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1、10申请公布号CN104302171A43申请公布日20150121CN104302171A21申请号201380025818222申请日2013031561/612,12620120316US61/611,95020120316US61/613,35220120320US61/736,93020121213USA01K67/027200601C07K16/00200601C12N15/8520060171申请人瑞泽恩制药公司地址美国纽约州72发明人J麦克沃克L麦克唐纳JH马丁AJ莫菲74专利代理机构北京商专永信知识产权代理事务所普通合伙11400代理人邬玥葛强54发明名称表达PH敏感性免疫球。
2、蛋白序列的非人动物57摘要本申请提供了基因修饰的非人动物，所述动物表达包括至少一个组氨酸的免疫球蛋白可变结构域，其中所述至少一个组氨酸由在所述动物的种系中针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者在种系免疫球蛋白核酸序列中插入的组氨酸密码子所编码。本申请还提供了免疫球蛋白基因，所述免疫球蛋白基因在一个或多个CDR中、在N末端区中和/或在环4区中含有组氨酸。免疫球蛋白可变结构域包括一个或多个组氨酸例如组氨酸簇取代非抗原结合的非组氨酸残基。本申请还提供了非人动物，所述非人动物是包括经修饰的重链可变基因座V、D、J区段，经修饰的轻链可变基因座V、J区段和重排的种系轻链基因VJ序列的动物的后代。本申请。
3、提供了非人动物，所述非人动物产生以PH敏感的方式结合抗原的免疫球蛋白结构域。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014111786PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0320362013031587PCT国际申请的公布数据WO2013/138712EN2013091951INTCL权利要求书3页说明书130页序列表124页附图57页按照条约第19条修改的权利要求书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书130页序列表124页附图57页按照条约第19条修改的权利要求书4页10申请公布号CN104302171ACN104302171A1/3页2。
4、1一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其种系中包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包括在免疫球蛋白可变基因座中用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子或插入组氨酸密码子。2根据权利要求1所述的非人动物，其中所述非人动物包括第一和第二可变基因座，其中至少所述第一或第二可变基因座包括插入至少一个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子。3根据权利要求2所述的非人动物，其中所述第一和第二可变基因座均包括用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子或插入组氨酸密码子。4根据权利要求3所述的非人动物，其中所述第一可变基因座包括至少一部分具有功能的未经重排的重链可变基因座未经重排的V、D。
5、、J区段。5根据权利要求4所述的非人动物，其中所述未经重排的重链可变基因座未经重排的V、D、J区段包括至少一部分人源基因座。6根据权利要求4所述的非人动物，其中所述未经重排的重链基因座是人源基因座，所述人源基因座包括未经重排的V区段、包含接头的合成的D区段和人源J区段。7根据权利要求6所述的非人动物，其中所述合成的D区段包括至少一个组氨酸密码子。8根据权利要求3所述的非人动物，其中所述第二可变基因座包括至少一部分具有功能的未经重排的轻链基因座未经重排的V、J区段。9根据权利要求4所述的非人动物，其中所述第二可变基因座包括重排的免疫球蛋白轻链可变基因序列重排的VJ序列。10根据权利要求1所述的非。
6、人动物，其中所述用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子和/或插入组氨酸密码子是在编码可变结构域的核酸序列中并且所述组氨酸在选自下述的区域中免疫球蛋白链的N末端区、免疫球蛋白链的环4区、重链的CDR1、重链的CDR2、重链的CDR3、轻链的CDR1、轻链的CDR2、轻链的CDR3及以上区域的组合。11根据权利要求2所述的非人动物，其中所述第一可变基因座或第二可变基因座中的至少一个与在内源性非人源免疫球蛋白基因座的内源性非人源恒定区核酸序列可操作地连接。12根据权利要求5所述的非人动物，其中所述第一可变基因座未经重排的人源V、D、J区段与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列可操作地连接。13根据权利。
7、要求12所述的非人动物，其中所述第一可变基因座未经重排的人源V、D、J区段在内源性非人源免疫球蛋白基因座与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列可操作地连接。14根据权利要求6所述的非人动物，其中所述第二可变基因座未经重排的V、J区段与内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接。15根据权利要求14所述的非人动物，其中所述内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列在内源性非人源免疫球蛋白基因座。16一种基因修饰的非人动物，所述动物包含与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列未经重排的V、D、J区段，其中一个或多个所述V、D和J基因区段包含至少权利要求。
8、书CN104302171A2/3页3一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列未经重排的V、J区段的，其中一个或多个所述V和J基因区段包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子的取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；其中所述非人动物表达包含来源于所述小鼠种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。17根据权利要求16所述的基因修饰的非人动物，其中所述非人动物是哺乳动物。18根据权利要求17所述的基因修饰的哺乳动物，其中所述哺乳动物是啮齿。
9、动物。19根据权利要求18所述的啮齿动物，其中所述啮齿动物选自下组小鼠、大鼠和仓鼠。20根据权利要求16所述的基因修饰的非人动物，其中所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列与非人源恒定区序列可操作地连接。21根据权利要求20所述的基因修饰的非人动物，其中与所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区核酸序列在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。23根据权利要求16所述的基因修饰的非人动物，其中与所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区核酸序列在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。24一种。
10、基因修饰的非人动物，所述动物包含与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列未经重排的V、D、J区段，其中一个或多个所述未经重排的V、D和J基因区段包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；与轻链恒定区基因序列可操作地连接的重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列重排的VJ序列，其中所述重排的VJ序列包括至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；其中所述非人动物表达包含来源于所述小鼠种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。25根据权利要。
11、求24所述的基因修饰的非人动物，所述非人动物为哺乳动物。26根据权利要求25所述的基因修饰的哺乳动物，所述哺乳动物为啮齿动物。27根据权利要求26所述的啮齿动物，所述啮齿动物选自下组小鼠、大鼠和仓鼠。28根据权利要求24所述的基因修饰的非人动物，其中所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列与非人源恒定区序列可操作地连接。29根据权利要求28所述的基因修饰的非人动物，其中与所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。30根据权利要求29所述的基因修饰的非人动物，其中与所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变。
12、区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。权利要求书CN104302171A3/3页431一种基因修饰的非人动物，其中所述动物包含B细胞群，所述B细胞群的特征为与野生型非人动物相比所述B细胞群的免疫球蛋白重链和轻链中组氨酸残基增加。32根据权利要求31所述的基因修饰的非人动物，其中所述增加约24倍。33根据权利要求31所述的基因修饰的非人动物，其中所述增加约210倍。34一种基因修饰的非人动物，所述动物表达包含由在所述非人动物的种系免疫球蛋白序列中通过取代和/或插入编码的组氨酸的免疫球蛋白的轻链和重链。35根据权利要求1所述的基因修饰的。
13、非人动物，其中所述可变区序列包含2、3、4或5个组氨酸的簇，所述组氨酸的簇为组氨酸密码子对非组氨酸密码子的取代和/或组氨酸密码子的插入。36根据权利要求5所述的基因修饰的非人动物，其中所述未经重排的重链基因座包含与所述重链基因座的方向相反的D基因区段。37一种制备非人动物的方法，所述非人动物产生具有由种系组氨酸密码子编码的组氨酸的抗体可变结构域，所述方法包括在其种系中修饰所述非人动物以便在未经重排的免疫球蛋白重链可变未经重排的V、D、J区段基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入；以及在其种系中修饰所述非人动物以使得在未经重排的免疫球蛋白轻链可变未经重排的。
14、V、J区段基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入。38根据权利要求37所述的方法，其中所述方法包括基因修饰所述小鼠的种系以包含至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变V、D、J区段基因座，并且在所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变未经重排的V、D、J区段基因座中制备组氨酸取代或插入。39根据权利要求37所述的方法，其中所述方法包括基因修饰所述小鼠的种系以包含至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白轻链未经重排的V、J区段基因座，并且在所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链基因座中制备组氨酸取代或插入。40根据权利要求37所述的方法，其中所述非人动物是啮齿动物。41。
15、根据权利要求40所述的方法，其中所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。42一种制备非人动物的方法，所述非人动物产生具有由种系组氨酸密码子编码的组氨酸的抗体可变结构域，所述方法包括修饰所述非人动物以使得在未经重排的免疫球蛋白重链可变未经重排的V、D、J区段基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入；以及修饰所述非人动物以使得在种系中的重排的免疫球蛋白轻链可变序列重排的VJ序列中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入。43根据权利要求42所述的方法，其中所述非人动物是啮齿动物。44根据权利要求43所述的方法，其中所述啮齿动物选自小鼠、。
16、大鼠和仓鼠。权利要求书CN104302171A1/130页5表达PH敏感性免疫球蛋白序列的非人动物发明领域0001一种基因修饰的非人动物，所述非人动物表达能够以PH依赖的方式与抗原结合的抗体。基因修饰的非人动物，所述非人动物包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座被修饰以含有至少一个编码能够质子化的氨基酸的密码子的取代或插入。基因修饰的非人动物，所述非人动物包括免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座被修饰以便在免疫球蛋白重链V、D或J基因区段，或轻链V或J区段，或其重排的重链VDJ区或其重排的轻链VJ区含有至少一个组氨酸取代和/或至少一个组氨酸插入。基因修饰的非人动物，所述非人动物表达在抗原。
17、结合中显示出PH敏感性的免疫球蛋白。基因修饰的动物，所述动物包含B细胞群，所述B细胞群富含包含至少一个组氨酸的免疫球蛋白可变结构域。基因修饰的非人动物，所述非人动物包含在免疫球蛋白重链V、D和/或J基因区段，和或轻链V和/或J基因区段，和/或其重排的重链VDJ序列或重排的轻链VJ序列中以插入和/或取代形式存在的两个或多个组氨酸的簇。0002非人动物的基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含至少一个组氨酸密码子的插入或至少一个组氨酸密码子对内源性非组氨酸密码子的取代。非人动物，包括啮齿动物，例如小鼠和大。
18、鼠，所述非人动物在其基因组中包含基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。能够表达抗原结合蛋白的基因工程改造的非人动物，所述抗原结合蛋白的特征为PH依赖性抗原结合、循环利用提高和/或血清半衰期增加。背景技术0003治疗用途的免疫球蛋白结合结构域具有各种各样的形式，包括具有与同源轻链结合的同源二聚体免疫球蛋白重链的传统抗体形式。多种这些形式，包括传统形式，显示出由于各种各样的因素导致的在体内的药代动力学性质不理想。在最近的几十年中，已尝试了。
19、不同方法以改善药代动力学。这些包括例如通过与聚合物缀合增加流体力学半径以降低肾脏清除率例如PEG；参见例如DUNCAN,R2006POLYMERCONJUGATESASANTICANCERNANOMEDICINES作为抗癌纳米药物的聚合物缀合物,NATREVCANCER6688701；N聚糖的唾液酸化参见例如STORK,R等，NGLYCOSYLATIONASNOVELSTRATEGYTOIMPROVEPHARMACOKINETICPROPERTIESOFBISPECICSINGLECHAINDIABODIES作为改善双特异性单链双体药代动力学性质的新策略的N糖基化,JBIOLCHEM28312。
20、78047812；用于促进在中性PH下FCFCRN结合而在内涵体PH下促进释放并与血清白蛋白结合的FC修饰参见例如CHUANG等，2002PHARMACEUTICALSTRATEGIESUTILIZINGRECOMBINANTSERUMALBUMIN利用重组血清白蛋白的制药策略,PHARMRES195569577。在适当的应用中和使用适当形式时，这些方法中的每一种均可以提供一些益处。0004然而，在本领域中仍需要改善治疗效果和生物制药的模式，包括但不限于操纵免说明书CN104302171A2/130页6疫球蛋白可变结构域的结构以工程改造显示出PH依赖性结合的可变结构域。需要用于多种形式的抗原结。
21、合蛋白中的可变结构域，其中针对与靶抗原或受体的结合所述可变结构域或其抗原结合片段赋予了所述抗原结合蛋白PH敏感性。在本领域中还需要用于生成PH依赖性免疫球蛋白可变结构域及其抗原结合片段的系统和方法。需要能够产生具有广泛的多样性的免疫球蛋白可变结构域的生物系统，其中所述广泛的多样性富含可滴定的氨基酸，所述可滴定的氨基酸是可以赋予所述可变结构域PH敏感性，例如能够在一个PH下例如中性的或较高的PH与靶抗原或表位结合，而在另一个PH下例如较低的或内涵体PH释放靶抗原或表位。0005特定形式的免疫球蛋白轻链提出了特殊挑战。抗体通常包含同型二聚体的重链组分，其中各重链单体均与相同的轻链结合。具有异二聚体。
22、重链组分例如双特异性抗体的抗体是理想的治疗性抗体。但是制备具有能够令人满意地与双特异性抗体的各个重链结合的适宜轻链组分的双特异性抗体已被证明是有问题的。0006在一种方法中，可以通过调查所有轻链可变结构域使用情况的统计数据，鉴定在人源抗体中使用频率最高的轻链并且在体外将轻链与具有不同特异性的两条重链配对来选择轻链。0007在另一种方法中，可以通过观察噬菌体展示文库例如含有人源轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人源SCFV文库中的轻链序列并从该文库中选择最常用的轻链可变区来选择轻链。然后可以在两条不同的目的重链上对所述轻链进行检测。0008在另一种方法中，可以通过使用两条目的重链的重链可变序列。
23、作为探针检测轻链可变序列的噬菌体展示文库来选择轻链。可以选择与两条重链可变序列均结合的轻链作为所述重链的轻链。0009在另一种方法中，可以将候选轻链与所述重链的同源轻链比对，并且在所述轻链中进行修饰以便更加紧密地匹配与两条重链的同源轻链共有的序列特征。如果需要将免疫源性的可能最小化，则所述修饰优选地生成存在于已知的人源轻链序列中的序列，以使得蛋白水解加工根据用于评估免疫源性可能性的本领域公知的参数和方法即在硅胶和湿分析法中不可能生成T细胞表位。0010依赖于体外方法的所有此类方法包含多种先天缺陷，例如序列一致性，与特定预先选定的重链的结合能力等。现有技术中需要不依赖于体外条件操纵，取而代之的是。
24、使用在生物学上更为明智的方法以制备包含常见轻链的人源表位结合蛋白的组合物和方法。0011此外，治疗性抗体例如双特异性治疗性抗体具有一些局限性，因为其通常需要较高剂量以达到所需的疗效。这部分是由于抗体抗原复合物被内化进入内涵体，并且在一个称为靶介导的清除过程中被作为溶酶体降解的靶点。因此，在现有技术中需要导致更有效的抗体循环例如双特异性抗体循环并通过促进在内涵体隔室中抗体抗原复合物的解离但不影响抗体与抗原的特异性和亲和性的阻止抗体降解的方法和组合物。0012施用到体内的药物，包括治疗性单克隆抗体，受到多种消除机制的影响，包括肾小球滤过例如进入尿液、分泌例如进入胆汁和通过细胞的分解代谢。尽管小分子。
25、通过肾脏的滤过从机体中清除，但大多数的分泌抗体例如IGG，因过大而无法通过肾小球被滤过主要通过细胞介导的分解代谢从机体中除去，例如流体相的内吞作用吞噬作用或受体介导的内吞作用。例如，具有若干重复表位的可溶性分子与多个循环抗体结合，并且所说明书CN104302171A3/130页7得到的较大的抗原抗体复合物被迅速地吞噬进入细胞降解。另一方面，与抗体结合的细胞表面靶受体即受体抗体复合物以剂量依赖性的方式经历靶向介导的内吞作用，从而在细胞内形成最终被溶酶体降解的内涵体。在一些情况下，细胞内吞受体抗体复合物以PH依赖性的方式在内涵体内结合新生儿FC受体FCRN并且再返回细胞表面，并当暴露于细胞外的中性。
26、PH例如PH7074下时释放进入血浆或细胞间液。0013在本领域中需要生产具有可滴定的残基的抗原结合蛋白的系统，例如非人动物、细胞和基因组的基因座，例如基因修饰的基因座，所述基因座重排免疫球蛋白基因区段以生产响应PH的改变的重链可变结构域，例如其提供或接受质子并且例如根据质子化状态不同其具有不同的结合特性。0014在本领域中还需要能够通过促进抗原结合蛋白从受体抗原结合蛋白复合物中解离或通过在酸性内涵体隔室中增加抗原结合蛋白对FCRN的亲和性进一步增加细胞内吞的抗原结合蛋白的再循环效率但不影响所述抗原结合蛋白对目的抗原的特异性和亲和性的方法和组合物。0015发明概述0016本申请提供了用于制备基。
27、因修饰的动物的组合物和方法，所述组合物和方法生成包含由非人动物的种系的修饰编码的至少一个组氨酸残基的免疫球蛋白可变结构域，其中所述种系的修饰包含至少一个组氨酸密码子插入重链V、D或J区段，至少一个组氨酸密码子插入轻链V或J区段，至少一个组氨酸密码子插入重排的轻链VJ基因，在重链V、D或J区段中使用至少一个组氨酸密码子取代非组氨酸密码子，在轻链V或J区段中使用至少一个组氨酸密码子取代非组氨酸密码子，在重排的轻链VJ序列中使用至少一个组氨酸密码子取代非组氨酸密码子。0017本申请还提供了用于在非人动物的种系免疫球蛋白序列中引入组氨酸密码子簇的组合物和方法。0018本申请还提供了在免疫球蛋白基因的N。
28、末端编码区、免疫球蛋白基因的环4编码区、免疫球蛋白基因的CDR编码区例如重排的VDJ序列或VDJ基因区段中引入组氨酸插入或使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子的组合物和方法。0019本申请提供了用于制备非人动物后代的组合物和方法，所述组合物和方法包含在两个免疫球蛋白重链基因座和在免疫球蛋白轻链基因座中插入组氨酸密码子和/或使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子。0020在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物在其种系中包含免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座在免疫球蛋白可变基因座中包含使用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子或插入组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述可变基因座。
29、例如未经重排的VDJ区段基因座包含至少一部分人源可变VDJ区段基因座。0021在一个实施方式中，所述经基因修饰的非人动物在其种系中包含第一可变基因座例如未经重排的免疫球蛋白重链VDJ区段基因座和第二可变基因座例如未经重排的免疫球蛋白轻链V、J区段基因座；或重排的免疫球蛋白轻链VJ序列。0022在一个实施方式中，所述非人动物包含第一和第二可变基因座，其中至少所述第一或第二可变基因座包含插入至少一个组氨酸密码子或用组氨酸密码子取代至少一个非说明书CN104302171A4/130页8组氨酸密码。0023在一个实施方式中，所述第一和第二可变基因座均包含用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子或插入组。
30、氨酸密码子。0024在一个实施方式中，所述第一可变基因座包含至少一部分具有功能的未经重排的重链可变基因座未经重排的V、D、J区段。0025在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变基因座包含至少一部分人源基因座未经重排的V、D、J区段。0026在一个实施方式中，所述未经重排的重链基因座是人源基因座，所述人源基因座包含未经重排的V区段、包含接头的合成的D区段和人源J区段。在一个实施方式中，所述合成的D区段包含至少一个组氨酸密码子。0027在一个实施方式中，所述第二可变基因座包含至少一部分具有功能的未经重排的轻链可变基因座未经重排的V、J区段。0028在一个实施方式中，所述第二可变基因座包含重排的免。
31、疫球蛋白轻链可变基因序列重排的VJ序列。0029在一个实施方式中，使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子和/或插入组氨酸密码子是在编码可变结构域的核酸序列中并且所述组氨酸在选自下述的区域中免疫球蛋白链的N末端区、免疫球蛋白链的环4区、重链的CDR1、重链的CDR2、重链的CDR3、轻链的CDR1、轻链的CDR2、轻链的CDR3及以上区域的组合。0030在一个实施方式中，所述第一可变基因座或第二可变基因座中的至少一个与在内源性非人源免疫球蛋白基因座的内源性非人源恒定区核酸序列可操作地连接。0031在一个实施方式中，所述第一可变基因座未经重排的人源V、D、J区段与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序。
32、列可操作地连接。0032在一个实施方式中，所述第一可变基因座未经重排的人源V、D、J区段在内源性非人源免疫球蛋白基因座与内源性非人源免疫球蛋白重链恒定区核酸序列可操作地连接。0033在一个实施方式中，所述第二可变基因座未经重排的V、J区段与内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接。0034在一个实施方式中，所述内源性非人源免疫球蛋白轻链恒定区序列在内源性非人源免疫球蛋白基因座。0035在一个实施方式中，所述可变区序列包含2、3、4或5个组氨酸的簇，所述组氨酸的簇是使用组氨酸密码子取代非组氨酸密码子和/或插入组氨酸密码子。0036在一个实施方式中，所述未经重排的重链基因座包含D基因区段，。
33、所述D基因区段与所述重链基因座的方向是相反的。在一个实施方式中，所述反向的D基因区段在亲水性阅读框架中。0037在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列未经重排的V、D、J区段，其中一个或多个所述V、D和J基因区段包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列未经重排说明书CN104302171A5/130页9的V、J区段的，其中一个或多个所述V和J基因区段包含至少一个针对。
34、非组氨酸密码子的组氨酸密码子的取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；其中所述非人动物表达包含来源于所述小鼠种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。0038在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自下组小鼠、大鼠和仓鼠。0039在一个实施方式中，所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列与非人源恒定区序列可操作地连接。0040在一个实施方式中，与所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区核酸序列在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋。
35、白基因座中。0041在一个实施方式中，与所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区核酸序列在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。0042在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物包含可与恒定区基因序列可操作地连接的至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列未经重排的V、D、J区段，其中一个或多个所述未经重排的V、D和J基因区段包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；与轻链恒定区基因序列可操作地连接的重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列重排的VJ序列，其中所述重排的VJ序列包。
36、括至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者至少一个组氨酸密码子的插入；其中所述非人动物表达包含来源于所述小鼠种系中的组氨酸取代或组氨酸插入的免疫球蛋白重链可变结构域和/或免疫球蛋白轻链可变结构域。0043在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自下组小鼠、大鼠和仓鼠。0044在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核酸序列与非人源恒定区序列可操作地连接。在一个实施方式中，与所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区序列是在所述非人动物种系中的内源性非。
37、人源免疫球蛋白基因座中。在一个实施方式中，与所述重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核酸序列可操作地连接的所述非人源恒定区序列是在所述非人动物种系中的内源性非人源免疫球蛋白基因座中。0045在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中所述非人动物包含B细胞群，所述B细胞群的特征为与野生型非人动物相比所述B细胞群的免疫球蛋白重链和轻链中组氨酸残基增加。在一个实施方式中，所述增加约24倍。在一个实施方式中，所述增加约210倍。0046在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述非人动物表达包含由在所述非人动物的种系免疫球蛋白序列中通过取代和/或插入编码的组氨酸的免疫球蛋白的轻链和重链。0。
38、047在一个方面，本申请提供了一种用于制备非人动物的方法，所述非人动物产生具说明书CN104302171A6/130页10有由种系组氨酸密码子编码的组氨酸的抗体可变结构域，所述方法包括在其种系中修饰所述非人动物以便在未经重排的免疫球蛋白重链可变未经重排的V、D、J区段基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入；以及在其种系中修饰所述非人动物以使得在未经重排的免疫球蛋白轻链可变未经重排的V、J区段基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入。0048在一个实施方式中，所述方法包括基因修饰所述小鼠的种系以包含至少一部分未经重排的。
39、人源免疫球蛋白重链可变V、D、J区段基因座，并且在所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变未经重排的V、D、J区段基因座中制备组氨酸取代或插入。0049在一个实施方式中，所述方法包括基因修饰所述小鼠的种系以包含至少一部分未经重排的人源免疫球蛋白轻链未经重排的V、J区段基因座，并且在所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链基因座中制备组氨酸取代或插入。0050在所述方法的一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。0051在一个方面，本申请提供了一种用于制备非人动物的方法，所述非人动物产生具有由种系组氨酸密码子编码的组氨酸的抗体可变结构域，所述方法包括修饰所述。
40、非人动物以使得在未经重排的免疫球蛋白重链可变未经重排的V、D、J区段基因座中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入；以及修饰所述非人动物以使得在种系中的重排的免疫球蛋白轻链可变序列重排的VJ序列中包含至少一个针对非组氨酸密码子的组氨酸密码子取代，或者组氨酸密码子插入。0052在所述方法的一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。0053在不同的方面和实施方式中，所述非人动物是通过基因修饰多能性或全能性细胞例如胚胎干ES细胞基因修饰的，并且使用所述基因修饰的细胞作为供体细胞与宿主胚胎在代孕母体中妊娠来源于所述经基因。
41、修饰的供体细胞的动物。在不同的方面和实施方式中，通过本领域公知的任意其他方法对所述非人动物进行基因修饰。0054本申请提供了用于制备显示出PH依赖性抗原结合的抗体可变结构域的方法和组合物。本申请提供了经修饰的抗原结合蛋白以及用于制备其的组合物和方法，所述抗原结合蛋白在较低例如内涵体PH下以较低的亲和性结合靶抗原，在更高的例如细胞外或中性PH下以较高的亲和性结合相同的靶抗原。0055在一个方面，本申请提供了一种用于制备显示出PH依赖性结合的抗体的方法，所述方法包括修饰抗体可变结构域的序列以加入组氨酸残基，或使用组氨酸残基取代已有的残基，以形成组氨酸修饰的可变结构域。在一个实施方式中，所述取代不是。
42、结合抗原关键性的残基例如在中性或细胞外PH。0056在一个实施方式中，2、3、4、5或6个或者更多个残基被组氨酸取代。在一个实施方式中，所述2、3、4、5或6个或者更多个被组氨酸取代的残基在一簇中。在一个实施方式中，所述簇包含两个或多个连续的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述簇包含两个或更多个被一个或多个非组氨酸残基分隔的组氨酸取代。在一个实施方式中，所述簇的长度为2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基，以及针对结合抗原不是关键性的所有残基例如在中性或细胞说明书CN104302171A107/130页11外PH下被修饰为组氨酸。0057在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域例如或。
43、。在一个实施方式中，所述可变结构域在重链可变结构域中。在一个实施方式中，所述轻链可变结构域和重链可变结构域的序列被修饰。0058在一个实施方式中，所述可变结构域的序列是CDR序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是重链的CDR序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是轻链的CDR序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是重链的CDR序列和轻链的CDR序列。0059在一个实施方式中，所述CDR序列是CDR3序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是CDR2序列。在一个实施方式中，所述CDR序列是CDR3序列。0060在一个实施方式中，所述CDR序列是轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。在一个实。
44、施方式中，所述CDR序列是重链的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。0061在一个实施方式中，所述抗体可变结构域的序列是环4序列。在一个实施方式中，所述环4序列是重链环4序列。在一个实施方式中，所述环4序列是轻链环4序列。0062在一个实施方式中，所述抗体可变结构域的序列是N末端序列。在一个实施方式中，所述N末端序列是重链N末端序列。在一个实施方式中，所述N末端序列是轻链N末端序列。0063在一个实施方式中，所述抗体可变结构域的序列选自重链的CDR序列、轻链的CDR序列、重链的环4序列、轻链的环4序列、重链的N末端序列、轻链的N末端序列及其组合。0064在一个实施方式中，所述可变结构域来自重。
45、链，并且所述可变结构域的序列包含第一CDR序列和选自下述的序列N末端序列、环4序列、第二CDR序列、第三CDR序列及其组合。在一个特定的实施方式中，所述第一CDR序列是CDR3，并且所述可变结构域的序列还包含选自下述的序列N末端序列、环4序列、CDR2序列、CDR1序列及其组合。0065在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域来自重链，并且所述组氨酸修饰在环4序列和选自下述的序列中CDR1或CDR2或CDR3、N末端序列及其组合。在一个特定的实施方式中，所述组氨酸修饰在环4序列和CDR3序列中。在一个特定的实施方式中，所述组氨酸修饰在环4序列和CDR3序列和N末端序列中。在一个特定的实施方。
46、式中，所述组氨酸修饰在环4序列和N末端序列中。0066在一个方面，本申请提供了如本申请所述的组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在PH低于6时不与目的抗原结合或者以第一亲和性与目的抗原结合；在PH约7或更高时以第二亲和性与相同的目的抗原结合。在一个实施方式中，所述第一PH低于55，或低于5。在一个实施方式中，所述第一PH是575，在一个实施方式中，所述第二PH是约7或更高。在一个实施方式中，所述第二PH是人的细胞外PH。在一个实施方式中，所述第二PH是72至74。在一个特定的实施方式中，所述第二PH是72。0067在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构。
47、域在选自CDR、N末端、环4及其组合的序列中包含1、2、3、4、5或6个或更多个组氨酸取代。在一个特定的实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域包含在CDR3中的修饰。在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域包含选自在重链中的CDR3的修饰、在轻链中的CDR3的修饰及其组合。在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的可变结构域包含在CDR例如CDR3中的至少一个取代和在说明书CN104302171A118/130页12选自N末端、环4及其组合的序列中的至少一个取代。0068在一个实施方式中，所述CDR选自下组重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3及其组合。。
48、0069在一个实施方式中，所述至少一个CDR包含轻链CDR3。在一个实施方式中，所述至少一个CDR包含轻链CDR3和重链CDR3。0070在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在中性或碱性PH例如PH774下以约106或更低例如107、108、109、1010、1011、1012的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR1，其中全部非抗原结合的氨基酸残基被组氨酸取代，或者其中所述CDR1包含组氨酸取代的簇。在一个实施方式中，所述可变结构域在酸性PH下例如PH56，在一个实施方式中，PH6不与目的抗原集合或者与目的抗原结合弱102106倍。0071在一。
49、个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在中性或碱性PH例如PH774下以约106或更低例如107、108、109、1010、1011、1012的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR2，其中全部非抗原结合的氨基酸残基被组氨酸取代，或者其中所述CDR2包含组氨酸取代的簇。在一个实施方式中，所述可变结构域在酸性PH下例如PH56，在一个实施方式中，PH6不与目的抗原集合或者与目的抗原结合弱102106倍。0072在一个实施方式中，所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域在中性或碱性PH例如PH774下以约106或更低例如107、108、109、1010、1011、1012的KD结合目的抗原，其中所述组氨酸修饰的免疫球蛋白可变结构域包含CDR3，其中全部非抗原结合的氨基酸残基被组氨酸取代，或者其中所述CDR3包含组氨酸取代的簇。在一个实施方式中，所述可变结构域在酸性PH下例如PH56，在一个实施方式中，PH6不与目的抗原集合或者与目的抗原结合弱102106倍。0073在一个方面，本申请提供了一种制备包含组氨酸修饰的结构域的人源抗原结合多肽的方法，所述方法包括修饰如本申请所述的免疫球蛋白可变结构域核苷酸序列以使其编码一个或多个组氨酸，以形成编码组氨酸修饰的结构域的核酸序列，并且将编码所述组氨酸修饰的结构域的核酸序列与人源免疫球蛋白序列融合直接或使。