一种日本沼虾离体孵化的方法 【技术领域】
本发明涉及虾类遗传育种方法，特别是涉及一种日本沼虾受精卵离体孵化的方法。
背景技术
日本沼虾(Macrobrachium nipponense)俗称青虾，是我国产量最大的淡水虾，其肉质细嫩、滋味鲜美、营养丰富，是重要的水产养殖品种。近几年，日本沼虾经济性状退化严重：随着养殖产量极具增加，集约化程度不断提高，日本沼虾品种出现严重退化，性成熟提早、个体变小、病害增多，上市率明显降低，养殖效益逐年下滑。这使得日本沼虾有关遗传改良的研究受到广大科研工作者极度重视。而对日本沼虾进行基因转移、细胞核移植等遗传操作的前提是受精卵在离开母体的情况下能够正常地发育和孵化。因此，日本沼虾受精卵的离体孵化是当前急需解决的问题。
迄今为止，有关甲壳类受精卵离体孵化的研究的报道相对较少。1994年，Sandoz & Bookhout可能是第一个尝试利用人工孵化的方法繁殖首长黄道蟹(Cancer magister)，认为首长黄道蟹卵可以以50eggs/cm2的密度离体孵化。1953年，Costlow & Bookhou认为在保证水体溶氧的条件下，当孵化水体随变速摇动器一起摇动时，首长黄道蟹卵的孵化密度可提高至110eggs/cm2。1971年，Phillip曾成功离体孵化锯齿长臂虾(Palaemon serratus)卵，认为离体孵化的至关重要的因素是流动的孵化水体和合适的溶氧条件，但实验的结果重复性并不高，他把这种不确定因素归结为胚胎在离体孵化时受到病原丝状细菌即亮发菌(Leucothrix sp.)感染的缘故。直到1979年，C.Balasundaram & T.J.Pandian首次利用专门的孵化设备成功离体孵化凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamet)，并获得稳定实验结果，认为在无菌条件下，流动的水体和合适的溶氧是非常重要的，还认为受精卵至少需1日龄才可离体孵化成功。1996年，Thomas Cacec利用罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)为实验材料成功孵化罗氏沼虾胚胎，而起始孵化点可提前至受精卵受精后16小时。Praneet Damrongpho认为罗氏沼虾胚胎离体孵化的成功与否决定于离体孵化时胚胎发育的起点，认为受精后0.5天的胚胎要比受精后10.5天的胚胎对外界环境的变化要敏感，还认为罗氏沼虾胚胎的离体孵化和孵化水体的化学成分有关。迄今为止，尚未见日本沼虾受精卵离体孵化研究成功的正式报道，而且缺乏有参考价值的研究文献。因此，在这一研究领域几乎是空白。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种日本沼虾受精卵离体孵化的方法，以克服受精卵依赖母体孵化的生物学特性的难题。
该方法主要包括以下步骤
a.亲虾的选取：挑选发育良好、无病害、无伤残、体表无寄生物和营养状况良好的雌雄成虾作为亲虾，雌虾体长3cm-6.0cm，优先为3.5-5cm，头部背面充满生殖腺，颜色发绿；雄体体长5.0cm-6.5cm，头部两侧可见白色生殖腺团；
b.交配、产卵：将步骤a挑选的亲虾放在一起，观察雌雄虾交配现象，观察等待雌虾产卵，观察时间为1-3天，在观察等待期间进行步骤c的操作，并将孵化装置准备好；
c.孵化水处理：观察等待期间，将曝气24小时的自来水经活性炭过滤器过滤后加入孵化装置，加入量占孵化装置体积的3/4；
d.剥卵：观察亲虾交配，母虾排卵后，用镊子从母体腹部逐个剥取尚处于受精期的虾卵，使其成为无纠结的单独个体，剥取时，动作要轻柔，以免对卵造成损伤；
e.洗卵：用蒸馏水配制的8‰-15‰的NaCl溶液，优选为10‰的NaCl溶液，将步骤d中剥去的受精卵洗涤两次，洗涤后用8‰-15‰的NaCl溶液浸泡受精卵5-15分钟；
f.孵化：将步骤e中洗卵后的受精卵放入已加入处理后孵化水的孵化装置，放入受精卵的数量为50-1000颗，孵化装置放置在一水浴槽中，孵化装置底部装有曝气头，曝气头接进气管先后与空气泵和空气净化器连接，调节空气进入量，使得受精卵在水体中温和地翻动，水浴槽中水的温控制在18-30℃，优选为20-28℃，孵化260-650小时；
g.日常管理：每隔22-26小时彻底换取孵化水一次，换水前先停止气体进入，当所有受精卵沉淀至底部时，虹吸掉上部的水体，然后补充同等水温的新鲜孵化水，换水时尽可能避免受精卵所处水体温度的骤然变化。
本发明所述的日本沼虾受精卵离体孵化的方法，克服了受精卵依赖母体孵化地生物学特性的难题，为日本沼虾的基因转移、细胞核移植等遗传操作奠定基础，填补了这一领域的研究空白，具有重要的实际应用价值。
通过实施例的方式可进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。
【具体实施方式】
实施例1
操作步骤如下：
a.挑选发育良好的雌雄亲虾，雌虾体长4.2cm，头部背面充满生殖腺，颜色发绿，雄性体长6.3cm，头部两侧可见白色生殖腺团；
b.将挑选的亲虾放在一起，观察察雌雄虾交配现象，等待雌虾产卵，观察时间为3天；在等待雌虾产卵期间在观察等待期间进行步骤c的操作；
c.孵化水处理：观察等待期间，将曝气24小时的自来水经活性炭过滤器过滤后加入孵化装置，加入量占孵化装置体积的3/4；
d.剥卵：观察亲虾交配，母虾排卵后30分钟，用镊子从母体腹部逐个剥取尚处于受精期的虾卵，使其成为无纠结的单独个体，剥取时，动作要轻柔，以免对卵造成损伤；
e.洗卵：用蒸馏水配制的10‰的NaCl溶液，将步骤d中剥去的受精卵洗涤两次，洗涤后浸泡受精卵8分钟；
f.孵化：将步骤e中洗卵后的受精卵放入已加入处理后孵化水的孵化装置，共放入受精卵500颗，孵化装置放置在一水浴槽中，孵化装置底部装有曝气头，曝气头接进气管先后与空气泵和空气净化器连接，调节空气进入量，使得受精卵在水体中温和地翻动，水浴槽中水的温控制在20-22℃，孵化627小时；
g.日常管理：每隔22-26小时彻底换取孵化水一次，换水前先停止气体进入，当所有受精卵沉淀至底部时，虹吸掉上部的水体，然后补充同等水温的新鲜孵化水，换水时尽可能避免受精卵所处水体温度的骤然变化。
627h后孵出幼体，孵出幼体338尾，孵化率为67.6％。
实施例2
按照实施例1的步骤进行实施例2的操作，其区别在于：
1.步骤a中挑选的雌虾体长3.7cm，雄性体长5.2cm；
2.步骤b中观察产卵期间为1天；
3.步骤d中剥取受精卵的开始时间为开始排卵后25分钟；
4.步骤e中洗卵所用NaCl溶液浓度为5‰，洗涤后浸泡受精卵15分钟；
5.步骤f中水浴槽中水的温控制在23-25℃，受精卵的孵化数量为500颗，孵化时间为541小时。
541h后孵出幼体，孵出幼体的数量为327尾，孵化率为65.4％。
实施例3
按照实施例1的步骤进行实施例3的操作，其区别在于：
1.步骤a中挑选的雌虾体长5.5cm，雄性体长5.6cm；
2.步骤b中观察产卵期间为2天；
3.步骤d中剥取受精卵的开始时间为开始排卵后15分钟；
4.步骤e中洗卵所用NaCl溶液浓度为10‰，洗涤后浸泡受精卵10分钟；
5.步骤f中水浴槽中水的温控制在26-28℃，受精卵的孵化数量为500颗，孵化时间为315小时。
315h后孵出幼体，孵出幼体的数量为354尾，孵化率为70.8％。