一种质粒及其构建方法和在艾滋病毒载量测定上的应用 本发明涉及一种质粒及其构建方法和在艾滋病毒载量测定上的应用，属艾滋病防治领域。
艾滋病(AIDS)是由I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的破坏机体免疫系统的致死疾病。自1985年我国发现首例艾滋病人以来，该病在全国迅速蔓延，现已进入高速增长期，艾滋病的防治已成为关系到国计民生的大事。艾滋病的临床治疗，及抗艾滋病新药和疫苗的发现与研究，需要一客观、可靠的指标来评判HIV感染者的病程和预后。已有的血清p24抗原水平检测、逆转录酶活性测定、病毒分离培养等方法也能在一定程度上反映患者体内病毒数量的变化，但以上方法干扰因素多，费时费力且灵敏度较低。大量研究表明，HIV-1病毒载量的变化是HIV-1感染者病程和预后判断的最客观依据，已商品化的定量检测HIV-1的技术有：聚合酶链反应(PCR)(Amplicor HIV-1Monitor test；Roche)、NASBA和b-DNA。Roche公司的Amplicor Monitor test(PCR)是FDA批准的唯一用于临床检测HIV-1的试剂盒。该检测试剂盒价格十分昂贵(每个样品的检测费用在200至500美元之间)，技术要求高。现有地方法有的只能在极少数实验室开展，因此难以广泛应用于临床和科学研究。
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种操作简单，价格便宜，特异性好，灵敏度高，同时有较好的可重复性的质粒及其构建方法和在艾滋病毒载量测定上的应用。
本发明是这样实现的：质粒为pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486。
pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486的构建方法，是将8E5细胞含有的单拷贝HIV-1前病毒DNA进行Sal I/Sac I双酶切，与被同样双酶切的购自Promega公司的pSP64Poly(A)质粒发生粘性末端连接，得到含有HIV-1gag基因片断的pSPgag737重组质粒，转化至JM109感受态细胞，经酶切/PCR鉴定，得到阳性克隆子。体外转录阳性克隆子，获得病毒载量定量测定的RNA外参照。
pSPgag737/JM109 CGMCC NO.0486在艾滋病毒载量测定上的应用：应用 1、2的外参照，将聚合酶链反应技术与柯达电泳图谱分析系统相结合，建立测定HIV-1感染者和艾滋病人血浆的病毒载量定量测定的方法。
附图1为pSPgag737质粒的构建。
附图2为带酶切位点的GAG1/GAG2为引物的聚合酶链反应(PCR)扩增结果
附图2中1：扩增产物(8E5细胞DNA为模板)；2：DL2000分子量标准。
附图3为重组质粒的酶切电泳分析图谱。
附图3中1：λDNA/EcoRI+Hind III分子质量标准；2：重组质粒；3：重组质粒经EcoRI酶切；4：重组质粒经BamHI酶切。
附图4是重组质粒为模板的PCR扩增结果。
附图4中1：DL2000分子质量标准；2：引物sk38/sk39的PCR扩增产物(115bp)；3：引物sk145/sk431的PCR扩增产物(142bp)；4：引物GAG1/GAG2的PCR扩增产物(721bp)。
附图5为病毒载量测定PCR扩增结果。
附图5中1：pGEM-7zf/HeaIII分子质量标准；2：阳性对照；3：阴性对照；4～9：十倍稀释的外参照6个梯度(1-105)；10：病人A的含HIV-1样品；11：病人B的含HIV-1 RNA样品；12：健康人血浆样品。
附图6为外参照工作曲线。
附图6中其线性系数为0.96，其回归方程为Y(Mass)＝25.46X(Log Inputcopies)+18.13
以下结合附图对本发明的技术方案作进一步详述：
该质粒为pSPgag737 CGMCC NO.0486。该质粒鉴定为pSPgag737的理由是它的基因组内插入了HIV-1gag基因片断。其分类性质为含有SP6 RNA聚合酶启动子和(dA：dT)30的质粒。作为判断基准的有关文献是GenBank/EMBL Accession Number：X65328。
1. pSPgag737质粒的构建
用分别引入Sal I和Sac I酶切位点的引物GAG1(上游，5′GCAACCCTCTTATTGTGTG3′，1043-1060)/GAG2(下游，5′CCAACAAGGTTTCTGTCATC3′，1763-1744)扩增8E5细胞前病毒DNA，经Sal I和Sac I双酶切后，酶切片段通过低熔点琼脂糖回收纯化，与经过同样双酶切的购自Promega公司的质粒pSP64Poly(A)发生粘端连接，从而构建成重组的新质粒pSMgag737(如图1)。
2.制备宿主大肠杆菌JM109的感受态细胞，完成pSPgag737质粒对感受态细胞的转化反应，利用氨卞抗性和蓝白斑双筛选获得阳性重组子。提取质粒，因重组质粒保留了原EcoR I酶切位点，而消除了BamHI酶切位点，可酶切鉴定。GAG1/GAG2引物的扩增产物包含SK38(上游，5′ATTAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT3′，1551-1578)/SK39(下游，5′TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC3′，1665-1638)，SK145(上游，5′AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT3′，1366-1395)/SK431(上游，5′GCTATGTCAGTTCCCCTGGTTCTC3′，1507-1481)两对通用引物的扩增靶序列，将酶切鉴定后的质粒DNA作为模板，分别用sk145/sk431和sk38/sk39进一步作PCR扩增鉴定。
(1)GAG1/GAG2扩增获得的克隆片断的PCR电泳结果表明：用GAG1/GAG2扩增HIV-1 gag保守序列产生特异条带(图2)，条带大小与预期结果一致
(2)pSPgag737质粒酶切鉴定及PCR扩增鉴定分别用EcoRI和BamHI酶切质粒DNA后，EcoRI能将质粒酶切成线状，而BamHI因重组后酶切位点消失而无法切割，线性质粒大小也在4268bp和3530bp条带之间，与预期的设计完全一致(图3)。以克隆质粒为模板，分别以sk38/sk39、sk145/sk431及GAG1/GAG2为引物进行PCR扩增，均产生特异扩增产物(图4)。进一步说明质粒克隆成功，并含特异克隆片断。
3.制备HIV-1病毒载量定量测定的外参照pSPgag737质粒用EcoRI在克隆片断的下游将质粒酶切成线性，用线性质粒作为模板进行体外转录，具体方法参照宝生物公司SP6 RNA聚合酶转录试剂盒说明书进行，RNA转录产物用紫外分光光度计定量，十倍系列稀释至1拷贝/ml，获得HIV-1病毒载量定量测定的外参照。
4. HIV-1病毒RNA的提取血清学检测为阳性的艾滋病人静脉采血，EDTA抗凝，离心后获血浆。取血浆200μl，以异硫氰酸胍一部法提取HIV-1RNA，异丁醇/醋酸钠沉淀后，以50μl RNase free水溶解。
5. HIV-1病毒载量(Viral load)的测定分别取十倍系列稀释的外参照RNA(1～105拷贝/μl)和样品RNA作为模板，用sk145/sk431为引物，依购自宝生物公司的BcaBEST TM RNA PCR Kit说明书进行扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以pGEM-7zf/HaeIII为Marker，EB染色后用Kodak凝胶图谱分析系统进行定量测定。根据不同拷贝数的外参照，其扩增产物电泳条带的光强度(Intensity)或含量(Mass)不同，在Excell中作出Mass-Input copies工作曲线。据样品扩增产物电泳条带含量(Mass)，在工作曲线中查出被测样品核酸的初始拷贝数，进而计算出单位体积血浆中的病毒载量。
如上述PCR扩增结果(图5)所显示：外参照Mass随Log(Input copies)的增大而递增。利用Excel作出的的工作曲线有好的线性关系(r＝0.96)，其回归方程为Y(Mass)＝25.46X(Log(Input copies))+18.13，据此回归方程计算出病人的病毒载量分别为4.55×105Copies/ml血浆和7.55×104Copies/ml血浆，健康人未测出HIV-1病毒。
本发明的结果表明，当以重组pSPgag737转录的RNA作为测定病毒载量的外参照时，RNA参照包含有sk38/sk39和sk145/sk431引物扩增的靶序列。它的检测灵敏度高，一个反应管内初始拷贝数低至10拷贝/μl甚至1拷贝/μl的RNA时都能很好地扩增，扩增效果和特异性都好。
在建立定量PCR方法的过程中，比较了两对引物的扩增结果，证明用sk145/sk431引物扩增效果比sk38/sk39好，工作范围更大，扩增特异性更好(数据为列出)。目前商品化的试剂Amplicor Monitor test和Nucisens的检测范围分别是：50-50,000拷贝/ml、40-105拷贝/ml，QUANTIPLEX的检测下限为500拷贝/ml。本研究建立的定量PCR方法检测范围是：10-109拷贝/ml(DNA样品)；5-106拷贝/ml(RNA样品)。如果采用高速离心浓缩样品内的病毒核酸，检测下限将能进一步提高。经对10个未知样品的三次重复测定，方法本身造成的变异系数低于35％。 样品号 第一次测定 第二次测定 第二次测定 变异系数(CV％) S1 3.92×105 4.33×105 4.81×105 10.23 S2 0.98×105 0.76×105 1.28×105 25.9 S3 0.92×105 0.51×105 0.64×105 30.36 S4 0.07×105 0.04×105 0.05×105 28.71 S5 2.42×105 1.74×105 1.62×105 22.39 S6 1.14×105 0.96×105 0.78×105 18.75 S7 1.26×105 0.89×105 1.10×105 17.13 S8 3.25×105 2.87×105 2.54×105 12.31 S9 5.38×105 4.76×105 5.15×105 6.15 S10 0.61×105 0.87×105 0.50×105 28.79
采用本发明的技术方案，检测一个样品的试剂成本约50元人民币，除PCR仪之外，一套Kodak电泳图谱分析系统和电脑约需3～4万元左右，一般临床和研究机构都可以购买得起，操作比较简易。
本发明与现有技术相比，具有操作简单，价格便宜，特异性好，灵敏度高，同时有较好的可重复性，将为艾滋病的防治和科学研究提供有力工具。