一种临床感染性疾病基因芯片制备设计方案 技术领域：
本发明确定了一种临床诊断应用基因芯片的制备设计方案，属于生物技术领域。
背景技术：
基因芯片技术是一种新兴的生物技术，它在生物学各领域有广泛的应用前景。临床诊断是其应用领域之一。感染性疾病是临床上最普遍的疾病，基因芯片具有替代现有诊断技术的极大潜力。应用于临床的感染性疾病诊断基因芯片目前尚无产品面市。由于诊断芯片的特殊要求，作为基础研究的表达谱芯片技术照搬于诊断基因芯片上，很难满足诊断芯片的技术要求。另一方面，感染性病原物是人体的一种生物，它们在进化上有相当大的差异，因而可以找到与人类不同的特异DNA片段，这为建立感染性病原物的DNA芯片技术带来便利。
发明内容：
本发明根据感染性病原物的特点和临床诊断的特殊要求，建立了一种临床诊断应用基因芯片的制备设计方案，该方案为：
1.利用短的特异DNA片段(100-200bp)作为探针。该种探针的优点是：(1)由于寡核苷酸序列虽然特异性较高，但其杂交条件要求严格，不同的探针在同一条件下进行杂交，很难找到一个使所有探针的杂交效果都一样好地条件。而较长的DNA序列对杂交条件要求相对宽松，已建立的杂交条件对所有探针的杂交都合适。(2)寡核苷酸杂交对一个碱基的突变都非常敏感，而病原物的变异相对较快，这就使得检测技术的假阴性率较高，而DNA片段是检测序列，个别碱基的变异不会引起漏检而引起假阴性。(3)较长的DNA序列作探针的缺点是遇到其他微生物或宿主的同源序列而导致假阳性。(4)寡核苷酸的制作成本较高，而DNA片段的成本相对较低。
2.设置多个对照位点。本方案设置对照位点，临床使用时可将其中的几个设为阳性，将另一部分位点设为阴性位点。这样一方面避免偶然原因使单个阳性(或阴性)位点的检测失误，另一方面可为诊断时，设置阳性对照模板浓度梯度，配以适当的循环数，建立半定量检测技术体系。
3.每种病原物设置多个检测位点。为避免因不同患者病原物的差异而出现假阴性，对同一病原物选择多个位点进行检测，这样可以减少因病原物的变异导致假阴性的可能性。
4.每个位点设置重复，重复次数为4.在芯片检测操作中，会因洗脱，载片上的杂点，杂交液分布不均匀等，造成某个位点的假信号，或没有信号。如果只有一个检测位点，就会引起判断失误。每个位点有4个重复，上述的杂质信号，杂交不均匀等错误不可能同时在2个以上的位点发生。这样就可以避免上述等原因导致的假阳性或假阴性。
5.点阵设计，尽可能地使对照和检测位点数总和是某一个数的平方，将所有位点组成一个正方形矩阵，重复4次还是一个正方形矩阵。对照位点分别占据4角，或中心，或对角线上，或形成菱形。每个位点的4个重复尽可能对称。以5个检测位点4个对照位点为例，点阵设计图见图1。
本发明具有成本低、操作简便、检测结果精确等优点。本技术方案既可用于临床感染性疾病基因芯片制备，也适用于利用基因芯片技术进行所有以特异序列为检测靶点的种群、类群和个体鉴定。
附图说明：
附图1为为点阵示意图。图中4个对照位点，5个检测位点的点阵设计图。只有对照信号的杂交图谱。
图中2为只有对照信号的杂交图谱。图中4个对照位点和5个检测位点组成一个正方形小矩阵，4个重复并成一个大矩阵，大矩阵也是正方形。每个位点的4个重复对称分布。对照位点的I、III和IV形成对角线，而II形成菱形。
具体实施方式：
本发明的实施按如下程序进行：
1.通过网络搜索获得病原物特异DNA片段，然后设计PCR引物并从临床标本中克隆，测序。然后设计探针引物，使序列长度在100-200bp。
2.采用常规质粒DNA扩增，提取及纯化方法扩增克隆的探针质粒，利用PCR方法扩增探针序列，并采用常规的PCR产物纯化方法纯化PCR产物。纯化PCR产物即可用作芯片制备的探针。
3.按常规的方法配制探针点样液(如3XSSC溶液)，用点样仪制备DNA芯片，点阵按前述设计方案设计。
4.点样后，在紫外交联仪中交联固定DNA探针，通常用紫外光强65-120mJ/cm2，交联时间10-30分钟。交联固定后沸水煮2分钟变性探针DNA，用甲基吡咯烷酮封闭，芯片制备完成。