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1、10申请公布号CN104039134A43申请公布日20140910CN104039134A21申请号201280039113122申请日2012061061/495,95520110610US61/650,35320120522USA01N1/02200601G01N33/00200601G01N31/0020060171申请人宾夕法尼亚大学董事会地址美国宾夕法尼亚州72发明人ER莫勒JS摩尔L张W罗杰斯AD班特雷74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人赵蓉民54发明名称细胞组学血管健康概况分析的系统和方法57摘要本发明涉及确定对象中血管健康的方法。该方法包括以下步骤从对。
2、象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹确定对象的血管健康。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014021086PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0417922012061087PCT国际申请的公布数据WO2012/170974EN2012121351INTCL权利要求书2页说明书32页附图27页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书32页附图27页10申请公布号CN104039134ACN10。
3、4039134A1/2页21确定对象中血管健康的方法,包括从所述对象获得生物样品;基于所述生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于所述生物样品至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于所述微粒和祖细胞数据产生所述生物样品的流式细胞术指纹;和基于所述产生的流式细胞术指纹确定所述对象的所述血管健康。2权利要求1所述的方法,其中所述至少一组微粒的所述水平通过流式细胞术测量。3权利要求1所述的方法,其中所述生物样品是血浆样品。4权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有银屑病的对象。5权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有狼疮的对象。6权利要求1所述的方法,其中所述对象是具有已知CVD风险因素的对。
4、象。7权利要求1所述的方法,其中所述对象是没有已知CVD风险因素的对象。8权利要求1所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。9权利要求1所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。10权利要求9所述的方法,其中所述对象是1型糖尿病对象。11权利要求9所述的方法,其中所述对象是2型糖尿病对象。12权利要求1所述的方法,其中所述祖细胞是内皮祖细胞EPCS。13权利要求1所述的方法,其中当至少一个微粒组的水平上调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。14权利要求1所述的方法,其中当至少一个祖细胞组的水平下调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血。
5、管疾病或血管机能异常进展的风险。15权利要求1所述的方法,其中当至少一个微粒组的水平上调和至少一个祖细胞组的水平下调时,所述对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。16确定对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险的方法,包括从所述对象获得生物样品;基于所述生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于所述生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于所述微粒和祖细胞数据产生所述生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹确定与所述对象心血管疾病或血管机能异常相关的风险。17权利要求16所述的方法,其中所述至少一组微粒的所述水平通过流式细胞术测。
6、量。18权利要求16所述的方法,其中所述生物样品是血浆样品。19权利要求16所述的方法,其中所述对象是糖尿病对象。20权利要求19所述的方法,其中所述对象是1型糖尿病对象。21权利要求19所述的方法,其中所述对象是2型糖尿病对象。22权利要求16所述的方法,其中所述祖细胞是内皮祖细胞EPCS。23权利要求16所述的方法,其中所述产生的流式细胞术指纹表明细胞损伤。24权利要求16所述的方法,其中所述产生的流式细胞术指纹表明内皮完整性、内皮权利要求书CN104039134A2/2页3修复能力的丧失、或其组合。25权利要求16所述的方法,进一步包括产生健康对照样品的流式细胞术指纹,和将所述对象的生物。
7、样品的所述产生的流式细胞术指纹与所述健康对照样品的所述流式细胞术指纹进行比较。权利要求书CN104039134A1/32页4细胞组学血管健康概况分析的系统和方法0001相关申请的交叉引用0002本申请要求2011年6月10提交的美国临时申请序列号61/495,955和2012年5月22日提交的美国临时申请序列号61/650,353的优先权权益,其全部公开内容通过引用被并入本文,如同每个以其全部在本文中列出。0003发明背景0004心血管疾病CVD在美国是最主要的死亡原因;每39秒一个成人死于心脏病发作、中风或其它心血管疾病“在美国,高血压和胆固醇失去控制”。疾病控制中心网站。HTTP/WWWC。
8、DCGOV/FEATURES/VITALSIGNS/CARDIOVASCULARDISEASE/。2011年1月31日更新,2012年2月6日访问。美国CVD患病率已经非常高369的成人或约8千1百万人并预测在接下来的20年里增加约10,到2030年估计超过40的成人大约1亿1千6百万人将患有一种或多种形式的CVDHEIDENREICHETAL,2011,CIRCULATION123933944。很早以前症状在临床上是明显的,新生血管疾病开始于内皮细胞机能异常。当动脉粥样硬化进展到阻塞的血流引起缺血的点时,或当由于破裂或侵蚀,血栓从存在的斑块形成时,有症状的、临床CVD事件通常发生HEIDEN。
9、REICHETAL,2011,CIRCULATION123933944。0005令人遗憾地,目前不存在有成本效益的和准确的可确定患者心血管健康的血液测试。相反,心血管风险通常由若干循环生物标记,如高灵敏度C反应蛋白HSCRP和纤维蛋白原进行评估RIDKER,2003,CIRCULATION107363369。由于这些生物标记通常是急性期反应物,因此对于动脉粥样硬化不是特异性的,它们只被推荐给具有心血管事件的中等风险的患者GREENLANDETAL,2010,CIRCULATION122E584E636。同样,在临床实践中没有可用的生物标记来灵敏地和准确地评价对医学治疗的反应。心血管风险分层的基。
10、于弗雷明汉(FRAMINGHAM)的方法没有结合生物标记或遗传异常,因此预测值受限。0006一个公开的心血管风险算法,雷诺尔德(REYNOLDS)评分,包括HSCRP,但是,如同弗雷明汉,遗传背景不包括在方案中。实践和预防工作组中基因组应用的评价(EVALUATIONOFGENOMICAPPLICATIONSINPRACTICEANDPREVENTIONWORKINGGROUPEWG)发现推荐测试28个基因中219P21遗传变体或57个其它变体以在一般人群中评估CVD特别是心脏病和中风风险的证据不充分。EWG提出来自单独或组合使用这些基因组标记中任何一个的净健康益处的量是可以忽略的EVALUA。
11、TIONOFGENOMICAPPLICATIONSINPRACTICEPREVENTIONWORKINGGROUP2010RECOMMENDATIONSFROMTHEEGAPPWORKINGGROUPGENOMICPROFILINGTOASSESSCARDIOVASCULARRISKTOIMPROVECARDIOVASCULARHEALTHJOURNAL128398438101097/GIM1090B1013E3181F1872C1090。0007因此,存在对早期诊断测试未满足的临床需要,该早期诊断测试提供在明显的CVD之前心血管健康的测量和治疗干预的评估。本发明通过细胞基试验满足该需要,该细。
12、胞基试验基于血管健康概况(VASCULARHEALTHPROLE)VHP的建立中祖细胞PCS,如内皮祖细胞EPCS和微粒MPS的测量而评估心血管状态。0008发明概述说明书CN104039134A2/32页50009本发明涉及确定对象中的血管健康的方法。该方法包括以下步骤从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹(CYTOMETRICNGERPRINT);和基于产生的流式细胞术指纹确定对象的血管健康。0010在一个实施方式中,至少一组微粒的水平通过流式细胞术测量。在另一个实。
13、施方式中,生物样品是全血液样品品。在另一个实施方式中,生物样品是血浆样品。在另一个实施方式中,对象是具有银屑病的对象。在另一个实施方式中,对象是具有狼疮的对象。在另一个实施方式中,对象是具有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是没有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是1型糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是2型糖尿病对象。在另一个实施方式中,祖细胞是内皮祖细胞EPCS。在另一个实施方式中,当至少一个微粒组的水平上调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。在另一个实施方式中,当至少一。
14、个祖细胞组的水平下调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。在另一个实施方式中,当至少一个微粒组的水平上调和至少一个祖细胞组的水平下调时,对象处于心血管疾病或血管机能异常的风险,或使心血管疾病或血管机能异常进展的风险。0011本发明还涉及确定对象中与心血管疾病或血管机能异常相关的风险的方法。所述方法包括以下步骤从对象获得生物样品;基于生物样品中至少一组微粒的水平获得微粒数据;基于生物样品中至少一组祖细胞的水平获得祖细胞数据;基于微粒和祖细胞数据产生生物样品的流式细胞术指纹;和基于产生的流式细胞术指纹,确定与对象的心血管疾病或血管机能异常相关的风险。0。
15、012在一个实施方式中,至少一组微粒的水平通过流式细胞术测量。在另一个实施方式中,生物样品是血浆样品。在另一个实施方式中,生物样品是全血液样品品。在另一个实施方式中,对象是具有银屑病的对象。在另一个实施方式中,对象是具有狼疮的对象。在另一个实施方式中,对象是具有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是没有已知CVD风险因素的对象。在另一个实施方式中,对象是糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是1型糖尿病对象。在另一个实施方式中,对象是2型糖尿病对象。在另一个实施方式中,祖细胞是内皮祖细胞EPCS。在另一个实施方式中,产生的流式细胞术指纹指示细胞损伤。在另一个实施方式中,产生的流式细。
16、胞术指纹指示内皮完整性、内皮修复能力丧失或其组合。在另一个实施方式中,所述方法进一步包括产生源自一个或多个个体的健康对照样品的流式细胞术指纹和比较对象的生物样品的产生的流式细胞术指纹与健康对照样品的流式细胞术指纹。0013附图简述0014为了说明本发明的目的,在附图中描述本发明的某些实施方式。然而,本发明不限于附图中描述的实施方式的精确安排和手段。0015图1是显示用于确定血管健康概况的高通量流式细胞术试验的示意图。血液样品分成外周血单核细胞PBMCS和血浆。祖细胞在PBMCS中鉴定,而微粒在血浆中鉴定。0016图2是CANTOA上FSC/SSC阈值优化的图解。如图2所描述的,FSC和SSC阈。
17、值由具有不同FSC或SSC阈值的以中等速度通过机器的03M小球A排或03、1和3M小说明书CN104039134A3/32页6球在FFC/SSC等值线图上的B排和在SSCW直方图上的C排确定。D和E列显示在具有设为5000的FSC阈值或设为200的SSC阈值D列以及只有设为200的SSC阈值和没有FSC阈值E列的FFC/SSC等值线图和SSCW直方图上3个小球的更好的分辨率。设为200的FSC阈值或设为200的SSC阈值F列获得更多的背景噪声。设为200的FSC阈值和没有SSCG列,03M小球缺失。对于小颗粒,侧向散射较前向散射是更好的参数。在该研究中为了在FSC/SSC等值线和SSCW直方图。
18、上的3个混合物小球的更好的分辨率,将FSC和SSC阈值设为5000和200D列。0017图3是CANTOA上FSC/SSCPMT确定的图解。如图3所描述的,双重过滤的PBS和03UM小球用于建立FSC、SSCPMT。当双重过滤的PBS以中等流速通过机器时,接受每秒小于10个事件。分别将FSC和SSC的阈值设为5000和200。利用不同SSC电压通过机器上运行的相同样品来确定FSC和SSCPMT。利用SSC300和325,更多的MPS丧失,并且SSC375和400上获得更多的背景噪声。在该研究中,接受350的SSC电压。由于大量背景噪声,这里未显示400的SSC电压数据。0018图4是窗口延伸确。
19、定的图解。如图4所描述的,FACSCANTOAWINDOWEXTENSIONWE通过以WE0至7的中等速度运行的03、1和3M小球来确定。为了SSCW直方图上3个小球的更好的分辨率和低背景噪声,选择WE02。0019图5是CANTOA上样品检测中窗口延伸02和7的比较。如图5所描述的,将PFP用FITCANNEXIN或CD31、PERCPCY55CD41、PECD105或CD144、APCCD64染色和在WE02或7上运行。当固定数目的3M小球100,000被计数时停止捕获。将A排在点图上用设为02的WE门控(GATED)在小于约1M上。将B排在点图上用设为7的WE门控在小于约1M上。在SSC。
20、W直方图上用WE02将C排门控在小于约1M上和用WE7将D排门控在小于约1M上。利用WE7采集更多的背景噪声和更少的阳性颗粒B排和D排。0020图6是门控策略的图解。如图6所描述的,03、1和3M小球用于估计MPS大小CANTOA上的A和B以及GALLIOS上的C。将MPS门控在小于约1M上CANTO上在SSCW直方图上门控的D和在FSC/SSC点图上的E以及GALLIOS上的F。对于CANTOA设置,分别将前向和侧向散射阈值设为5000和200,和将窗口延伸设为02。对于GALLIOS设置,将FS的鉴别器值设为1,前向散射采集角是W2。0021图7是抗体优化的图解。如图7所描述的,500L双。
21、重过滤的PBS中用于MP检测的相同体积的抗体在CANTOA上运行。未过滤的抗体A排较双重过滤的抗体B排显示更多的假阳性事件。用于MPS检测的所有试剂应当通过01022M低蛋白结合过滤器进行双重过滤以从运行缓冲液去除抗体聚集物和背景噪声。0022图8是抗体优化的进一步图解。如图8所描述的,将50LPFP用未过滤的抗体A和C排和双重过滤的抗体B和D排标记。将A和B排在SSCW直方图上门控在小于1M上。将C和D排在FSC和SSC点图上门控在小于1M上。预先过滤抗体有助于通过去除抗体聚集而减少假阳性颗粒。0023图9是CANTOA和GALLIOS上MP检测的图示。如图9所描述的,在CANTO和GALL。
22、IOS上检测MPS。在CANTOA排和GALLIOSB排上将MPS门控在小于1M上。基于荧光扣除对照(FLUORESCENCEMINUTESONE)FMO管确定阳性MPS。0024图10是BDCANTOA和BCGALLIOS的比较。如图10所描述的,计算的斯皮尔曼说明书CN104039134A4/32页7等级相关用于在两个平台之间比较MP计数,大多数相关超过08,除了显示06相关的CD105P5年2型糖尿病的患者采集并与年龄相关的健康的对象H比较。PC和MP亚型通过流式细胞术和ELISA基方法的组合来测量。促凝血的MPS/CD341PCS的比证明在对象组之间区分的有价值的指标P5001。该受损。
23、的血管功能的指标在LT组中是最高的,虽然有加强的抑制素治疗,并且较一些可溶蛋白生物标记提供更多的信息。0117意想不到地,发现了2型糖尿病中MPS和PCS之间的关系。该比提供具有糖尿病的患者中血管机能异常和心血管风险的定量的和临床上可行的测量。0118以下材料和方法用于实施例20119患者招募和研究设计0120将在先前的12个月内诊断有2型糖尿病的患者称作“早期”ES,并将超过五年以前诊断的那些患者称作“长期”LT。在没有先前或目前的糖尿病或心血管相关状况病史的基础上将年龄相关的“健康的”H对象招募进入研究,并且不采取任何类型的CV相关的药物治疗包括抑制素或高脂血症、高血压或糖尿病的药物治疗。。
24、ES组的四个36和LT组的14个67接受抑制素药物治疗,连同一些其它药物治疗以治疗糖尿病、高血压和其它状况。关于心血管疾病的家族史,健康组中18个66对象中的12个,早期中1190中的10个和长期组中每个参加者100答复存在先前的心血管疾病家族史。LT患者中糖尿病的平均时间长度是20年。所有的研究参加者都是不抽烟者。从所有的研究参加者获得书面的知情同意,并且研究方案经INSTITUTIONALREVIEWBOARDIRB批准。每个对象在上午800左右捐献约50ML静脉血,并且所有对象在前一天晚上禁食。将血液采集在肝素化BAXTER注射器中,用于细胞和可溶蛋白分析30ML、柠檬酸纳用于微粒10M。
25、L和EDTA用于脂质分析10ML。记录每个对象的人口统计数据、医学/药物治疗历史、体格检查和生命体征。0121PCS/PACS的流式细胞术0122样品采集后不到约1H,利用氯化铵溶胞作用将白血细胞从30ML血液分离,如先前所描述的。不确定血小板计数。细胞染色、门控策略、流式细胞术方法以及分析被如下描述。将大约5E6个细胞用6色抗体组FITC抗CD31PECAMPHARMINGEN、PE抗CDI33MILTENYIBIOTEC、PERCPCY55抗CD3,CDI9,CD33BECTONDICKINSON、APCH7抗CD45BECTONDICKINSON、PECY7抗CD34BECTONDICK。
26、INSON和APC抗VEGFR2RD系统染色。生存能力通过碘化丙啶排除来评估。利用说明书CN104039134A1715/32页18BECTONDICKINSONLSRII流式细胞仪,对每个样品处理2E6个活事件,并且六个荧光标记连同光散射只允许有活力的、低至中的侧向散射。对PCS和PACS分析单峰,其是CD3、19、33阴性的。将单峰门控为从侧向散射宽度对前向散射宽度的图鉴定的突出的细胞簇以保证将细胞聚集物从分析中排除。将荧光扣除对照FMO样品用作阴性对照。将细胞群体PCS和PACS定量为以每ML血液的数目的单核细胞百分数。分析集中于对PCS和PACS的亚型定义表1。利用FLOWJO分析软件。
27、TREESTAR,ASHLAND,OR进行数据分析。0123表10124通过流式细胞术的每个表面标记的细胞或颗粒基因型012501260127MP分离0128贫血小板血浆PPP获自采血之后1小时内的柠檬酸化血以分离MPS。将全血以1500G离心15MIN,收集上清,并通过在室温以13,500G离心5MIN获得PPP。对每个对象,将PPP等分进分离管和在80储存直到以后使用。使用的所有样品只进行一次冻融循环。0129MPS的流式细胞术0130为了MPS的表征和定量,将PPP与1BDANNEXINV结合缓冲液10MMHEPES,PH74,140MMNACL和25MMCAC12BDBIOSCIENC。
28、ES中的ANNEXINVFITC、PECY5CD41A、APCCD14BDBIOSCIENCES和PECDI44RD系统的混合物一起在黑暗中在室温温育30MIN,然后加入1BDANNEXINV结合缓冲液以制成1ML的总体积/管。将阴性对照制备为用ANNEXINVFITC和无钙结合缓冲液中相同量的匹配的同种型对照抗体染色的PPP。利用BDBIOSCIENCESFACSCANTO流式细胞仪,通过校准珠限定FSCH和SSCH散射对数尺度上的P1区005,但是在混杂变量调节之后它是显著的。单独PECAM1CD31标记对一种细胞类型不是特异的。发现是显著的MP的最后4个亚型都是血小板MPPMP并且对CD。
29、41阳性并且一些也对CD31阳性。CD41单阳性群体和ANNEXINV/CD31/CD41三阳性亚型在DM患者中都是近乎(MARGINALLY)显著的P005和上调的。CD41和ANNEXINV/CD31/CD41亚型在混杂变量调节之后都不是显著的。最后,存在两个CD31/CD41双阳性PMP亚型,其通过指纹法发现在DM和HC之间不同。这些之一是近乎显著的P011和在DM患者中上调CD31暗/CD41暗,而其它是高度显著的P0001并且是与HC相比以平均较更低浓度存在于DM的差别表达的亚型中仅有的一个CD31亮/CD41亮。最后,CD31暗/CD41暗亚型与CD31亮/CD41亮亚型之比与单独。
30、的暗或亮的亚型或通过流式细胞术指纹发现的其它差别表达的MP亚型中任何一个相比更强烈地差别表达P0001,并因此用于形成本发明的EPCS和MPS的组合测量。0225由于通常认为,祖细胞在细胞修复能力和新血管生长中发挥作用,并且微粒是细胞损伤的度量,所以假设两个的组合将较任何一个单独在临床上提供更多关于心血管状态的信息。评价每个淋巴细胞和通过暗与亮CD31/CD41微粒之比的EPCSCD31、CD34、CD133亮、CD45暗阴性的相对事件计数的能力以在DM和HC之间区分图22。针对这两个标记组合的ROC曲线下面积AUC是086、95CI079、094,指示高区分准确性。当与CRP组合时,AUC增。
31、加到090、95CI083、096。表7显示DM和HC组之间EPC和MP亚型的比较。0226表70227DM和HC组之间EPC和MP亚型的比较02280229说明书CN104039134A3129/32页320230IQR,四分位距0231P值获自威尔科克森秩和检验0232获自针对对数变换计数的多变量线性回归模型0233EPC绝对指示每ML血液CD31/CD34/CD45暗至阴性/CD133祖细胞的亚型0234EPC相对指示作为FSCA对SSCA淋巴细胞区域中事件百分比的CD31/CD34/CD45暗至阴性/CD133祖细胞的亚型0235研究结果鉴定了一个与DM相比在HC中上调的CD31/CD。
32、34/CD45暗阴性/CD133亮EPCS的亚群。此外,确定了存在对应于血小板、T淋巴细胞、ANNEXINV和内皮微粒的微粒的7个亚群。因此,该研究证实了EPCS和MPS水平在具有动脉粥样硬化的HC和DM患者之间不同的假设,并提示这些测量用作心血管健康的预测标记。0236EPCS作为生物标记的使用是有意义的,因为它直接涉及心血管系统中的病理过程,这与非特异地响应潜在情况的其它通常使用的生物标记相反。在DM患者对HC的情况中,存在一个EPCS群体,具有在对照组中上调的CD31/CD34/CD45暗阴性/CD133的表型。该EPC群体与ESTES等人ESTESETAL,2010,CYTOMETRY。
33、PARTA77A831839描述的循环造血干细胞和祖细胞CHSPC群体相似并且显示在图20中。EPCS是异质群体,其特异的表型定义仍有争论。一般,文献中描述的EPC表型将包括干细胞标记如CD34、未成熟标记如CD133和内皮标记如VEGFR2KDRETAL,2009,CYTOMETRYPARTA75A2537。说明书CN104039134A3230/32页330237在该研究中,利用广泛的组,其中细胞首先基于尺寸而被选择。然后,属于成熟造血谱系的细胞通过门控掉CD3、CD19、CD33和CD45亮细胞而被去除。然后,利用指纹法,将剩余的群体再分和进行统计学评价,而没有任何预定的偏倚,以发现是否。
34、存在DM患者和HC之间差别表达的细胞群体。与一些其它研究一样,发现VEGFR2在分析中不是有用的标记ESTES,ML,MUND,JA,INGRAM,DA,ANDCASE,J2001IDENTICATIONOFENDOTHELIALCELLSANDPROGENITORCELLSUBSETSINHUMANPERIPHERALBLOODINCURRENTPROTOCOLSINCYTOMETRYJOHNWILEYSONS,INC,这表明所述标记不提供信息或,如一些研究已显示的,所述试剂不可靠。如可在图23中看到的,存在许多针对VEGFR2的假阳性事件,因此难于发现真正的阳性阈值。另外,已显示VEGFR。
35、2抗体不能充分滴定,因为组中抗体浓度的增加增加产生的信号。本研究中的组含有另外的内皮标记CD31,其也在提供信息的表型中阳性表达,这支持被接受以在EPCS上表达的不成熟CD133、干CD34和内皮CD31标记的相似的一般表型。0238发现在本研究中差别表达的群体表达ESTES等研究ESTESETAL,2010,CYTOMETRYPARTA77A831839中发现的显示为促血管生成的相同的标记。在ESTES等中,小鼠体内肿瘤模型显示,具有与该研究中EPCS相同表型的细胞导致肿瘤生长显著增加,这表明这些细胞涉及新生血管发生。另外,发现相似的细胞群体CD34/CD133/CD117CD117,CKI。
36、T,是干细胞标记在缺血组织中产生增加的血管发生,导致2周之后大鼠梗死区中35倍高的毛细血管数目,与不表达CD133的更成熟的血管内皮相反KOCHERETAL,2001,NATMED7430436。本研究不包括CD117,然而,可能是由于两个群体重叠和共享相似功能的两个其它标记。因此,我们的研究的无偏倚结果在显示促血管生成的EPCS在动脉粥样硬化群体和HC之间差别表达方面与其它研究是一致的。0239血小板MPSPMP已知对血管健康具有有利和不利作用TUSHUIZENETAL,2011,ARTERIOSCLERTHROMBVASCBIOL3149。这些主张得到本研究的支持,因为多个不同PMP群体在。
37、两个群体之间显著不同,其中三个在DM患者中上调,而其它的在HC中上调。OMOTO等OMOTOETAL,1999,NEPHRON81271277发现与没有并发症的DM患者相比,PMPS在具有肾病的2型DM患者中显著上调,这提示PMPS涉及导致肾功能异常的活性。此外,TAN等TANETAL,2005,DIABETICMEDICINE2216571662发现具有临床上明显的动脉粥样硬化的DM患者较没有临床上明显的动脉粥样硬化的DM患者和HC具有显著更高水平的PMPS。另外,显示PMPS和EMPS均在具有严重高血压的患者中上调PRESTONETAL,2003,HYPERTENSION41211217,。
38、这提示EMPS和PMPS可以是血压对内皮和因此血管损伤的影响的标记。还显示PMPS体外刺激内皮细胞以释放细胞因子和表达粘附分子NOMURAETAL,2001,ATHEROSCLEROSIS158277287。本结果显示多数MP亚型是差的血管健康的标记。然而,无偏倚的流式细胞术指纹方法也能发现在HC中上调的PMPS群体,这与PMPS可具有有利作用的其它发现一致。已显示PMP辅助人脐静脉内皮细胞的血管生成活性和外周血单核细胞中增大的EPC分化KIMETAL,2004,BRJHAEMATOL1243376384。MAUSE等已显示PMPS可提高血管生成的早期向外生长细胞的潜能以在血管损伤之后恢复内皮。
39、完整性MAUSEETAL,2010,CIRCULATION122495506。因此,通过无偏倚的计算方法,该研究区分在血管健康中发挥作用的PMPS的两个单独群体。0240内皮MPSEMP,如同PMPS,在DM患者中升高,并且已建立理论,即,EMPS与血管说明书CN104039134A3331/32页34机能异常相关,是细胞凋亡的预兆,并因此反映血管壁损伤CHIRONIETAL,2009,CELLTISSUERES335143151。在一个研究中,EMP水平与流量介导的扩张FMD负相关,这表明EMPS与内皮机能失调相关FENGETAL,2010,ATHEROSCLEROSIS2085。另外,另一。
40、个研究显示,EMPS在具有冠状动脉疾病的患者中较对照中显著更高BERNALMIZRACHIETAL,2003,AMERICANHEARTJOURNAL145962970。该研究中发现的CD105群体亚型可能对应于EMPS,其已在许多研究中显示是疾病和血管机能异常的标记。因此,本文呈现的结果与对EMPS的先前工作一致,显示具有临床动脉粥样硬化的DM患者与HC相比具有更高的EMPS水平。0241结果还显示,与HC相比,CD3T细胞MPTMP群体亚型在DM患者中显著上调。该发现支持先前的工作,因为已知TMPS是促炎的,通过减少ENOS表达水平和增加内皮细胞中氧化应激降低NO产生MARTINETAL,。
41、2004,CIRCULATION10916531659。另外,TMPS通过改变NO前列环素途径而在传导和阻力动脉中引起内皮功能失调。此外,TMPS以与人相似的浓度损害乙酰胆碱诱发的主动脉环松弛MARTINETAL,2004,CIRCULATION10916531659。最后,TMPS也已显示响应流动和化学刺激而产生内皮机能失调MARTINETAL,2004,CIRCULATION10916531659。0242ANNEXINV细胞结合磷脂酰丝氨酸,其是凋亡的标记。对动脉粥样硬化斑块进行的研究已显示,斑块中发现的凋亡MP解释几乎所有的斑块提取物的TF组织因子活性。这表明MPS可在凝血级联的启动中。
42、发挥作用MALLATETAL,1999,CIRCULATION99348353。另外,与具有稳定心绞痛的患者相比,对ANNEXINV阳性的MPS在具有急性冠脉综合征的患者中显著地上调MALLATETAL,2000,CIRCULATION101841843。这表示增加的ANNEXINVMPS反映患者动脉粥样硬化状况的恶化。然而,研究限制是对ANNEXINVMP的凝血酶原酶试验与流式细胞术分开进行,因此这些细胞可以具有任何来源。本研究支持这些发现,因为ANNEXINV群体亚型在DM患者中显著地上调。0243细胞基系统分析,也称作细胞组学,整合环境和遗传的心血管风险因素的生物学结果。对发展可常规地用。
43、于指导医学治疗和风险评估这样的确定存在未满足的临床需要。目前的结果通过利用模式发现计算的方法对血管健康提供综合的见解以分析若干靶包括血管微粒最近被鉴定为血管健康的强大生物标记群体和内皮祖细胞的特性。例如,可评价无症状患者的心血管风险,并可纵向地监测有症状的患者。这些能力实现个性化医疗的主要目标。0244该研究的目的是利用无偏倚的方法发现在动脉粥样硬化DM群体和HC之间差别表达的细胞和微粒的表型亚型。因此,没有在发现的EPC如ECFC或体内动物模型或MP如凝血酶原酶试验群体上进行功能试验。这些群体提示的功能源自讨论中引用的其它组进行的研究0245仍然,不像其它研究,流式细胞术指纹和广泛试验的使用。
44、允许我们去除任何无意的门控偏倚以发现在群体中差别表达的很多群体。此外,使用的方法包括严格的流式细胞术方案,包括利用珠标准随着时间对仪器仔细地进行标准化,利用珠标准在数学上校正另外的残留仪器改变,FMO对照用于阳性,双指数变换,以及数字仪器的使用。最后,如与回顾相反,连续招募DM患者和HC。0246该研究的结果表明,与具有动脉粥样硬化的DM群体相比,在健康对照中EPCS较说明书CN104039134A3432/32页35高,并且大多数MP亚型较低。重要的是,这些结果用流式细胞术指纹能够发现利用常规分析方法时可保持隐藏的分布模式的新的无偏倚数据分析方法获得。若干亚型在这两个群体中显著地差别表达,其。
45、中一些在文献中得到支持,而其它的是新发现。有意思的是,VEGFR2通常与EPCS相关的标记是不提供信息的。流式细胞术指纹是客观的、综合的和节省劳动的方法,并在可能含有隐藏数据模式的复杂、多变量分布分析中具有普遍的实用性。这些结果合在一起提供血管健康概况的依据,其可用于许多应用,包括药物研发、临床风险评估和伴随诊断学。0247本文引用的每个和每一专利、专利申请和公开的公开内容由此以其全部通过引用并入本文。0248虽然本发明已参考具体实施方式进行了公开,但是,显然本发明的其它实施方式和改变可以由本领域技术人员想到而不背离本发明的真正精神和范围。所附权利要求意图被解释为包括所有这样的实施方式和等同的。
46、改变。说明书CN104039134A351/27页36图1说明书附图CN104039134A362/27页37图2说明书附图CN104039134A373/27页38图3说明书附图CN104039134A384/27页39图4说明书附图CN104039134A395/27页40图5说明书附图CN104039134A406/27页41图5续说明书附图CN104039134A417/27页42图6说明书附图CN104039134A428/27页43图7说明书附图CN104039134A439/27页44图8说明书附图CN104039134A4410/27页45图8续说明书附图CN104039134。
47、A4511/27页46图9说明书附图CN104039134A4612/27页47图10说明书附图CN104039134A4713/27页48图10续说明书附图CN104039134A4814/27页49图11说明书附图CN104039134A4915/27页50图12说明书附图CN104039134A5016/27页51图13说明书附图CN104039134A5117/27页52图14说明书附图CN104039134A5218/27页53图15说明书附图CN104039134A5319/27页54图16说明书附图CN104039134A5420/27页55图17说明书附图CN104039134A5521/27页56图18说明书附图CN104039134A5622/27页57图19说明书附图CN104039134A5723/27页58图20说明书附图CN104039134A5824/27页59图21说明书附图CN104039134A5925/27页60图22说明书附图CN104039134A6026/27页61图23说明书附图CN104039134A6127/27页62图24说明书附图CN104039134A62。