本发明涉及类胰高血糖素肽1（glucagon-like peptide-1）.（GLP-1）、被切断的GLP-1、胰岛素调理素（insulinotropin）和被切断的胰岛素调理素的衍生物。更具体地说，本发明涉及GLP-1，被切断的GLP-1，胰岛素调理素和被切断的胰岛素调理素的衍生物，及其适于药用的盐，所说这些物质的pI值约为4或更小，或者PI值约为7或更大。本发明范围内的GLP-1，被切断的GLP-1，胰岛素调理素和被切断的胰岛素调理素的衍生物特别适合于通过电离子透入疗法供给哺乳动物。本发明的衍生物具促胰岛素活性并用于哺乳动物中以提高胰岛素作用。本发明的治疗方法包括给予哺乳动物有效量的GLP-1，被切断的GLP-1，胰岛素调理素或被切断的胰岛素调理素的衍生物。本发明还涉及含有所说GLP-1，被切断的GLP-1，胰岛素调理素或被切断的胰岛素调理素地衍生物的药物组合物。此外，本发明还涉及通过电离子透入疗法施用某些已知的胰岛素调理素和被切断的胰岛素调理素衍生物，从而在哺乳动物中提高胰岛素作用的以上已知物的新用途。 GLP-1的氨基酸序列已知如下：
His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly.
GLP-1由Lopez，L.C.等在P.N.A.S.，USA80：5485-5489（1983）;Bell，G.I.等在Nature302：716-718（1983）;Heinrick，G.等在Endocrinol.115：2176-2181（1984）and Ghiglione，M.等在Diabetologia27：599-600（1984）中公开。
已知GLP-1能进行有7-37个氨基酸的GLP-1（7-37）转换成31-氨基酸肽的自然加工，该加工过程据报道在胰和肠中发生。该7-37肽（本文改称作胰岛素调理素）是一种具有促胰岛素活性的激素。
胰岛素调理素具有下列氨基酸序列：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly.
胰岛素调理素，其某些衍生物和它的在治疗哺乳动物糖尿病上的用途在PCT/US87/01005（WO87/06941）中公开，公开日1987年11月19日，其所述内容在本文中作为参考。在PCT/US87/01005中公开的胰岛素调理素衍生物包括含有或缺乏可能不出现在天然序列中的一种或多种氨基酸的多肽。在PCT/US87/01005中公开的其它胰岛素调理素衍生物包括某些C-末端盐，酯和胺化物，其中的盐和酯被定义为OM（这里M是适于药用的阳离子或一种低级（C1-C6）支链或非支链烷基），胺化物被定义为-NR2R3（这里R2和R3相同或不同，选自氢和低级（C1-C6）支链或非支链烷基组成的一组基团）。
某些具有促胰岛素活性的其它多肽（本文改称作被切断的胰岛素调理素）和其衍生物在PCT/US89/01121（WO90/11296）中公开。这些多肽，本文指GLP-1（7-36）、GLP-1（7-35）和GLP-1（7-34）分别具有下列氨基酸序列：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg;
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-
Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly;and
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys.
在PCT/US89/01121中公开的多肽衍生物，包括具有无关紧要的氨基酸取代或附加氨基酸，以提高与载体蛋白偶联作用或提高其促胰岛素作用的多肽。其它在PCT/US89/01121中公开的胰岛素调理素衍生物包括某些C-末端盐、酯和胺化物，其中的盐和酯被定义为OM（其中M是适于药用的阳离子或低级支链或非支链烷基），胺化物定义为-NR2R3（这里R2和R3相同或不同，选自氢和低级支链或非支链烷基组成的一组基团）。
治疗上有效的多肽对哺乳动物给药存在某些问题为本领域专业人员所熟知。多肽的口服给药，不需要某种形式的给药器械，但由于肠固有的低渗透性和在肠胃中的其它过程，例如化学降解，一般使得口服给药不成功。多肽的透皮给药（transdermal administration）使多肽不经受内脏的降解，提供了对哺乳动物给以治疗上有效的多肽的可能性，透皮施用药物活性化合物的各种方法为本领域专业人员所熟知。一种本领域专业人员已知的透皮给药方法称作电离子透入疗法。
电离子透入疗法包括施以皮肤电位梯度并配合表面同时施用治疗剂。完成该方法需要两个电极以及一个药物槽和电源。各种类型的电离子透入疗法的装置由Tyle.P.，在Pharmaceutical Research3：318-326（1986）中描述过。用于电离子透入疗法中的电极的典型例在US，4，950，229中公开，该文在此作为参考。电离子透入疗法的结果是治疗剂经皮肤转送到局部或全身位点。另外，已知电离子透入疗法包括不同电压型的应用包括如electroporation或脉冲流技术之类方法。
以低水平电流用于透皮施用亮氨脯氨肽（leuprolide），一种合成的9氨基酸leutinizing激素释放激素类似物（见Meyer，B.R.等，Clin.Pharmacol Ther，44：607-612（1988））;以电离子透入输送胰岛素给鼠的有关研究有所报道，见Siddiqui，o.，等，J.Pharmaceutical Sciences76：314-345（1987）。促性腺激素释放激素和促甲状腺素释放激素的透皮电离子透入疗法的研究也已被报道（Miller，L.L.，等，J.Pharmaceutical Scieces79：490-493（1990）和Burnette，R.R.，J.Pharmaceutical Sciences 75：738-743（1986））。也公开过乙醇能促进Leuprolide和CCK-8（缩胆囊肽-8）类似物电离子透入疗法的透皮输送（Srinivasan，V.等，J，Pharmaceutical Science 79：588-591（1990））、
本发明涉及含有下列基本结构的类胰高血糖素肽1（GLP-1）和被切断的GLP-1多肽衍生物：
H2N-W-COOH
其中W是选自如下序列的氨基酸序列：
His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly和
His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Alε-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg;
及其适于药用的盐，其中所说衍生物的PI值约为4.0或更小或者PI值约为7.0或更大，并且当施于哺乳动物时，产生具有促胰岛素活性的多肽衍生物。
本发明还涉及含有下列基本结构的如上所述的GLP-1和被切断的GLP-1的多肽衍生物：
H2N-W-（X）m-（Y）n-Z
和其适于药用的盐，其中W定义如上，m是0或1，n是0或1;X是碱性的或中性的L-氨基酸残基，Y是碱性的或中性的L-氨基酸残基，Z是CO2R1或CONR2R3，其中当m是1，n是0，并且X是碱性L-氨基酸残基，或者m是0，n是1，并且Y是碱性L-氨基酸残基，或者m和n都是1，并且X和Y中一个或两者是碱性L-氨基酸残基时，R1是H或（C1-C6）直链或支链烷基;当m和n都是0，或者m是1，n是0并且X是中性L-氨基酸残基，或者m是0，n是1并且Y是中性氨基酸残基，或者m和n都是1，并且X和Y都是中性L-氨基酸残基时，R1是（C1-C6）直链或直链烷基;并且R2和R3各自独立地为H或（C1-C6）直链或支链烷基。
此外，本发明还涉及含有下列基本结构的多肽衍生物：
H2N-R-COOH
其中R是选自如下序列的氨基酸序列：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly，
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg，
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly and
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys;
和其适于药用的盐。所说的衍生物的PI值约为4.0或更小，或者PI值约为7.0或更大，且具有促胰岛素活性，其条件是所说衍生物不是C-末端（C1-C6）直链或支链烷基酯以及所说衍生物不是式CONR2R3（其中R2和R3各自独立地为H或（C1-C6）直链或支链烷基）的C-末端羧酰胺。
本发明也涉及具有下列基本结构的以上刚描述的多肽衍生物：
H2N-R-X-（Y）n-Z
和其适于药用的盐。其中R是如上所描述的，n是0或1;X是碱性或中性L-氨基酸残基，Y是碱性或中性L-氨基酸残基，Z是CO2R1或CONR2R3，其中当n是0并且X是碱性L-氨基酸残基，或者n是1，并且X和Y中一个或两者是碱性氨基酸残基时，R1是H或（C1-C6）直链或支链烷基;当n是0，并且X是中性氨基酸残基，或n是1，并且X和Y都是中性氨基酸残基时R1是（C1-C6）直链或支链烷基;R2和R3各自独立地是H或（C1-C6）直链或支链烷基。
本发明优选的衍生物是那些具有PI值约为8.5或更大的衍生物。这些多肽的其它的优选的衍生物是那些其中的R是
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe lle Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
更优选的R是
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe lle Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly;
而n是0，并且X是Arg，或者n是1，并且X和Y都是Arg的衍生物。也更优选这样一些优选的衍生物，其中Z是CO2R1并且R1是H，或者Z是CONR2R3并且R2和R3各自都是H。
本发明进一步涉及在哺乳动物中提高胰岛素活性的方法，该方法包括给予所说哺乳动物有效量的本发明的衍生物。按照本发明的提高胰岛素活性的一种优选方法包括治疗Ⅱ型糖尿病。一种优选的这类衍生物的给药方法是电离子透入疗法透皮给药。
另外，本发明还涉及在哺乳动物中提高胰岛素活性的方法，该方法包括以电离子透入疗法给予所说哺乳动物有效量的具有下列基本结构的多肽衍生物：
其中R是选自如下序列的氨基酸序列：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly，
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg，
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly and
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys;
和其适于药用的盐，基中m是0或1，n是0或1，X是碱性或中性L-氨基酸残基;Y是碱性或中性L-氨基酸残基，Z是CO2R1或CONR2R3，其中当m是1，n是0，并且X是碱性L-氨基酸残基，或者m是0，n是1并且Y是碱性氨基酸残基，或者m和n都是1，并且X和Y之一或两者是碱性L-氨基酸残基时，R1是H或（C1-C6）直链或支链烷基;当m和n都是0，或者m是0，n是1，并且X是中性L-氨基酸残基，或者m是0，n是1，并且Y是中性L-氨基酸残基，或者m和n都是1，并且X和Y都是中性L-氨基酸残基时，R1是（C1-C6）直链或支链烷基。并且R2和R3各自独立地为H或（C1-C6）直链或支链烷基。
本发明的衍生物也可以和其它治疗剂例如其它抗糖尿病剂（如磺酰脲）一起使用。
一种以电离子透入疗法给予上面刚描述的多肽衍生物的优选方法，包括电离子透入疗法给予这样一些衍生物，其中R是：
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly;
m是0，并且n是0，更优选的方法包括其中Z是CONR2R3，并且R2和R3都是H。
本发明还涉及含有根据本发明的多肽衍生物的药物组合物。这类组合物在哺乳动物中提高胰岛素活性方面有用。因此，本发明的药物组合物特别适合于治疗某些糖尿病症状例如Ⅱ型糖尿病。
本申请整个说明书和所附权利要求中所使用的“衍生物”一词包括（但不限于）含有所示基本结构的多肽，其中在其C末端包含一种或多种L-氨基酸，其中C-末端羧基与（C1-C6）直链或支链烷基形成酯;其中C-末端羧基形成羧酰胺或取代羧酰胺;其中的酸性氨基酸残基（Asp和/或Glu）形成酯或羧酰胺;以及它们的结合体。
本申请整个说明书和所附权利要求中所使用的“碱性L-氨基酸残基”包括（但不限于）普通氨基酸Lys，Arg和His。
本申请整个说明书和所附权利要求中所使用的“中性L-氨基酸残基”一词包括（但不限于）Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，TrpGly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Glu。而Gly由于除了羧基和氨基外在α-碳原子上仅有H原子，从技术的角度来说Gly不是L-氨基酸残基，为简便起见，为里且称作L-氨基酸。
上而的有关L-氨基酸的碱性或中性的分类基于相应氨基酸在PH7.0时的净电荷而论。
本申请整个说明书和所附权利要求中所使用的“PI”一词指使用称作PCGENE（Intelli Genetics，Inc.，700East，EI Camino Real，Mountain View，CA94040）的商品软件计算出的理论PI。
具有与以上所描述的多肽同源性的多肽也包括在本发明范围内。这种同源性足够将促胰岛素活性传给这类多肽。以上所述多肽的变体也在本发明的范围内，这些变体包括无关紧要的氨基酸取代体并具有促胰岛素活性。
本申请说明书全文和所附权利要求中所使用的“提高胰岛素活性”一词包括（但不限于）增加胰岛素合成，增加胰岛素分泌，增加肌肉和脂肪摄取葡萄糖和降低肝脏产生葡萄糖这些作用的一种或多种。
本发明的多肽可采用本领域技术人员熟知的各种方法制备。例如，所说多肽能使用自动肽合成器例如Applied Biosystems（ABI）430A固相肽合成器来合成。另外，本发明的Z是CO2H的多肽可采用重组CNA技术制备，其中编码该多肽的DCNA序列可人工连接到表达载体上和用于转化合适的宿主细胞。然后将被转化的宿主细胞在多肽能被表达的条件下培养，然后从培养物中回收多肽。此外，将合成和重组DNA技术结合，能用来产生本发明的胺化物和酯衍生物和/或产生所需多肽的片断，这些片断然后用本领域技术人员熟知的方法连接。
按照本发明的多肽衍生物用本领域技术人员熟知的方法制备。例如，本发明的多肽的C-末端烷基酯衍生物，由在起催化作用的酸如Hcl存在下，将所需的（C1-C6）链烷醇与所需的多肽反应制备。形成这类烷基酯的合适的反应条件包括反应温度约50℃，反应时间约1小时到约3小时。类似地在多肽内含有Asp和/或Glu残基的（C1-C6）烷基酯的本发明的多肽衍生物也可用此法形成。
本发明的多肽的羧酰胺衍生物也可用本领域技术人员公知的固相肽合成法制备，例如，参见，Solid Phase Peptide Synthesis，Stewart，J.M，等，Pierce Chem.Co Press.1984。当按照本发明，希望得到有PI约为4或更小的多肽衍生物时，这类衍生物可用本领域技术人员熟知的各种方法制备。例如，将谷氨酰胺残基脱酰氨基产生谷氨酸残基，在游离氨基的N-末端和/或赖氨酸残基的ε-氨基进行烷基化或酰胺化，或者将其上方法结合即产生较低PI值的衍生物。为将胰岛素调理素衍生物的PI降低至小于约3.89，那么必需将可利用的氨基的任何两个加以修饰，或者至少修饰一个氨基，以及将谷氨酰胺脱酰氨基。谷氨酰胺残基的脱酰氨基通过将本发明的所需多肽悬浮在PH大于8的水中几个小时便很容易完成。
例如，依据反应的PH值，在碱性条件下胰岛素调理素的乙酰化作用可产生其中N-末端氨基和两ε氨基都酰胺化的衍生物。结果是衍生物具有3.61的理论PI值。另外，N-末端乙酰化结合胰岛素调理素单个谷氨酰胺残基脱酰氨化形成谷氨酸残基产生具有4.11理论PI值的衍生物。
作为降低PI的另一种方法，可用一种环酐与多肽反应，以封闭碱性碱基并引入酸性残基，举以下为例（而非限于此），一种胰岛素调理素（SEQUENCE ID NO：2）的DMF溶液在有8当量的三乙胺和8当量的琥珀酐存在下反应给出在其N-末端和Lys20和Lys28残基产生N-琥珀酸根的胰岛素调理素衍生物。
另外，本发明的多肽衍生物可用以下方法或结合上述方法制备，该方法是修饰编码该多肽序列的DNA，以便碱性氨基酸残基被酸性或中性氨基酸残基取代，或者中性氨基酸残基被酸性氨基酸残基取代。这种在多肽基本序列上的改变也可通过衍生物的直接合成来完成。这种方法为本领域专业技术人员所熟知。当然，为实际能用于本发明，这些衍生物必须具有促胰岛素作用。
按照本发明的多肽衍生物（其中所说多肽不包括GLP-1或被切断GLP-1的氨基酸1-6）的促胰岛素活性可用如下方法测定。
用经改进的Lacy，P.E.等在Diabetes，16：35-39（1967）所述方法从正常鼠胰组织分离胰岛，其中，用Ficoll梯度液（于Hanks′平衡盐溶液中27%，23%，20.5%和11%，PH7.4）分离胰组织胶原酶消化液。胰岛从20.5%/11%梯度液相交处收集，洗涤，并且在体视显微镜下挑出外分泌腺和其它组织，该胰岛在37℃和95%空气/CO2气流下，在补充以10%牛胎血清和含有11mM葡萄糖的RPMI1640培养基中培养过夜。该胰岛然后转移到补充以10%牛胎血清和含有5.6mM葡萄糖的RPMI1640培养基中，在37℃和95%空气/5%CO2气流中培养60分钟，待研究的多肽衍生物以含10%牛胎血清和16.7mM葡萄糖的RPMI培养基配制成1nM和10nM浓度溶液。用移液管将约8到10个被分离的胰岛转移到96孔微滴平盘中的含有培养基的总体积为250ul的上述多肽衍生物中。该胰岛在37℃下和95%空气/5%CO2气流中，在多肽衍生物存在下培养90分钟。然后收集无胰岛培养基等分样，将其100ul用放射免疫试验法使用Equate Insulin RIAKit（Binax，Inc.，Portland，ME）来试验胰岛素存在量。
本发明的含有多肽衍生物的药物组合物可用本领域技术人员熟知的方法制备。例如，多衍肽生物可与适于药用的稀释剂或载体结合。当本发明的多肽衍生物用于静脉内、肌内或皮下给药时，使用本领域公知的适宜的无菌稀释剂。该药物组合物需含有足够量的多肽衍生物，以便按如下所述在一个合适的时期内给予合适剂量。
为按照本发明的多肽衍生物的电离子透入疗法给药，可配制各种组合物。多肽衍生物可包含在溶液中或作为凝胶或泡沫的一部分，然而优选在这种组合物中的衍生物具有与所使用的电离子透入装置药物槽中的电极相同的或近似相同的电荷。衍生物的电荷可被控制例如，通过使用合适的缓冲液。当使用缓冲液时，优选使用具有与将被给予的特定多肽衍生物相反电荷的缓冲液，另外，如果使用其合适的盐形式，多肽衍生物可作为自身“缓冲液”。这类组合物的可变因素包括多肽衍生物的浓度、缓冲液的浓度（当存在时），组合物的离子强度和非水共溶剂。一般来说，为获得该组合物以电离子透入疗法的最高传输效率，最好将该组合物中的除多肽衍生物外的所有各种离子浓度减至最小。这种浓度的调节本领域技术人员能据本文公开的内容进行。
各种电离子透入疗法的装置是已知的，用于该装置的各种电极是已知的并且是可购得的。这类电极包括用铂或银-氯化银制作的。已知各种电极之间的差异伴随某些性能的细微差别。例如，使用铂电极引起水解，导致氢离子释放，随之改变PH，PH的改变接着影响多肽衍生物的离介状态，从而产生其电离子透入输送作用。相反，当使用电离子透入疗法装置时，银-氯化银电极不产生水解。然而，这种银-氯化银电极需要有离子存在，以引起竞争而诱导穿透皮肤的传输流。用于本发明的多肽衍生物的电离子透入疗法给药的合适电极的选择，本领域技术人员能据本文公开的内容进行。
此外，如Riviere，J.E.等，在J.Toxicol.-cut.&Ocular Toxicol.&，493-504（1989-1990）所描述的使用猪皮瓣评估电离子透入疗法给药的方法可用于本发明的多肽衍生物和组合物。
当本发明的多肽衍生物由静脉内，肌内或皮下给药时，治疗成年人糖尿病的发作的有效剂量范围是从每天约1Pg/kg到1，000μg/kg。在两餐饭期间或之间的静脉内输注，优选的剂量是约4到10ng/kg/min或对100kg体重病人来说约0.6到1.4μg/天。然而，这个范围以外的剂量也是可取的，也在本发明的范围内。合适剂量可以也应当由医生来确定，它将视被治疗症状的严重程度以及给予的衍生物所能产生的应答和病人的年龄、体重、性别及医治史而定。对按照本发明的多肽衍生物的电离子透入疗法给药来说，剂量范围是从约500到1000μg/每天。这里，该范围以外的剂量也是可能的，并且在本发明的范围内。
实施例1
H2N-R-X-（Y）n-Z其中n是0;X是Arg;Z是CONR2R3其中R2和R3中H，R是
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
本标题肽合成以P-甲基二苯甲基胺（Hcl盐）树脂起始用Applied Biosystems（ABI）430A固相肽合成器〔mfr，address〕使用N-甲基吡咯烷酮/羟基苯并三唑t-BOC循环的ABI Versionl.40。完成合成时，终循环选择来除去最后的t-BOC保护基。使用下列氨基酸侧链保护系：Arg（Tos），Lys（cl-z），Trp（CHO），Glu（OCYHex），Tclr（Br-Z），Ser（Bzl），Thr（Bzl），Asp（OCyHlex）和His（BOM）。使用的合成循环是由ABI所提供的有下列改进：羟基苯并三唑到测定环的传送时间从6秒增加到10秒，以保证能再生长和使其适当的传送;并且羟基苯并三唑到活化器的传送时间从12秒增到18秒。为了防止由乙酐试药瓶产生的蒸汽引起的仪器的阻塞，反应器循环被修改为在传送乙酐后使相关隔断阀增压。ABOC11活化剂循环用来激活Glu，代替通常使用的ABOC12。在最终除去N-末端t-BOC基团后，获得总共2.65g肽-树脂。在含有2ml水，2ml70%乙醇胺的甲醇液和16ml二甲基甲酰胺溶液中轻轻震摇1小时处理肽-树脂使甲酰基保护基从Trp残基上除去。然后树脂经过滤，以二甲基甲酰胺（3×10ml），甲醇（3×10ml）和二氯甲烷（3×10ml）连续洗涤。洗涤过的树脂经真空干燥给出2.48g树脂。
为从树脂上除去肽，将997mg干树脂用液态氟化氢/10%m-甲苯酚在0℃处理1小时，然后蒸发除去氟化氢，肽被三氟乙酸吸收。接着用乙醚沉定肽，得到403mg肽白色固体。分析HPLC数据表明，在肽中的Trp甲酰基保护基未完全除去。为除去残留的甲酰基保护基，将40mg肽溶解在3.6mlH2O和0.4ml70%乙醇胺的甲醇混合物中。所得溶液在室温下静置30分钟，然后加入0.35ml三氟乙酸，离心（14.000rpm，5min）收集沉淀。收集到的沉淀溶解在4ml6M胍.HCL中，使用60分钟期间100%→40%A，0%→60%B梯度系统流速10ml/min在1英寸VYDACC18柱上于制备型反相HPLC进行色谱分离，其中，A是0.1%三氟乙酸/95%H2O/5%CH3CN，B是CH3CN得到10.5mg标题肽。
FABMS：3511.4Dα（母体+H预测值3511Dα）
实施例2
H2N-R-X-（Y）n-Z其中n是0;X是Arg;Z是CO2R1，这里R1是H;R是
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
使用实施例1中所描述的方法，改成合成本标题肽，制备出总量2.0g肽树脂。按照实施例1的方法用氟化氢处理900mg肽树脂，用三氟乙酸溶液从乙醚中沉淀后得到340mg肽。然后，如实施例1，将1.40mg肽用乙醇胺水溶液处理，酸化，沉淀并色谱分离，得到10mg本标题肽。
FABMS：3511.9Dα（母体+H预测值：3512Dα）
实施例3
H2N-R-X-（Y）n-Z其中n是1;X是Arg;Y是Arg;Z是CONR2R3，R2和R3是H，R是
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
使用实施例1中所描述的方法，改成合成本标题肽，制备出总量为1.3g的肽树脂。按照实施例1的方法用氟化氢处理1.3g肽树脂，用三氟乙酸溶液从乙醚中沉淀后得到671mg肽。然后，如实施例1，将7mg肽用乙醇胺水溶液处理，酸化，沉淀并色谱分离，得到4.2mg本标题肽。
FABMS：3667.8Dα（母体+H预测值3667.81Dα）
实施例4
H2N-R-X-（Y）n-Z
其中n是1，X是Arg;Y是Arg;Z是CO2R1，这里R1是H，R是
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
使用实施例1中所描述的方法，改成合成本标题肽，制备出总量为2.66g肽树脂。按照实施例1的方法用氟化氢处理1.1g肽树脂，用三氟乙酸溶液从乙醚中沉淀后得到490mg肽。然后，如实施例1，将10mg肽用乙醇胺水溶液处理，酸化，沉淀并色谱分离，得到3.8mg本标题肽。
FABMS：3669.1Dα（母体+H预测值：3668.83Dα）
实施例5
H2N-R-X-（Y）n-Z
其中n是0，X是Arg，Z是CO2R1基中R1是H，R是
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly的衍生物，这里衍生物是N-末端（N-α）琥珀酰化的并且两个Lys残基的ε氨基是琥珀酰化的
于800μg二甲基甲酰胺（DMF）中800μg（0.24μmoles）胰岛素调理素的溶液中相继加入在20μlDMF中的200μg（2.0μmoles）琥珀酸酐和在10μlDMF中的200μg（2.0μmoles）三乙胺。将该清彻溶液在室温下搅拌3小时，产生单一的主产物（按实施例1的方法由反相HPLC分析），产率约90%（根据HPLC峰面积），该产物加到10ml水中，用三氟乙酸酸化至PH2，冷冻至干。将该干燥的冻干物吸收进HPLC流动相。并且按实施例1的方法经制备型反相HPLC纯化。经Plasma Desorptlon质谱分析显示生成的均一产物是三琥珀酰基（tri-succinoyl）取代的胰岛素调理素。预测质量（M+H）：3656.68Dα，实测值：3658.2Dα。
实施例6
其中n是0;X是Arg;z是CO2R1这里R1是H，R是
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
的衍生物，该衍生物是六-或七-琥珀酰化物
按实施例5的方法，以100μg（0.03μmoles）代替800μg（0.24μmoles）胰岛素调理素，而按实施例5中的所有其它反应剂量进行反应，在室温下搅拌16小时后得到新产物（由HPLC分析证实）。按实施例5方法分离该产物，由ES-MS质谱分析显示是六-和七-琥珀酰化胰岛素调理素的混合物。六-琥珀酰化胰岛素调理素的预测质量：3955.68Dα，实测值：3955.9Dα。七-琥珀酰化胰岛素调理素的预测质量：4055.68Dα，实测值：4055.9Dα
实施例7
其中n是0，X是Arg，Z是CO2R1这里R1是H，R是
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
100微克（100μg）胰岛素调理素溶解在含有20μl水tricine缓冲液（PH8.75）的50μlDMF溶液中，在37℃下搅拌过液。按照实施例1的方法进行HPLC显示一个新峰出现，该峰与按实施例2的方法总合成的产物一起洗脱。