细胞组学血管健康概况分析的系统和方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201280039113.1

申请日:

2012.06.10

公开号:

CN104039134A

公开日:

2014.09.10

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A01N 1/02申请公布日:20140910|||实质审查的生效IPC(主分类):A01N 1/02申请日:20120610|||公开

IPC分类号:

A01N1/02; G01N33/00; G01N31/00

主分类号:

A01N1/02

申请人:

宾夕法尼亚大学董事会

发明人:

E·R·莫勒; J·S·摩尔; L·张; W·罗杰斯; A·D·班特雷

地址:

美国宾夕法尼亚州

优先权:

2011.06.10 US 61/495,955; 2012.05.22 US 61/650,353

专利代理机构:

北京纪凯知识产权代理有限公司 11245

代理人:

赵蓉民

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内容摘要

本发明涉及确定对象中血管健康的方法。该方法包括以下步骤:从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹确定对象的血管健康。

权利要求书

1.  确定对象中血管健康的方法,包括:
从所述对象获得生物样品;
基于所述生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;
基于所述生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;
基于所述微粒和祖细胞数据产生所述生物样品的流式细胞术指纹;和
基于所述产生的流式细胞术指纹确定所述对象的所述血管健康。

2.
  权利要求1所述的方法,其中所述至少一组微粒的所述水平通过流式细胞术测量。

3.
  权利要求1所述的方法,其中所述生物样品是血浆样品。

4.
  权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有银屑病的对象。

5.
  权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有狼疮的对象。

6.
  权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有已知CVD风险因素的对象。

7.
  权利要求1所述的方法,其中所述对象是没有已知CVD风险因素的对象。

8.
  权利要求1所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。

9.
  权利要求1所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。

10.
  权利要求9所述的方法,其中所述对象是1型糖尿病对象。

11.
  权利要求9所述的方法,其中所述对象是2型糖尿病对象。

12.
  权利要求1所述的方法,其中所述祖细胞是内皮祖细胞(EPCs)。

13.
  权利要求1所述的方法,其中当至少一个微粒组的水平上调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。

14.
  权利要求1所述的方法,其中当至少一个祖细胞组的水平下调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。

15.
  权利要求1所述的方法,其中当至少一个微粒组的水平上调和至少一个祖细胞组的水平下调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。

16.
  确定对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险的方法,包括:
从所述对象获得生物样品;
基于所述生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;
基于所述生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;
基于所述微粒和祖细胞数据产生所述生物样品的流式细胞术指纹;和
基于产生的流式细胞术指纹确定与所述对象心血管疾病或血管机能异常相关的风险。

17.
  权利要求16所述的方法,其中所述至少一组微粒的所述水平通过流式细胞术测量。

18.
  权利要求16所述的方法,其中所述生物样品是血浆样品。

19.
  权利要求16所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。

20.
  权利要求19所述的方法,其中所述对象是1型糖尿病对象。

21.
  权利要求19所述的方法,其中所述对象是2型糖尿病对象。

22.
  权利要求16所述的方法,其中所述祖细胞是内皮祖细胞(EPCs)。

23.
  权利要求16所述的方法,其中所述产生的流式细胞术指纹表明细胞损伤。

24.
  权利要求16所述的方法,其中所述产生的流式细胞术指纹表明内皮完整性、内皮修复能力的丧失、或其组合。

25.
  权利要求16所述的方法,进一步包括产生健康对照样品的流式细胞术指纹,和将所述对象的生物样品的所述产生的流式细胞术指纹与所述健康对照样品的所述流式细胞术指纹进行比较。

说明书

细胞组学血管健康概况分析的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月10提交的美国临时申请序列号61/495,955和2012年5月22日提交的美国临时申请序列号61/650,353的优先权权益,其全部公开内容通过引用被并入本文,如同每个以其全部在本文中列出。
发明背景
心血管疾病(CVD)在美国是最主要的死亡原因;每39秒一个成人死于心脏病发作、中风或其它心血管疾病(“在美国,高血压和胆固醇失去控制”。疾病控制中心网站。http://www.cdc.gov/Features/Vitalsigns/CardiovascularDisease/。2011年1月31日更新,2012年2月6日访问)。美国CVD患病率已经非常高(36.9%的成人或约8千1百万人)并预测在接下来的20年里增加约10%,到2030年估计超过40%的成人(大约1亿1千6百万人)将患有一种或多种形式的CVD(Heidenreich et al.,2011,Circulation123:933-944)。很早以前症状在临床上是明显的,新生血管疾病开始于内皮细胞机能异常。当动脉粥样硬化进展到阻塞的血流引起缺血的点时,或当由于破裂或侵蚀,血栓从存在的斑块形成时,有症状的、临床CVD事件通常发生(Heidenreich et al.,2011,Circulation123:933-944)。
令人遗憾地,目前不存在有成本效益的和准确的可确定患者心血管健康的血液测试。相反,心血管风险通常由若干循环生物标记,如高灵敏度C-反应蛋白(hsCRP)和纤维蛋白原进行评估(Ridker,2003,Circulation107:363-369)。由于这些生物标记通常是急性期反应物,因此对于动脉粥样硬化不是特异性的,它们只被推荐给具有心血管事件的中等风险的患者(Greenland et al.,2010,Circulation122:e584-e636)。同样,在临床实践中没有可用的生物标记来灵敏地和准确地评价对医学治疗的反应。心血管风险分层的基于弗雷明汉(Framingham)的方法没有结合生物标记或遗传异常,因此预测值受限。
一个公开的心血管风险算法,雷诺尔德(Reynolds)评分,包括hsCRP,但是,如同弗雷明汉,遗传背景不包括在方案中。实践和预防工作组中基因组应用的评价(Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention Working Group(EWG))发现推荐测试28个基因中219p21遗传变体或57个其它变体以在一般人群中评估CVD特别是心脏病和中风风险的证据不充分。EWG提出来自单独或组合使用这些基因组标记中任何一个的净健康益处的量是可以忽略的(Evaluation of Genomic Applications in Practice Prevention Working Group.2010.Recommendations from the EGAPP Working Group:Genomic profiling to assess cardiovascular risk to improve cardiovascular health.Journal12:839-843810.1097/GIM.1090b1013e3181f1872c1090)。
因此,存在对早期诊断测试未满足的临床需要,该早期诊断测试提供在明显的CVD之前心血管健康的测量和治疗干预的评估。本发明通过细胞基试验满足该需要,该细胞基试验基于血管健康概况(Vascular Health Profile)(VHP)的建立中祖细胞(PCs),如内皮祖细胞(EPCs)和微粒(MPs)的测量而评估心血管状态。
发明概述
本发明涉及确定对象中的血管健康的方法。该方法包括以下步骤:从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹(cytometric fingerprint);和基于产生的流式细胞术指纹确定对象的血管健康。
在一个实施方式中,至少一组微粒的水平通过流式细胞术测量。在另一个实施方式中,生物样品是全血液样品品。在另一个实施方式中,生物样品是血浆样品。在另一个实施方式中,对象是具有银屑病的对象。在另一个实施方式中,对象是具有狼疮的对象。在另一个实施方式中,对象是具有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是没有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是1型糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是2型糖尿病对象。在另一个实施方式中,祖细胞是内皮祖细胞(EPCs)。在另一个实施方式中,当至少一个微粒组的水平上调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。在另一个实施方式中,当至少一个祖细胞组的水平下调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。在另一个实施方式中,当至少一个微粒组的水平上调和至少一个祖细胞组的水平下调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。
本发明还涉及确定对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险的方法。所述方法包括以下步骤:从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹,确定与对象的心血管疾病或血管机能异常相关的风险。
在一个实施方式中,至少一组微粒的水平通过流式细胞术测量。在另一个实施方式中,生物样品是血浆样品。在另一个实施方式中,生物样品是全血液样品品。在另一个实施方式中,对象是具有银屑病的对象。在另一个实施方式中,对 象是具有狼疮的对象。在另一个实施方式中,对象是具有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是没有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是1型糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是2型糖尿病对象。在另一个实施方式中,祖细胞是内皮祖细胞(EPCs)。在另一个实施方式中,产生的流式细胞术指纹指示细胞损伤。在另一个实施方式中,产生的流式细胞术指纹指示内皮完整性、内皮修复能力丧失或其组合。在另一个实施方式中,所述方法进一步包括产生源自一个或多个个体的健康对照样品的流式细胞术指纹和比较对象的生物样品的产生的流式细胞术指纹与健康对照样品的流式细胞术指纹。
附图简述
为了说明本发明的目的,在附图中描述本发明的某些实施方式。然而,本发明不限于附图中描述的实施方式的精确安排和手段。
图1是显示用于确定血管健康概况的高通量流式细胞术试验的示意图。血液样品分成外周血单核细胞(PBMCs)和血浆。祖细胞在PBMCs中鉴定,而微粒在血浆中鉴定。
图2是Canto A上FSC/SSC阈值优化的图解。如图2所描述的,FSC和SSC阈值由具有不同FSC或SSC阈值的以中等速度通过机器的0.3μm小球(A排)或0.3、1和3μm小球(在FFC/SSC等值线图上的B排和在SSC-W直方图上的C排)确定。D和E列显示在具有设为5000的FSC阈值或设为200的SSC阈值(D列)以及只有设为200的SSC阈值和没有FSC阈值(E列)的FFC/SSC等值线图和SSC-W直方图上3个小球的更好的分辨率。设为200的FSC阈值或设为200的SSC阈值(F列)获得更多的背景噪声。设为200的FSC阈值和没有SSC(G列),0.3μm小球缺失。对于小颗粒,侧向散射较前向散射是更好的参数。在该研究中为了在FSC/SSC等值线和SSC-W直方图上的3个混合物小球的更好的分辨率,将FSC和SSC阈值设为5000和200(D列)。
图3是Canto A上FSC/SSC PMT确定的图解。如图3所描述的,双重过滤的PBS和0.3um小球用于建立FSC、SSC PMT。当双重过滤的PBS以中等流速通过机器时,接受每秒小于10个事件。分别将FSC和SSC的阈值设为5000和200。利用不同SSC电压通过机器上运行的相同样品来确定FSC和SSC PMT。利用SSC300和325,更多的MPs丧失,并且SSC375和400上获得更多的背景噪声。在该研究中,接受350的SSC电压。由于大量背景噪声,这里未显示400的SSC电压数据。
图4是窗口延伸确定的图解。如图4所描述的,FACS Canto A Window Extension(WE)通过以WE0至7的中等速度运行的0.3、1和3μm小球来确定。为了SSC-W直方图上3个小球的更好的分辨率和低背景噪声,选择WE0.2。
图5是Canto A上样品检测中窗口延伸0.2和7的比较。如图5所描述的,将PFP用FITC-Annexin(或CD31)、Percp-Cy5.5-CD41、PE-CD105(或CD144)、APC-CD64 染色和在WE0.2或7上运行。当固定数目的3μm小球(100,000)被计数时停止捕获。将A排在点图上用设为0.2的WE门控(gated)在小于约1μm上。将B排在点图上用设为7的WE门控在小于约1μm上。在SSC-W直方图上用WE0.2将C排门控在小于约1μm上和用WE7将D排门控在小于约1μm上。利用WE7采集更多的背景噪声和更少的阳性颗粒(B排和D排)。
图6是门控策略的图解。如图6所描述的,0.3、1和3μm小球用于估计MPs大小(Canto A上的A和B以及Gallios上的C)。将MPs门控在小于约1μm上(Canto上在SSC-W直方图上门控的D和在FSC/SSC点图上的E以及Gallios上的F)。对于Canto A设置,分别将前向和侧向散射阈值设为5000和200,和将窗口延伸设为0.2。对于Gallios设置,将FS的鉴别器值设为1,前向散射采集角是W2。
图7是抗体优化的图解。如图7所描述的,500μl双重过滤的PBS中用于MP检测的相同体积的抗体在Canto A上运行。未过滤的抗体(A排)较双重过滤的抗体(B排)显示更多的假阳性事件。用于MPs检测的所有试剂应当通过0.1-0.22μm低蛋白结合过滤器进行双重过滤以从运行缓冲液去除抗体聚集物和背景噪声。
图8是抗体优化的进一步图解。如图8所描述的,将50μl PFP用未过滤的抗体 (A和C排)和双重过滤的抗体(B和D排)标记。将A和B排在SSC-W直方图上门控在小于1μm上。将C和D排在FSC和SSC点图上门控在小于1μm上。预先过滤抗体有助于通过去除抗体聚集而减少假阳性颗粒。
图9是Canto A和Gallios上MP检测的图示。如图9所描述的,在Canto和Gallios上检测MPs。在Canto(A排)和Gallios(B排)上将MPs门控在小于1μm上。基于荧光扣除对照(fluorescence minutes one)(FMO)管确定阳性MPs。
图10是BD Canto A和BC Gallios的比较。如图10所描述的,计算的斯皮尔曼等级相关用于在两个平台之间比较MP计数,大多数相关超过0.8,除了显示0.6相关的CD105(+)(P<0.05)。Gallios上MPs计数大于Canto A上两倍。A排显示两个平台的相关,而B排显示两个平台上MPs数目的比较。
图11是用于MP分析的门控策略的图解。MPs通过小于约1μm的校准器小球限定的FSC/SSC图上的P1区上第一门控进行鉴定(A和B)。微粒的来源通过针对源自内皮的MPs(C)的Annexin-V和CD144、针对源自血小板的MPs(D)的Annexin-V和CD41、针对源自单核细胞的MPs(E)的Annexin-V和CDI4的共表达而鉴定。
图12是显示与抑制素应用相比低密度脂蛋白水平(图A)和EPO水平(图B)的散布图(具有中线)图解。LDL,低密度脂蛋白胆固醇;EPO,促红细胞生成素;H,健康的;ES,早期糖尿病;LT,长期糖尿病。
图13是CD34+PCs、板基试验的nM PS+MPs以及nM PS+MPs /CD34+PCs比的散布图(具有中线)和显著性的图解。KW计算的P。H,健康的;ES,早期糖尿病;LT,长期糖尿病;MP,微粒;PC,祖细胞。
图14是ELISA板MPs、流式细胞术测量的CD34细胞和比的中间水平的图解。 插入表显示与"非细胞"动脉粥样硬化生物标记的比较。
图15是用于EPC分析的门控策略的图解。用于EPCs的连续门控策略由门控以下组成:(a)活力(viable)事件(上面的左图),在红色虚线下面;(b)与淋巴细胞一致的大小区域中的细胞(下面的右图),红色椭圆形内;(c)单峰事件(下面的左图),黑色多边形内;和最后(d)对谱系标记CD3、CD19或CD33阴性和对CD45暗至阴性的事件(下面的右图),彩色显示的左下象限内。使用的活力标记是碘化丙啶(Propidium Iodide),在PE-A通道上检测的(上面的左图)。门控是完全自动的,并且无需操作员干预而单独地应用于每个样品。
图16是原始的(未门控的)微粒分布的图解。显示未门控的、任意选择的样品中的微粒分布。显示7个荧光参数加侧向散射宽度的所有配对组合。
图17也是原始的(未门控的)微粒分布的图解。针对1μm以下的颗粒门控之后,显示图16中描述的相同样品。
图18是单变量微粒分布的图解。聚集个体微粒数据组。相对于侧向散射(y轴)绘制(x轴)关于每个荧光参数的事件分布。这些分布上重叠的是单变量分布的核心密度估计(黑色曲线)。代表阳性标记表达的阈值通过这些分布的检查来选择(垂直的黑线)。
图19是另一个原始的(未门控的)微粒分布的图解。在针对1μm以下的颗粒和针对以在阳性表达阈值以上的水平表达至少一个标记的颗粒门控之后,显示图16和17中描述的相同样品(如图18所示)。
图20是通过与HC相比以显著低的浓度存在于DM的流式细胞术指纹确定的EPCs亚型的图解。将个体HC数据集聚集并利用双指数变换在三个二变量图中显示为彩色分布。将CF发现的指纹面元(bin)中与DM相比在HC中更强地表达的事件(P<0.001)显示为黑点。利用荧光扣除对照(FMO)对每个个体样品确定每个显示的标记(CD31、CD24和CD133)的阳性表达阈值,并显示它们的平均值(实黑线)和标准差(包围灰色区域的点虚线)。
图21是与HC相比以不同浓度存在于DM中的MP亚型的图解。MP分布的CF分析导致在HC和DM之间差别表达的8个群体的发现。差别表达的面元(bin)中的事件显示为所有个体DM数据组的聚集(显示为彩色分布)上重叠的黑点。黑线代表对每个参数个别确定的阳性表达阈值(参见图18)。在每个图上面,给出差别表达的亚型的表型。在每个图内显示更高表达的亚型(DM或HC)的群。
图22是组合EPC和MP测量的图解。在上面的图中,垂直轴线代表MP亚型CD31/CD41与CD31/CD41的比。水平轴线代表EPCRel,如文本中所描述的。将测量除以HC组之中的中值而标准化和对数转换。将DM对象绘制为红点,而将HC对象绘制为蓝点。下面的两个图独立地将两个测量描绘为箱式图,其中中值由水平棒指示,箱从第一四分位数延伸到第三四分位数,须(whiskers)延伸不超过1.5倍四分间距。
图23是VEGF-R2试剂的荧光扣除对照(Fluorescence Minus One)(FMO)分析的图解。FMO对照管通过用图中除一个之外的所有标记染色而制备。显示任意选择的3个样品的VEGF-R2FMO分布。FMO阈值通过以下来确定:首先找到针对VEGF-R2分布与侧向散射区域(红色椭圆形)的2D核心密度估计的主要阴性簇边界,然后找到与该边界的水平切线(红色虚线)。注意,在这些样品中存在显著数目的超过FMO阈值的事件。而且,这些事件经常出现以形成从阴性群体去除的丛式孔(clusters well)。这些代表“假阳性”事件,因为这些对照管中没有VEFG-R2试剂,所以阳性表达是由于除外这些细胞上VEFG-R2受体实际表达的一些原因。因此,VEGF-R2的实际表达不能被可靠地查明,尤其当靶事件不常发生时,如在EPCs的情况中。
图24是微粒表型差异表达的图解。显示表7中描述的微粒亚型的糖尿病和健康对照之间差异表达的箱式图。每个箱式图显示等级特定的分布的中值以及第一和第三四分位数。
详细描述
本发明涉及对血管健康概况分析的系统和方法。本发明的系统和方法包括基于多种PCs(如EPCs)和MPs测量的用于评估心血管状态的细胞基试验。该“细胞组学(cytomic)”方法——利用系统生物学的力量结合高度灵敏的高维流式细胞术——是对心血管健康的遗传和环境影响的反映,在细胞水平整合和靶向在内皮功能中起积极作用的细胞(和亚细胞颗粒)。
在本发明的一个方面,所述系统和方法利用具有无偏分析方案的广泛的细胞表面标记图,该方案利用流式细胞术指纹来评价具有糖尿病(DM)的患者和健康对照(HC)之间的差异。与先前的研究——其通过获得MP和EPC样品只单独观察MPs或EPCs的水平——不同,血管机能异常(通过MP水平)和修复能力(通过EPC水平)如何相互作用的平衡可被观察和提供显著提高的诊断和/或风险确定。
定义
除非另外限定,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的意思。虽然与本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料可在本发明的实施或测试中使用,但是描述优选的方法和材料。
如本文所用,以下术语中每个具有与在该部分中与其相关的意思。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文用于指一个或指超过一个(即,指至少一个)的冠词语法对象。作为实例,“要素(an element)”指一个要素或超过一个要素。
“约”如本文所用当指可测量的值如量、短暂的持续时间等时意思包括从特定值的±20%或±10%,更优选±5%,甚至更优选±1%和仍然更优选±0.1%的变化,因为这样的变化对进行公开的方法是适当的。
术语“异常的”当用于对象、生物体、组织、细胞或其组分的上下文中时,指在至少一个可观察的或可检测的特性(例如,年龄、治疗、天的时间等)方面与显示“正常的”(期望的)各自特性的那些对象、生物体、组织、细胞或其组分不同的那些对象、生物体、组织、细胞或其组分。对一个细胞或组织类型来说是正常或期望的特性可能对不同细胞或组织类型来说是异常的。
术语“评估(assessing)”包括任何形式的测量,并且包括确定是否存在要素。术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”和“试验(assaying)”可互换地使用并包括定量和定性确定。评估可以是相对的或绝对的。“评估……的存在”包括确定存在的事物的量,和/或确定它是否存在或不存在。
如本文所用,术语“生物标记”是生物实体如细胞或细胞组或其一个或多个片段、蛋白质或其片段,包括可从生物样品分离或在生物样品中或在生物样品上测量的多肽或肽,与取自不具有CVD的表面上正常的对象的可比较样品相比,其差别地存在于取自具有确定的或可能临床上显著的CVD的对象的样品中。生物标记可以是完整的细胞或分子,或它可以是其部分——其可以部分有功能或例如通过特定的结合蛋白或其它检测方法被识别。如果与预定值或对照群体的参考概况比较,生物标记的可测量方面与对象中CVD的存在或风险相关,则认为该生物标记是提供信息的。这样的可测量方面可包括例如生物样品中生物标记或其部分的存在、不存在、量或浓度,和/或其作为超过一个生物标记的部分概况的存在。生物标记的可测量方面还被称作特征。特征可以是比或生物标记的两个或多个可测量方面的其它这样的数学上定义的关系。生物标记概况包括至少一个可测量特征,并可包括两个、三个、四个、五个、10个、20个、30个或任何数目的特征。生物标记概况还可包括相对于至少一个外部或内部标准的至少一个特征的至少一个可测量方面。
如本文所用,术语“流式细胞术指纹”指多个细胞、微粒或流式细胞仪中所测量的其它对象的多变量概率分布的表示。在流式细胞术方法中,每个细胞或微粒通常由不小于两个被测变量来表征,并常常由多至二十或更多个被测变量表征。多个细胞的流式细胞测量因此可以由与测量变量数目一样多的维限定的超空间中的分布表征。流式细胞术指纹是该多变量概率分布以数字载体(vector)形式的紧凑表示,每个数字代表多变量空间的特定亚区域中分布函数的密度。
如本文所用,术语“心血管疾病”或“CVD”通常指心脏和血管疾病,包括动脉粥样硬化、冠心病、脑血管疾病和外周血管疾病。心血管病症是CVD的急性现象并且包括心肌梗塞、中风、心绞痛、短暂性缺血发作和充血性心力衰竭。心血管疾病,包括动脉粥样硬化,通常由脂肪物质、炎性细胞、细胞外基质和斑块的积累产生。
如本文所用,术语与一个或多个生物标记有关的“数据”,或术语“生物标记数据”通常指反应样品中生物标记的产物的绝对和/或相对丰度(水平)的数据。如本文 所用,术语与一个或多个生物标记有关的“数据集”指代表对象的参考群体中一组生物标记的一个或多个生物标记产物中每个水平的数据集合。数据集可用于产生本发明的式/分类器。根据一个实施方式,数据集不需要包括参考群体每个个体的组的每个生物标记产物的数据。例如,“数据集”当用于将应用于式的数据集的上下文中时可指代表一个或多个参考群体中每个个体的每个生物标记产物水平的数据,但是如将被理解的,也可指代表所述一个或多个参考群体中每个的99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%或更少个体的每个生物标记产物水平的数据,并可仍然用于应用到式的目的。
糖尿病(DM)是由胰岛素不充分产生引起并导致碳水化合物、脂肪和蛋白质异常代谢的一种严重的慢性形式的糖尿病。该疾病以血液和尿中增加的糖水平、过度口渴、频繁排尿、酸中毒和消耗为特征。该状况由肥胖和不活动的生活方式恶化。该疾病常常没有症状,通常通过指示葡糖耐受不良的试验诊断,并用饮食改变和锻炼计划来治疗。糖尿病与包括冠状、外周和颈动脉疾病的心血管并发症的高风险相关。如本文所显示的,将DM用作血管疾病的模型系统,并且将来自糖尿病群的本发明的血管健康概况结果与年龄和性别相似的健康对照(HC)进行比较以发现生物学上提供信息的标记以辅助血管并发症的检测和治疗。
“疾病”是一种动物的健康状态,其中动物不能保持内稳态,并且其中如果疾病没有改善,那么动物的健康持续恶化。
相比之下,动物中的“病症”是一种健康状态,其中动物能保持内稳态,但是其中动物的健康状态较缺少病症的情况不好。如果不治疗,病症不会必然引起动物健康状态的进一步下降。
“式”、“算法”或“模型”是任何数学方程、算法、分析或编程的过程,或采取一个或多个连续或范畴的输入(或“参数”)和计算输出值的统计学技术,有时称作“指数”或“指数值”。“式”的非限制实例包括和、比和回归运算符,如系数或指数,生物标记值转换和标准化(没有限制地包括基于临床参数,如性别、年龄或种族性的那些标准化方案)、规则和指导方针、统计分类模型以及在历史的群体上培养的神经网络。在组合CVD标记和其它生物标记中具有特别用途的是线性和非线性方程和统计分类分析以确定对象样品中检测的CVD标记的水平之间的关系。在组和组合构建中,具有特别意义的是结构统计分类算法,以及风险指数构建的方法,利用模式识别特征,包括建立的技术如交互相关、主成分分析(Principal Components Analysis)(PCA)、因子旋转、逻辑回归(Logistic Regression)(LogReg)、线性判别分析(Linear Discriminant Analysis)(LDA)、Support Vector Machines(SVM)、随机森林(Random Forest)(RF)、偏最小二乘法(Partial Least Squares)、稀疏偏最小二乘法(Sparse Partial Least Squares)、柔性判别分析(Flexible Discriminant Analysis)、递归分类树(Recursive Partitioning Tree)(RPART)、以及其它相关的决策树分类技术、最接近收缩质心(Nearest Shrunken Centroids(SC))、分步模型选择 程序、Kth-最近相邻(Kth-Nearest Neighbor)、提升树(Boosting或Boosted Tree)、决策树(Decision Trees)、神经网络(Neural Networks)、贝叶斯网络(Bayesian Networks)、支持向量机(Support Vector Machines)和隐马尔科夫模型(Hidden Markov Models)以及其它。其它技术可用于存活和事件发生时间危害分析,包括本领域技术人员熟知的Cox、Weibull、Kaplan-Meier和Greenwood模型。
“增加的发展(developing)CVD的风险”在本文用于指对象发展CVD的可能性或概率的增加。该风险可相对于个体的自身风险,或相对于不具有CVD临床证据的参考群体而被评估。参考群体可以代表关于近似的年龄、年龄组和/或性别的个体。
“增加的进展(progressing)CVD的风险”在本文用于指具有CVD的对象具有进展CVD的可能性或概率的增加。该风险可相对于个体的自身风险,或相对于不具有CVD临床证据的参考群体而被评估。参考群体可以代表关于近似的年龄、年龄组和/或性别的个体。
如本文所用,“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其它表达介质,其可用于在实现本文描述的多种疾病或病症的确定或评价风险的试剂盒中传达本发明的化合物、组合物、载体、生物标记或递送系统的有用性。本发明的试剂盒的指导材料可例如附于含有本发明的鉴定的化合物、组合物、载体、生物标记或递送系统的容器或与含有鉴定的化合物、组合物、载体、生物标记或递送系统的容器一起运送。可选地,指导材料可以与发明容器分开运送,目的是指导材料和化合物、组合物、载体、生物标记或递送系统被接收者合作地使用。
一个或多个生物标记的“水平”指样品中生物标记的绝对或相对量或浓度。
“测量(Measuring)”或“测量(measurement)”,或可选地“检测(detecting)”或“检测(detection)”指评估来自临床或对象的样品内给定物质——包括这样的物质的定性或定量浓度水平的衍生化——的存在、不存在、数量或量(其可以是有效量),或另外评价对象临床参数的值或分类。
“微粒”(MPs)如本文所用是由于激活或凋亡通过胞吐出芽(exocytic budding)形成的从真核细胞脱落的0.1-1μm血浆颗粒,并指示细胞损伤。如本文所考虑的,MPs可以是内皮MPs(EMPs)、血小板MPs(PMPs)和/或单核细胞MPs(MMPs)。MPs含有来自它们的母细胞的miRNA、蛋白质和其它抗原,并常常是促凝结和促炎的。
术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文可互换地使用,并指任何动物或其体外或原位细胞,顺从本文描述的方法。在某些非限制的实施方式中,患者、对象或个体是人。
如本文所用,术语“预定值”指获自对象的一般群体或选择的群体的生物样品中一个或多个生物标记的量。例如,选择的群体可以由表面上健康的对象,如先前不具有任何指示CVD存在的征兆或症状的个体组成。在另一个实例中,预定值可以由具有确定的CVD的对象组成。在另一个实例中,预定值可以由具有DM的对 象组成。预定值可以是断开值或范围。预定值可基于表面上健康的对象和具有确定的CVD、ES或LT或DM的对象之间的比较测量而确定,如本文所描述的。
“祖细胞”(PC)如本文所用可包括本领域技术人员理解的任何类型的PC,包括促血管生成细胞(PACs)、内皮祖细胞(EPCs)和循环造血干细胞和祖细胞(CHSPCs)。如本文所显示的,发现了一群细胞,其表型上与EPCs的通常定义一致,但是也与CHSPCs一致。为了简洁和清楚的目的,这样的细胞在本文被简单称作PCs。
“样品”或“生物样品”如本文所用指从个体分离的生物材料。生物样品可含有适合检测期望的生物标记的任何生物材料,并可包括获自个体的细胞和/或非细胞材料。
贯穿本公开,本发明的各个方面可以以范围形式存在。应当理解,以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁,并且不应被解释为对本发明范围的固定限制。相应地,范围的描述应被认为已具体地公开了该范围内所有可能的亚范围以及个体数值。例如,诸如1至6的范围的描述应被认为已具体地公开了该范围内的亚范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及个体的数,例如,1、2、2.7、3、4、5、5.3、6和其间的任何全部和部分增量。这适用而不论范围的宽度。
描述
细胞基系统分析,也称作‘细胞组学’,整合环境和遗传的心血管风险因素的生物学结果。对发展可常规地用于指导医学治疗和风险评估这样的试验存在未满足的临床需要。本发明的系统和方法通过利用模式发现计算方法对血管健康提供综合的见解以分析若干靶,包括血管微粒(最近被鉴定为血管健康的强大生物标记)和内皮祖细胞群体的特性。例如,可评价无症状的患者的心血管风险,并可纵向地监测有症状的患者。这些能力实现个性化医疗的主要目标。
如本文所考虑的,本发明的系统和方法包括在明显的CVD之前提供心血管健康测量的早期诊断测试,以及治疗干预的评估。应当理解,本发明可用于心血管健康的任何参数的测量,并可适合本领域技术人员将理解的任何CVD风险的检测和确定。
例如,糖尿病(DM)与包括冠状、外周和颈动脉疾病的心血管并发症的高风险相关。具有2型DM的患者CAD和PAD的风险增加2至4倍(Beckman et al.,2002,JAMA287:2570-2581)。因此,认为来自具有长期2型DM和具有临床上明显的动脉粥样硬化的患者的血液样品将具有与非糖尿病对照对象不同的异常血管健康概况。如本文所显示的,将DM用作血管疾病的模型系统,并将来自糖尿病群的本发明的血管健康概况结果与年龄和性别相似的健康对照(HC)比较以发现生物学上提供信息的标记以辅助血管并发症的检测和治疗。
祖细胞和测量方法
如本文所考虑的,本发明包括样品中多种祖细胞(PCs)的鉴定和门控。PCs在本文被限定为包括PACs、EPCs和/或CHSPCs以及与CVD相关的任何其它祖细胞类型。这些细胞是修复能力的介质,并且虽然这样的细胞的精确表型限定还未确定,但是认为它们通过结构发展或旁分泌作用参与血管发生以支持血管生长。
EPCs是骨髓衍生细胞,其响应内源的(例如,来自缺血组织、肿瘤细胞)或外源的(例如,抑制素)信号而动员进循环。简言之,EPCs的生理功能促进血管内稳态,血管内稳态对防止由于血管损伤的多种疾病的发病是重要的(et al.,2009,Cytometry Part A75A:25-37)。
常常用于用流式细胞术鉴别EPCs的表面标记包括CD133、CD34和VEGF-R2(也称作KDR)(et al.,2009,Cytometry Part A75A:25-37;Hirschi et al.,2008,Arterioscler Thromb Vasc Biol.28:1584-1595;Khan et al.,2005,Cytometry B Clin Cytom64:1-8)。Estes等的最近研究用体外造血集落形成活性和具有表型CD31+、CD34+、CD133+和CD45暗-阴性的NOD/SCID小鼠中的多谱系移植物限定了细胞群体(Estes et al.,2010,Cytometry Part A77A:831-839),他们将其称作循环造血干和祖细胞(CHSPCs)。如本文所考虑的,对用于表征PC或PCs群体的表面标记的数目和类型没有限制,如本领域技术人员所将理解的。
PCs可通过本领域技术人员了解的任何合适的方法测量。例如,细胞可通过高通量方法测量。在一个实施方式中,细胞通过流式细胞术测量。在另一个实施方式中,细胞通过ELISA基技术测量。在另一个实施方式中,细胞通过板基捕获试验测量。在另一个实施方式中,将通过流式细胞术测量的细胞利用流式细胞术指纹来表示。在一些实施方式中,细胞通过以任何组合的多种方法测量。例如,可使用流式细胞术、ELISA基技术和板基捕获试验或其任何组合。
微粒和测量方法
微粒(MPs)是由于激活或凋亡通过胞吐出芽形成的从真核细胞脱落的0.1-1μm血浆颗粒,并指示细胞损伤。如本文所考虑的,MPs可以是内皮MPs(EMPs)、血小板MPs(PMPs)和/或单核细胞MPs(MMPs)。
MPs含有来自它们的母细胞的miRNA、蛋白质和其它抗原,并常常是促凝结和促炎的。MPs在凝结和炎症中的作用是动脉粥样硬化病理生理学的重要部分,使作为潜在的血管健康生物标记的MPs特别吸引人。实际上,许多研究已证明在血管机能异常的情况中细胞特异的MPs升高(Tushuizen et al.,2011,Arterioscler Thromb Vasc Biol31:4-9)。另外,MPs可在它们的母细胞中通过“输出”促凋亡化合物如胱天蛋白酶3而防止凋亡,由此降低细胞溶质的水平(Hussein et al.,2007,Thromb Haemost98(5):1096-107)。然而,与具有稳定的心绞痛症状的患者相比,MPs在具有急性冠脉综合征的患者中显著提高(Bernal-Mizrachi et al.,2003,American Heart Journal145:962-970),并且是继发性心肌梗塞或死亡的强大预测物(Sinning et al., 2011,European Heart Journal32:2034-2041)。它们还在急性缺血性中风/脑血管意外之后升高(Jung et al.2009.Ann Neurol.66(2):191-9)。在糖尿病患者的预测观察性研究中,升高的MPs强烈预示冠状损害的存在,并被证明是较糖尿病持续时间、脂质浓度或高血压的存在更重要的独立风险因素(Koga et al.,2005,J Am Coll Cardiol45:1622-1630)。循环白细胞衍生的MPs在216名无症状的对象中预示亚临床动脉粥样硬化和斑块数(Chironi et al.,2006,Arterioscler Thromb Vasc Biol.26:2775-2780)。如本文所考虑的,MP的存在、数目和类型可用作生物标记和/或用作本发明的敏感和特异的血管健康概况试验的组分,在预测无症状的患者动脉粥样硬化风险中具有临床实用性。
这些亚微米颗粒被释放进入循环,携带大量表面标记,用于鉴定它们的细胞来源。暴露的膜磷脂酰丝氨酸(PS)和组织因子,连同过多的其它表面分子和细胞质组分,包括核质,使MPs能够影响许多种生物学功能,包括凝结、血栓形成和血管发生。
MPs可通过本领域技术人员了解的任何合适的方法测量。例如,MPs可通过高通量方法测量。在一个实施方式中,细胞通过流式细胞术测量,如各个实施例中所显示的。如本文所考虑的,对用于表征MP或MPs群体的表面标记的数目和类型没有限制,如本领域技术人员所将理解的。
流式细胞术指纹
流式细胞术指纹(Rogers et al.,2008,Cytometry Part A73A:430-441;Rogers&Holyst,2009,Adv Bioinformatics:193947)(CF)提供一种快速分析高维、高容量流式细胞术数据而无需研究者或系统偏倚的方法。CF将多变量分布分解成大量非重叠区域,在本文被称作“面元(bin)”,其完全地跨越空间,产生的在数据集中记录的每个事件在面元之一中找到。给定面元组,CF将每个事件分配到面元,计数每个面元中的事件数,以及将样品的完全多变量分布表示为变平的载体,在本文称作每个面元事件数的“指纹”。如本文所显示的,可将指纹当成数据的完全的微门控,每个门控或面元被加以标记。
还如本文所显示的,针对多样品的多变量概率分布函数可利用简单的统计分析方法比较。例如,可搜索这样的面元,其与利用与现在常规用于基因表达数据分析相似的方法的另一组样品相比,在一组样品中显著地上调和/或下调(Boscolo et al.,2008,IEEE/ACM Transactions on5(1):15-24)。因此,CF的使用不仅赋予“数据挖掘”方法以流式细胞数据分析,由此多变量分布的疾病相关或治疗相关的改变直接从数据中发现,而且建立通向用其它技术综合分析的桥梁(例如,Doring et.al.(et al.,2012,Arterioscler Thromb Vasc Biol。32:182-195))。这不同于依赖研究者限定的门控的常规分析方法,研究者限定的门控代表由于疾病或治疗可改变的多变量空间的特定区域的假设。因此,CF不仅消除研究者偏倚(其可通过门控 主观性而无意地引入)的概率,而且允许所有多变量区域的综合分析,不仅是研究者的期望所预先限定的那些。
本发明方法
如本文所描述的,本发明在对象血管健康确定中利用大量细胞基生物标记。该方法可被如图1所示概括地描述,其中从对象采集生物样品如血液。如本文所考虑的,对象的和用于进行本文描述的方法的生物样品可以是血液、血清、血浆或本领域技术人员所将了解的任何其它合适的流体、组织或细胞样品。接下来,至少一个PC和至少一个MP通过高通量方法,如流式细胞术测量。接下来,进行流式细胞术数据的流式细胞术指纹以将数据分成多个分类,而没有研究者或系统偏倚,以便获得鉴定的生物标记的血管健康概况。利用该概况,与另一组样品相比,一组样品中显著上调和/或下调的生物标记可被鉴定并且在对象中CVD或增加或发展CVD的风险的确定或预测中和使用。
在另一个实施方式中,本发明涉及确定对象中血管健康的方法。该方法包括以下步骤:从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品流式细胞术指纹;以及基于产生的流式细胞术指纹确定对象的血管健康。
在另一个实施方式中,利用综合组(comprehensive panel),其中首先基于大小来选择细胞。然后,属于成熟的造血谱系的细胞通过门控掉CD3+、CD19+、CD33+和CD45细胞而去除。然后,利用流式细胞术指纹,将剩下的群体再分和进行统计评价,而没有任何预定的偏倚,以发现是否存在在DM患者和HC之间差别表达的细胞群体。
在一个实施方式中,本发明涉及通过测量微粒与祖细胞的关系确定糖尿病对象中心血管疾病发病率或血管机能异常的风险的方法。在一个实施方式中,该方法确定或预示增加的发展CVD的风险。在另一个实施方式中,该方法确定或预示增加的进展CVD的风险。例如,该方法包括以下步骤:从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品流式细胞术指纹;以及基于产生的流式细胞术指纹确定对象的与心血管疾病或血管机能异常相关的风险。
在另一个实施方式中,本发明包括确定对象中血管健康的方法,其中该方法包括以下步骤:从对象获得生物样品;和确定样品中相对于祖细胞水平的微粒的类型和/或水平,其中微粒相对于祖细胞的水平指示对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险,由此确定所述对象中的血管健康。
在另一个实施方式中,本发明包括确定糖尿病对象中与心血管疾病或血管机 能异常相关的风险的方法,该方法包括以下步骤:从所述对象获得生物样品;确定样品中相对于祖细胞水平的微粒水平,其中微粒相对于祖细胞的水平指示所述对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险。在一个实施方式中,糖尿病对象是1型糖尿病对象。在另一个实施方式中,糖尿病对象是2型糖尿病对象。
在另一个实施方式中,本发明包括确定对象中糖尿病相关的风险的方法,该方法包括以下步骤:从对象获得生物样品;确定所述样品中相对于祖细胞水平的微粒水平,其中微粒相对于祖细胞的水平指示对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险,由此确定对象中糖尿病相关的风险。
在一些实施方式中,本发明的方法包括确定相对于PACs或EPCs水平的微粒水平的步骤。
在一个实施方式中,微粒相对于PCs、PACs或EPCs的水平指示细胞损伤。在另一个实施方式中,微粒相对于PCs、PACs或EPCs的水平指示内皮完整性、内皮修复能力的丧失、或其组合。
在一个实施方式中,微粒和祖细胞水平的比较是微粒与祖细胞的比。在一些实施方式中,该比可直接与主动脉脉搏波速度(aPWV)相关,提供血浆胆固醇水平、MPs、PACs、内皮损伤和动脉硬度之间的函数联系。
实验实施例
现在参考以下实施例描述本发明。仅为了说明的目的提供这些实施例,并且本发明应决不被解释为受限于这些实施例,而是应被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有改变。
无需进一步描述,据认为,本领域的普通技术人员可利用先前的描述和以下示例的实施例,制造和利用本发明和实施要求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式,并且不被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1:通过流式细胞术的循环MPs的检测
如先前所说明的,流式细胞术(FCM)可用于血液中微粒(MPs)的检测。该技术能够进行一个样品中数千MPs的测量,同时确定鉴定多种MP亚型的的多个标记。MPs非常小的尺寸(0.l至1.0μm)使它们的检测在标准流式细胞仪的尺寸分辨率的界限处。因此,精确的检测需要敏锐地注意样本制备、样品获取和数据分析的细节。如本文所显示的,利用BD Biosciences FACS Canto A和Beckman Coulter Gallios优化患者中人血浆的MPs的检测。
以下材料和方法用于实施例1:
无血小板的血浆(PFP)通过肝素化血液的两步离心从37名健康的对象获得(1500g,15min以及13,000g,2分钟)。将50μl PFP用双重过滤的5μl FITC-CD31 (555445,BD)、5μl PE-CD144(560410,BD)、2.5μl APC-CD64(CD6405,Invitrogen)和5μl PerCP-Cy5.5-CD41a(340930,BD)或2.5μl FITC-Annexin V(556570,BD)、1.25μl PE-CD105(560839,BD)和5μl Percp-Cy5.5-CD3(340949,BD )标记。FMO管用于建立阴性门控。
在室温30分钟温育之后,将50μl 3μm的珠(BCP-30-5,Spherotech)和双重过滤的PBS或Annexin缓冲液加入管以使总的终体积达500μl。然后将样品在FACS Canto A(BD)和Gallios(Beckman Coulter)上运行。
为了数据获取和分析,利用0.3、1和3μm校准珠将前向和侧向散射阈值、光电倍增管(PMT)电压和窗口延伸(WE)优化以检测0.1-1μm颗粒。将MP在具有前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)的方案中以对数模式分析。标准珠0.3(Sigma)、l和3.0μm直径(Spherotech)用于MP大小的估计。将SSW或FSC-SSC图上具有0.3至1.0μm大小的事件门控为MPs。当对于Canto和Gallios计数固定数目的3μm珠(200,000)时,停止获取。用BD FACS Canto A上的DiVa version6.1.2和BC Gallios上的Kaluza version1.1进行分析。
如图2所示,FSC和SSC阈值由具有不同FSC或SSC阈值的以适中速度通过机器的0.3μm珠(A排)或0.3、1和3μm珠(FFC/SSC等值线图上B排和SSC-W直方图上C排)确定。D和E列显示在具有设为5000的FSC阈值或设为200的SSC阈值(D列),以及只有设为200的SSC阈值和没有FSC阈值(E列)的FFC/SSC等值线图和SSC-W直方图上3个珠的更好的分辨率。设为200的FSC阈值或设为200的SSC阈值(F列)获得更多的背景噪声。设为200的FSC阈值和没有SSC(G列),0.3μm珠缺失。对于小颗粒,侧向散射较前向散射是更好的参数。在该研究中,为了FSC/SSC轮廓和SSC-W直方图上的3个混合物珠的更好的分辨率,将FSC和SSC阈值设为5000和200(D列)。
如图3所示,双重过滤的PBS和0.3um珠用于建立FSC、SSC PMT。当双重过滤的PBS以中等速度通过机器时,接受每秒小于10个事件。分别将FSC和SSC的阈值设为5000和200。利用不同SSC电压通过机器上运行的相同样品来确定FSC和SSC PMT。利用SSC 300和325,更多的MPs丧失,并且SSC 375和400上获得更多的背景噪声。在该研究中,接受350的SSC电压。由于大量背景噪声,这里未显示400的SSC电压数据。
如图4所示,FACS Canto A Window Extension(WE)通过以WE0至7的中等速度运行的0.3、1和3μm珠来确定。为了SSC-W直方图上3个珠的更好的分辨率和低背景噪声而选择WE0.2。
如图5所示,将PFP用FITC-Annexin (或CD31)、Percp-Cy5.5-CD41、PE-CD105(或CD144)、APC-CD64染色和在WE0.2或7上运行。当固定数目的3μm珠(100,000)被计数时停止捕获。将A排在点图上用设为0.2的WE门控在小于约1μm上。将B排在点图上用设为7的WE门控在小于约1μm上。在SSC-W直方图上用WE0.2将C排门控在小于约1μm上和用WE7将D排门控在小于约1μm上。利用WE7采集更多的背 景噪声和更少的阳性颗粒(B排和D排)。
如图6所示,0.3、1和3μm小球用于估计MPs大小(Canto A上的A和B以及Gallios上的C)。将MPs门控在小于约1μm上(Canto上在SSC-W直方图上门控的D和在FSC/SSC点图上的E和Gallios上的F)。对于Canto A设置,分别将前向和侧向散射阈值设为5000和200,和将窗口延伸设为0.2。对于Gallios设置,将FS的鉴别器值设为1,前向散射采集角是W2。
如图7所示,将500μl双重过滤的PBS中用于MP检测的相同体积的抗体在Canto A上运行。未过滤的抗体(A排)较双重过滤的抗体(B排)显示更多的假阳性事件。用于MPs检测的所有试剂应当通过0.1-0.22μm低蛋白结合过滤器双重过滤以从运行缓冲液去除抗体聚集物和背景噪声。
如图8所示,将50μl PFP用未过滤的抗体(A和C排)和双重过滤的抗体(B和D排)标记。将A和B排在SSC-W直方图上门控在小于约1μm上。将C和D排在FSC和SSC点图上门控在小于约1μm上。预先过滤抗体有助于通过去除抗体聚集而减少假阳性颗粒。
如图9所示,在Canto和Gallios上检测MPs。在Canto(A排)和Gallios(B排)上将MPs门控在小于约1μm上。基于荧光扣除对照(FMO)管确定阳性的MPs。
如图10所示,计算的斯皮尔曼等级相关用于在两个平台之间比较MP计数,大多数相关超过0.8,除了显示0.6的相关的CD105(+)(P<0.05)。Gallios上MPs计数大于Canto A上两倍。A排显示两个平台的相关,而B排显示两个平台上MPs数目的比较。
如该实施例所显示的,流式细胞术仪设置的优化可显著减少背景噪声。优选,试剂,包括缓冲液和抗体,应通过0.1- 0.2μm低蛋白结合过滤器双重过滤以减少抗体聚集和来自缓冲液的背景噪声。Gallios和FACSCanto上获得的值是相关的,并且Gallios在目的区域中检测到大量事件。
实施例2:作为糖尿病群体中血管健康测量的微粒与祖细胞关系
考查MPs与PCs/PACs的关系以查看是否它可用作改进的和临床上可行的血管病理学指标。将血浆样品从具有早期(ES,诊断<l年)和长期(LT,诊断>5年)2型糖尿病的患者采集并与年龄相关的健康的对象(H)比较。PC和MP亚型通过流式细胞术和ELISA基方法的组合来测量。促凝血的MPs/CD341 PCs的比证明在对象组之间区分的有价值的指标(P5 0.01)。该受损的血管功能的指标在LT组中是最高的,虽然有加强的抑制素治疗,并且较一些可溶蛋白生物标记提供更多的信息。
意想不到地,发现了2型糖尿病中MPs和PCs之间的关系。该比提供具有糖尿病的患者中血管机能异常和心血管风险的定量的和临床上可行的测量。
以下材料和方法用于实施例2:
患者招募和研究设计
将在先前的12个月内诊断有2型糖尿病的患者称作“早期”(ES),并将超过五年以前诊断的那些患者称作“长期”(LT)。在没有先前或目前的糖尿病-或心血管-相关状况病史的基础上将年龄相关的“健康的”(H)对象招募进入研究,并且不采取任何类型的CV相关的药物治疗——包括抑制素或高脂血症、高血压或糖尿病的药物治疗。ES组的四个(36%)和LT组的14个(67%)接受抑制素药物治疗,连同一些其它药物治疗以治疗糖尿病、高血压和其它状况。关于心血管疾病的家族史,健康组中18个(66%)对象中的12个,早期中11(90%)中的10个和长期组中每个参加者(100%)答复存在先前的心血管疾病家族史。LT患者中糖尿病的平均时间长度是20年。所有的研究参加者都是不抽烟者。从所有的研究参加者获得书面的知情同意,并且研究方案经Institutional Review Board(IRB)批准。每个对象在上午8:00左右捐献约50mL静脉血,并且所有对象在前一天晚上禁食。将血液采集在肝素化(Baxter)注射器中,用于细胞和可溶蛋白分析(30mL)、柠檬酸纳用于微粒(10mL)和EDTA用于脂质分析(10mL)。记录每个对象的人口统计数据、医学/药物治疗历史、体格检查和生命体征。
PCs/PACs的流式细胞术
样品采集后不到约1h,利用氯化铵溶胞作用将白血细胞从30mL血液分离,如先前所描述的。不确定血小板计数。细胞染色、门控策略、流式细胞术方法以及分析被如下描述。将大约5E6个细胞用6-色抗体组:FITC-抗CD31(PECAM)(Pharmingen)、PE-抗-CDI33(Miltenyi Biotec.)、PerCP-Cy5.5-抗-CD3,-CDI9,-CD33(Becton Dickinson)、APC-H7抗-CD45(Becton Dickinson)、PE-Cy7-抗-CD34(Becton Dickinson)和APC-抗-VEGF-R2(R&D系统)染色。生存能力通过碘化丙啶排除来评估。利用Becton-Dickinson LSRII流式细胞仪,对每个样品处理2E6个活事件,并且六个荧光标记连同光散射只允许有活力的、低至中的侧向散射。对PCs和PACs分析单峰,其是CD3、19、33-阴性的。将单峰门控为从侧向散射宽度对前向散射宽度的图鉴定的突出的细胞簇以保证将细胞聚集物从分析中排除。将荧光扣除对照(FMO)样品用作阴性对照。将细胞群体(PCs和PACs)定量为以每ml血液的数目的单核细胞百分数。分析集中于对PCs和PACs的亚型定义(表1)。利用FlowJo分析软件(Treestar,Ashland,OR)进行数据分析。
表1
通过流式细胞术的每个表面标记的细胞或颗粒基因型


MP分离
贫血小板血浆(PPP)获自采血之后1小时内的柠檬酸化血以分离MPs。将全血以1500g离心15min,收集上清,并通过在室温以13,500g离心5min获得PPP。对每个对象,将PPP等分进分离管和在-80℃储存直到以后使用。使用的所有样品只进行一次冻融循环。
MPs的流式细胞术
为了MPs的表征和定量,将PPP与1×BD annexin-V结合缓冲液(10mM Hepes,pH7.4,140mM NaCl和2.5mM CaC12)(BD Biosciences)中的Annexin-V(FITC)、PECY5-CD41a、APC-CD14(BD Biosciences)和PE-CDI44(R&D系统)的混合物一起在黑暗中在室温温育30min,然后加入1×BD annexin-V结合缓冲液以制成1mL的总体积/管。将阴性对照制备为用Annexin-V(FITC)和无钙结合缓冲液中相同量的匹配的同种型对照抗体染色的PPP。利用BD Biosciences FACSCanto流式细胞仪,通过校准珠限定FSC-H和SSC-H散射(对数尺度)上的P1区(<11m)(图11A)。每1L MPs的数目利用P1区和6-1m微球体珠(Bacteria Counting Kit,Invitrogen)确定以确定分析的样品(1L)的体积(图11B)。用每个特异Ab和AnnexinV染色的MPs的数目利用FACSDiva软件(BD Biosciences)来分析和确定并且表示为MPs/1L。通过阳性抗体染色的MPs细胞起源的表征列在上面的表1中。
MP板基捕获试验
PS+MPs的浓度利用Zymuphen MP Activity Kit(Aniara-CAT#A521096)确定。在该试验中,将MPs从PPP捕获到不溶解的annexin-V上,并且通过功能性凝血酶原酶试验测量它们的PS含量。这通过外膜表面上nM磷脂酰丝氨酸的测量提供总MP促凝血活性的间接测量。将通过该方法测量的MPs以nM磷脂酰丝氨酸当量表示。
可溶蛋白
可溶蛋白通过电化学发光(electro-chemiluminescant)检测利用商业上测试的试剂盒,按照制造商的说明书从柠檬酸化血浆确定。Meso-Scale Discovery多种试剂盒——包括血管损伤II试验试剂盒(CAT#K11136C-l)——用于测量SAA、CRP、 VCAM1和ICAM1。IL6、IL8、TNFa和IL1b利用人促炎性基础试剂盒(Human Pro-Inflammatory Base Kit)(KI5025A-5)测量。人低氧试验(Human Hypoxia Assay)(CAT#KI5122C-l)测量VEGF、IGFBF-1和EPO。纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)用来自AmericanDiagnostica的Imubind试剂盒检测。间质细胞衍生的因子1(SDF-1)通过R&D系统(CAT#DY350)测量。IL1b、SAA、IL6和IL8是用这些试验的下面的检测。
HbA1c
HbA1c根据制造商的方案利用Primus硼酸盐亲和性HPLC方法(Primus Corporation,Kansas City,MO)进行。
脂质概况分析
将血液样品采集在EDTA中用于脂质分析。HDL利用酶体外试验按照制造商的方案在罗氏自动化临床化学分析仪上进行,用于人HDL胆固醇的直接定量确定。甘油三酯和胆固醇利用VITROS TRIG载玻片和VITROS化学产品校准器试剂盒2在VITROS化学系统(VITROS950Chemistry System)上进行。LDL通过Friedewald Equation计算。
全血细胞计数(CBC)和白细胞计数(WBC)区别分析
血细胞分析利用COULTER LH780血液分析仪(Beckman Coulter)按照制造商的方案进行。
统计学分析
疾病状态组的所有单变量比较使用双侧非参数检验或构成比的卡方比较,其不需要高斯分布。大多数测量的特性,特别是MP、PACs和可溶蛋白水平,具有强的非高斯分布。对象特性的疾病状态组比较没有呈现与疾病状态相关的响应趋势。这些比较使用KruskalWallis(KW)检验(非参数ANOVA比较)。PC、PAC、MP和可溶蛋白水平的分析相对于疾病状态呈现响应趋势。这些趋势的统计学显著性的评估使用Jonckheere-Terpstra(JT)检验(非参数趋势比较)。个体疾病状态组(例如ES对LT)之间差异的事后比较使用Wilcoxon两样品检验。通过性别的患者构成比的比较应用跨组的构成比相等的精确卡方检验。该检验比较疾病状态组中观察到的构成比与所有疾病状态组构成比是相同的假设。其它特征性的构成比(例如抑制素使用)是用于从H组排除的标准,因此只比较ES和LT组。对特定协变量调整之后,MP和PAC关系与疾病状态的分析基于逻辑回归模型,协变量已经包括在模型中。
在假定疾病状态差异和响应变化性的相似关系的基础上,能力计算用来自Koga等的数据利用CD144+EMPs进行。ES中的11个、LT中的22个和H中的18个的样品大小在检测相对疾病状态差异(对照对糖尿病)中具有约90%能力,如前面提到 的研究中所记录的。
实施例2结果
在先前发现——糖尿病是心血管疾病的风险因素,并且糖尿病的持续时间是该风险的另外的附加成分——的基础上,我们招募ES和LT患者。对象特性呈现在表2中。包括总共41名对象(平均年龄57岁)。在三组之间不区分年龄和性别。如预期的,血糖控制、糖化血红蛋白、HbA1c的标准标记在所有糖尿病和健康个体之间显著改变,但在ES和LT组之间不能区分。糖尿病组中观察到的较低水平的LDL最可能与抑制素使用相关(ES中36%,LT中67%)。为了研究糖尿病组中的该效应,在由抑制素使用分开的每组中绘制LDL水平,如图12A所示。接受抑制素的LT糖尿病患者具有与健康个体相比减少的LDL水平,指示若没有这样的治疗,该群中LDL水平将实质上更高。相对用抑制素,LDL水平在不用抑制素的LT患者中较低的事实可能是由于与后者(n=14)相比前者的小样本大小(n=7)。HDL和甘油三酯在三组之间没有差别。虽然LDL水平在LT组中被控制,但是相对H组,LT组中收缩压更高(P<0.01)。重要地,当我们的研究调查某些细胞来源的标记(特别地单核细胞MPs)的作用时,单核细胞和淋巴细胞计数在三组之中在统计学上未改变。红血细胞计数在ES和H组之间没有改变,但是在LT组中显著降低。相似地,相对H组,LT中血红蛋白水平显著较低(表2)。
表2
患者特性

数据是平均值±SD
*P<0.01,**P<0.001,NS,非显著的;NA,未分析的。事后比较显著性水平(未对多个比较进行调整)。LT对H,ES对H,LT对H,ES对H,#P<0.05,LT对ES
KW用于检验针对测量值的所有三组之间的显著性。对于测量的数据,患者组之间的事后分析使用两样本Wilcoxon检验。性别数据的比较使用双侧精确Pearson卡方检验,用于三组的比较和用于事后分析。具有零健康患者的特性将其作为组要求,因此未分析与该组的比较。
进行PCs、PACs和总MPs连同一些细胞特异的MPs的评估。观察到通常的关系,其中开始或疾病持续期间,PC和PAC水平降低,MPs和大多数MP亚型增加(表3)。上述的例外是PCs从H增加到ES状态,但是在LT疾病状态中全部降到H水平以下,然而这不具有统计学意义(P<0.05)。PACs以较PCs显著低的频率检测到,并且观察到一些显著的变化。
所有三个PACs在H和ES疾病状态之间大致相等,但是CD133VEGF-R2从ES到LT对象显著下降。三个阳性PACs,CD133+、CD34+、VEGFR2中显著的减少只在H和LT组之间观察到。有意思的是,注意到每组内具有流式细胞术未检测到的水平的三种阳性PACs(CD133+、CD34+、CDVEGF-R2)的个体的数目随着疾病的开始也引人注目地上升(H中33%,ES中63和LT中68%)。对于细胞衍生的MPs,循环EMPs和PMPs水平在H和LT之间显著的改变(P=0.03)。CD14单核细胞衍生的MPs不受疾病状态或持续期间影响(表3)。流式细胞术测量的AnnV+MPs和板基试验测量的PS+MPs的nM的改变实质上相等(P=0.02)。然而,流式细胞术方法可检测到H对ES随着疾病的开始的差异,而板基方法检测到ES和LT随着疾病持续期间,的变化。两个试验之间的不同分辨率可能是由于它们的分开的读取;细胞计量术(AnnV+MPs)计数PS+MPs的数目,而板捕获PS+MPs和利用凝血酶原酶试验定量。但是,两个试验都检测到H和LT之间的差异。这些结果显示利用较流式细胞术更可行的板基试验在临床研究中测量MPs的可能性。还进行协变量调节以评价在协变量、年龄、性别、高血压和抑制素使用包括在回归模型中之后是否观察到的组差异仍然显著。由于H组内高血压和抑制素使用是排除标准,只有年龄和性别可在那些比较中使用。随着对年龄和性别的调节,AnnV+MPs在H和ES之间仍然是显著的(P=0.02),EMPs(P=0.03)和PMPs(P=0.01)在H和LT之间也是。AnnV+MPs在H和LT之间是在显著的边缘(P=0.053)。对于ES和LT之间的比较,在包括年龄之后,调节年龄、性别、高血压和抑制素使用,没有其它协变量改进模型。
通过流式细胞术测量两个和三个阳性PACs以及细胞衍生的MPs在技术上具有挑战性并且昂贵。研究通过流式细胞术测量单个阳性PCs和通过板基试验测量PS+MPs的值。CD34+PCs显示从H到E的减少在显著的边缘(P=0.06),而通过板基试验测量促凝血的MPs显示显著的向上趋势(P=0.02),如图13所示。
评估是否MP/PC之比在PCs/PACs或MPs单独的研究中提供另外的信息。有意思的是,PS+MPs/CD34+PC之比证明区别对象组的有价值指标(P=0.01)(图13),并且该改变较分析的任何其它单个PC、PAC或MP亚型更显著(表3)。ELISA板MPs的中间水平、流式细胞术测量的CD34细胞、两个水平之间的比以及与“非细胞”动脉粥样硬化生物标记的比较显示在图14中。还将PCs、PACs和MPs与一些可溶蛋白标记比较。MP/PC之比与许多常常利用的可溶蛋白——包括CRP、ICAM1和VCAM1——相比更有预测性(表4)。将这些可溶蛋白通过多元化试验定量,有成本效益的和有效的方法常常用于临床研究。TNFa、VEGF、IGFBF-1、SDF-1和PAI-1 虽然可检测,但是不显著。有意思的是,EPO浓度在LT组中较高(P1/4 0.004)(表4),并且不是由于外源重组人EPO(rhEPO)或与抑制素使用有关(图12B)。LT组内的那些具有显著降低的红细胞(RBC)计数和血红蛋白并因此与健康和ES比较,接近贫血状态(表2)。
表3
细胞和细胞衍生的生物标记

数据是中值(25%-75%四分位距)。P(A)C值对应细胞/mL,MP值对应MPs/μL,除了PS+MPs,其对应通过板基试验的nM PS等价物。H,健康;ES,早期糖尿病;LT,长期糖尿病。*P<0.05。事后比较显著性水平(未对多个比较进行调整)。LT对H,ES对H,#P<0.05LT对ES。
P值通过JT检验计算以检验三组之间的差异。患者组之间的事后分析使用两样本Wilcoxon检验。
表4
可溶蛋白分析

*P<0.01H,健康;ES,早期糖尿病;LT,长期糖尿病。事后比较显著性水平(未对多个比较进行调整)。LT对H,ES对H,#P<0.05LT对ES。
P值通过JT检验计算以检验三组之间的差异。患者组之间的事后分析使用两样本Wilcoxon检验。
据认为这是显示随着2型糖尿病的开始和持续时间,PACs降低和MP增加的首次研究。另外,为以下提供证据:评价MPs与PCs之比(nM PS+MPs/CD34+PCs)的价值;临床上可行的和较一些标准蛋白标记提供更多信息的测量。PCs和MPs不是心血管疾病的副产物,而是该疾病的活性成分,并因此反映特异的疾病途径。例如,MPs不仅是细胞损伤的标记,而且是促进内皮机能异常和凝结的活性剂。PCs和PACs的减少指示血管修复能力的丧失。在证明PCs/PACs和MPs水平与糖尿病的持续时间相关中,我们的结果还提供对糖尿病的分步病因学和其促成血管病理学的机制见解。
冠状动脉疾病(CAD)的存在在具有糖尿病的个体中常常是无症状的。虽然最近的非侵入性研究表明,CAD可在显著数目的这些个体中检测到,但是常规筛查方法尚未显示在临床上有用或有成本效益。生物标记,特别是源自细胞的生物标记,可证明更加预示心血管事件。对处于血管并发症风险的患者的细胞生物标记的寻找是有希望的,但是尚未成为临床实践的一部分,因为快速、容易进行的细胞基试验尚未被验证。
如实施例1所显示的,鉴定了2型糖尿病中和随着疾病的持续时间的PCs/PACs和细胞衍生的MPs的显著改变。这是示例性的利用MPs/PCs之比的价值,其包括两个生物学相关的标记,所述标记在功能上影响疾病进展。进一步,显示该比可以较通常用于使处于提高的心血管风险的个体分层的许多个体标准蛋白生物标记提供更多信息。从临床的角度,来自这些研究的结果表明,用于造血祖细胞的单个平台高通量、多元化流式细胞术试验和用于MPs的板基试验是鉴定处于最高心血管事件风险的那些个体的可行和有成本效益的方法。
实施例3:糖尿病(DM)中MPs和PCs的研究
进行50个对象的研究以利用流式细胞术和ELISA评价与健康对照相比最近诊断的DM的患者和长期诊断的那些患者中MPs和PCs的水平。除了测量内皮、血小板和单核细胞MPs,还测量内皮祖细胞(EPCs)。
以下材料和方法用于实施例3:
研究人群和方法学
将先前的12个月内诊断有2型DM的患者称为“早期”(ES),并将诊断超过5年的那些患者称为“长期”(LT)。在没有先前或目前的糖尿病或心血管疾病史的基础上招募年龄相关的“健康的”H)对象进研究,并且不采取任何类型的CV相关的药物治疗——包括抑制素。只有非吸烟者才允许参与该研究。每个对象捐献大约50mL静脉血。所有对象在就诊之前的晚上禁食,并在上午大约8点抽取血液样品。将血液采集在肝素化(Baxter)注射器中,用于PCs和可溶蛋白分析(30mL)、柠檬酸钠用于MPs(10mL)和EDTA用于脂质分析(10mL)。MPs利用流式细胞术并且还用利用annexin V抗体的非细胞特异的ELISA试验来测量。
确定产生的数据,具有非高斯分布,因此进行两种适当的比较检验。跨对象组的差异利用Kruskal-Wallis(KW)检验(非参数ANOVA比较)来确定。由于跨对象组存在时间成分(即疾病持续时间)和潜在趋势,利用Jonckheere-Terpstra(IT)检验——非参数检验,以比较数据中的趋势。如所预期的,血糖控制、糖化血红蛋白、HbA1c的标准标记随着疾病持续时间而显著改变(P<0.0001)。
PCs和MPs的研究表征
根据细胞表面标记将细胞衍生的MPs和PCs在每个对象组中鉴定和定量。利用流式细胞术,CD133和/或CD34表达限定PCs,而另外的VEGF-R2的表面表达限定EPCs。将最初通过尺寸(<1um,利用流式细胞术)从无血小板的血浆(PFP)限定的MPs进一步利用单标记表面表达通过细胞类型来表征。内皮、血小板和单核细胞MPs分别通过CD144、41和14的表面表达来确定。在许多细胞衍生的MPs上质膜的外部小叶上检测到的阴离子性磷脂(phopholipid)、磷脂酰丝氨酸经由流式细胞术通过AnnV结合来确定。另外,将商业上可获得的ELISA基板基试验用于MP检测。这经由外膜表面上nM磷脂酰丝氨酸的测量提供总MP量的间接测量。表5示例了用于MPs鉴定的单克隆抗体的特异性。
表5

实施例3结果
一般而言,随着糖尿病对象中疾病的持续时间,PC和EPC水平降低,MPs和大多数MP亚型增加(图11)。有意思的是,EPCs的变化较祖细胞更显著。对于细胞特异的MPs,循环内皮MPs(EMPs)和血小板衍生的微粒(PMPs)的水平在组之间改变最显著(图11)。CD14+单核细胞衍生的MPs(MMPs)受疾病或持续时间影响最小。通过流式细胞术和ELISA板基的试验的AnnV+MP的定量在选择的疾病组之间显示相同的趋势和显著性,提供该ELISA基试验在临床研究中应用的验证和保证。具有流式细胞术不能检测水平的三个阳性EPCs的每组内个体的数目随着疾病和疾病持续时间增加,H中33%,ES中63%和LT中68%。为了鉴别哪些组彼此最分离,对三个组合(即健康对EST、健康对LTD和ESD对LTD)上所有列出的PCs、EPCs和MPs进行单独的t检验。这些之中,H和LTD彼此最不同。
结果显示,与健康的个体比较,长期糖尿病患者中MPs升高,EPCs降低。与MPs相比,长期糖尿病患者中CD34阳性细胞的比率较两者任一单独的更大。
实施例4:流式细胞术指纹
流式细胞术指纹(CF)将对应表格式数据的多变量概率分布函数表示为"变平的"、计算上高效的指纹显示,其便于样品的定量比较。为了测试灵敏度和特异性,产生实验和合成数据以充当用于评价CF的参考组。无需现有知识的引入,CF能“发现”覆盖四个数量级至100,000个事件的背景中10个示踪事件等级的下限的浓度范 围内未门控分析中示踪(spiked)细胞的位置和浓度。
如本文所显示的,这呈现了对表格式流式细胞术数据的定量分析的方法。同样,称作“flowFP”的Bioconductor软件包已被开发以整合指纹法方法与数据分析的其它先进方法。该整合的便利产生计算平台,其支持假定的产生和测试,消除操作者偏倚的来源和提供增加水平的数据分析自动化。重要地,流式细胞术数据的指纹基表示允许多形式数据的直接融合,能够进行双平台(流式细胞术和ELISA)数据的整合分析。
实施例5:微粒ELISA试验
在一些实施方式中,通过流式细胞术检测的样品(例如,无血小板血浆样品)还可通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测试。ELISA样品可用1%EDTA/盐水连续稀释。可将预滴定量(PBS中5ug.ml)的Annexin V(BD Biosciences)加入96孔微量滴定板的每个孔作为捕获试剂(以靶向MP表面上的磷脂酰丝氨酸)并且在4℃温育18h。可洗涤板,并且PFP连续稀释的样品可加入孔中,在25℃在板振荡器(200r.p.m.)上温育18h。洗涤之后,可将预滴定量的生物素化抗体(CD144、14、41a)加入每个孔并且在25℃在板振荡器上温育2h。洗涤之后,可将过氧化物酶结合的抗生物素蛋白加入每个孔。每个孔可随后洗涤和然后与过氧化物酶底物溶液在室温温育20min。该温育之后,可将终止溶液加入每个孔,并且吸光度可用EIA读数器在450的波长测量。
具体地,可如下测试该ELISA试验和单平台流式细胞术试验的特异性、准确性、精确度、线性、限度和范围。
所述试验的特异性是明确地评估MP颗粒与annexin-V结合的能力。分析程序的准确性表示被接受为约定真值或接受的参考值与发现的值之间一致的接近度。ELISA试验不是定量试验,而流式细胞术试验是。可比较两个平台上的结果。分析程序的精确度表示在规定的条件下获自相同均质样品的多次抽样的一系列测量之间一致的接近度。精确度可在三个水平考虑:重复性、中间精确度和再现性。重复性或试验内精确度与该研究最相关。分析程序的线性是其获得与样品中分析物浓度直接成比例的结果的能力。个体分析程序的检测限是样品中分析物的最低量,其可被检测到但不必定量为精确值。分析程序的范围是样品——对于其已证明,分析程序具有合适水平的精确度、准确性和线性——中分析物的较高和较低浓度之间的间隔。限度和范围又可通过比较数据与流式细胞术数据来评估。
实施例6:具有糖尿病和动脉粥样硬化的患者中MPs和EPCs的研究
该研究基于具有利用流式细胞术指纹的无偏倚分析方案的广泛细胞表面标记组而利用新的科学发现方法以评价DM患者和HC之间的差异。与通过获得MP 和EPC样品只观察MPs或EPCs水平的其它研究不同,该研究观察血管机能异常——通过MP水平,和修复能力——通过EPC水平,如何相互作用的平衡。
患者招募和研究设计
诊断有2型DM超过5年和具有临床上明显的动脉粥样硬化、心肌梗塞病史、中风、跛行或血管再形成程序的患者包括在该研究中。研究登记之前3个月内急性疾病、心肌梗塞或中风和孕妇从该研究中排除。在没有之前或当前的糖尿病史或心血管疾病史或主要的心血管风险因素——包括吸烟、高血压或升高的LDL胆固醇——的基础上将年龄相似的‘健康的’对象招募进研究。
开始,连续招募104个对象(52个DM和个52HC)。随后,由于需要新鲜而不是冷冻样品的分析进行MP分析的协议的修订,连续招募另外的对象(n=14DM和n=7HC)。从这些对象中,62个DM和51个HC样品产生可用于定量EPCs的数据。将四十八个DM和48个HC样品用于MP分析。47个DM和43个HC样品的数据用于组合的MP和EPC分析。来自全血细胞计数(CBC)结果的绝对淋巴细胞计数(ALC)用于标准化EPC计数,96个样品中五个不具有ALC,因此不可用于EPC分析。具有EPC数据的二十二个对象不具有可用的新鲜样品,因此不包括在MP分析中。记录每个对象的人口统计信息、医学和药物治疗史、体格检查和生命体征。数据利用如下进行分析:用于统计计算的R环境(版本2.13.1,R Development Core Team,Vienna,Austria)和flowFP(Rogers et al.,2008,Cytometry Part A73A:430-441)、flowCore(Ellis,B.,Haaland,P.,Hahne,F.,Le Meur,N.,以及Gopalakrishnan,N.2009.flowCore:Basic Structures for flow cytometry data.Bioconductor package version1.18.0。软件可获自http://bioconductor.org/packages/2.10/bioc/html/flowCore.html)以及KernSmooth(Wand,M.(R port by Brian Ripley).2011.KernSmooth:Functions for kernel smoothing for Wand&Jones(1995).R package version2.23-6。软件可获自http://CRAN.R-project.org/package=KernSmooth)包。
样品采集
禁食一晚上之后,利用21-规格针将血液采集在金盖(Fisher Scientific)血浆分离管(SST)中用于脂质分析和具有EDTA添加剂(Fisher Scientific)的淡紫色盖管中用于HbA1c和CBC分析,如先前所描述的(Curtis et al.,2010,Cytometry B Clin Cytom78(5):329-37)。将四个柠檬酸钠真空采血管(vacutainer tubes)充满3ml外周血用于MP分析,并且还将30ml外周血抽进60ml涂有肝素的注射器用于EPC分析。
EPC流式细胞术
样品采集后一个小时之内,将30ml全血用氯化铵裂解,用PBS中的3%FCS洗涤和再悬浮于10ml PBS中的3%FCS。将8×106个细胞与小鼠IgG(Sigma,Cat# I5381-10MG)在冰上温育10分钟。封闭之后,将细胞在冰上在黑暗中用以下染色45分钟:20μl FITC-CD31(BD Cat#555445,克隆WM59)、20μl PE-Cy7-CD34(BD Cat#348791,克隆8G12)、20μl Percp-Cy5.5-CD3(BD Cat#340949,克隆SK7)、20μl Percp-Cy5.5-CD33(BD Cat#341650,克隆P67.6)、20μl Percp-Cy5.5-CD19(BD Cat#340951,克隆SJ25C1)、5μl V450-CD45(BD Cat#560367CloneHI30)、10μl PE-CD133(Miltenyl Biotec Cat#130-080-801,克隆AC133)和20μl APC-VEGFR2(R&D Cat#FAB357A,克隆89106)。荧光扣除对照管用于建立阴性门控(Roederer,2001,Cytometry45:194-205)。染色之后,将样品洗涤两次并向每管加入具有0.1%BSA和5μg/ml碘化丙啶(Sigma cat#P4170)的600μl PBS。
补偿管用BD CompBeads(抗小鼠IgG和阴性对照,Cat#552843)制备。8个峰值荧光校准珠(Spherotech,cat#RCP-30-SA)每天在捕获之前和之后运行,用于在天之间标准化。所有捕获发生在BD FACS Canto A分析流式细胞仪上并且在计数至少200,000个淋巴细胞之后停止。
EPC数据分析
对于每个对象,读取表格式数据并利用flowCore Bioconductor包(Ellis,B.,Haaland,P.,Hahne,F.,Le Meur,N.,and Gopalakrishnan,N.2009.flowCore:Basic Structures for flow cytometry data.Bioconductor package version 1.18.0。软件可获自http://bioconductor.org/packages/2.10/bioc/html/flowCore.html)在未转换的线性坐标中处理。基于通过FACSDiva捕获软件确定和在FCS首部储存的溢出矩阵而应用数字补偿,并且基于每天运行的参考珠(Spherotech,Cat#RCP-30-5A)利用最亮的峰将数据标准化。将荧光数据双指数转换,并将散射数据线性转换以将荧光和散射数据置于相似等级。开发完全自动化的门控策略以便消除可能的操作员偏倚(图15)。简言之,将其前向散射区域(FSC-A)或侧向散射区域(SSC-A)在目标区之上发信号的事件和前向散射区域上(淋巴细胞簇下面)的小事件去除以防止对自动化门控的干扰。应用生存能力门控,其中排除超过PE-A(Phycoerythrin)检测器(在575/26带通滤波器上)上恒定阈值的所有事件——其代表PI结合。利用区块分析算法基于2D核心密度估计的自动化多边形门控用于检测FSC-A对SSC-A中淋巴细胞区中的事件。产生自动化的门控以基于在FSC-A对前向散射宽度(FSC-W)上双峰群体与单峰群体分开的事实选择单峰细胞。最后,产生CD45对谱系混合物(CD3T细胞、CD19B细胞和CD33单核细胞)中的二维长方形门控以消除已分化成造血谱系的细胞和/或光亮地表达CD45的细胞,只留下谱系阴性和CD45暗-阴性事件。剩下的事件然后利用flowFP包(Holyst,H.A.,and Rogers,W.T.2009.FlowFP:Fingerprinting for Flow Cytometry.Bioconductor Package version 1.12.1。软件可获自http://bioconductor.org/packages/2.10/bioc/html/flowFP.html)分析。利用具有默认分辨率的方法flowFPModel基于来自健康对照对象的所有门控事件的聚集——利 用不用于门控的四个测量的荧光参数(PE-Cy7-CD34、PE-CD133、APC-VEGF-R2和FITC-CD31)——而构建面元划分模型。产生的面元划分模型含有1024个面元。然后利用用于所有样品的方法flowFP从DM和HC对象产生指纹。每个面元中相对事件计数通过小细胞门控中的事件数(通常视为代表流式细胞仪中测量的淋巴细胞数)除以面元中的事件数而计算。绝对事件计数通过表示为每μl全血数千个淋巴细胞的ALC实验室结果乘以相对事件计数而获得。最后,利用Wilcoxon检验在DM和HC样品之间比较面元,利用Benjamimi-Hochberg校正对多个比较校正P值。P值<0.05被认为是显著的。
MP分离
贫血小板血浆(PPP)利用从在柠檬酸钠管中采集的血液离心而分离。血液采集后一小时内,为了如前面所描述分离MPs(Curtis et al.,2010,Cytometry B Clin Cytom78(5):329-37),将全血在室温以2,500g离心15分钟。将PPP小心地移到新管并轻轻地混合。然后将新鲜样品经由流式细胞术分析。
MP流式细胞术
将50μl PPP用2.5μl FITC-Annexin-V(BD Bioscience Cat#556570)、2.5μl PE-CD144(BD Bioscience Cat#560410,克隆55-7H1)、0.75μl Percp-Cy5.5-CD64(BD Bioscience Cat#561194,克隆10.1)、0.75μl AF647-CD105(BD Bioscience Cat#561439,克隆266)、0.75μl APC-H7-CD41a(BD Bioscience Cat#561422,克隆HIP8)、2.5μl PE-Cy7-CD31(Biolegend Cat#303118,克隆WM59)和0.75μlBV421-CD3(Biolegend Cat#300433,克隆UCHT1)在黑暗中在室温标记30分钟。在标记之前将抗体用0.1μm低蛋白结合过滤器(Millipore,Cat#SLVV033RS)双重过滤。
将样品管染色之后,将5μl3.0μm珠加入每个管作为参考计数珠。将Annexin缓冲液(10mM Hepes,pH7.4,140mM NaCl和2.5mM CaCl2)加入每个管以使总体积500μl。将Annexin缓冲液用0.22微米滤器,之后是0.1μm滤器双重过滤。
BD FACSCanto A流式细胞仪每天用Cell Tracker珠(BD)利用Diva软件版本6.1.2校准。将前向和侧向散射阈值、光电倍增管(PMT)电压和窗口延伸(WE)优化以利用0.3、1.0和3.0μm校准珠检测0.1-1.0μm颗粒。已知尺寸的珠(0.3μm、1.0μm和3.0μm)用于MP尺寸的估计。
当计数固定数目的3.0μm珠(20,000)时停止捕获,导致每个样品8万2千至220万个MPs。补偿管也利用PPP、BD CompBead(BD Bioscience Cat#552843)运行,并利用与用于样品管相同的试剂染色。
MP数据分析
将用于统计计算的R环境用于流式细胞术数据的分析。flowCore包(38)用于读取文件、补偿和门控。FlowFP(Rogers et al.,2008,Cytometry Part A73A:430-441)用于流式细胞术指纹(CF)分析。对于每个对象,表格式数据在未转换的线性坐标中读出。基于通过Diva捕获软件确定和在FCS首部储存的溢出矩阵而应用数字补偿。将数据在侧向散射宽度上门控(图16和17)为粒度的相对测量以消除大于1μm的所有事件,如通过每天采集的尺寸校准珠所确定的。标记阳性表达的阈值通过考查所有捕获的事件的单变量分布的核心密度估计来鉴定(图18)。为了确定分析结果对阈值选择的灵敏度,在阳性和阴性群体之间核心密度估计中没有清楚分离的荧光标记的阈值通过多种因素增加约1.4至2.5倍之间,并且结果显示稳定,证明阈值的选择没有实质上影响结果。将荧光数据双指数转换,并将组中不表达标记的事件假定为碎片并门控掉(图19)。利用R包flowFP(Holyst,H.A.,and Rogers,W.T.2009.FlowFP:Fingerprinting for Flow Cytometry.Bioconductor Package version1.12.1。软件可获自http://bioconductor.org/packages/2.10/bioc/html/flowFP.html)对产生的分布进行指纹法分析。面元划分模型基于HC对象利用方法flowFPModel——利用在默认分辨率的所有荧光标记——而产生,导致8192个面元。然后利用方法flowFP基于该模型产生针对每个样品的指纹。利用Wilcoxon检验在DM和HC样品之间比较面元,利用Benjamimi-Hochberg校正对多个比较进行校正。校正的P值<0.05被认为是显著的。将判断是显著的面元进一步通过表型相似性分组。因此,确定为在DM与HC之间差别表达的表型亚型可由多变量空间中邻近的一个或多个面元组成,其所有均可落到针对阳性表达的每个参数阈值的同一侧上。
高灵敏度C-反应蛋白测量
高灵敏度C-反应蛋白利用激光基免疫比浊定量方法在自动化激光基比浊计(Siemens Healthcare Diagnostics,Model BNII)上按照制造商建议的方法进行测量。
统计学分析
参加者特性视情况利用威尔科克森秩和检验或费希尔的精确检验在DM和HC组之间进行比较。EPC和MP计数利用威尔科克森秩和检验在DM和HC组之间进行比较。多变量线性回归模型用于估计组之间EPC和MP计数中调节的差异。调节变量基于分步模型选择程序进行选择,分步模型选择程序基于Akaike信息判据(AIC),对于其保持减少AIC的变量。评价的变量是:年龄、性别、种族、目前的锻炼和体重指数。因为EPC和MP计数确实倾斜,所以应用对数变换以便针对DM对HC的指数化回归系数定量DM和HC组之间平均计数的比。在事后分析中,显示DM和HC组之间最强差异的MP和EPC计数均通过HC组中的中值标准化。标准化的EPCs对标准化的MPs的绘图用于图解地评价是否MPs和EPCs的组合 用于区分DM与HC。更正式地,接受者操作特性(ROC)曲线用于评价MP和EPC计数的能力,具有和没有hsCRP,以在DM和HC组之间进行区分。所有分析利用R完成。
实施例6结果
DM组较HC组稍微年长,如表6所示。
表6
参加者特性


概括呈现为中值(四分位距)除非另外记录为n(%)
*P值视情况获自威尔科克森秩和检验或费希尔精确检验
性别在DM和HC之间稍微不同,与DM组中~40%女性相比,HC组中~60%女性。与HC组相比,DM组中还有更多数目的非洲裔美国人。此外,DM组中有更高比例的吸烟者、更低比例的报道的锻炼和更高的平均BMI。如所期望的,HbA1c在DM组中升高,血压也是如此;然而,与对照相比,DM中LDL水平更低,同时不与对照相比,对于EPC分析,DM群的68%以及MP分析中DM群的73%依赖抑制素。有意思的是,不依赖抑制素的DM患者的LDL较依赖抑制素的那些患者更高,但是仍然较HC低。这不是完全意料之外的,因为理论上,虽然对于DM患者,LDL可与HC相似,但是LDL的组成不同和更致动脉粥样化(Nesto,2008,Clinical Diabetes26:8-13)。另外,与HC组相比,DM组中HDL水平较低。MP和EPC群中,高灵敏度CRP的水平在DM中较HC更高(Haffner,2006,Am J Cardiol97(2A):3A-11A)。虽然大多数DM患者依赖抗血小板和/或抑制素药物,但是对照中几乎没有依赖预防性抗血小板药物治疗的。
经由传统的手动连续门控分析(利用FlowJo,Treestar,Ashland,OR)的EPCs的评估没有显示在DM和HC之间统计学上显著性的差异。然而,当应用流式细胞术指纹时,不同的表型亚型——在本文称作EPCs——在一个指纹面元中被辨别。该亚型具有表型CD34+/CD31+/CD133/CD45暗-阴性(图20),并且与HC相比,在DM患者中平均较低。该亚型的相对事件计数(EPC相对)在DM和HC之间显著不同,甚至在如上面所讨论的协变量调节之后。单独地,ALC水平在糖尿病患者和对照之间显著不同(P<0.001),但是该差异在混杂因素调节之后减小(P=0.11)。该发现与发现淋巴细胞计数与心血管事件相关的其它作者的工作一致;然而,在混杂变量 调节之后,不存在相关性(Eryd et al.,2012,Arterioscler Thromb Vasc Biol。32(2):533-9)。
经由流式细胞术指纹的MPs的评估导致发现在HC和DM组之间显著不同的MPs的8个不同表型亚型(图21)。在除一个之外(下面讨论)的所有这些中,与HC相比,浓度在DM中平均较高。经由指纹法发现的每个统计学上显著的群体实际上是对于指示的标记(或多个)阳性的MPs亚型。例如,图21G显示对CD41阳性的MPs亚型。这些不全是对CD41阳性的MPs亚型,而是那些这样的事件,其对CD41阳性,同时也对组中所有其它标记阴性,并落入在DM和HC群之间显著不同地占据的指纹面元。在DM和HC之间强烈不同的一个亚型是CD3+T-淋巴细胞MPs(TMP)的亚型,与HC相比,其还以较高浓度存在于DM患者中。相似地,CD105+内皮MP(EMP)群的亚型以更高的平均浓度存在于DM患者中。另一个显著的亚型由为Annexin V+的事件组成,其在DM中上调。虽然Annexin V单阳性亚型表示凋亡MP,但是它不是对母细胞类型特异的标记。另一个增加的亚型是CD31+表型。虽然该亚型具有p值>0.05,但是在混杂变量调节之后它是显著的。单独PE-CAM1(CD31)标记对一种细胞类型不是特异的。发现是显著的MP的最后4个亚型都是血小板MP(PMP)并且对CD41阳性(并且一些也对CD31阳性)。CD41单阳性群体和Annexin V+/CD31+/CD41+三阳性亚型在DM患者中都是近乎(marginally)显著的(P<0.05)和上调的。CD41+和Annexin V+/CD31+/CD41+亚型在混杂变量调节之后都不是显著的。最后,存在两个CD31+/CD41+双阳性PMP亚型,其通过指纹法发现在DM和HC之间不同。这些之一是近乎显著的(P=0.11)和在DM患者中上调(CD31/CD41),而其它是高度显著的(P<0.001)并且是与HC相比以平均较更低浓度存在于DM的差别表达的亚型中仅有的一个(CD31/CD41)。最后,CD31/CD41亚型与CD31/CD41亚型之比与单独的暗或亮的亚型或通过流式细胞术指纹发现的其它差别表达的MP亚型中任何一个相比更强烈地差别表达(P<0.001),并因此用于形成本发明的EPCs和MPs的组合测量。
由于通常认为,祖细胞在细胞修复能力和新血管生长中发挥作用,并且微粒是细胞损伤的度量,所以假设两个的组合将较任何一个单独在临床上提供更多关于心血管状态的信息。评价每个淋巴细胞和通过暗与亮CD31+/CD41+微粒之比的EPCs(CD31+、CD34+、CD133、CD45暗-阴性)的相对事件计数的能力以在DM和HC之间区分(图22)。针对这两个标记组合的ROC曲线下面积(AUC)是0.86、95%CI:(0.79、0.94),指示高区分准确性。当与CRP组合时,AUC增加到0.90、95%CI:(0.83、0.96)。表7显示DM和HC组之间EPC和MP亚型的比较。
表7
DM和HC组之间EPC和MP亚型的比较


IQR,四分位距
*P值获自威尔科克森秩和检验
**获自针对对数变换计数的多变量线性回归模型
***EPC绝对指示每ml血液CD31+/CD34+/CD45暗至阴性/CD133+祖细胞的亚型
****EPC相对指示作为FSC–A对SSC-A淋巴细胞区域中事件百分比的CD31+/CD34+/CD45暗至阴性/CD133+祖细胞的亚型
研究结果鉴定了一个与DM相比在HC中上调的CD31+/CD34+/CD45暗-阴性/CD133EPCs的亚群。此外,确定了存在对应于血小板、T-淋巴细胞、Annexin V+和内皮微粒的微粒的7个亚群。因此,该研究证实了EPCs和MPs水平在具有动脉粥样硬化的HC和DM患者之间不同的假设,并提示这些测量用作心血管健康的预测标记。
EPCs作为生物标记的使用是有意义的,因为它直接涉及心血管系统中的病理过程,这与非特异地响应潜在情况的其它通常使用的生物标记相反。在DM患者对HC的情况中,存在一个EPCs群体,具有在对照组中上调的CD31+/CD34+/CD45暗-阴性/CD133+的表型。该EPC群体与Estes等人(Estes et al.,2010,Cytometry Part A77A:831-839)描述的循环造血干细胞和祖细胞(CHSPC)群体相似并且显示在图20中。EPCs是异质群体,其特异的表型定义仍有争论。一般,文献中描述的EPC表 型将包括干细胞标记如CD34、未成熟标记如CD133和内皮标记如VEGF-R2(KDR)(et al.,2009,Cytometry Part A75A:25-37)。
在该研究中,利用广泛的组,其中细胞首先基于尺寸而被选择。然后,属于成熟造血谱系的细胞通过门控掉CD3+、CD19+、CD33+和CD45细胞而被去除。然后,利用指纹法,将剩余的群体再分和进行统计学评价,而没有任何预定的偏倚,以发现是否存在DM患者和HC之间差别表达的细胞群体。与一些其它研究一样,发现VEGF-R2在分析中不是有用的标记(Estes,M.L.,Mund,J.A.,Ingram,D.A.,and Case,J.2001.Identification of Endothelial Cells and Progenitor Cell Subsets in Human Peripheral Blood.In Current Protocols in Cytometry:John Wiley&Sons,Inc.),这表明所述标记不提供信息或,如一些研究已显示的,所述试剂不可靠。如可在图23中看到的,存在许多针对VEGF-R2的假阳性事件,因此难于发现真正的阳性阈值。另外,已显示VEGF-R2抗体不能充分滴定,因为组中抗体浓度的增加增加产生的信号。本研究中的组含有另外的内皮标记(CD31),其也在提供信息的表型中阳性表达,这支持被接受以在EPCs上表达的不成熟(CD133)、干(CD34)和内皮(CD31)标记的相似的一般表型。
发现在本研究中差别表达的群体表达Estes等研究(Estes et al.,2010,Cytometry Part A77A:831-839)中发现的显示为促血管生成的相同的标记。在Estes等中,小鼠体内肿瘤模型显示,具有与该研究中EPCs相同表型的细胞导致肿瘤生长显著增加,这表明这些细胞涉及新生血管发生。另外,发现相似的细胞群体CD34+/CD133+/CD117+(CD117,c-Kit,是干细胞标记)在缺血组织中产生增加的血管发生,导致2周之后大鼠梗死区中3-5倍高的毛细血管数目,与不表达CD133的更成熟的血管内皮相反(Kocher et al.,2001,Nat Med7:430-436)。本研究不包括CD117,然而,可能是由于两个群体重叠和共享相似功能的两个其它标记。因此,我们的研究的无偏倚结果在显示促血管生成的EPCs在动脉粥样硬化群体和HC之间差别表达方面与其它研究是一致的。
血小板MPs(PMP)已知对血管健康具有有利和不利作用(Tushuizen et al.,2011,Arterioscler Thromb Vasc Biol31:4-9)。这些主张得到本研究的支持,因为多个不同PMP群体在两个群体之间显著不同,其中三个在DM患者中上调,而其它的在HC中上调。Omoto等(Omoto et al.,1999,Nephron81:271-277)发现与没有并发症的DM患者相比,PMPs在具有肾病的2型DM患者中显著上调,这提示PMPs涉及导致肾功能异常的活性。此外,Tan等(Tan et al.,2005,Diabetic Medicine22:1657-1662)发现具有临床上明显的动脉粥样硬化的DM患者较没有临床上明显的动脉粥样硬化的DM患者和HC具有显著更高水平的PMPs。另外,显示PMPs和EMPs均在具有严重高血压的患者中上调(Preston et al.,2003,Hypertension41:211-217),这提示EMPs和PMPs可以是血压对内皮和因此血管损伤的影响的标记。还显示PMPs体外刺激内皮细胞以释放细胞因子和表达粘附分子(Nomura et al.,2001, Atherosclerosis158:277-287)。本结果显示多数MP亚型是差的血管健康的标记。然而,无偏倚的流式细胞术指纹方法也能发现在HC中上调的PMPs群体,这与PMPs可具有有利作用的其它发现一致。已显示PMP辅助人脐静脉内皮细胞的血管生成活性和外周血单核细胞中增大的EPC分化(Kim et al.,2004,Br J Haematol124(3):376-384)。Mause等已显示PMPs可提高血管生成的早期向外生长细胞的潜能以在血管损伤之后恢复内皮完整性(Mause et al.,2010,Circulation122:495-506)。因此,通过无偏倚的计算方法,该研究区分在血管健康中发挥作用的PMPs的两个单独群体。
内皮MPs(EMP),如同PMPs,在DM患者中升高,并且已建立理论,即,EMPs与血管机能异常相关,是细胞凋亡的预兆,并因此反映血管壁损伤(Chironi et al.,2009,Cell Tissue Res335:143-151)。在一个研究中,EMP水平与流量介导的扩张(FMD)负相关,这表明EMPs与内皮机能失调相关(Feng et al.,2010,Atherosclerosis208:5)。另外,另一个研究显示,EMPs在具有冠状动脉疾病的患者中较对照中显著更高(Bernal-Mizrachi et al.,2003,American Heart Journal145:962-970)。该研究中发现的CD105+群体亚型可能对应于EMPs,其已在许多研究中显示是疾病和血管机能异常的标记。因此,本文呈现的结果与对EMPs的先前工作一致,显示具有临床动脉粥样硬化的DM患者与HC相比具有更高的EMPs水平。
结果还显示,与HC相比,CD3+T细胞MP(TMP)群体亚型在DM患者中显著上调。该发现支持先前的工作,因为已知TMPs是促炎的,通过减少eNOS表达水平和增加内皮细胞中氧化应激降低NO产生(Martin et al.,2004,Circulation109:1653-1659)。另外,TMPs通过改变NO前列环素途径而在传导和阻力动脉中引起内皮功能失调。此外,TMPs以与人相似的浓度损害乙酰胆碱诱发的主动脉环松弛(Martin et al.,2004,Circulation109:1653-1659)。最后,TMPs也已显示响应流动和化学刺激而产生内皮机能失调(Martin et al.,2004,Circulation109:1653-1659)。
Annexin V+细胞结合磷脂酰丝氨酸,其是凋亡的标记。对动脉粥样硬化斑块进行的研究已显示,斑块中发现的凋亡MP解释几乎所有的斑块提取物的TF(组织因子)活性。这表明MPs可在凝血级联的启动中发挥作用(Mallat et al.,1999,Circulation99:348-353)。另外,与具有稳定心绞痛的患者相比,对Annexin V阳性的MPs在具有急性冠脉综合征的患者中显著地上调(Mallat et al.,2000,Circulation101:841-843)。这表示增加的Annexin V+MPs反映患者动脉粥样硬化状况的恶化。然而,研究限制是对Annexin V+MP的凝血酶原酶试验与流式细胞术分开进行,因此这些细胞可以具有任何来源。本研究支持这些发现,因为Annexin V+群体亚型在DM患者中显著地上调。
细胞基系统分析,也称作‘细胞组学’,整合环境和遗传的心血管风险因素的生物学结果。对发展可常规地用于指导医学治疗和风险评估这样的确定存在未满足的临床需要。目前的结果通过利用模式发现计算的方法对血管健康提供综合的见 解以分析若干靶——包括血管微粒(最近被鉴定为血管健康的强大生物标记)群体和内皮祖细胞的特性。例如,可评价无症状患者的心血管风险,并可纵向地监测有症状的患者。这些能力实现个性化医疗的主要目标。
该研究的目的是利用无偏倚的方法发现在动脉粥样硬化DM群体和HC之间差别表达的细胞和微粒的表型亚型。因此,没有在发现的EPC(如ECFC或体内动物模型)或MP(如凝血酶原酶试验)群体上进行功能试验。这些群体提示的功能源自讨论中引用的其它组进行的研究
仍然,不像其它研究,流式细胞术指纹和广泛试验的使用允许我们去除任何无意的门控偏倚以发现在群体中差别表达的很多群体。此外,使用的方法包括严格的流式细胞术方案,包括:利用珠标准随着时间对仪器仔细地进行标准化,利用珠标准在数学上校正另外的残留仪器改变,FMO对照用于阳性,双指数变换,以及数字仪器的使用。最后,如与回顾相反,连续招募DM患者和HC。
该研究的结果表明,与具有动脉粥样硬化的DM群体相比,在健康对照中EPCs较高,并且大多数MP亚型较低。重要的是,这些结果用流式细胞术指纹——能够发现利用常规分析方法时可保持隐藏的分布模式的新的无偏倚数据分析方法——获得。若干亚型在这两个群体中显著地差别表达,其中一些在文献中得到支持,而其它的是新发现。有意思的是,VEGF-R2——通常与EPCs相关的标记——是不提供信息的。流式细胞术指纹是客观的、综合的和节省劳动的方法,并在可能含有隐藏数据模式的复杂、多变量分布分析中具有普遍的实用性。这些结果合在一起提供血管健康概况的依据,其可用于许多应用,包括药物研发、临床风险评估和伴随诊断学。
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虽然本发明已参考具体实施方式进行了公开,但是,显然本发明的其它实施方式和改变可以由本领域技术人员想到而不背离本发明的真正精神和范围。所附权利要求意图被解释为包括所有这样的实施方式和等同的改变。

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1、10申请公布号CN104039134A43申请公布日20140910CN104039134A21申请号201280039113122申请日2012061061/495,95520110610US61/650,35320120522USA01N1/02200601G01N33/00200601G01N31/0020060171申请人宾夕法尼亚大学董事会地址美国宾夕法尼亚州72发明人ER莫勒JS摩尔L张W罗杰斯AD班特雷74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人赵蓉民54发明名称细胞组学血管健康概况分析的系统和方法57摘要本发明涉及确定对象中血管健康的方法。该方法包括以下步骤从对。

2、象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹确定对象的血管健康。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014021086PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0417922012061087PCT国际申请的公布数据WO2012/170974EN2012121351INTCL权利要求书2页说明书32页附图27页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书32页附图27页10申请公布号CN104039134ACN10。

3、4039134A1/2页21确定对象中血管健康的方法,包括从所述对象获得生物样品;基于所述生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于所述生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于所述微粒和祖细胞数据产生所述生物样品的流式细胞术指纹;和基于所述产生的流式细胞术指纹确定所述对象的所述血管健康。2权利要求1所述的方法,其中所述至少一组微粒的所述水平通过流式细胞术测量。3权利要求1所述的方法,其中所述生物样品是血浆样品。4权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有银屑病的对象。5权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有狼疮的对象。6权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有已知CVD风险因素的对。

4、象。7权利要求1所述的方法,其中所述对象是没有已知CVD风险因素的对象。8权利要求1所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。9权利要求1所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。10权利要求9所述的方法,其中所述对象是1型糖尿病对象。11权利要求9所述的方法,其中所述对象是2型糖尿病对象。12权利要求1所述的方法,其中所述祖细胞是内皮祖细胞EPCS。13权利要求1所述的方法,其中当至少一个微粒组的水平上调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。14权利要求1所述的方法,其中当至少一个祖细胞组的水平下调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血。

5、管疾病或血管机能异常进展的风险。15权利要求1所述的方法,其中当至少一个微粒组的水平上调和至少一个祖细胞组的水平下调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。16确定对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险的方法,包括从所述对象获得生物样品;基于所述生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于所述生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于所述微粒和祖细胞数据产生所述生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹确定与所述对象心血管疾病或血管机能异常相关的风险。17权利要求16所述的方法,其中所述至少一组微粒的所述水平通过流式细胞术测。

6、量。18权利要求16所述的方法,其中所述生物样品是血浆样品。19权利要求16所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。20权利要求19所述的方法,其中所述对象是1型糖尿病对象。21权利要求19所述的方法,其中所述对象是2型糖尿病对象。22权利要求16所述的方法,其中所述祖细胞是内皮祖细胞EPCS。23权利要求16所述的方法,其中所述产生的流式细胞术指纹表明细胞损伤。24权利要求16所述的方法,其中所述产生的流式细胞术指纹表明内皮完整性、内皮权利要求书CN104039134A2/2页3修复能力的丧失、或其组合。25权利要求16所述的方法,进一步包括产生健康对照样品的流式细胞术指纹,和将所述对象的生物。

7、样品的所述产生的流式细胞术指纹与所述健康对照样品的所述流式细胞术指纹进行比较。权利要求书CN104039134A1/32页4细胞组学血管健康概况分析的系统和方法0001相关申请的交叉引用0002本申请要求2011年6月10提交的美国临时申请序列号61/495,955和2012年5月22日提交的美国临时申请序列号61/650,353的优先权权益,其全部公开内容通过引用被并入本文,如同每个以其全部在本文中列出。0003发明背景0004心血管疾病CVD在美国是最主要的死亡原因;每39秒一个成人死于心脏病发作、中风或其它心血管疾病“在美国,高血压和胆固醇失去控制”。疾病控制中心网站。HTTP/WWWC。

8、DCGOV/FEATURES/VITALSIGNS/CARDIOVASCULARDISEASE/。2011年1月31日更新,2012年2月6日访问。美国CVD患病率已经非常高369的成人或约8千1百万人并预测在接下来的20年里增加约10,到2030年估计超过40的成人大约1亿1千6百万人将患有一种或多种形式的CVDHEIDENREICHETAL,2011,CIRCULATION123933944。很早以前症状在临床上是明显的,新生血管疾病开始于内皮细胞机能异常。当动脉粥样硬化进展到阻塞的血流引起缺血的点时,或当由于破裂或侵蚀,血栓从存在的斑块形成时,有症状的、临床CVD事件通常发生HEIDEN。

9、REICHETAL,2011,CIRCULATION123933944。0005令人遗憾地,目前不存在有成本效益的和准确的可确定患者心血管健康的血液测试。相反,心血管风险通常由若干循环生物标记,如高灵敏度C反应蛋白HSCRP和纤维蛋白原进行评估RIDKER,2003,CIRCULATION107363369。由于这些生物标记通常是急性期反应物,因此对于动脉粥样硬化不是特异性的,它们只被推荐给具有心血管事件的中等风险的患者GREENLANDETAL,2010,CIRCULATION122E584E636。同样,在临床实践中没有可用的生物标记来灵敏地和准确地评价对医学治疗的反应。心血管风险分层的基。

10、于弗雷明汉(FRAMINGHAM)的方法没有结合生物标记或遗传异常,因此预测值受限。0006一个公开的心血管风险算法,雷诺尔德(REYNOLDS)评分,包括HSCRP,但是,如同弗雷明汉,遗传背景不包括在方案中。实践和预防工作组中基因组应用的评价(EVALUATIONOFGENOMICAPPLICATIONSINPRACTICEANDPREVENTIONWORKINGGROUPEWG)发现推荐测试28个基因中219P21遗传变体或57个其它变体以在一般人群中评估CVD特别是心脏病和中风风险的证据不充分。EWG提出来自单独或组合使用这些基因组标记中任何一个的净健康益处的量是可以忽略的EVALUA。

11、TIONOFGENOMICAPPLICATIONSINPRACTICEPREVENTIONWORKINGGROUP2010RECOMMENDATIONSFROMTHEEGAPPWORKINGGROUPGENOMICPROFILINGTOASSESSCARDIOVASCULARRISKTOIMPROVECARDIOVASCULARHEALTHJOURNAL128398438101097/GIM1090B1013E3181F1872C1090。0007因此,存在对早期诊断测试未满足的临床需要,该早期诊断测试提供在明显的CVD之前心血管健康的测量和治疗干预的评估。本发明通过细胞基试验满足该需要,该细。

12、胞基试验基于血管健康概况(VASCULARHEALTHPROLE)VHP的建立中祖细胞PCS,如内皮祖细胞EPCS和微粒MPS的测量而评估心血管状态。0008发明概述说明书CN104039134A2/32页50009本发明涉及确定对象中的血管健康的方法。该方法包括以下步骤从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹(CYTOMETRICNGERPRINT);和基于产生的流式细胞术指纹确定对象的血管健康。0010在一个实施方式中,至少一组微粒的水平通过流式细胞术测量。在另一个实。

13、施方式中,生物样品是全血液样品品。在另一个实施方式中,生物样品是血浆样品。在另一个实施方式中,对象是具有银屑病的对象。在另一个实施方式中,对象是具有狼疮的对象。在另一个实施方式中,对象是具有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是没有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是1型糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是2型糖尿病对象。在另一个实施方式中,祖细胞是内皮祖细胞EPCS。在另一个实施方式中,当至少一个微粒组的水平上调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。在另一个实施方式中,当至少一。

14、个祖细胞组的水平下调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。在另一个实施方式中,当至少一个微粒组的水平上调和至少一个祖细胞组的水平下调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。0011本发明还涉及确定对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险的方法。所述方法包括以下步骤从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹,确定与对象的心血管疾病或血管机能异常相关的风险。0。

15、012在一个实施方式中,至少一组微粒的水平通过流式细胞术测量。在另一个实施方式中,生物样品是血浆样品。在另一个实施方式中,生物样品是全血液样品品。在另一个实施方式中,对象是具有银屑病的对象。在另一个实施方式中,对象是具有狼疮的对象。在另一个实施方式中,对象是具有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是没有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是1型糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是2型糖尿病对象。在另一个实施方式中,祖细胞是内皮祖细胞EPCS。在另一个实施方式中,产生的流式细胞术指纹指示细胞损伤。在另一个实施方式中,产生的流式细。

16、胞术指纹指示内皮完整性、内皮修复能力丧失或其组合。在另一个实施方式中,所述方法进一步包括产生源自一个或多个个体的健康对照样品的流式细胞术指纹和比较对象的生物样品的产生的流式细胞术指纹与健康对照样品的流式细胞术指纹。0013附图简述0014为了说明本发明的目的,在附图中描述本发明的某些实施方式。然而,本发明不限于附图中描述的实施方式的精确安排和手段。0015图1是显示用于确定血管健康概况的高通量流式细胞术试验的示意图。血液样品分成外周血单核细胞PBMCS和血浆。祖细胞在PBMCS中鉴定,而微粒在血浆中鉴定。0016图2是CANTOA上FSC/SSC阈值优化的图解。如图2所描述的,FSC和SSC阈。

17、值由具有不同FSC或SSC阈值的以中等速度通过机器的03M小球A排或03、1和3M小说明书CN104039134A3/32页6球在FFC/SSC等值线图上的B排和在SSCW直方图上的C排确定。D和E列显示在具有设为5000的FSC阈值或设为200的SSC阈值D列以及只有设为200的SSC阈值和没有FSC阈值E列的FFC/SSC等值线图和SSCW直方图上3个小球的更好的分辨率。设为200的FSC阈值或设为200的SSC阈值F列获得更多的背景噪声。设为200的FSC阈值和没有SSCG列,03M小球缺失。对于小颗粒,侧向散射较前向散射是更好的参数。在该研究中为了在FSC/SSC等值线和SSCW直方图。

18、上的3个混合物小球的更好的分辨率,将FSC和SSC阈值设为5000和200D列。0017图3是CANTOA上FSC/SSCPMT确定的图解。如图3所描述的,双重过滤的PBS和03UM小球用于建立FSC、SSCPMT。当双重过滤的PBS以中等流速通过机器时,接受每秒小于10个事件。分别将FSC和SSC的阈值设为5000和200。利用不同SSC电压通过机器上运行的相同样品来确定FSC和SSCPMT。利用SSC300和325,更多的MPS丧失,并且SSC375和400上获得更多的背景噪声。在该研究中,接受350的SSC电压。由于大量背景噪声,这里未显示400的SSC电压数据。0018图4是窗口延伸确。

19、定的图解。如图4所描述的,FACSCANTOAWINDOWEXTENSIONWE通过以WE0至7的中等速度运行的03、1和3M小球来确定。为了SSCW直方图上3个小球的更好的分辨率和低背景噪声,选择WE02。0019图5是CANTOA上样品检测中窗口延伸02和7的比较。如图5所描述的,将PFP用FITCANNEXIN或CD31、PERCPCY55CD41、PECD105或CD144、APCCD64染色和在WE02或7上运行。当固定数目的3M小球100,000被计数时停止捕获。将A排在点图上用设为02的WE门控(GATED)在小于约1M上。将B排在点图上用设为7的WE门控在小于约1M上。在SSC。

20、W直方图上用WE02将C排门控在小于约1M上和用WE7将D排门控在小于约1M上。利用WE7采集更多的背景噪声和更少的阳性颗粒B排和D排。0020图6是门控策略的图解。如图6所描述的,03、1和3M小球用于估计MPS大小CANTOA上的A和B以及GALLIOS上的C。将MPS门控在小于约1M上CANTO上在SSCW直方图上门控的D和在FSC/SSC点图上的E以及GALLIOS上的F。对于CANTOA设置,分别将前向和侧向散射阈值设为5000和200,和将窗口延伸设为02。对于GALLIOS设置,将FS的鉴别器值设为1,前向散射采集角是W2。0021图7是抗体优化的图解。如图7所描述的,500L双。

21、重过滤的PBS中用于MP检测的相同体积的抗体在CANTOA上运行。未过滤的抗体A排较双重过滤的抗体B排显示更多的假阳性事件。用于MPS检测的所有试剂应当通过01022M低蛋白结合过滤器进行双重过滤以从运行缓冲液去除抗体聚集物和背景噪声。0022图8是抗体优化的进一步图解。如图8所描述的,将50LPFP用未过滤的抗体A和C排和双重过滤的抗体B和D排标记。将A和B排在SSCW直方图上门控在小于1M上。将C和D排在FSC和SSC点图上门控在小于1M上。预先过滤抗体有助于通过去除抗体聚集而减少假阳性颗粒。0023图9是CANTOA和GALLIOS上MP检测的图示。如图9所描述的,在CANTO和GALL。

22、IOS上检测MPS。在CANTOA排和GALLIOSB排上将MPS门控在小于1M上。基于荧光扣除对照(FLUORESCENCEMINUTESONE)FMO管确定阳性MPS。0024图10是BDCANTOA和BCGALLIOS的比较。如图10所描述的,计算的斯皮尔曼说明书CN104039134A4/32页7等级相关用于在两个平台之间比较MP计数,大多数相关超过08,除了显示06相关的CD105P5年2型糖尿病的患者采集并与年龄相关的健康的对象H比较。PC和MP亚型通过流式细胞术和ELISA基方法的组合来测量。促凝血的MPS/CD341PCS的比证明在对象组之间区分的有价值的指标P5001。该受损。

23、的血管功能的指标在LT组中是最高的,虽然有加强的抑制素治疗,并且较一些可溶蛋白生物标记提供更多的信息。0117意想不到地,发现了2型糖尿病中MPS和PCS之间的关系。该比提供具有糖尿病的患者中血管机能异常和心血管风险的定量的和临床上可行的测量。0118以下材料和方法用于实施例20119患者招募和研究设计0120将在先前的12个月内诊断有2型糖尿病的患者称作“早期”ES,并将超过五年以前诊断的那些患者称作“长期”LT。在没有先前或目前的糖尿病或心血管相关状况病史的基础上将年龄相关的“健康的”H对象招募进入研究,并且不采取任何类型的CV相关的药物治疗包括抑制素或高脂血症、高血压或糖尿病的药物治疗。。

24、ES组的四个36和LT组的14个67接受抑制素药物治疗,连同一些其它药物治疗以治疗糖尿病、高血压和其它状况。关于心血管疾病的家族史,健康组中18个66对象中的12个,早期中1190中的10个和长期组中每个参加者100答复存在先前的心血管疾病家族史。LT患者中糖尿病的平均时间长度是20年。所有的研究参加者都是不抽烟者。从所有的研究参加者获得书面的知情同意,并且研究方案经INSTITUTIONALREVIEWBOARDIRB批准。每个对象在上午800左右捐献约50ML静脉血,并且所有对象在前一天晚上禁食。将血液采集在肝素化BAXTER注射器中,用于细胞和可溶蛋白分析30ML、柠檬酸纳用于微粒10M。

25、L和EDTA用于脂质分析10ML。记录每个对象的人口统计数据、医学/药物治疗历史、体格检查和生命体征。0121PCS/PACS的流式细胞术0122样品采集后不到约1H,利用氯化铵溶胞作用将白血细胞从30ML血液分离,如先前所描述的。不确定血小板计数。细胞染色、门控策略、流式细胞术方法以及分析被如下描述。将大约5E6个细胞用6色抗体组FITC抗CD31PECAMPHARMINGEN、PE抗CDI33MILTENYIBIOTEC、PERCPCY55抗CD3,CDI9,CD33BECTONDICKINSON、APCH7抗CD45BECTONDICKINSON、PECY7抗CD34BECTONDICK。

26、INSON和APC抗VEGFR2RD系统染色。生存能力通过碘化丙啶排除来评估。利用说明书CN104039134A1715/32页18BECTONDICKINSONLSRII流式细胞仪,对每个样品处理2E6个活事件,并且六个荧光标记连同光散射只允许有活力的、低至中的侧向散射。对PCS和PACS分析单峰,其是CD3、19、33阴性的。将单峰门控为从侧向散射宽度对前向散射宽度的图鉴定的突出的细胞簇以保证将细胞聚集物从分析中排除。将荧光扣除对照FMO样品用作阴性对照。将细胞群体PCS和PACS定量为以每ML血液的数目的单核细胞百分数。分析集中于对PCS和PACS的亚型定义表1。利用FLOWJO分析软件。

27、TREESTAR,ASHLAND,OR进行数据分析。0123表10124通过流式细胞术的每个表面标记的细胞或颗粒基因型012501260127MP分离0128贫血小板血浆PPP获自采血之后1小时内的柠檬酸化血以分离MPS。将全血以1500G离心15MIN,收集上清,并通过在室温以13,500G离心5MIN获得PPP。对每个对象,将PPP等分进分离管和在80储存直到以后使用。使用的所有样品只进行一次冻融循环。0129MPS的流式细胞术0130为了MPS的表征和定量,将PPP与1BDANNEXINV结合缓冲液10MMHEPES,PH74,140MMNACL和25MMCAC12BDBIOSCIENC。

28、ES中的ANNEXINVFITC、PECY5CD41A、APCCD14BDBIOSCIENCES和PECDI44RD系统的混合物一起在黑暗中在室温温育30MIN,然后加入1BDANNEXINV结合缓冲液以制成1ML的总体积/管。将阴性对照制备为用ANNEXINVFITC和无钙结合缓冲液中相同量的匹配的同种型对照抗体染色的PPP。利用BDBIOSCIENCESFACSCANTO流式细胞仪,通过校准珠限定FSCH和SSCH散射对数尺度上的P1区005,但是在混杂变量调节之后它是显著的。单独PECAM1CD31标记对一种细胞类型不是特异的。发现是显著的MP的最后4个亚型都是血小板MPPMP并且对CD。

29、41阳性并且一些也对CD31阳性。CD41单阳性群体和ANNEXINV/CD31/CD41三阳性亚型在DM患者中都是近乎(MARGINALLY)显著的P005和上调的。CD41和ANNEXINV/CD31/CD41亚型在混杂变量调节之后都不是显著的。最后,存在两个CD31/CD41双阳性PMP亚型,其通过指纹法发现在DM和HC之间不同。这些之一是近乎显著的P011和在DM患者中上调CD31暗/CD41暗,而其它是高度显著的P0001并且是与HC相比以平均较更低浓度存在于DM的差别表达的亚型中仅有的一个CD31亮/CD41亮。最后,CD31暗/CD41暗亚型与CD31亮/CD41亮亚型之比与单独。

30、的暗或亮的亚型或通过流式细胞术指纹发现的其它差别表达的MP亚型中任何一个相比更强烈地差别表达P0001,并因此用于形成本发明的EPCS和MPS的组合测量。0225由于通常认为,祖细胞在细胞修复能力和新血管生长中发挥作用,并且微粒是细胞损伤的度量,所以假设两个的组合将较任何一个单独在临床上提供更多关于心血管状态的信息。评价每个淋巴细胞和通过暗与亮CD31/CD41微粒之比的EPCSCD31、CD34、CD133亮、CD45暗阴性的相对事件计数的能力以在DM和HC之间区分图22。针对这两个标记组合的ROC曲线下面积AUC是086、95CI079、094,指示高区分准确性。当与CRP组合时,AUC增。

31、加到090、95CI083、096。表7显示DM和HC组之间EPC和MP亚型的比较。0226表70227DM和HC组之间EPC和MP亚型的比较02280229说明书CN104039134A3129/32页320230IQR,四分位距0231P值获自威尔科克森秩和检验0232获自针对对数变换计数的多变量线性回归模型0233EPC绝对指示每ML血液CD31/CD34/CD45暗至阴性/CD133祖细胞的亚型0234EPC相对指示作为FSCA对SSCA淋巴细胞区域中事件百分比的CD31/CD34/CD45暗至阴性/CD133祖细胞的亚型0235研究结果鉴定了一个与DM相比在HC中上调的CD31/CD。

32、34/CD45暗阴性/CD133亮EPCS的亚群。此外,确定了存在对应于血小板、T淋巴细胞、ANNEXINV和内皮微粒的微粒的7个亚群。因此,该研究证实了EPCS和MPS水平在具有动脉粥样硬化的HC和DM患者之间不同的假设,并提示这些测量用作心血管健康的预测标记。0236EPCS作为生物标记的使用是有意义的,因为它直接涉及心血管系统中的病理过程,这与非特异地响应潜在情况的其它通常使用的生物标记相反。在DM患者对HC的情况中,存在一个EPCS群体,具有在对照组中上调的CD31/CD34/CD45暗阴性/CD133的表型。该EPC群体与ESTES等人ESTESETAL,2010,CYTOMETRY。

33、PARTA77A831839描述的循环造血干细胞和祖细胞CHSPC群体相似并且显示在图20中。EPCS是异质群体,其特异的表型定义仍有争论。一般,文献中描述的EPC表型将包括干细胞标记如CD34、未成熟标记如CD133和内皮标记如VEGFR2KDRETAL,2009,CYTOMETRYPARTA75A2537。说明书CN104039134A3230/32页330237在该研究中,利用广泛的组,其中细胞首先基于尺寸而被选择。然后,属于成熟造血谱系的细胞通过门控掉CD3、CD19、CD33和CD45亮细胞而被去除。然后,利用指纹法,将剩余的群体再分和进行统计学评价,而没有任何预定的偏倚,以发现是否。

34、存在DM患者和HC之间差别表达的细胞群体。与一些其它研究一样,发现VEGFR2在分析中不是有用的标记ESTES,ML,MUND,JA,INGRAM,DA,ANDCASE,J2001IDENTICATIONOFENDOTHELIALCELLSANDPROGENITORCELLSUBSETSINHUMANPERIPHERALBLOODINCURRENTPROTOCOLSINCYTOMETRYJOHNWILEYSONS,INC,这表明所述标记不提供信息或,如一些研究已显示的,所述试剂不可靠。如可在图23中看到的,存在许多针对VEGFR2的假阳性事件,因此难于发现真正的阳性阈值。另外,已显示VEGFR。

35、2抗体不能充分滴定,因为组中抗体浓度的增加增加产生的信号。本研究中的组含有另外的内皮标记CD31,其也在提供信息的表型中阳性表达,这支持被接受以在EPCS上表达的不成熟CD133、干CD34和内皮CD31标记的相似的一般表型。0238发现在本研究中差别表达的群体表达ESTES等研究ESTESETAL,2010,CYTOMETRYPARTA77A831839中发现的显示为促血管生成的相同的标记。在ESTES等中,小鼠体内肿瘤模型显示,具有与该研究中EPCS相同表型的细胞导致肿瘤生长显著增加,这表明这些细胞涉及新生血管发生。另外,发现相似的细胞群体CD34/CD133/CD117CD117,CKI。

36、T,是干细胞标记在缺血组织中产生增加的血管发生,导致2周之后大鼠梗死区中35倍高的毛细血管数目,与不表达CD133的更成熟的血管内皮相反KOCHERETAL,2001,NATMED7430436。本研究不包括CD117,然而,可能是由于两个群体重叠和共享相似功能的两个其它标记。因此,我们的研究的无偏倚结果在显示促血管生成的EPCS在动脉粥样硬化群体和HC之间差别表达方面与其它研究是一致的。0239血小板MPSPMP已知对血管健康具有有利和不利作用TUSHUIZENETAL,2011,ARTERIOSCLERTHROMBVASCBIOL3149。这些主张得到本研究的支持,因为多个不同PMP群体在。

37、两个群体之间显著不同,其中三个在DM患者中上调,而其它的在HC中上调。OMOTO等OMOTOETAL,1999,NEPHRON81271277发现与没有并发症的DM患者相比,PMPS在具有肾病的2型DM患者中显著上调,这提示PMPS涉及导致肾功能异常的活性。此外,TAN等TANETAL,2005,DIABETICMEDICINE2216571662发现具有临床上明显的动脉粥样硬化的DM患者较没有临床上明显的动脉粥样硬化的DM患者和HC具有显著更高水平的PMPS。另外,显示PMPS和EMPS均在具有严重高血压的患者中上调PRESTONETAL,2003,HYPERTENSION41211217,。

38、这提示EMPS和PMPS可以是血压对内皮和因此血管损伤的影响的标记。还显示PMPS体外刺激内皮细胞以释放细胞因子和表达粘附分子NOMURAETAL,2001,ATHEROSCLEROSIS158277287。本结果显示多数MP亚型是差的血管健康的标记。然而,无偏倚的流式细胞术指纹方法也能发现在HC中上调的PMPS群体,这与PMPS可具有有利作用的其它发现一致。已显示PMP辅助人脐静脉内皮细胞的血管生成活性和外周血单核细胞中增大的EPC分化KIMETAL,2004,BRJHAEMATOL1243376384。MAUSE等已显示PMPS可提高血管生成的早期向外生长细胞的潜能以在血管损伤之后恢复内皮。

39、完整性MAUSEETAL,2010,CIRCULATION122495506。因此,通过无偏倚的计算方法,该研究区分在血管健康中发挥作用的PMPS的两个单独群体。0240内皮MPSEMP,如同PMPS,在DM患者中升高,并且已建立理论,即,EMPS与血管说明书CN104039134A3331/32页34机能异常相关,是细胞凋亡的预兆,并因此反映血管壁损伤CHIRONIETAL,2009,CELLTISSUERES335143151。在一个研究中,EMP水平与流量介导的扩张FMD负相关,这表明EMPS与内皮机能失调相关FENGETAL,2010,ATHEROSCLEROSIS2085。另外,另一。

40、个研究显示,EMPS在具有冠状动脉疾病的患者中较对照中显著更高BERNALMIZRACHIETAL,2003,AMERICANHEARTJOURNAL145962970。该研究中发现的CD105群体亚型可能对应于EMPS,其已在许多研究中显示是疾病和血管机能异常的标记。因此,本文呈现的结果与对EMPS的先前工作一致,显示具有临床动脉粥样硬化的DM患者与HC相比具有更高的EMPS水平。0241结果还显示,与HC相比,CD3T细胞MPTMP群体亚型在DM患者中显著上调。该发现支持先前的工作,因为已知TMPS是促炎的,通过减少ENOS表达水平和增加内皮细胞中氧化应激降低NO产生MARTINETAL,。

41、2004,CIRCULATION10916531659。另外,TMPS通过改变NO前列环素途径而在传导和阻力动脉中引起内皮功能失调。此外,TMPS以与人相似的浓度损害乙酰胆碱诱发的主动脉环松弛MARTINETAL,2004,CIRCULATION10916531659。最后,TMPS也已显示响应流动和化学刺激而产生内皮机能失调MARTINETAL,2004,CIRCULATION10916531659。0242ANNEXINV细胞结合磷脂酰丝氨酸,其是凋亡的标记。对动脉粥样硬化斑块进行的研究已显示,斑块中发现的凋亡MP解释几乎所有的斑块提取物的TF组织因子活性。这表明MPS可在凝血级联的启动中。

42、发挥作用MALLATETAL,1999,CIRCULATION99348353。另外,与具有稳定心绞痛的患者相比,对ANNEXINV阳性的MPS在具有急性冠脉综合征的患者中显著地上调MALLATETAL,2000,CIRCULATION101841843。这表示增加的ANNEXINVMPS反映患者动脉粥样硬化状况的恶化。然而,研究限制是对ANNEXINVMP的凝血酶原酶试验与流式细胞术分开进行,因此这些细胞可以具有任何来源。本研究支持这些发现,因为ANNEXINV群体亚型在DM患者中显著地上调。0243细胞基系统分析,也称作细胞组学,整合环境和遗传的心血管风险因素的生物学结果。对发展可常规地用。

43、于指导医学治疗和风险评估这样的确定存在未满足的临床需要。目前的结果通过利用模式发现计算的方法对血管健康提供综合的见解以分析若干靶包括血管微粒最近被鉴定为血管健康的强大生物标记群体和内皮祖细胞的特性。例如,可评价无症状患者的心血管风险,并可纵向地监测有症状的患者。这些能力实现个性化医疗的主要目标。0244该研究的目的是利用无偏倚的方法发现在动脉粥样硬化DM群体和HC之间差别表达的细胞和微粒的表型亚型。因此,没有在发现的EPC如ECFC或体内动物模型或MP如凝血酶原酶试验群体上进行功能试验。这些群体提示的功能源自讨论中引用的其它组进行的研究0245仍然,不像其它研究,流式细胞术指纹和广泛试验的使用。

44、允许我们去除任何无意的门控偏倚以发现在群体中差别表达的很多群体。此外,使用的方法包括严格的流式细胞术方案,包括利用珠标准随着时间对仪器仔细地进行标准化,利用珠标准在数学上校正另外的残留仪器改变,FMO对照用于阳性,双指数变换,以及数字仪器的使用。最后,如与回顾相反,连续招募DM患者和HC。0246该研究的结果表明,与具有动脉粥样硬化的DM群体相比,在健康对照中EPCS较说明书CN104039134A3432/32页35高,并且大多数MP亚型较低。重要的是,这些结果用流式细胞术指纹能够发现利用常规分析方法时可保持隐藏的分布模式的新的无偏倚数据分析方法获得。若干亚型在这两个群体中显著地差别表达,其。

45、中一些在文献中得到支持,而其它的是新发现。有意思的是,VEGFR2通常与EPCS相关的标记是不提供信息的。流式细胞术指纹是客观的、综合的和节省劳动的方法,并在可能含有隐藏数据模式的复杂、多变量分布分析中具有普遍的实用性。这些结果合在一起提供血管健康概况的依据,其可用于许多应用,包括药物研发、临床风险评估和伴随诊断学。0247本文引用的每个和每一专利、专利申请和公开的公开内容由此以其全部通过引用并入本文。0248虽然本发明已参考具体实施方式进行了公开,但是,显然本发明的其它实施方式和改变可以由本领域技术人员想到而不背离本发明的真正精神和范围。所附权利要求意图被解释为包括所有这样的实施方式和等同的。

46、改变。说明书CN104039134A351/27页36图1说明书附图CN104039134A362/27页37图2说明书附图CN104039134A373/27页38图3说明书附图CN104039134A384/27页39图4说明书附图CN104039134A395/27页40图5说明书附图CN104039134A406/27页41图5续说明书附图CN104039134A417/27页42图6说明书附图CN104039134A428/27页43图7说明书附图CN104039134A439/27页44图8说明书附图CN104039134A4410/27页45图8续说明书附图CN104039134。

47、A4511/27页46图9说明书附图CN104039134A4612/27页47图10说明书附图CN104039134A4713/27页48图10续说明书附图CN104039134A4814/27页49图11说明书附图CN104039134A4915/27页50图12说明书附图CN104039134A5016/27页51图13说明书附图CN104039134A5117/27页52图14说明书附图CN104039134A5218/27页53图15说明书附图CN104039134A5319/27页54图16说明书附图CN104039134A5420/27页55图17说明书附图CN104039134A5521/27页56图18说明书附图CN104039134A5622/27页57图19说明书附图CN104039134A5723/27页58图20说明书附图CN104039134A5824/27页59图21说明书附图CN104039134A5925/27页60图22说明书附图CN104039134A6026/27页61图23说明书附图CN104039134A6127/27页62图24说明书附图CN104039134A62。

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