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1、10申请公布号CN104292324A43申请公布日20150121CN104292324A21申请号201410524880222申请日20110506201110116643920110506C07K14/47200601C07K1/06200601C07K1/04200601A61K38/17200601A61P31/04200601A61P31/1020060171申请人上海医药工业研究院地址200040上海市静安区北京西路1320号申请人正大天晴药业集团股份有限公司72发明人冯军路建光张喜全徐宏江吴勇朱裕辉杨洁54发明名称一组HRP5类似物及其制备方法57摘要本发明属于医药领域，具体。
2、而言涉及一组HRP5类似物及其制备方法。本发明所涉及的HRP5类似物的氨基酸序列通式如SEQIDNO2所示XAA1XAA2XAA3XAA4XAA5XAA6XAA7XAA8XAA9LEUXAA11LYSTYRLEUARGXAA16XAA17XAA18。体外活性测定表明，本发明提供的多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果，对临床上分离的耐药性革兰氏阳性菌、耐药性革兰氏阴性菌及耐药性真菌同样具有显著的杀菌效果，具有广谱、高效的特点。62分案原申请数据51INTCL权利要求书1页说明书9页序列表15页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表15。
3、页10申请公布号CN104292324ACN104292324A1/1页21多肽或其药用盐，其氨基酸序列为LYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSPHENH2，LYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGDLYSDPHENH2，DLYSDARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGDLYSDPHENH2或DLYSDARGLEUPHEDLYSDLYSLEULEULYSTYRLEUARGDLYSDPHENH2。2权利要求1的多肽，其氨基酸序列为LYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUA。
4、RGLYSPHENH2。3权利要求12中任一项的多肽的制备方法，其包括以下步骤1在树脂上固相合成多肽；2将步骤1的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，加入侧链保护基清除剂，并与520倍体积比的冰乙醚混合，沉淀多肽，离心，干燥得到粗肽。4权利要求3的制备方法，其中步骤1是在液相环境中进行，具体包括浸泡树脂脱除氨基保护基洗涤偶联氨基酸监测洗涤脱除氨基保护基顺序连接其余氨基酸干燥树脂。5权利要求4的制备方法，其中所述氨基保护基选自叔丁氧羰基、苄氧羰基或9芴基甲基羰基。6权利要求4的制备方法，其中所述液相环境所使用的溶剂选自二甲基甲酰胺或二氯甲烷。7权利要求4的制备方法，其中偶联氨基酸所使用的偶联试剂选。
5、自碳二亚胺型试剂与1羟基苯并三唑，或者苯并三氮唑鎓盐型试剂与1羟基苯并三唑。8权利要求7的制备方法，其中所述偶联试剂选自二异丙基碳二亚胺与1羟基苯并三唑，或者21H苯并三偶氮L1基1,1,3,3四甲基脲四氟硼酸酯与1羟基苯并三唑。9权利要求3的制备方法，其进一步包括将粗肽纯化的步骤，其中纯化方法选自反相色谱法或离子交换色谱法。10权利要求12中任一项的多肽在制备抗细菌及抗真菌药物中的应用。权利要求书CN104292324A1/9页3一组HRP5类似物及其制备方法0001本申请是申请号为2011101166439，申请日为2011年5月6日，发明名称为“一组新型的HRP5类似物及其制备方法”的分。
6、案申请。技术领域0002本发明属于医药领域，具体而言涉及一组新型的具有广谱抗菌活性的HRP5类似物及其制备方法。背景技术0003自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染的有力武器，但随着传统抗生素的滥用，越来越多的病原菌开始对传统抗生素产生耐药性，所以急需寻找一类全新的抗菌药物来替代抗生素进行使用。0004阳离子抗菌肽CATIONICANTIMICROBIALPEPTIDES是植物和动物产生的一般由1250个氨基酸残基组成的阳离子型富含精氨酸及赖氨酸多肽，能够保护宿主不受外界病原微生物感染。阳离子抗菌肽的抗菌谱比传统抗生素宽，来自昆虫、猪、蛙以及人的阳离子抗菌肽不仅对革兰氏阳性菌。
7、及革兰氏阴性菌有抗菌作用，而且还具有抗真菌及抗病毒活性。传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件，如使酶变性，来达到杀菌的目的，但细菌只要一种基因突变后就可以抵抗此类抗生素的攻击。而阳离子抗菌肽则通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用，以此穿透杀死细菌，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。但天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性，对病原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性并最大程度降低其毒性是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。目前的研究主要将螺旋的两性抗菌肽作为研究对象，围绕阳离子氨基酸以及疏水性氨基酸数量及位置，对抗菌肽进行结。
8、构改造，如残基替换、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽链的正电荷含量等，取得了较大进展。0005富组蛋白HISTIDINERICHPROTEIN,HRPS或HISTATINS是一类存在于灵长类动物腮腺和颌下腺分泌物中富含组氨酸的阳离子多肽。现已分离出至少12种人HRPSHRP112，其中HRP1、HRP3及HRP5是主要富组蛋白，占总HRPS的8590，分别由38，32，24个氨基酸组成。HRP1和HRP3由不同的基因编码，HRP5是HRP3经蛋白酶水解的产物，包含在HRP3的N末端24个残基中。编码HRP1，3的基因已被测序且定位于人类第4号染色体Q13上。现有研究表明HRPS具有多种活跃的。
9、生物学功能，其抗微生物作用尤为重要，如抑制、杀灭变形链球菌和白色念珠菌等。0006HRP5含有24个氨基酸残基，分子量为3037D。其氨基酸序列为ASPSERHISALALYSARGHISHISGLYTYRLYSARGLYSPHEHISGLULYSHISHISSERHISARGGLYTYRSEQIDNO1。RAJ等学者认为HRP5抗白色念珠菌的特性与其氨基酸序列有关，他们分别将HRP5及其残基片段N16116位氨基酸、C16924位氨基酸、C141124位氨基酸、C121324位氨基酸、C101524位氨基酸和M10716位氨基酸分别与不同浓说明书CN104292324A2/9页4度的白色念球。
10、菌作用，检测其抗白色念球菌的能力。试验结果表明C16和C14有较强的抑制白色念珠菌生长的能力，而且HRP5与C16的抗白色念球菌的活性基本一致，而同样含有16个氨基酸的N16抗白色念珠菌的活性远远低于C16。这一结果提示HRP5的抗白色念珠菌的功能区位于羧基端。为了进一步研究HRP5的结构和功能的关系，许多学者通过残基替换得到了一系列的变异体，其中较重要的是DHVAR1、DHVAR2、DHVAR4、DHVAR5。它们是HRP5活性区1124位氨基酸变异体。发明内容0007多肽或其药用盐，所述多肽具有如下氨基酸序列0008XAA1XAA2XAA3XAA4XAA5XAA6XAA7XAA8XAA9L。
11、EUXAA11LYSTYRLEUARGXAA16XAA17XAA18SEQIDNO20009其中XAA1为CYS或缺失；0010XAA2为LYS、DLYS、ARG、DARG、HOR或缺失；0011XAA3为LEU、ILE、NLE、VAL、TRP、PHE、DPHE、THI或缺失；0012XAA4为LYS、DLYS、ARG、DARG、AIB或HOR；0013XAA5为LYS、DLYS、ARG、DARG或HOR；0014XAA6为LEU、ILE、NLE、VAL、TRP、PHE、DPHE或THI；0015XAA7为LEU、ILE、NLE、VAL、TRP、PHE、DPHE或THI；0016XAA8为LY。
12、S、DLYS、ARG、DARG或HOR；0017XAA9为LYS、DLYS、ARG、DARG或HOR；0018XAA11为LEU、ILE、NLE、VAL、TRP、PHE、DPHE或THI；0019XAA16为LYS、DLYS、ARG、DARG或HOR；0020XAA17为LEU、ILE、NLE、VAL、TRP、PHE、DPHE或THI；0021XAA18为CYS或缺失，当XAA1与XAA18同为CYS时，该多肽可以形成环肽。0022作为本发明的一种优选方案XAA1与XAA18同为CYS或同时缺失；XAA2优选ARG、DARG或缺失；XAA3优选PHE、DPHE或缺失；XAA4优选LYS、DLY。
13、S、ARG、AIB或HOR；XAA5优选LYS、ARG或DARG；XAA6优选LEU、ILE或NLE；XAA7优选TRP、PHE、DPHE或THI；XAA8优选LYS、DLYS或ARG；XAA9优选LYS、DLYS或ARG；XAA11优选LEU、DPHE或PHE；XAA16优选LYS、DLYS或ARG；XAA17优选TRP、PHE、DPHE或THI。0023本发明所涉及的氨基酸残基既包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本发明所涉及的天然氨基酸所对应的三字母代码表如表1所示，本发明所涉及的非天然氨基酸所对应的三字母代码表及结构如表2所示。0024本发明所涉及的所有氨基酸残基若不特别限定其构型，代。
14、表L型氨基酸。0025本发明所涉及的多肽，既可以是线性肽，也可以是环肽。当XAA1与XAA18同为CYS时，可以通过加入氧化剂使得XAA1与XAA18之间形成二硫键，此时该肽由线性肽变成环肽。0026本发明所涉及的多肽为线性肽时，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺的形式，优选以酰胺的形式存在。0027表1天然氨基酸三字母代码表0028说明书CN104292324A3/9页50029表2非天然氨基酸三字母代码表及结构003000310032本发明优选的一个实施方式中公开了一种线性的多肽AMP1，其氨基酸序列为0033LYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGL。
15、YSPHENH2SEQIDNO30034本发明另一个优选的实施方式中公开了一组线性的多肽AMP2，AMP3，AMP4，AMP5，AMP6，AMP7，AMP8，AMP9，AMP10，AMP11，AMP12，其氨基酸序列分别为说明书CN104292324A4/9页60035LYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGDLYSDPHENH2SEQIDNO40036DLYSDARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGDLYSDPHENH2SEQIDNO50037DLYSDARGLEUPHEDLYSDLYSLEULEULYSTYRLEUARGDLYSD。
16、PHENH2SEQIDNO60038PHELYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSPHENH2SEQIDNO70039LYSARGLEUPHELYSARGLEUPHELYSTYRLEUARGARGPHENH2SEQIDNO80040ARGARGILEPHELYSARGLEUPHELYSTYRLEUARGARGPHENH2SEQIDNO90041ARGLEUARGARGILEPHELYSARGLEUPHELYSTYRLEUARGARGPHENH2SEQIDNO10LYSARGLEUTHILYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSTHINH2SEQ。
17、IDNO110042LYSARGNLEPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSTHINH2SEQIDNO120043AIBARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSTHINH2SEQIDNO130044HORARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSTHINH2SEQIDNO140045本发明的又一个优选的实施方式公开了一种环状的多肽AMP13，其氨基酸序列为0046SEQIDNO150047本发明还有个目的就是提供上述线性及环状多肽的制备方法，可以采用本领域技术人员熟悉的固相化学合成技术制备线性肽以及通过双氧水氧。
18、化法在线性肽的基础上制备环肽。0048固相化学合成技术的制备步骤如下00491在树脂上固相合成多肽；00502将步骤1的产物在三氟乙酸或氢氟酸中进行裂解，优选三氟乙酸，并加入侧链保护基清除剂，然后用520倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀45次，真空干燥，得到粗肽；0051若本发明所涉及的多肽C末端为羧酸形式则步骤1采用WANG树脂进行合成；若本发明所涉及的多肽C末端为酰胺形式则步骤1采用RINKAMIDEMBHA树脂进行合成。0052步骤1是在液相环境中进行，具体包括浸泡树脂脱除氨基保护基洗涤偶联氨基酸监测洗涤脱除氨基保护基顺序偶联剩余氨基酸干燥树脂。0053其中氨。
19、基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨说明书CN104292324A5/9页7基保护基选自叔丁氧羰基BOC、苄氧羰基Z和9芴基甲基羰基FMOC，优选9芴基甲基羰基FMOC。0054作为固相多肽合成技术的一个优势，对部分氨基酸的侧链可以通过引入化学基团进行保护，例如ARG及HOR可以采用五甲基苯并呋喃5磺酰基PBF；CYS可以采用三苯甲基TRT；LYS及TRP可以采用叔丁氧羰基BOC；TYR可以采用叔丁基TBU。所述的保护基团不限于此，可以根据本领域常规方案进行合理选择。0055步骤1的液相环境所用溶剂选自二甲基甲酰胺DMF或二氯甲烷DCM，优选DMF。0056步骤1中脱。
20、除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶PIP溶液，浓度1040PIP/DMF，脱除时间为2050MIN。优选浓度为2025PIP/DMF，脱除时间2535MIN。0057步骤1中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，偶联试剂由碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂与1羟基苯并三唑HOBT组成。0058碳二亚胺型试剂包括二环己基碳二亚胺DCC、二异丙基碳二亚胺DIC及N二氨基丙基N乙基碳二亚胺EDC。0059苯并三氮唑鎓盐型试剂包括21H苯并三偶氮L1基1,1,3,3四甲基脲四氟硼酸酯TBTU、O苯并三唑N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸盐HBTU、六氟磷酸苯并三唑1氧基三二甲氨。
21、基磷BOP、六氟磷酸苯并三唑1基氧基三吡咯烷基磷PYBOP等。0060偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺DIC与1羟基苯并三唑HOBT、21H苯并三偶氮L1基1,1,3,3四甲基脲四氟硼酸酯TBTU与1羟基苯并三唑HOBT，最优选DIC二异丙基碳二亚胺与1羟基苯并三唑HOBT。0061步骤1中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。0062步骤1中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。0063步骤2所述的侧链保护基清除剂是选自如茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2乙二硫醇、间甲酚等两个或者两个以上的组合并与三氟乙酸或氢氟酸按520V/V进行配制得到。优选三氟乙酸。
22、TFA茴香硫醚1,2乙二硫醇75苯酚水855541。0064特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的多肽制备方法还包括采用常规手段进行纯化。所采用的纯化方法可以为反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。0065本发明所涉及的多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度MIC来鉴定。美国临床实验室标准化委员会NCCLS推荐采用常量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度MIC，培养基采用MUELLERHINTONMH肉汤培养基。以两性霉素B、多粘菌素E及万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的多肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有显著的杀菌效果，对临床上分离的耐药。
23、性革兰氏阳性菌、耐药性革兰氏阴性菌及耐药性真菌同样具有显著的杀菌效果，具有广谱、高效的特点。因此本发明所涉及的多肽可以在临床上作为活性成分替代传统抗生素进行治疗。说明书CN104292324A6/9页80066以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。具体实施方式0067实施例1AMP1的制备及纯化0068序列LYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSPHENH2SEQIDNO300691材料及试剂0070RINKAMIDEMBHA树脂，取代值041MMOL/G。0071所需带保护的氨基酸为FMOCLARGPBFOH、FMOCLLEUOH、。
24、FMOCLLYSBOCOH、FMOCLPHEOH及FMOCLTYRTBUOH。0072试剂HOBT、DIC、DMF、哌啶。00732仪器0074PSI300型多肽合成仪、WATERS600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。00753操作步骤以025MMOL为例0076A固相化学合成多肽0077称取RINKAMIDEMBHA树脂061G，置于多肽合成仪的反应器中，加入10MLDMF，浸泡2H，然后加入20PIP/DMF溶液15ML，混合30MIN来脱除氨基保护剂，用DMF洗涤树脂7次，然后向反应器中加入3874MGFMOCLPHEOH、等摩尔的偶联试剂DIC033MOL/L与HOBT033MO。
25、L/L进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，确保氨基酸偶联到树脂上，用DMF洗涤树脂7次。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。0078B裂解及沉淀0079肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照1G树脂10ML裂解试剂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFA茴香硫醚1,2乙二硫醇75苯酚水855541，室温搅拌反应3小时，抽滤。接着向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清，再用冰乙醚反复洗涤沉淀45次，真空干燥，称重粗肽。0080C反相色谱纯化0081用制备型HPLC，采用反相色谱法，纯化上述。
26、粗肽。0082HPLC条件如下0083色谱柱XBRIDGETMPREPC185MOBDTM19150MM0084流速10ML/MIN0085检测波长210NM0086流动相A含01TFA水溶液0087B含01TFA的乙腈0088梯度洗脱程序如表30089表3梯度洗脱表0090说明书CN104292324A7/9页90091收集目标肽纯度大于99的部分，然后50减压浓缩至干。经ESIMS测定，该肽的分子量为188028，理论值为188043。0092实施例2表4中HRP5类似物的制备及纯化00931材料及试剂0094RINKAMIDEMBHA树脂，取代值041MMOL/G。0095所需带保护的氨。
27、基酸FMOCLARGPBFOH、FMOCDARGPBFOH、FMOCLLEUOH、FMOCLHORPBFOH、FMOCLLYSBOCOH、FMOCDLYSBOCOH、FMOCLPHEOH、FMOCDPHEOH、FMOCLTYRTBUOH、FMOCLILEOH、FMOCLNLEOH、FMOCLTHIOH及FMOCLAIBOH。0096试剂HOBT、DIC、DMF、哌啶。00972仪器0098PSI300型多肽合成仪、WATERS600半制备型高效液相色谱仪、磁力搅拌器。00993操作步骤以025MMOL为例0100以类似实施例1中操作步骤AC的方法制备及纯化表4中的多肽，收集纯度大于99的部分，。
28、然后50减压浓缩至干。ESIMS测定值如表4所示。0101表4HRP5类似物0102说明书CN104292324A8/9页100103实施例3环肽AMP13的制备及纯化0104序列SEQIDNO1501051材料及试剂0106RINKAMIDEMBHA树脂，取代值041MMOL/G。0107所需带保护的氨基酸为FMOCLARGPBFOH、FMOCLLEUOH、FMOCLLYSBOCOH、FMOCLPHEOH、FMOCLTYRTBUOH及FMOCLCYSTRTOH。0108试剂HOBT、DIC、DMF、哌啶、30H2O2。01092仪器0110PSI300型多肽合成仪、WATERS600半制备型。
29、高效液相色谱仪、磁力搅拌器。01113操作步骤0112A以类似实施例1中操作步骤AC的方法制备及纯化具有如下序列CYSLYSARGLEUPHELYSLYSLEULEULYSTYRLEUARGLYSPHECYSNH2的多肽，收集纯度大于99的部分，然后50减压浓缩至干。经ESIMS测定，该肽的分子量为208624，理论值为208672。0113B分子内二硫键的形成0114称取本实施例操作步骤A中多肽1000MG，溶于200ML水，配制成浓度为05MG/ML的溶液，加入333ML浓度为30的过氧化氢，室温下搅拌反应，用HPLC监测反应的进行，直至完全转化为氧化型。0115C反向色谱纯化0116以类。
30、似实施例1中操作步骤C的方法纯化，收集环肽AMP13纯度大于99的部分，然后50减压浓缩至干。经ESIMS测定，该肽的分子量为208425，理论值为208472。0117实施例4体外抗菌活性测定0118根据美国临床实验室标准化委员会NCCLS推荐的常量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度MIC，培养基采用MUELLERHINTONMH肉汤培养基。0119具体步骤为01201抗菌药物贮存液制备0121精确配制浓度为1280G/ML的上述HRP5类似物AMP113和阳性对照品两性霉素B、多粘菌素E及万古霉素。配制好的各贮存液置于20环境中保存备用。01222培养基的配制0123称取MH肉汤培养基2。
31、1G，溶于蒸馏水中并定容至1L，121高温灭菌30MIN。01243接种物的制备0125用接种环挑取形态相似待检菌落35个，接种于45ML的MH肉汤中，35孵育26H。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至05麦氏比浊标准，约含12108CFU/ML。用MH肉汤将上述菌悬液进行1100稀释后备用。01264稀释抗菌药物的制备及菌液接种0127取无菌试管13100MM13支，排成一排，第1管中加入16MLMH肉汤，第213说明书CN104292324A109/9页11管中各加入1MLMH肉汤，然后向第1管加入抗菌药物原液1280G/ML04ML，混匀，接着吸取1ML至第2管，混匀后。
32、再从第2管中吸取1ML至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ML弃去，然后向第111管及第13管中加入上述制备好的接种物各1ML，使每管最终菌液浓度约为5105CFU/ML。第111管药物浓度分别为128G/ML、64G/ML、32G/ML、16G/ML、8G/ML、4G/ML、2G/ML、1G/ML、05G/ML、025G/ML、0125G/ML，第12管为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第13管为不含抗菌药物的阴性对照。01285孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35普通空气孵箱中孵育1620H。01296结果以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度M。
33、IC。各抗菌肽的MIC测定结果如表5所示。0130表5HRP5类似物的MIC测定结果0131说明书CN104292324A111/15页1200010002序列表CN104292324A122/15页130003序列表CN104292324A133/15页140004序列表CN104292324A144/15页150005序列表CN104292324A155/15页160006序列表CN104292324A166/15页170007序列表CN104292324A177/15页180008序列表CN104292324A188/15页190009序列表CN104292324A199/15页200010序列表CN104292324A2010/15页210011序列表CN104292324A2111/15页220012序列表CN104292324A2212/15页230013序列表CN104292324A2313/15页240014序列表CN104292324A2414/15页250015序列表CN104292324A2515/15页26序列表CN104292324A26。