基酸组成，并由此降低物理性能和适用性，所以当在与强疏水肽或蛋白质相关的制备中的时候，当在常规缓冲条件下在预定浓度或更高浓度熔融的时候，或者根据转导物质的特征，MTD就可被沉淀。因此，与在所使用的浓度范围内未沉淀并考虑到将被转导的物质的特征时表现出最优化的渗透性和活性的MTD的组合也可能是需要的。0008因此，本发明人研发了新的细胞膜渗透结构域，通过缺失或修饰氨基酸序列或嵌合融合而具有改善的细胞膜渗透性，从而改善物理特性和常规MTD的适用性，并提高细胞膜渗透性及其确定的细胞内转导作用，由此证明比常规MTD更加改善的作用，由此完成本发。
15、明。发明内容0009技术问题0010本发明被发明以研发如上所述的肽，其通过改进传统MTD肽的氨基酸序列而具有更佳的细胞渗透性，并意图提供改进的MTD，其由于缺失、修饰或嵌合融合至传统MTD的氨基酸序列并多核苷酸编码改进的MTD而具有改善的细胞膜渗透性和物理特性。0011本发明还意图提供一种使用改进的MTD来基因设计生物活性分子以具有细胞渗透性的方法，以及使用改进的MTD将生物活性分子输入至细胞内的方法。0012然而，本发明所要实现的技术目标并不限于如上所述的目标，并且本领域技术人说明书CN104039811A3/36页5员将根据如下的说明而清楚地理解将不会被描述的其它目标。0013技术方案00。
16、14本发明的多个方面提供了由通式1表达的肽，其中A1为蛋氨酸M，MET；A2为选自由精氨酸R，ARG、组氨酸H，HIS和赖氨酸K，LYS构成的组的氨基酸；并且MTD具有选自由序列编号为1至7构成的组的氨基酸序列0015通式10016A1A2MTD；和0017编码所述肽的多核苷酸。0018在本发明的一种实施方式中，所述肽调解生物活性分子至细胞内的转运，并具有选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列。0019在本发明的另一种实施方式中，多核苷酸具有选自由序列编号为36至56构成的组的碱基序列。0020在本发明的一种实施方式中，序列编号为15的氨基酸序列可由序列编号为36的序列编码，但是本发明。
17、不限于此。0021在本发明的另一种实施方式中，序列编号为16的氨基酸序列可由序列编号为37的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0022在本发明的还一种实施方式中，序列编号为17的氨基酸序列可由序列编号为38的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0023在本发明的还一种实施方式中，序列编号为18的氨基酸序列可由序列编号为39的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0024在本发明的还一种实施方式中，序列编号为19的氨基酸序列可由序列编号为40的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0025在本发明的还一种实施方式中，序列编号为20的氨基酸序列可由序列编号为41的多核苷酸序列编码，但是本发明。
18、不限于此。0026在本发明的还一种实施方式中，序列编号为21的氨基酸序列可由序列编号为42的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0027在本发明的还一种实施方式中，序列编号为22的氨基酸序列可由序列编号为43的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0028在本发明的还一种实施方式中，序列编号为23的氨基酸序列可由序列编号为44的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0029在本发明的还一种实施方式中，序列编号为24的氨基酸序列可由序列编号为45的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0030在本发明的还一种实施方式中，序列编号为25的氨基酸序列可由序列编号为46的多核苷酸序列编码，但是本发明。
19、不限于此。0031在本发明的还一种实施方式中，序列编号为26的氨基酸序列可由序列编号为47的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0032在本发明的还一种实施方式中，序列编号为27的氨基酸序列可由序列编号为48的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0033在本发明的还一种实施方式中，序列编号为28的氨基酸序列可由序列编号为49说明书CN104039811A4/36页6的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0034在本发明的还一种实施方式中，序列编号为29的氨基酸序列可由序列编号为50的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0035在本发明的还一种实施方式中，序列编号为30的氨基酸序列可由序。
20、列编号为51的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0036在本发明的还一种实施方式中，序列编号为31的氨基酸序列可由序列编号为52的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0037在本发明的还一种实施方式中，序列编号为32的氨基酸序列可由序列编号为53的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0038在本发明的还一种实施方式中，序列编号为33的氨基酸序列可由序列编号为54的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0039在本发明的还一种实施方式中，序列编号为34的氨基酸序列可由序列编号为55的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0040在本发明的还一种实施方式中，序列编号为35的氨基酸序列可由序。
21、列编号为56的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0041本发明的另一个方面提供了基因设计具有细胞渗透性的生物活性分子的方法，包括使具有选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列的肽连接至生物活性分子。0042在本发明的一种实施方式中，所述连接通过使生物活性分子连接至肽的N端、C端或者两端来实施。0043在本发明的另一种实施方式中，所述连接通过使相反设置的肽的氨基酸连接至生物活性分子的C端来实施。0044在本发明的还一种实施方式中，所述连接通过肽键或化学键来实施。0045在本发明的还一种实施方式中，所述化学键可以选自二硫键、二胺键、硫胺键、羧基胺键、酯键和共价键。0046在本发明的还一种。
22、实施方式中，生物活性分子选自由蛋白质、多肽和肽构成的组。0047在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子选自由生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽、抗体和抗体片段构成的组。0048在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子可以选自酶、激素、载体蛋白、免疫球蛋白、抗体、结构蛋白、运动功能蛋白、受体、信号蛋白、储藏蛋白、膜蛋白、跨膜蛋白、内蛋白、外蛋白、分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、裂解蛋白、具有二硫键的蛋白、蛋白复合物、化学修饰的蛋白和朊病毒。0049在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子可以选自由核酸、编码核酸序列、MRNA、反义RNAMIRNA或SIRNA分子、碳水化合物、脂质和醣脂。
23、构成的组。0050在本发明的还一种实施方式中，生物活性分子为治疗药物或毒性化合物。0051本发明的又一个方面提供了将生物活性分子输送至个体细胞内的方法，包括对个体施用连接生物活性分子的选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列。0052有益效果0053本发明的改进的MTD比常规MTD具有不可忽视的更佳的将生物活性分子传递至细胞内的细胞渗透性，并有效地维持了所传递的生物活性分子在细胞内的活性。因此，本发明说明书CN104039811A5/36页7的改进的MTD可被用于药物传递系统内，用于DNA/RNA治疗的重组蛋白疫苗或药物，用于基因和蛋白质治疗的方法，药理学或医学有用的蛋白质、或者药物医学。
24、和药物组合物的制备，并且对于研发新的和改进的药物也是非常有用的。附图说明0054图1至4为使用PEPFOLD服务器程序来分析本发明的改进的MTD的二级结构的结果。0055图5为通过流式细胞术在人类结肠直肠癌细胞中分析本发明的改进的MTD的细胞渗透性定量分析结果。0056图6为通过流式细胞术在人类胚胎肾细胞中分析本发明的改进的MTD的细胞渗透性定量分析结果。0057图79为通过共聚焦激光扫描显微术在皮肤源角化细胞内可视观察本发明的改进的MTD的细胞渗透性的结果；MR形式改进的MTD通过通式A1A2MTD表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为精氨酸；MH形式改进的MTD通过A1A2MTD来表达，其中A1。
25、为蛋氨酸并且A2为组氨酸；和MK形式改进的MTD通过通式A1A2MTD来表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为赖氨酸。0058图10为通过共聚焦激光扫描显微术在人类宫颈癌细胞内可视观察本发明的改进的MTD的细胞渗透性的结果；MR形式改进的MTD通过通式A1A2MTD表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为精氨酸；MH形式改进的MTD通过A1A2MTD来表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为组氨酸；和MK形式改进的MTD通过通式A1A2MTD来表达，其中A1为蛋氨酸并且A2为赖氨酸。0059图11示出了显示在EPIORAL皮肤模型中本发明的改进的MTD的细胞组织中的渗透性的图像，该图像由共聚焦激光扫描显微术摄取。0。
26、060图12为本发明的改进的MTD的皮肤渗透性通过共聚焦激光扫描显微术在体内的鉴定结果。0061图13为通过共聚焦激光扫描显微术使乙酰化六肽结合本发明的改进的MTD来制备的肽复合物的细胞渗透性在体外的鉴定结果。0062图14为示出了通过共价键使改进的MTD与LACZSIRNA结合的图像。0063图15示出了显示静脉注射至老鼠内的本发明的改进的MTD渗透至活体器官的肺组织内的图像，由共聚焦激光扫描显微术摄取。0064图16示出了显示当改进MTD被静脉注射至老鼠内的时候，改进的MTD被渗入至活体的肺组织内，由此降低牛乳糖蛋白的表达的图像。具体实施方式0065虽然低分子量合成化合物或天然化合物可被容。
27、易地递送至细胞内，但是例如蛋白质、肽和核酸的大分子由于大分子量而并不会渗入至呈双层脂质膜结构的细胞膜内。为了克服这样的大分子不会渗透通过细胞的质膜的缺陷，研发了大分子细胞内转导技术MITT,韩国专利公开号1020090103957。0066因为物质转导结构域仅由疏水氨基酸组成，所以当MITT被用于使例如为硫酸类说明书CN104039811A6/36页8肝素蛋白多糖HSPG的碳水化合物带负电并且令例如为粘多糖的多糖和唾液酸带负电的时候，到达具有负电荷和亲水性的细胞膜的能力就会被限制。0067因为在MITT中使用的位于N端的信号肽为指示蛋白质翻译后转运的短肽，所以对于不同的蛋白质来说信号肽的通用结。
28、构由包括蛋白质的的起始密码子M的两亲性结构域组成，并且两亲性分子由两个结构域组成，例如亲水性极性结构域和疏水性非极性结构域。发明人希望考虑信号肽的两亲性特征，因为两个结构域的作用是明显的，发明人估计信号肽的连续性将被良好地保存。0068然而，当带正电的氨基酸是延续的，或者其中包括连续的至少三个带正电的氨基酸的序列或者五个氨基酸的序列与疏水肽连接的时候，发明人估计疏水肽将不会直接渗透过细胞膜并转导至细胞内，而是通过内噬作用而转导至细胞内，正如PTD那样。0069基于这样的设想，发明人提供了新的改进的MTD，通过将具有正电荷的一个或两个亲水性极性氨基酸应用于常规的疏水MTD来加强至具有负电荷的细胞。
29、膜的可接近性而更加有效地将生物活性分子传递至细胞内，并且由此完成本发明。0070本发明提供了由通式1表达的肽，其中A1为蛋氨酸M，MET；A2为选自由精氨酸R，ARG、组氨酸H，HIS和赖氨酸K，LYS构成的组的氨基酸；并且MTD具有由序列编号为1至7构成的组的氨基酸序列0071通式10072A1A2MTD；和0073编码所述肽的多核苷酸。0074与在韩国专利公开1020090103957中公开的MTD相比，所述肽调解生物活性分子至细胞内的转运并表现出极佳的细胞渗透性。在本发明中，所述肽被称为“改进的MTD”。0075所述肽可以选自由序列编号为15至35构成的组的氨基酸序列，但是本发明不限于此。
30、。0076所述肽优选具有被量化的一个序列以允许相对比较在韩国专利公开1020090103957中研发的193个MTD，并且尽管本发明不限于此，所选择的满足如下的条件00771脯氨酸位于序列的中间；2相对于每个结构域通过评价使用SIGNALP程序诱导细胞外分泌物的可能性而获得的数值为60或更大；3使用PROTPARAM程序参见HTTP/WEBEXPASYORG/PROTPARAM/评价的脂溶指数为100至300；4使用PROTSCALE程序评价的弹性平均弹性参见HTTP/WEBEXPASYORG/PROTSCALE/为036或更大；5使用PROTPARAM程序评价的亲水性为30或更小；6使用PR。
31、OTPARAM程序评价的不稳定指数为30至60；7使用PROTSCALE极性程序评价的极性为01或更大。0078序列编号为1的氨基酸序列可由序列编号为8的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0079序列编号为2的氨基酸序列可由序列编号为9的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0080序列编号为3的氨基酸序列可由序列编号为10的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0081序列编号为4的氨基酸序列可由序列编号为11的多核苷酸序列编码，但是本发明说明书CN104039811A7/36页9不限于此。0082序列编号为5的氨基酸序列可由序列编号为12的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0083。
32、序列编号为6的氨基酸序列可由序列编号为13的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0084序列编号为7的氨基酸序列可由序列编号为14的多核苷酸序列编码，但是本发明不限于此。0085本发明的多核苷酸可以是RNA或DNA的类型，并且DNA包括CDNA和合成DNA。所述DNA可以是单链或者双链。如果DNA为单链的，那么其可以是编码链或者非编码反义链。编码序列可以是与选自序列编号为36至56的碱基序列相同的，或者是与之不同的编码序列。所述编码序列通过基因编码的简并或冗余而获得，并编码相同的多肽。0086本发明的多核苷酸还包括如上所述的多核苷酸的变形，其对由推导序列编号为15至35的氨基酸序列表征的多核。
33、苷酸的片段、类似物或衍生物进行编码。多核苷酸的变形可以是多核苷酸的天然生成的等位变形或者多核苷酸的非天然生成的变形。0087本发明的多核苷酸可以具有由选自序列编号为36至56的碱基序列表征的编码序列的天然生成的等位变形。所述的等位变形为具有至少一个核苷酸的替代、缺失或添加的多碱基序列的替换形式，而编码多核苷酸的功能基本上不变化。0088本领域技术已知的是单氨基酸可以由至少一个核苷酸密码子编码，并且多核苷酸可被容易地改变来制备替换的多核苷酸编码的相同的肽。因此，在本发明的另一种实施方式中，多核苷酸包括替换的碱基序列编码的包括如上所述的氨基酸序列的肽。核酸分子编码的包括所要求保护的氨基酸序列的肽包。
34、括所要求保护的序列和碱基序列编码的位于所要求保护的氨基酸序列的N端或C端的任意氨基酸的任意组合。0089本发明的另一个方面提供了一种使用改进的MTD对生物活性分子进行基因设计以具有细胞渗透性的方法。0090生物活性分子的治疗应用通常由于低细胞渗透性而受到限制。尽管生物活性分子已经示出通过细胞内的内噬过程而被细胞所摄取，但是采用这种方式进入细胞的分子通常会被细胞内的细胞内小泡捕集并在溶酶体中降解。0091本发明的改进的MTD似乎比传统的MTD具有更加有效的细胞渗透性。本发明的改进的MTD可以以套装的形式提供，其包括本领域技术人员已知的用于帮助将肽连接至目标多肽的所需组分。相继地，连接至改进的MT。
35、D的目标蛋白质在这种方式中可以在体外或在体内递送至细胞，用于细胞内的内噬作用。0092如上所述的多核苷酸可被插入至蛋白质表达载体中以产生通过如上所述的改进的MTD的作用而可由其外侧传递至细胞内的蛋白质。0093表达载体被基因设计以将在N端和/或C端方向上编码MTD的核酸序列结合至作为生物活性分子的编码肽、多肽、蛋白质结构域或全长蛋白质的核酸序列，并位于正确的读取框架内从而使得由大分子转导结构域和目标生物活性分子构成的重组蛋白可被表达。表达载体可以在原核或真核表达系统中使用的容易获得的那些中选择。0094如在本发明中所使用的，MTD为导引目标蛋白质从细胞外部至内部的细胞内转运的大分子转导结构域，。
36、并且改进的MTD比传统MTD具有更加增强的细胞渗透性。在本发明说明书CN104039811A8/36页10的另一种实施方式中，改进的MTD可以包括肽或多肽通过细胞膜进入细胞的可替换的序列调解进口。0095目标蛋白质为通常表现出小于通过细胞膜的最佳渗透性的蛋白质，但是当N端和/或C端连接至本发明的改进的MTD的时候，其由细胞的外部转运至内部。0096目标蛋白质可以在改进的MTD和目标多肽、蛋白质结构域或全长蛋白质之间具有切割位点，并且所述切割位点可替换地为因子X位点或者本领域技术人员已知的另一个位点，从而切割重组蛋白质以从主体肽或多肽物理移除改进的MTD。0097如在本发明中所使用的，术语“生物。
37、活性分子”包括如果被纳入至细胞内能够表现出生物作用的任意分子。因为分子量范围为约100,000至约1百万的非常大的蛋白质被细胞所输出例如抗体、纤维蛋白原和巨球蛋白，非常大的蛋白质可以通过本发明的方法而被运输至细胞内。0098生物活性分子的例子包括但不限于蛋白质、多肽和肽，其包括生物活性分子的功能结构域，例如生长因子、酶、转录因子、毒素、抗原肽对于疫苗、抗体和抗体片段。生物活性分子的其它例子包括核酸，例如质粒、编码核酸序列、MRNA和反义RNA分子、碳水化合物、脂质和糖脂。生物活性分子的其它例子包括用于诊断、治疗和/或预防疾病的那些，特别是具有低细胞膜渗透性的那些。这些治疗剂的一些例子包抗癌药物。
38、，例如道诺红霉素，和有毒化学物，因为当通过这种方法施用的时候其可以使用更低的计量，所以现在其可被更加安全地施用。生物活性分子的又一个例子为抗原肽。抗原肽可被给予以提供免疫保护，当涉及免疫反应通过细胞输入的时候。其他的例子包括免疫抑制肽即现有技术已知的阻断自体反应T细胞。大量的其它例子对于本领域技术人员是显而易见的。0099适用于本发明的生物活性分子的代表性例子根据它们的功能包括酶、激素、转运蛋白、免疫球蛋白或抗体、结构蛋白、运动功能蛋白、受体、信号蛋白和储藏蛋白；根据它们的位置和作用包括膜蛋白或跨膜蛋白、内蛋白、外蛋白或分泌蛋白、病毒蛋白、天然蛋白、糖蛋白、裂解蛋白、具有二硫键的蛋白、蛋白复合。
39、物、化学修饰的蛋白和朊病毒。0100标准的重组核酸方法可被用于表达基因设计的重组蛋白。编码本发明的改进的MTD的核酸序列可在具有合适的信号和处理序列以及调控序列的核酸表达载体中克隆用于转录和翻译，并且可以使用自动有机合成方法而合成蛋白质。用于合成蛋白质的方法例如在文献METHODSINENZYMOLOGY,第289卷SOLIDPHASEPEPTIDESYNTHESIS，GREGGBFIELDS编者,SIDNEYPCOLOWICK,MELVINISIMON编者,ACADEMICPRESS1997中公开。0101为了获得克隆基因或核酸、例如编码MTD肽的CDNA高水平表达，MTD序列典型地被亚克隆。
40、至表达载体内，其包含用于引导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及在核酸编码蛋白质的情况中为用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为本领域已知的，并且在文献SAMBROOKRUSSELL,MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,第三版,COLDSPRINGHARBORLABORATORY,NY2001；和AUSUBEL等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,GREENEPUBLISHINGASSOCIATESANDWILEYINTERSCIENCE,NY1989中公开。用于表达本发明的改进的MTD的细菌表达系统例如在大肠杆菌、。
41、芽孢杆菌和沙门氏菌PALVA等,GENE222292351983；MOSBACH等,NATURE3025435451983中提供。用于这样的表达系统的试剂盒为市售的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为本领说明书CN104039811A109/36页11域已知的并且同样为市售的。在本发明的另一种实施方式中，真核表达载体可以是腺病毒载体，腺相关载体或逆转录病毒载体。0102通常地，用于表达通过将蛋白质连接至改进的MTD的N端、C端或两端来制备的细胞可渗透重组蛋白的表达载体可以包括调控序列，例如包括可操作地连接至序列编码大分子转导结构域的启动子。0103可以使用的诱导型启动子的非限制性。
42、例子包括类固醇激素响应启动子例如蜕皮激素响应、雌激素响应和糖皮质激素响应启动子，四环素“TETON”和“TETOFF”系统，和金属响应启动子。该构建体可被引入至合适的宿主细胞内，例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或组织培养细胞。该构建体还可被引入至胚胎干细胞以产生作为模型体的基因转移生物。大量合适的载体和启动子为本领域技术人员已知的并且为市售的，用于产生本发明的重组构建体。0104已知的方法可被用于构造包含本发明的多核苷酸的载体和合适的转录/翻译控制信号。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/基因重组。例如，这样的技术在文献SAMBROOKRUSSELL,MOLECULARCLON。
43、INGALABORATORYMANUAL,第三版,COLDSPRINGHARBORLABORATORY,NY2001；和AUSUBEL等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYGREENEPUBLISHINGASSOCIATESANDWILEYINTERSCIENCE,NY1989中公开。0105适用于制造细胞可渗透重组蛋白质的宿主细胞包括细菌细胞和真核细胞例如真菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞。宿主细胞可通过任意常规方法分裂，包括冻融循环、声波降解法、机械分裂或者使用细胞裂解剂。文献SCOPES,PROTEINPURICATIONPRINCIPLESANDPRACT。
44、ICE,NEWYORKSPRINGERVERLAG1994公开了用于纯化重组和非重组蛋白质的一些通用方法。所述方法例如包括离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱法、选择性沉淀、透析和疏水作用色谱。这些方法可以经调整以设计出用于细胞可渗透重组蛋白质的纯化策略。如果细胞可渗透重组蛋白质包括纯化处理，例如附加表位或金属螯合序列，那么亲和色谱法可被用于极大地纯化蛋白质。0106所产生的蛋白质的量可以通过直接地例如使用蛋白质印迹分析或间接地即通过用于特定的DNA结合活性的细胞的分析材料，例如通过电泳迁移率变动分析通过检测大分子转导结构域来评价。蛋白质可在纯化之前、在任何纯化步骤过程中、或者在纯化之后被检测。
45、。在某些方案中，纯化或者完全地纯化是不需要的。0107通过本发明的方法制备的基因设计的重组蛋白为细胞可渗透蛋白质，并可被用作为蛋白质基疫苗，特别是当灭杀或衰减全部生物疫苗为不切实际的时候。通过本发明的方法制备的细胞可渗透蛋白质还可被用于治疗多种疾病，特别是免疫疾病或癌症。细胞可渗透蛋白质可被传递至细胞的内部，消除利用重组载体来转染或转换细胞的需求。本发明的细胞可渗透蛋白质可在体外使用来评价蛋白质功能或者可被用于维持细胞处于所期望的状态。0108本发明的改进的MTD可被用于在体外或在体内将肽、多肽、蛋白质结构域或者蛋白质递送至目标细胞的内部。改进的MTD可以通过源自重组DNA或RNA分子由重组蛋。
46、白质的表达而形成的肽键连接至目标蛋白质，或者可以通过连接子的方式共价连接至MTD而被连接至目标蛋白质。共价键可被用于将本发明的改进MTD连接至非蛋白质分子，例如多核苷酸，用于输入至细胞内。说明书CN104039811A1110/36页120109根据本发明基因设计具有细胞膜渗透性的蛋白质的方法提供了一种用于将治疗蛋白质产物递送至细胞内的方式。本发明与细胞外蛋白质递送的在先描述方法的组合提供了以稳定的、功能性的形式以控制释放的方式传递蛋白质以输入至细胞内的方法。0110多肽使用合适的表达载体和表达系统来制造。细胞渗透性基于蛋白质或多肽通过重组具有位于N端和/或C端的MTD的蛋白质至所表达的多肽的。
47、表达而被赋予。较不稳定的蛋白质通过本领域技术人员已知的并且在先描述的方法而被稳定化。递送至细胞外环境通过在恰当的载体中、例如微球载体提供稳定化的重组蛋白质来完成。蛋白质的选择将指示恰当的载体和表达系统，以及合适的稳定和递送技术。药物递送系统领域的技术人员可以从所描述的那些中选择出合适的技术。0111如在本发明中所使用的，术语“细胞膜”涉及包含脂质的屏障，其将细胞或细胞团与细胞外空间相隔离。细胞膜包括但不限于质膜、细胞壁、细胞内细胞器膜，例如线粒体膜、核膜等。0112如在本发明中所示的，术语“生物活性分子”涉及能够诱发或改进在系统内的生物响应的化合物或分子。生物活性分子的非限制性的例子包括抗体例。
48、如单克隆的、嵌合的、人源化的等、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化疗剂、小分子、维生素、辅助因子、核苷、核甘酸、寡核苷酸、酶核酸、反义核酸、三螺旋形成寡核苷酸、2,5A嵌合体、SINA、SIRNA、MIRNA、RNAI抑制剂、DSRNA、同种异型酶、其适配子、诱饵和类似物。本发明的生物活性分子还包括能够调节其它生物活性分子的药代动力学和/或药效动力学的分子，例如脂质和例如为聚胺、聚酰胺、聚乙二醇和其他聚酯的聚合物。在特定的实施方式中，术语生物活性分子与术语“大分子”可互换地使用。0113如在本发明中所使用的，术语“大分子”涉及大的分子分子量大于1,000道尔顿，例如但不限于生物来源或合成来。
49、源的肽、蛋白质以及寡核苷酸和多核苷酸。0114如在本发明中所使用的，术语“肽”涉及由单链D或L氨基酸或者通过肽键结合的D和L氨基酸混合物构成的化合物。优选地，肽包含至少两个氨基酸残基并且在长度上小于约50个氨基酸。0115如在本发明中所使用的，术语“蛋白质”涉及由线性设置的通过肽键连接的氨基酸组成的化合物，但是与肽相比，具有明确定义的构象。蛋白质与肽相反，优选是包含50个或更多的氨基酸的链。0116如在本发明中所使用的，术语“多肽”涉及至少两个氨基酸残基并包含一个或多个肽键的聚合物。多肽涵盖肽和蛋白质，而无需考虑多肽是否具有明确定义的构象。0117如在本发明中所使用的，术语“核酸”涉及寡核苷酸或多核苷酸，例如脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA，以及RNA或DNA的类似物，例如由任意的单链或双链形式的核苷酸类似物构成。0118氨基酸残基在这里涉及为它们标准的单字母符号或三字母符号或者它们的全称A，ALA，丙氨酸；C，CYS，半胱氨酸；D，ASP，天门冬氨酸；E，GLU，谷氨酸；F，PHE，苯丙氨酸；G，GLY，甘氨酸；H，HIS，组氨酸；I，ILE，异亮氨酸；K，LYS，赖氨酸；L，LEU，亮氨酸；M，MET，蛋氨酸；N，ASN，天冬酰胺；P，PRO，脯氨酸；Q，GLN，谷氨酰胺；R，ARG，精氨酸；S，SER，丝氨酸；T，THR，苏氨酸；V，VAL，缬氨酸；W，TRP，色。