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1、10申请公布号CN104293834A43申请公布日20150121CN104293834A21申请号201410531801022申请日20141011C12N15/85200601C07K19/00200601C12P21/02200601A61K38/26200601A61K47/48200601A61P3/1020060171申请人上海兴迪金生物技术有限公司地址201203上海市浦东新区张江高科技园区蔡伦路781号609室72发明人许必雄郭颀然赵红阳74专利代理机构上海光华专利事务所31219代理人张艳54发明名称GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法57摘要本发明涉及生物。
2、技术领域，特别是涉及一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法。本发明提供一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列克隆至表达载体中；将表达载体转染CHODXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株；将所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。本发明所提供的制备方法在CHO细胞系DXB11中表达GLP1FC分子，不会产生降解问题，后续的纯化得率大大提高，生物学活性并未减弱，非常适合工艺业化生产需求。51INTCL权利要求书2页说明书18页序列表12页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书。
3、2页说明书18页序列表12页附图1页10申请公布号CN104293834ACN104293834A1/2页21一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤1将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列克隆至表达载体中；2将表达载体转染CHODXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株；3使用步骤2所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。2如权利要求1所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白由重组人胰高血糖素样肽1或其类似物通过连接肽与具有延长人体内半衰期作用的抗体FC片段连接形成。3如权利要求。
4、2所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述GLP1或其类似物的氨基酸序列与SEQIDNO14具有80以上的同源性。4如权利要求3所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述GLP1或其类似物的氨基酸序列与SEQIDNO14具有90以上的同源性。5如权利要求4所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述GLP1或其类似物的氨基酸序列与SEQIDNO14具有97以上的同源性。6如权利要求5所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述GLP1或其类似物的氨基酸序。
5、列如SEQIDNO14、SEQIDNO1或SEQIDNO2所示。7如权利要求2所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述连接肽的氨基酸数量为636个，所述连接肽由甘氨酸和丝氨酸组合而成，以G4S为单位的多单位连接实现。8如权利要求7所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述连接肽的氨基酸数量为1436。9如权利要求7所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO38所示。10如权利要求2所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于。
6、，所述抗体FC片段为不具ADCC效应子功能的非裂解性FC。11如权利要求10所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述抗体FC片段的氨基酸序列如SEQIDNO9所示。12如权利要求2所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO10和SEQIDNO11所示；所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列如SEQIDNO12和SEQIDNO13所示。13如权利要求1所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达载体选自D。
7、HFR系统的表达载体或GS系统的表达载体。14如权利要求1所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列克隆至表达载体中的方法具体为在GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列的两端设计与载体的多克隆位点所对应的酶切位点，再将编码序列与载体上所对应的酶切位点连接，实现目标蛋白编码DNA片段与表达载体的连接。15如权利要求1所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，权利要求书CN104293834A2/2页3其特征在于，所述将表达载体转染CHODXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株的方法具。
8、体为使用DNA转染试剂将质粒DNA转染CHODXB11细胞，传代培养后通过测定融合蛋白的表达量，从而筛选出阳性细胞形成细胞株。16如权利要求1所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述细胞表达的方法具体为将筛选出的阳性细胞株进行无血清驯化，然后接种至摇瓶中摇床培养，将所得培养液离心取上清液进行蛋白纯化。17如权利要求1所述的一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化的具体为通过膜过滤、亲和层析柱和凝胶过滤层析进行纯化。18CHODXB11细胞株在GLP1蛋白制备领域的用途。19一种融合蛋白，由如权利要求117任一权利要求所述。
9、的GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法制备获得。20一种药物组合物，包括有效剂量的如权利要求19所述的融合蛋白，还包括载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、增稠剂中的一种或多种的组合。权利要求书CN104293834A1/18页4GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法技术领域0001本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法。背景技术0002胰高血糖素样肽1GLP1可促进胰岛素释放，降低血浆中的胰高血糖素水平，降低胃排空的速率，促进饱食感并刺激胰岛的生物合成和细胞的增殖，可用于2型糖尿病的治疗。在我国2型糖尿病发病广泛，如果不及时。
10、加以治疗，容易转变成1型糖尿病，给患者和国家造成很大负担。因此，开发这类药物的需求极为迫切。目前美国礼来公司的艾塞那肽百泌达和丹麦诺和诺德制药公司的利拉鲁肽诺和力已经在我国获得进口注册，两种药物都具有降血糖和减轻体重的作用，但需要每天12次皮下注射给药。0003为了增加的体内半衰期，使GLP1长效化从而减少单位时间给药次数已经成为国内外研究的热点。目前研究的GLP1及类似物长效化的方法主要有以下三种方式1PEG化长效，代表为NOVENORDISK公司丹麦诺和诺德公司研发的每周一次皮下注射的长效GLP1类似物索玛鲁肽；2GLP1与白蛋白融合蛋白，代表为专利CN10665538A；3GLP1与抗体。
11、的FC片段融合蛋白，代表为专利CN1802386B。礼来公司的GLP1FCLY2189265目前正在美国三期临床阶段，根据临床实验的数据报道，LY2189265能够有效增加GLP1的半衰期，实现每周给药一次，提高了患者治疗的依从性。0004重组人胰高血糖素样肽1GLP1类似物与具有延长人体内半衰期作用的抗体FC片段组成的融合蛋白简称GLP1FC，国外制药公司将该融合蛋白应用于人体临床实验能够有效的治疗2型糖尿病的同时降低体重。0005随着抗体技术的发展，许多上市的抗体类药物都是在CHOS或CHOK1细胞为原始细胞的基础上构建工程细胞，工业生产中采用高密度细胞培养的方法实现抗体目标蛋白在最终细胞。
12、培养液中的高表达。由于抗体分子有分子结构稳定的特点，高密度细胞培养过程中由于部分工程细胞凋亡而释放出的蛋白酶对抗体目标蛋白影响很小。由于GLP1FC融合蛋白存在抗体FC片段作为分子的组成部分，其分子具有一些抗体的特性，很多人认为CHOS或CHOK1细胞为原始细胞的基础上构建工程细胞也应当是最方便和合理的选择。但是，在此技术领域的一些信息得到，该融合蛋白在细胞表达阶段会出现不同程度的降解，所降解的GLP1FC在后续分离纯化制备中很难去除，不但影响到产品的生物学活性也会严重影响产品制备的得率，其原因在于GLP1FC融合蛋白中N端最关键的GLP1部分的31个氨基酸很不稳定，容易被细胞凋亡裂解后释放的。
13、蛋白酶的水解作用而降解。QIAOZHENLU等人在文献CHARACTERIZATIONOFTHEPROTEASESINVOLVEDINTHENTERMINALCLIPPINGOFGLUCAGONLIKEPEPTIDE1ANTIBODYFUSIONPROTEINS中提到，GLP1FC在CHOS细胞系中表达最多会出现超过50的不完整形态，即降解条带。由于在细胞发酵过程中产生的N端出现降解的GLP1FC融合蛋白必须在最终药品的制造过程中有效去除，导致合格终产品的得率在1050之间。说明书CN104293834A2/18页50006在同一篇文章中提到细胞培养过程中添加蛋白酶抑制剂盐酸苯甲脒控制降解，但。
14、对产品的成药还是增加了风险，在后续的工艺中要对蛋白酶抑制剂进行灭活及根除也会使得整个产品的制备工艺更加复杂和不经济，而且添加蛋白酶抑制剂只能降低GLP1FC分子N端降解的程度，不能有效抑制其发生，不能真正解决降解问题。另一种去除GLP1FC分子N端降解产物的方法是使用多种色谱柱层析进行多步骤的纯化，虽然也能得到非常纯的GLP1FC融合蛋白，但是全过程的产率大大下降至20以下，大大低于治疗性抗体药物大于70的得率水平。发明内容0007鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，用于解决现有技术中的问题。本发明发明人将GLP1FC表达质粒。
15、DNA导入不同的哺乳动物细胞系中，惊奇的发现在CHO细胞系DXB11中所表达的GLP1FC融合蛋白无降解出现，以至于合格终产品的得率大于70。0008为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤00091将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白GLP1FC编码序列克隆至表达载体中；00102将表达载体转染CHODXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株；00113使用步骤2所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。0012优选的，所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白由重组人胰高血糖素样肽1GLP1或其类似物通过连接肽与。
16、具有延长人体内半衰期作用的抗体FC片段连接形成。0013更优选的，所述GLP1或其类似物的氨基酸序列与SEQIDNO14GLP1原型序列具有80以上的同源性，更优选的，具有90以上的同源性，进一步优选为具有97以上的同源性。0014更优选的，所述GLP1或其类似物的具体序列如SEQIDNO14、SEQIDNO1或SEQIDNO2所示。0015更优选的，所述连接肽的氨基酸数量为2个，所述连接肽由甘氨酸GLY和丝氨酸SER组合而成。0016更优选的，所述连接肽的氨基酸数量为636个。0017更优选的，所述连接肽的氨基酸数量为1436个。0018更优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO38所。
17、示。0019进一步优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO7所示。0020更优选的，所述抗体FC片段为本领域的不具ADCC效应子功能的非裂解性FC。0021进一步优选的，所述抗体FC片段的氨基酸序列如SEQIDNO9所示。0022在本发明的优选实施例中，所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO10和SEQIDNO11所示；所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列如SEQIDNO12和SEQIDNO13所示。0023优选的，所述表达载体选自DHFR系统的表达载体和/或GS系统的表达载体。说明书CN104293834A3/18页60024进一步优选。
18、的，所述DHFR系统的表达载体选自PIRESDHFR，所述GS系统的表达载体选自PEE124。0025优选的，所述将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白GLP1FC编码序列克隆至表达载体中的方法具体为在GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列的两端设计与载体的多克隆位点所对应的酶切位点，再将编码序列与载体上所对应的酶切位点连接，实现目标蛋白编码DNA片段与表达载体的连接。0026进一步优选的，所述将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白GLP1FC编码序列克隆至表达载体中的方法具体为将GLP1FC融合蛋白的编码序列两端设计了NHEI和MLUI两个酶切位点，分别与表达载体上的NHE。
19、I和MLUI酶切位点连接，实现目标蛋白编码DNA片段与表达载体的连接。0027优选的，所述将表达载体转染CHODXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株的方法具体为使用DNA转染试剂将质粒DNA转染CHODXB11细胞，传代培养后通过测定融合蛋白的表达量，从而筛选出阳性细胞形成细胞株。0028进一步优选的，所述测定融合蛋白的表达量的具体方法为针对GLP1的点印迹、针对GLP1的WESTERNBLOTTING免疫印迹法和针对FC片段的ELISA方法进行检测中的一种或多种的组合，从而测定融合蛋白的表达量。0029优选的，所述细胞表达的方法为适用于CHODXB11细胞的细胞表达方法。0030更优选的，所。
20、述细胞表达的方法具体为将筛选出的阳性细胞株进行无血清驯化，然后接种至摇瓶中摇床培养，将所得培养液离心取上清液进行蛋白纯化。0031更有选的，所述摇床培养的步骤优选为温度365375，4852的CO2环境中摇床培养至密度达到3545106，将温度降低至315325，每天补充养料，56天后细胞活率降低至8085停止培养。0032更有选的，所述将所得培养液离心取上清液进行蛋白纯化的步骤优选为，将所得培养液10003000RCF离心取出细胞后，再40006000RCF离心取上清进行蛋白纯化。0033优选的，所述纯化的具体为通过膜过滤、亲和层析柱和凝胶过滤层析进行纯化。0034本发明第二方面提供CHOD。
21、XB11细胞株在GLP1蛋白制备领域的用途。0035优选的，所述用途具体为在GLP1FC融合蛋白制备领域的用途。0036本发明第三方面提供一种融合蛋白，由所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法制备获得。0037本发明第四方面提供一种药物组合物，包括有效剂量的所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白。0038优选的，所述组合物还可包括本领域的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、增稠剂等，并可被制备成如片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液或悬浮液等各种本领域技术人员所熟知的药剂类型。0039本发明第五方面提供一种重组的CHODXB11宿主细胞，所述宿主细胞含有GLP1或其类似物与抗体FC片段。
22、融合蛋白的表达载体，所述表达载体具体为包含GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列的表达载体。0040本发明发明人针对目前GLP1融合蛋白，特别是与抗体FC片段相融合的GLP1FC分子在动物细胞中的表达普遍会出现被蛋白酶作用而发生降解的情况降解片段的出现说明书CN104293834A4/18页7势必会给下游的分离纯化带来很大的影响，降低产品的质量和制备的得率，通过添加蛋白酶抑制剂可以部分抑制，但不能完全解决GLP1FC分子在细胞培养过程中发生降解的问题；添加的蛋白酶抑制剂需要在后续纯化过程中有效去除，增加了纯化的难度，提供一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法。本发明所。
23、提供的制备方法在CHO细胞系DXB11中表达GLP1FC分子，不会产生降解问题，后续的纯化得率大大提高，生物学活性并未减弱，非常适合工艺业化生产需求。附图说明0041图1显示为本发明工艺流程图。具体实施方式0042本发明发明人将GLP1FC表达质粒DNA导入不同的哺乳动物细胞系中，惊奇的发现在CHO细胞系DXB11中所表达的GLP1FC融合蛋白无降解出现，以至于合格终产品的得率大于70，在此基础上完成了本发明。0043本发明提供一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法，包括如下步骤00441将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白GLP1FC编码序列克隆至表达载体中；00452。
24、将表达载体转染CHODXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株；00463使用步骤2所得细胞表达、纯化后，即得所述融合蛋白。0047本发明所提供的GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法中，GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白由重组人胰高血糖素样肽1GLP1或其类似物通过连接肽与具有延长人体内半衰期作用的抗体FC片段连接形成。0048在GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白中，GLP1的类似物可以是重组GLP1，GLP1或其类似物的氨基酸序列与SEQIDNO14GLP1原型序列具有80以上的同源性，更优选的，具有90以上的同源性，进一步优选为具有97以上的同源性。对于GLP1类似物。
25、如旨在提高GLP1分子性能从而对GLP1分子进行增加其生物学活性、降低其免疫源性、等的任何修饰所获得的GLP1类似物与抗体FC片段融合蛋白而言，当GLP1或其类似物的氨基酸序列与原型GLP1同源性80优选为90，进一步优选为97，都可以在DXB11原始细胞中获得稳定的表达，而不用担心蛋白酶的水解作用而降解的问题，从而在增加生物学性能的同时还能保证很高的产率。具体来说，由于GLP1蛋白产物降解其主要原因来自于N端最关键的GLP1部分的31个氨基酸很不稳定，容易被细胞凋亡裂解后释放的蛋白酶的水解作用而降解，所以当对原型GLP1分子进行修饰后，理论上只会使得GLP1分子被降解的几率降低，其原因在于修。
26、饰后形成新的降解位点的几率是非常低的。具体如美国礼来公司的GLP1FC产品DULAGLUTIDE就通过分子修饰，使GLP1FC产品的稳定性有所提升的同时还不影响GLP1的生物学活性。所以对于本领域技术人员而言应当能够理解的是，当本发明所提供的GLP1FC融合蛋白的制备方法能够稳定表达具有GLP1原型序列、及与原型序列具有97以上的同源性序列SEQIDNO1、具有90以上的同源性序列SEQIDNO2的GLP1FC时，该制备方法能够稳定表达具有说明书CN104293834A5/18页8相当或略低的同源性的其他GLP1修饰片段的融合蛋白是可以预期的。0049在本发明一优选实施例中，所述GLP1或其类。
27、似物的氨基酸序列如SEQIDNO14、SEQIDNO1或SEQIDNO2所示。0050在GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白中，连接肽可以是本领域的各种连接肽，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。优选的，所述连接肽由甘氨酸GLY和丝氨酸SER组合而成，所述连接肽并非GLY和SER的任意组合，而是普遍采用以G4S即氨基酸序列GGGGS为单位的多单位连接实现，此类连接肽的设计原则已经是本领域人员的公知技术。具体可参见CN102875683B，CN102875683B，申请号2011101932103等现有技术。连接肽的氨基酸数量为2个，更优选的为636个，进一步优选为1436个。0051在本。
28、发明一优选实施例中，连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO38所示。0052在本发明一最优实施例中，连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO7所示。0053在GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白中，抗体FC片段为本领域的不具ADCC效应子功能的非裂解性FC，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。由于与GLP1或其变构体通过柔性连接肽相连的FC片段来源于免疫球蛋白IGG的恒定区，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。在四种人IGG亚型中，IGG1和IGG2，IGG3，IGG4均可以与GLP1或其变构体通过柔性连接肽结合。FC融合主要是为了增加它的体内循环半衰期和降低生产成本，而FC介导的“抗体依赖细胞。
29、介导的细胞毒性作用”ANTIBODYDEPENDENTCELLMEDIATEDCYTOTOXICITY，ADCC功能是不必要的，甚至可能产生有害副作用。为了得到不具ADCC效应子功能的非裂解性FC，本发明发明人对人的IGG4的FC片段P01861_IGHG4三个位点进行了修饰，第一个修饰是FC氨基酸序列按照EU编号系统的S228P，此修饰可以稳固链间二硫键的结构从而达到稳定二聚体结构的作用；第二个修饰是EU编号系统的L235E，此修饰彻底消除FC片段FCR的结合，从而将ADCC降到最低。第三个修饰是EU编号系统的L445P，这个修饰使IGG4的FC的C端氨基酸序列与IGG1和IGG2的FC的C。
30、端氨基酸序列相同，从而增加C端氨基酸序列的均一性。我们这个修饰后的FC序列命名为“IGG4S228P，L235E，L445P”，其中IGG4后面括号中的氨基酸根据EU编号。0054在本发明一优选实施例中，抗体FC片段的氨基酸序列如SEQIDNO9所示。0055在本发明一优选实施例中，所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO10和SEQIDNO11所示；所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列如SEQIDNO12和SEQIDNO13所示。0056本发明所提供的GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法中，表达载体可选自本领域适合CHODXB11。
31、细胞表达的载体系统，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。优选的，所述表达载体选自DHFR系统的表达载体和/或GS系统的表达载体。0057在本发明一优选实施例中，DHFR系统的表达载体如PIRESDHFR，GS系统的表达载体如PEE124。0058本发明所提供的GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法中，将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白GLP1FC编码序列克隆至表达载体中的方法只要不对本发明的发明目的产生限制即可。具体来说，可以在GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列的两端设计与载体的多克隆位点所对应的酶切位点，再将编码序列与载体上所对应的酶切位点连接，实现目标蛋。
32、白编码DNA片段与表达载体的连接。说明书CN104293834A6/18页90059在本发明一优选实施例中，将GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白GLP1FC编码序列克隆至表达载体中的方法具体为将GLP1FC融合蛋白的编码序列两端设计了NHEI和MLUI两个酶切位点，分别与表达载体上的NHEI和MLUI酶切位点连接，实现目标蛋白编码DNA片段与表达载体的连接。0060本发明所提供的GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法中，将表达载体转染CHODXB11细胞，培养并筛选出阳性细胞株的方法只要不对本发明的发明目的产生限制即可。0061在本发明一优选实施例中，将表达载体转染CHODX。
33、B11细胞，培养并筛选出阳性细胞株的方法具体为使用DNA转染试剂将质粒DNA转染CHODXB11细胞，传代培养大约3周后，通过测定融合蛋白的表达量，从而筛选出阳性细胞形成细胞株。0062所述通过测定融合蛋白的表达量具体方法为通过针对GLP1的点印迹、WESTERNBLOTTING免疫印迹法和针对FC片段的ELISA方法进行检测，从而测定融合蛋白的表达量。此外，通过针对GLP1的WESTERNBLOTTING免疫印迹法，亦证实了GLP1蛋白的正确表达。0063本发明所提供的GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法中，细胞表达的方法只要不对本发明的发明目的产生限制即可，具体来说，可选用本。
34、领域适用于CHODXB11细胞的细胞表达方法。优选的，所述细胞表达的方法具体为将筛选出的阳性细胞株进行无血清驯化，然后接种至摇瓶中摇床培养，将所得培养液离心取上清液进行蛋白纯化。0064所述摇床培养的步骤优选为温度365375，4852的CO2环境中摇床培养至密度达到3545106，将温度降低至315325，每天补充养料，56天后细胞活率降低至8085停止培养。0065所述将所得培养液离心取上清液进行蛋白纯化的步骤优选为，将所得培养液10003000RCF离心取出细胞后，再40006000RCF离心取上清进行蛋白纯化。0066在本发明一优选实施例中，细胞表达的方法具体为将筛选出的阳性细胞株进行。
35、无血清驯化，以2105密度传代至1L摇瓶中，温度37，5的CO2环境中，120RPM摇床培养至密度达到4106，将温度降低至32，每天补充葡萄糖、氨基酸等养料，56天后细胞活率降低至8085停止培养；将细胞液2000RCF离心取出细胞后，再5000RCF离心取上清进行蛋白纯化。0067本发明所提供的GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法中，对于融合蛋白的纯化方法并没有具体限制，只要不对本发明的发明目的产生限制即可。融合蛋白的纯化方法已经是本领域的现有技术，融合蛋白的纯化主要采用层析的方法纯化，例如使用阴离子交换层析或阳离子交换层析或采用凝胶过滤层析，或采用疏水层析，反相层析，还可以。
36、使用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析等，本领域技术人员可对上述所有纯化步骤进行适当的选择和组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。此外，利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱如重组的RPROTEINA,RPROTEING天然的NPROTEINA,NPROTEING或改进的耐碱型的MABSELECTSURE对表达的融合蛋白进行纯化亦可被用来纯化所述融合蛋白。0068在本发明一优选实施例中，纯化具体为通过膜过滤、亲和层析柱和凝胶过滤层析进行纯化。说明书CN104293834A7/18页100069本发明还提供所述CHODXB11细胞株在GLP1蛋白制备领域的用途，所述用途优选为在GLP。
37、1FC融合蛋白制备领域的用途，具体为通过CHODXB11细胞株细胞株表达GLP1FC融合蛋白。0070所述GLP1FC融合蛋白为GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白。0071所述GLP1或其类似物的氨基酸序列与SEQIDNO14GLP1原型序列具有80以上的同源性，更优选的，具有90以上的同源性，进一步优选为具有97以上的同源性。0072本发明还提供一种融合蛋白，由所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法制备获得。0073本发明还提供一种药物组合物，包括有效剂量的所述GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白。所述组合物还可包括本领域技术人员常用的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂、。
38、增稠剂等，并可被制备成如片剂、胶囊、粉末、糖浆、溶液或悬浮液等各种本领域的药剂类型。0074本发明发明人针对目前GLP1融合蛋白，特别是与抗体FC片段相融合的GLP1FC分子在动物细胞中的表达普遍会出现被蛋白酶作用而发生降解的情况降解片段的出现势必会给下游的分离纯化带来很大的影响，降低产品的质量和制备的得率，通过添加蛋白酶抑制剂可以部分抑制，但不能完全解决GLP1FC分子在细胞培养过程中发生降解的问题；添加的蛋白酶抑制剂需要在后续纯化过程中有效去除，增加了纯化的难度，提供一种GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的制备方法。本发明所提供的制备方法在CHO细胞系DXB11中表达GLP1FC分子。
39、，不会产生降解问题，后续的纯化得率大大提高，生物学活性并未减弱，非常适合工艺业化生产需求。0075本发明进一步提供一种重组的CHODXB11宿主细胞，所述宿主细胞含有GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白的表达载体，所述表达载体具体为包含GLP1或其类似物与抗体FC片段融合蛋白编码序列的表达载体。0076以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。0077在进一步描述本发明具体实。
40、施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。0078当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的。
41、方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。0079除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技说明书CN104293834A108/18页11术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见SAMBROOK等MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL，SECONDEDITION，COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989ANDTHIRDEDITION，2001；AUSUBEL等，CUR。
42、RENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JOHNWILEYSONS，NEWYORK，1987ANDPERIODICUPDATES；THESERIESMETHODSINENZYMOLOGY，ACADEMICPRESS，SANDIEGO；WOLFFE，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，THIRDEDITION，ACADEMICPRESS，SANDIEGO，1998；METHODSINENZYMOLOGY，VOL304，CHROMATINPMWASSARMANANDAPWOLFFE，EDS，ACADEMICPRESS，SANDIEGO，1999；和M。
43、ETHODSINMOLECULARBIOLOGY，VOL119，CHROMATINPROTOCOLSPBBECKER，EDHUMANAPRESS，TOTOWA，1999等。0080实施例10081重组人GLP1FC融合蛋白的编码序列00821GLP1的氨基酸构成0083天然的GLP1及其任何改构的GLP1分子均可通过不同的柔性连接肽与不同的FC片段，如IGG1，IGG2，IGG3，IGG4及改构的等连接形成融合蛋白，这些融合蛋白均有生物学活性和长效性。0084天然的GLP1的氨基酸序列如下0085HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSEQIDNO14。0086本发明的。
44、融合蛋白分子是在原形GLP1分子基础上进行过修饰的变异体，具体为在原形GLP1分子的31个氨基酸基础上进行了两种不同修饰的变异体，其名称和分子结构分别为0087分子名称G131个氨基酸的GLP1分子中有1个氨基酸修饰0088修饰GLY8GLP1737，原形GLP1的第一个氨基酸编号为7第7位，则第8位的氨基酸实际对应为第二个氨基酸更改为GLY。具体序列如SEQIDNO1所示0089HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGSEQIDNO10090分子名称G331个氨基酸的GLP1分子中有3个氨基酸修饰0091修饰GLY8GLU22GLY36GLP1737，原形GLP1的第一。
45、个氨基酸编号为7，则第8，22，36位的氨基酸分别更改为GLY，GLU，GLY。具体序列如SEQIDNO2所示0092HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGSEQIDNO200932柔性连接肽序列0094此处连接肽氨基酸数目从2个到31个，主要为甘氨酸GLY和丝氨酸SER相互组合。0095含有6个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSSEQIDNO3，命名为“L1”；0096含有11个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSSEQIDNO4，命名为“L2”；0097含有16个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSSEQIDNO5，命名为“L3”；0。
46、098含有21个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQIDNO6，命名为“L4”；0099含有26个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQIDNO7，命名为“L5”；说明书CN104293834A119/18页120100含有31个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQIDNO8，命名为“L6”。0101柔性连接肽L5为优选方案。实验表明用此柔性连接肽表达的GLP1FC检测生物学活性最高。01023IGG4的FC片段0103对人的IGG4的FC片段P01861_I。
47、GHG4三个位点进行了修饰，第一个修饰是FC氨基酸序列按照EU编号系统的S228P，第二个修饰是EU编号系统的L235E，第三个修饰是EU编号系统的L445P。我们这个修饰后的FC序列命名为“IGG4S228P，L235E，L445P”，具体序列如SEQIDNO9所示0104SKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW。
48、ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO901054两种融合蛋白的氨基酸序列0106两种不同的GLP1变构体序列与柔性连接肽和IGG4FC所形成的两种蛋白氨基酸序列分别为0107命名G1L5FC；0108结构G1L5IGG4S228P，L235E，L445P，具体序列如SEQIDNO10所示0109HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV。
49、TCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO100110命名G3L5FC；0111结构G3L5IGG4S228P，L235E，L445P，具体序列如SEQIDNO11所示0112HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO1101。