突变型鸡Myostatin和该基因的检测方法及在鸡育种中的应用 技术领域：本发明涉及鸡遗传育种改良的生物技术，具体说是肌肉生长抑制素(Myostatin)基因单核苷酸多态性检测分析方法及在鸡遗传育种改良中的应用。
背景技术：我国是一个家禽生产的大国，禽蛋生产量列世界首位，禽肉产量列世界第二位。然而，从我国家禽良种覆盖率来看仍然偏低，优良鸡种，尤其是蛋鸡和白羽肉鸡主要是以进口品种为主，因此畜牧生产的总体效益不高。由于对肉鸡生长速度过高追求，带来的问题是肉鸡的脂肪含量越来越高，品质越来越差，沉积过多的脂肪，影响了饲料转化率，蛋鸡生产也存在蛋料比偏低的问题，而利用分子遗传学及标记辅助选择育种方法相结合，无疑对解决上面的问题提供了最佳的途径。对于我国的肉鸡生产，主要有快大型的肉鸡和优质鸡的生产。快大型的肉鸡品种基本上是由国外进口地鸡种为主，年产量为20亿只。而作为我国最具有特色的优质鸡，具有良好的发展势头，由我国的南方开始向全国扩展。肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又称GDF-8(Growth Differentiation Factor 8)，是McPherron等(1997)首先从小鼠骨骼肌cDNA文库中克隆的一个新基因。蛋白质同源性比较证明，肌肉生长抑制素属于TGF-β(Transforming Growth Factorβ，转化生长因子β)超家族中的一个新成员但不属于已发现的亚家族。进一步研究发现，肌肉生长抑制素主要在小鼠的骨骼肌中表达，而且利用基因敲除技术研究它的功能发现，MSTN基因敲除鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，其肩、臀部的肌肉明显肥大，整个身体的骨骼肌都比野生型的小鼠大得多，单块肌肉的重量约为野生小鼠的2～3倍，从而导致了体重的增加。突变型小鼠骨骼肌纤维的数目比野生小鼠高出86％(P＜0.01)，表明突变小鼠骨骼肌肥大的原因既有肌细胞的增生，也有肌纤维的肥大。但在其他生长发育性状上没有发现任何表现型的差异。以上结果表明，MSTN在调控骨骼肌肉的生长发育中起着十分重要的作用。MSTN的功能也在比利时蓝牛得到了验证。经长期遗传选育的比利时蓝牛具有十分强壮的骨骼肌，比其他品种高20％。对双肌牛品种比利时蓝牛(Belgian Blue)和皮尔蒙特牛(Piedmontese)MSTN基因的分子生物学分析证明，比利时蓝双肌牛在MSTN基因外显子III缺失11bp，造成移码突变，使得从缺失后面的第14个密码子开始停止翻译，其结果是C-端仅7个氨基酸得到翻译其余102个氨基酸全部丢失，无法产生具有生物学活性的肌肉生长抑制素。
发明内容：本发明研制一种准确、简单、迅速、直接检测Myostatin基因单核苷酸多态性方法，利用该方法可以对种鸡进行遗传标记辅助选择育种，从而可以从根本上解决传统遗传育种中由于对肉鸡生长速度过高追求，带来的问题(如，肉鸡的脂肪含量越来越高，品质越来越差，沉积过多的脂肪，影响了饲料转化率，蛋鸡生产也存在蛋料比偏低等)。本发明的突变型鸡的Myostatin基因的核苷酸多态性为：G→A(304位)，A→G(322位)，C→T(334位)，G→A(167位)，7263A→A。本发明的突变型鸡的Myostatin基因的检测方法的具体步骤是：
第一步：PCR引物的设计
根据本实验室克隆的鸡Myostatin基因组全序列设计了3对引物如下：
P60 5′-TCCTATCAGG AAACCTATC-3′
P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′
P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′
P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′
P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′
P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′
第二步：鸡基因组DNA的提取；
第三步：PCR扩增，PCR扩增反应体系为10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序为94℃ 5min 1个循环；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35个循环；72℃ 8min 1个循环；4℃保温。
第四步：SSCP分析，1μl PCR产物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃变性10min，冰浴5min，经14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝29∶1)电泳分析(10V/cm、10h)后银染显色。
上述鸡基因组DNA的小量提取步骤操作简便、所需仪器药品投入少，适于养鸡现场使用；上述PCR反应体系为本发明的一部分，是检测鸡Myostatin基因单核苷酸多态性的优化PCR方法。
本发明的结果：
一、利用上述本发明的方法发现了鸡Myostatin基因单核苷酸多态性。
采用引物P80/P81进行PCR-SSCP分析，我们发现3种基因型(图1)。发现该片段中有3个核苷酸发生了突变，分别是G→A(304位)，A→G(322位)，C→T(334位)，这些突变导致了Myostatin 5’-调控区呈现出多态性(图2)。将与GenBank具有相同序列的定义为AA型，突变型定义为BB型。
利用引物P93/P94，对该PCR产物的SSCP分析，我们发现3种基因型(图3)。将两种纯合基因型片段进行回收、克隆和测序比较发现该片段中有1个核苷酸是G→A(167位)发生了突变(图4)。同样，将与与GenBank具有相同序列的定义为FF型，突变型定义为EE型。
用引物P80/P81进行PCR-SSCP分析，我们发现3种基因型(图5)。对两种纯合基因型的片段进行回收、克隆、测序比较发现，该片段中第7263位核苷酸A突变为T，因而造成Myostatin 3’-调控区的多态性(图6)。将与GenBank具有相同序列的定义为CC型，突变型定义为DD型。
二.发现了Myostatin基因单核苷酸多态性与生产性能间的关系
我们对所发现的Myostatin单核苷酸多态性与初生重、屠体重、胸肌重、腿肌重、肝重和腹脂重等性状的关系进行了最小二乘方差分析。我们发现，P60/61位点基因型对12周龄腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌率有影响(P＜0.05)：AA型与BB型的腹脂重差异显著(P＜0.05)；AA和AB型腹脂率显著高于BB型(P＜0.05)；AA型的初生重显著高于BB型(P＜0.05)；AA型胸肌率显著高于AB型(P＜0.05)(表1)。P93/94位点与胸肌重有显著相关(P＜0.05)：EF型比EE型具有更高的胸肌重(表2)。P80/P81位点与胸肌重(P＜0.05)和胸肌率(P＜0.01)相关：CC型与DD型之间的胸肌重差异显著(P＜0.05)，CC型的胸肌重较高；CC型、DD型之间的胸肌率差异极显著(P＜0.01)，CC型和CD型之间差异显著(P＜0.05)，CC型比CD和DD型的胸肌率高，而CD型的胸肌率也比DD型的高(P＜0.05(表3)。
表1 P60/61引物不同基因型对初生重、腹脂重和腹脂率的影响
基因型 个体数 基因型频率 腹脂重 腹脂率 初生重 胸肌率
116 0.340 52.55± 0.0354± 30.79± 0.0613±
AA
3.38a 0.0022a 0.28a 0.001a
187 0.548 49.10± 0.0353± 30.35± 0.0592±
AB
3.32ab 0.0022a 0.21ab 0.001b
38 0.111 43.34± 0.0294± 29.51± 0.0586±
BB
5.02b 0.0038b 0.45b 0.0015ab
注：均值比较时同一列字母相同者差异不显著(P＞0.05)
表2 P93/94引物不同基因型对初生重、腹脂重和腹脂率的影响
基因型 个体数 基因型频率 胸肌重
EE 170 0.499 86.70±3.32b
EF 131 0.384 93.23±3.50a
FF 40 0.117 90.16±4.56ab
注：均值比较时同一列字母相同者差异不显著(P＞0.05)
表3 p80/81引物不同基因型对胸肌重和胸肌率的影响
基因型频率 胸肌重 胸肌率
CC 213 0.617 95.37±1.57a 0.0634±0.00058a
CD 126 0.365 89.93±2.12ab 0.0614±0.00078b
DD 6 0.017 84.49±7.29b 0.0544 ±0.00269c
注：均值比较时同一列字母相同者差异不显著(P＞0.05)
无论是快大型鸡还是优质鸡的育种，肌肉重和肌肉率都是很重要的选择指标，而直接对其测定不能实现，我们发明的鸡肌肉性状Myostatin基因的多态性标记，可以作为肉鸡育种中肌肉性状和脂肪性状的选择标记，在提高鸡的肌肉生长速度的同时，在一定程度上达到降低脂肪含量的目的。本方法只要检测基因型，通过提高肌肉率的优势，就可以提高群体的增重速度。检测方法简单、基因型容易判断，因此具有推广价值。
本发明的突变型鸡Myostatin基因的检测方法在鸡选择育种中的应用的具体步骤是：
第一步：PCR引物的设计
根据本实验室克隆的鸡Myostatin基因组全序列设计了3对引物如下：
P60 5′-TCCTATCAGG AAACCTATC-3′
P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′
P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′
P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′
P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′
P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′
第二步：鸡基因组DNA的提取；
第三步：PCR扩增，PCR扩增反应体系为10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序为94℃5min 1个循环；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35个循环；72℃ 8min 1个循环；4℃保温。
第四步：SSCP分析，1μl PCR产物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃变性10min，冰浴5min，经14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝29∶1)电泳分析(10V/cm、10h)后银染显色。
第五步骤：1、用引物P80/P81进行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型：
AA ATGGATTCCTCGTGTTTGCAATGTATTTATTACGTATT
BB ATAGATTCCTCGTGTTTGCAGTGTATTTATTATGTATT
2、用引物P93/P94进行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型：
EE ATTTTGATACTAAAGGGTCCAATAGTTA
FF ATTTTGATACTAGAGGGTCCAATAGTTA
3、用引物P80/P81进行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型：
CC TTGCTACAGAAATTGTTAAAAAAC
DD TTGCTACAGATATTGTTAAAAAAC
第六步骤：根据各基因型的以下特性选择需要的种鸡，
腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌率：AA＞AB＞BB
胸肌重：EF＞FF＞EE
胸肌重、胸肌率：CC＞CD＞DD。
禽肉已取代牛肉成为世界第二大消费肉类，据FAO统计，1993-1995年度全球平均每年人均消费禽肉9.1kg，而到2005年将增至13.7kg，发展中国家的消费将从5.7kg增加到10.2kg，这其中亚洲的增长是最快的。我国是一个家禽生产的大国，禽蛋、禽肉生产量列世界首位。鸡肉和鸡蛋生产在我国畜牧业生产中有着重要地位。然而，从我国家禽良种覆盖率来看仍然偏低，优良鸡种，尤其是蛋鸡和白羽肉鸡主要是以进口品种为主，因此畜牧生产的总体效益不高。由于对肉鸡生长速度过高追求，带来的问题是肉鸡的脂肪含量越来越高，品质越来越差，沉积过多的脂肪，影响了饲料转化率，蛋鸡生产也存在蛋料比偏低的问题，而利用分子遗传学及标记辅助选择育种方法相结合，无疑对解决上面的问题提供了最佳的途径。对于我国的肉鸡生产，主要有快大型的肉鸡和优质鸡的生产。快大型的肉鸡品种基本上是由国外进口的鸡种为主，年产量为20亿只，出口40万吨，创汇7亿美元。优质鸡是我国优秀地方鸡种选育而成的，具有肉质细嫩，味道鲜美的特点，具有良好的发展势头，优质肉鸡的生产和消费已从局部地区向全国各地扩散，并有部分出口，年出栏量达到15亿只，年出口3000万只活鸡，种鸡饲养量为2000万套。全国优质肉鸡生产的发展速度达到年增25％-30％，市场潜力巨大。
本发明的鸡的育种方法是一种准确、简单、迅速、直接检测Myostatin基因单核苷酸多态性方法，利用该方法可以对种鸡进行遗传标记辅助选择育种，从而可以从根本上解决传统遗传育种中由于对肉鸡生长速度过高追求，带来的问题(如，肉鸡的脂肪含量越来越高，品质越来越差，沉积过多的脂肪，影响了饲料转化率，蛋鸡生产也存在蛋料比偏低等)。因为，无论是快大型鸡还是优质鸡的育种，肌肉重和肌肉率都是很重要的选择指标，而直接对其测定不能实现，我们发明的鸡肌肉性状Myostatin基因的多态性标记，可以作为肉鸡育种中肌肉性状和脂肪性状的选择标记，在提高鸡的肌肉生长速度的同时，在一定程度上达到降低脂肪含量的目的。本方法只要检测基因型，通过提高肌肉率的优势，就可以提高群体的增重速度。检测方法简单、基因型容易判断，因此具有推广价值。
附图说明：图1是Myostatin基因5’-调控区的SNPs分析(P60/61)，图2是AA型和BB型Myostatin基因序列比较表(P60/P61)，图3是鸡Myostatin基因5’-调控区的SNPs分析(P93/P94)，图4是EE型和EF型Myostatin基因序列比较表(P93/P94)，图5是鸡Myostatin基因3’-调控区的SNPs分析(P80/P81)，图6是CC型和DD型Myostatin基因序列比较表(P80/P81)。
具体实施方式一：突变型鸡的Myostatin基因的检测方法的具体步骤是：
第一步：PCR引物的设计
根据本实验室克隆的鸡Myostatin基因组全序列设计了3对引物如下：
P60 5′-TCCTATCAGGAAAACCTATC-3′
P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′
P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′
P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′
P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′
P81 5′-AACATTTATTTACAAAATATTGATG-3′
第二步：鸡基因组DNA的小量提取，本方法操作简便、所需仪器药品投入少，便于在养鸡现场使用，其具体步骤如下：
取20μl新鲜血液，加ACD抗凝，加入600μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化6～10hr，直至溶液中不再有粘稠的团块，将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，反复颠倒离心管，直至两相混合形成乳浊液，12,000rpm，室温离心10min。取上清，再用等体积酚∶氯仿、氯仿各抽提1次。取上清加1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀DNA。将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗两次。将DNA干燥后(注意不能太干)溶于适量TE或灭菌双蒸水中。
第三步：PCR扩增，本PCR反应体系为本发明的一部分，是检测鸡Myostatin基因单核苷酸多态性的优化PCR方法，反应步骤如下：
PCR扩增反应体系为10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/L dNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序为94℃ 5min 1个循环；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35个循环；72℃ 8min 1个循环；4℃保温。
第四步：SSCP分析，1μl PCR产物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃变性10min，冰浴5min，经14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝29∶1)电泳分析(10V/cm、10h)后银染显色。
银染方法：电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70％乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10-15min；去离子水洗胶2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液(100ml银染液：NH3·H2O 1ml；3.6％NaOH 2.1ml；20％AgNO3 1.8ml；加去离子水至100ml)染色30min。去离子水洗胶3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml显色液(200ml显色液：1％柠檬酸钠1ml；甲醛100ul；加去离子水至200ml)显色，约10-30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液；去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。
具体实施方式二：鸡的育种方法：
第一步：PCR引物的设计
根据本实验室克隆的鸡Myostatin基因组全序列设计了3对引物如下：
P60 5′-TCCTATCAGGAAAACCTATC-3′
P61 5′-ACCTCAAGGAAAATTCTGAG-3′
P93 5′-CAACTTTCAGTAATAATGGAA-3′
P94 5′-TGATAGGTTTTCCTGATAGGTA-3′
P80 5′-CTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGC-3′
P81 5′-AACATTTATTTTACAAAATATTGATG-3′
第二步：鸡基因组DNA的提取，取20μl新鲜血液，加ACD抗凝，加入600μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化6～10hr，直至溶液中不再有粘稠的团块，将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，反复颠倒离心管，直至两相混合形成乳浊液，12,000rpm，室温离心10min。取上清，再用等体积酚∶氯仿、氯仿各抽提1次。取上清加1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀DNA。将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗两次。将DNA干燥后(注意不能太干)溶于适量TE或灭菌双蒸水中。
第三步：PCR扩增，PCR扩增反应体系为10×PCR buffer 2.5μl，10mmol/LdNTPs 2μl，20μmol/L上游引物1μl，20μmol/L下游引物1μl，Taq酶1.0U，15ng/μl DNA模板4.0μl，ddH2O 13.3μl。PCR程序为94℃ 5min 1个循环；94℃ 40s，57℃ 40s，72℃ 40s共35个循环；72℃ 8min 1个循环；4℃保温。
第四步：SSCP分析，1μl PCR产物和5μl Loading buffer(98％甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)混合，98℃变性10min，冰浴5min，经14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝29∶1)电泳分析(10V/cm、10h)后银染显色。
第五步骤：1、用引物P80/P81进行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型：
AA ATGGATTCCTCGTGTTTGCAATGTATTTATTACGTATT
BB ATAGATTCCTCGTGTTTGCAGTGTATTTATTATGTATT
2、用引物P93/P94进行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型：
EE ATTTTGATACTAAAGGGTCCAATAGTTA
FF ATTTTGATACTAGAGGGTCCAATAGTTA
3、用引物P80/P81进行PCR-SSCP分析被提取基因是否是以下型：
CC TTGCTACAGAAATTGTTAAAAAAC
DD TTGCTACAGATATTGTTAAAAAAC
第六步骤：根据各基因型的以下特性选择需要的种鸡，
腹脂重、腹脂率、初生重、胸肌率：AA＞AB＞BB
胸肌重：EF＞FF＞EE
胸肌重、胸肌率：CC＞CD＞DD。
本实施方式选择具有BB、EF和CC型基因的鸡为种鸡进行育种。这种鸡具有腹脂率低、胸肌率高的特点。
本发明的突变型鸡的Myostatin基因与基因库的Myostatin基因的核甘酸序列对比如下：
一、Myostatin基因5’启动子中的单核苷酸多态性
基因库序列 ACTATTTCTGTGTAATATTAGAGTTAAGTAGCTCATGATATTCCTTAAAAATACCTCTCCTACTAAAAGTCTCTCAGTATCTAATTTGCT 90
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 90
基因库序列 GCCCAGGATTTTGCTGACTAGGCAAACTTGCTTTACTTAATAAGCGTCCACACTTCAGTAATGAATTTTGATACTAGAGGGTCCAATAGT 180
突变型序列 ----------------------------------------------------------------------------A------------- 180
基因库序列 TAGCACTTATAGTCACACGTGTACAAAATGTTTATTCCTGCTCACCTAGTACCTATCAGGAAAACCTATCATGATTTTCTGAAATCTGAG 270
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 270
基因库序列 CTGCTTAATGCACGTGAACTGTTGAACAAGCATGGATTCCTCGTGTTTGCAATGTATTTATTATGTATTTTTTTCCCCTCCTCCTAACAG 360
突变型序列 ---------------------------------A-----------------G-----------C-------------------------- 360
基因库序列 AAATCCCTCAGAATTTTCCTTGAGGTAGTACAAACTTTCAGCCACAATAGTGATAGAATCCTAAAGGAACCCTAAAAGAGAGCTCTGCCT 450
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 450
基因库序列 CAATTCATAGTCCAACTATGCGTTCAGTGTATATTTAAGAATGATAGTGCTGTCTTCCAGCACTGCTGCCCATAGTACTTGGAAATATAT 540
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 540
基因库序列 CCTTTCAGTATGTGAAGACGTATCCTCTACGAAGCCACCAGATAAATCAGTTCACCCTTGGCTGTAATCAAATGCTGTCTAGTGACTTGT 630
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 630
基因库序列 GATCGACAGGGCTTTAACCTCTGACAGCTAGATTCATTGTTGGGACAACAACCAATCGTCGGTTTTGACGACATGAGCCTAATCAAAGTT 720
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 720
基因库序列 GGAGTATAAAAGCCCCCTTGGCATATATAAGGCACACCAGTGTGGCAAGCCGTCTCTCAGATTGCATTTGCTGTCCCGGATCTGTTTAGA 810
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 810
基因库序列 ACTGAAAGAAAAGGGGAAAGGGAGAGGGGGGGGAAAAAAGGCAAAAAGATGCAGTGAGGTGTAAGAAAAAATGCAAAAGCTAGCAGTCTA 900
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 900
基因库序列 TGTTTATATTTACCTGTTCATGCAGATCGCGGTTGATCCGGTGGCTCTGGATGGCAGTAG 960
突变型序列 ------------------------------------------------------------ 960
二、Myostatin基因3’非编码区的单核苷酸多态性
基因库序列 GGTGCTCATGAATTTTGGCTGACGTGAGACCCCTTCGATAAATTGTGGAAGCCACCAAAAAAAAAAGCTATATCCCCTCATCCATCTTTG 6450
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6450
基因库序列 AAACTGTGAAATTACGTACGCTAGGCATTGCCAACATCCATATACTGTACAACTGTACAGACCACATATATCACAACATGAGCTGCAGAA 6540
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6540
基因库序列 TGTGAACTTAAAGACAGTAGAGTTACCTAAGGGCTGGCTTTGAAACAACGGACAAAGAAGCTACAATCAAAATCACCGGATTTAACAAAT 6630
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6630
基因库序列 GGGTTTCTTACACTGTGAGGGAATCAATATTCAGTCATTCAGACACAAATTTATATGCAGTTTTCAACATATGTTGGTAATCAAAAGTAA 6720
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6720
基因库序列 GCTCCTTCTCCTCTGAGGACAGAAGGAGCGGGCTATTAAATCAACTTCTTCACAGCTACACTTAATATTGTATTTACAGCAAAATATATA 6810
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6810
基因库序列 CTGGTAACGTATACACCACTACACATTACCACCAGAATCATCCTTGAACACTTGAATATATAGTGCAGAGTTATGATAAGATGAAATTCC 6900
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6900
基因库序列 ACGTAAATGGACAAATCCTGAAGTTAGGGATGGTATAGTGTATTTAGCAGTGTTTCCATTCCTTTTTTTCGTTAGTATGTTAGTAATCAA 6990
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 6990
基因库序列 TGGCAATGGTGCTACGTAAGCAGGCTGAGTAAATAGAAAGATAGTTATCTAAGTGAAAGAATTTAGAGTAATAATGAATTTGCCCTATCC 7080
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7080
基因库序列 TCAGGTACACTATTCAACATTCACAAGAAAAGGATTTTTTTTAAACAAAAGGTGAATAGTTTTCTAAACGTAGTAAAACAAAAGGCAGCA 7170
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7170
基因库序列 CGGAAGTCTGATGTTCAAACCATAATCCCATATCGTAATCTGCCTTTGCAACGTTACCGTTTGCACTATGATAAGCCAATGCAAATAGTT 7260
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7260
基因库序列 GGTTGCTACAGAAATTGTTAAAAAACCACTTTGATATAACTGACTTGTGTAATATGTATGCATCAATATTTTGTAAATAAATGTTTATTT 7350
突变型序列 ------------T----------------------------------------------------------------------------- 7350
基因库序列 TTTAATCTGTTCGTATACATTCATTACAAAAAAAGAGTAATGGTAACCTGTCCTTTAGTTTAATAAACAAACCCAGGTTTTCTCTTCATA 7440
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7440
基因库序列 ACATAATTTCCTGGTTTTTAACAGTAATATGAAAGAACAGTGCAACAGAGTAAACCACAGGTAGAGAATTATACCACATTTTGTATGTTT 7530
突变型序列 ------------------------------------------------------------------------------------------ 7530
基因库序列 GGTTTTTTTTTTTTAACATTGGCATGA 7557
突变型序列 --------------------------- 7557