核酸检测方法 【技术领域】
本发明涉及核酸检测领域。具体地说，本发明提供一种通过同时进行靶核酸扩增和可检测信号的生成来检测样品中靶核酸的方法。
背景技术
核酸扩增技术广泛应用于临床微生物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域。这些技术将是新兴的药理基因组学、产前诊断和分子水平癌症诊断和治疗的重要组成部分。扩增产物的检测非常重要，它决定核酸检测的特异性、灵敏度、可靠性及成本。
借助核酸序列特异性扩增能够进行序列的灵敏检测。随着聚合酶链反应(PCR)的发明，出现了很多其他扩增方法，这些方法要么是热循环扩增方法，要么是等温扩增方法。扩增产物的分析或检测对这些方法来说都很重要。一种好的检测手段应该具有以下特征：
(a)特异性强。检测方法应该具有序列特异性。为此可以使用序列特异性探针。
(b)对扩增过程无干扰。检测过程应对扩增过程无影响或影响很小，不应使特异性或灵敏度降低。
(c)简便易行。检测方法应尽量减少扩增后操作、易于使用、高产出、低成本。这些要求都至少部分取决于该方法是否简便。
(d)同时进行扩增和检测。这样才能够对扩增过程进行实时监测。实时检测能够实现在很大的动态范围内进行准确定量。
(e)封闭均相系统。这样的系统能够大大减少产物夹带造成的交叉污染。为了尽量减少对扩增产物进行扩增后操作时严重交叉污染的危险，扩增和检测应在封闭系统中进行。
等温扩增指的是在基本恒定的温度下进行的一类扩增。等温扩增的例子有基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导地扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、单引物等温扩增(SPIATM)和指数单引物等温扩增(X-SPIATM)(公开于美国专利5130238、5409818、5554517、6063603、5399491、5437990、5480784、5888779、6090591、5270184、5916779、5854033、6183960、6210884、6344329、6251639)、3SR(自动维持序列扩增)(Guatelli，1990)和环介导的等温扩增(LAMP)(Notomi，2000，美国专利6410278)。现有技术中已研究了各种实时检测手段，包括荧光极化(FP)(Walker，1996；Spears，1997)、限制性核酸内切酶介导的FRET探针切割(Nadeau，1999)、分子灯塔(Leone，1998；Nilsson，2002)。
美国专利6350580公开了一种用含有二级结构的探针和一种FEN核酸酶检测靶核酸的方法。在有靶分子存在时，探针与靶分子结合并被FEN核酸酶切割。如果没有靶分子存在，探针则以所述二级结构的构象存在。但该方法的许多步骤有以下缺点：
(a)探针的设计更为困难。这类探针有两个熔点，即二级结构的熔点和靶杂交的熔点。在有靶序列存在时，探针可以维持两种形式，即二级结构形式或杂交形式。这两种形式彼此竞争。杂交熔点受二级结构熔点的影响。关键是设计出其熔点对任何靶检测都适合的探针，而二级结构的存在使得杂交熔点的预测更加复杂。
(b)制备这样的探针更加困难。由于固相寡核苷酸合成的偶合效率低于100％，化学合成的寡核苷酸/探针是正确长度的和短于正确长度的寡核苷酸/探针的混合物。探针越长，它所含的短于正确长度的寡核苷酸/探针就越多。加入形成二级结构的序列使探针比没有这一序列的探针要长。结果降低了产率，提高了成本。
(c)具有二级结构的寡核苷酸难于纯化。探针合成后的纯化非常重要。纯化寡核苷酸时，其稳定的二级结构会使纯化复杂化，这是公知的事实。
(d)含有二级结构的探针被FEN核酸酶非特异性切割降低了基于这一机制的所有检测的可靠性。用该方法进行检测会产生很高的背景，从而严重限制检测灵敏度或产生假阳性结果。
【发明内容】
为克服上述问题，本发明提供了一种通过同时进行靶核酸扩增和可检测信号的生成来检测样品中的靶核酸的方法。本发明方法能够在密闭均相系统中特异而灵敏地定量检测样品中的靶核酸，无须对扩增产物进行扩增后处理，最大限度地减少了扩增产物污染的机会。实时操作时，可以在很大的动态范围内准确定量靶核酸。该方法能够对每一靶核酸都产生一个独特的可检测信号，从而对多个核酸同时进行定量。除了实时操作外，也可以进行扩增后产物的分析。
因此，本发明提供了一种检测靶核酸的方法，所述方法包括：
(1)用一种不具有显著的5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶扩增所述靶核酸，生成单链核酸；
(2)使扩增后的靶核酸与一种标记探针形成一种切割结构；
(3)用一种结构特异性核酸酶切割所述切割结构内的所述标记探针，产生一种可检测的信号；
(4)测量所述可检测信号，从而测定所述靶核酸。
【附图说明】
图1是被结构特异性核酸酶识别和切割的示例性结构的示意图。左边一组表示由不带5′悬垂的探针形成的切割结构。右边一组表示由带5′悬垂的探针形成的切割结构。包括一个模板分子和一个探针分子的双分子切割结构见图1A。由一个模板分子、一个探针和第三个寡核苷酸形成的三分子切割结构见图1B-1J。与模板杂交时，在探针和第三个寡核苷酸之间可以有缺口、切口或重叠结构，这些结构分别示于图1B、1E、1H；1C、1F、1I；和1D、1G、1J。图1B-1D为由参与扩增的寡核苷酸或其延伸形式与探针和模板分子一起形成的切割结构。图1E-1J画出了由不参与扩增的非延伸性寡核苷酸、探针和模板分子形成的切割结构。非延伸性寡核苷酸可以有3′悬垂(图1 H-1J)，也可以没有(图1E-1G)。图1中“→”表示5′→3′方向的核酸/寡核苷酸链；“●”表示标记探针的5′端；“■”表示标记探针的3′端；“-”表示非延伸性寡核苷酸。
图2示出用一种结构特异性核酸酶和一种具有强链置换活性的DNA聚合酶进行核酸检测(实施例2)。所用的结构特异性核酸酶是来源于Archaeglobus fulgidus的悬垂核酸内切酶-1(Afu FEN-1)。所用的具有强链置换活性的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶LF，它是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶的一种缺失突变体，不具有5′内切/外切核酸酶结构域。图2A和图2B分别显示的是在没有和有模板分子存在时加入不同量的Afu FEN-1的荧光变化情况。图2B的荧光信号减去图2A的荧光信号即反映荧光信号的净增加。结果如图2C所示。FRET探针在5′端有一个6Fam荧光基团，3′端有一个黑洞淬光剂-1(BHQ-1)。当探针完整时，荧光信号较低。用Bst DNA聚合酶LF进行引物延伸形成一种可以被Afu FEN-1识别的切割结构。在这种切割结构内FRET探针的切割使6Fam和BHQ-1在物理上隔开，结果增强了6Fam荧光信号。图2A表明，在没有模板存在时Afu FEN-1不切割探针分子。若无模板，即使加40ng AfuFEN-1，荧光强度也与不加Afu FEN-1/Bst DNA LF(E-)和不加Afu FEN-1(0ng)时相同。这证明模板对产生可检测信号是必要的。
图3显示的是用结构特异性核酸酶和逆转录酶进行核酸检测(实施例3)。逆转录酶是NASBA、TMA及3SR核酸扩增方法中的关键酶。此处所用的逆转录酶来自莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV RT)。所用的结构特异性核酸酶是Afu FEN-1。图3A示出在不同量的MMLV RT存在下的差示荧光光谱(有模板-无模板)。图3B显示MMLV RT的量对荧光强度增加的影响。与用Bst DNA聚合酶LF时一样，切割是以模板指导方式进行的。在这种反应条件下，荧光强度的增加依赖于所加的逆转录酶的量。
图4显示的是用一种高保真DNA聚合酶即Pfu DNA聚合酶进行的人类基因组DNA的PCR扩增(实施例4)。用结构特异性核酸酶Afu FEN-1进行PCR扩增产物的实时检测。图4A显示扩增曲线，表明荧光强度(Rn)随着扩增的进行而增加，其中X轴为扩增循环数，Y轴为Rn。图4B显示循环阈值(Ct)与DNA量的关系图，其中并列的空白柱和阴影柱分别表示两次平行试验的结果。循环阈值是用实时PCR进行靶核酸定量的关键参数，当靶扩增达到一定水平时，荧光强度的增加达到一个具有统计显著性的阈值。相应的循环数即为循环阈值。样品中的靶序列数量越多，达到阈值所需要的循环数就越少，循环阈值也就越低。
图5显示了用一种无核酸酶DNA聚合酶即Stoffel DNA聚合酶进行人类基因组DNA的PCR扩增。PCR加入结构特异性核酸酶Afu FEN-1，使扩增和检测同时进行成为可能。用Stoffel DNA聚合酶扩增了来自HaCat细胞基因组DNA的人18S核糖体RNA基因的一个片段。图5A显示扩增曲线。图5B显示用连续稀释的人类基因组DNA制作的标准曲线。
图6显示切割产物的毛细管电泳(CE)检测---Bst DNA聚合酶LF和Afu FEN-1(实施例6)。探针的切割导致探针分子的物理、化学及生物学特性，如大小、所带电荷及迁移率等的改变。检测切割情况的一种方法是监测带荧光基团片段在毛细管电泳中的迁移情况。未切割探针只观察到一个峰(6A)。用Bst DNA聚合酶LF进行引物延伸触发了探针被Afu FEN-1切割，这是由多个峰的存在得到证实的(图6B)。
图7显示切割产物的毛细管电泳检测---Stoffel DNA聚合酶和AfuFEN-1(实施例7)。图7A显示未切割探针。无模板对照没有产生任何其它峰(图7B)，而有模板的反应产生多个切割产物(图7C)。
图8显示切割产物的毛细管电泳检测---MMLV逆转录酶和Afu FEN-1(实施例8)。未切割探针观察到单个峰(图8A)。用MMLV逆转录酶进行引物延伸，用Afu FEN-1进行探针切割，产生一种主要切割产物(图8B)。
图9显示切割产物的毛细管电泳检测---用Stoffel DNA聚合酶和AfuFEN-1进行PCR(实施例9)。用Stoffel DNA聚合酶和Afu FEN-1进行2.4ng人类基因组DNA的PCR扩增，产生多个产物(图9B)。图9A显示未切割的探针对照。
【具体实施方式】
本说明书中所用的术语“靶核酸”或“模板”，不仅是指样品中天然存在的序列，而且也是指所有由化学合成和/或酶反应创制的序列，包括单链核酸、双链核酸或二者的混合物。
术语“核酸聚合酶”是指DNA聚合酶或RNA聚合酶。术语“不具有显著的5′→3′核酸酶活性”是指：(a)该酶不具有任何内在的5′→3′核酸酶活性，其实例有只具有3′→5′核酸外切酶或校正活性的逆转录酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶。(b)或者该酶的5′→3′核酸酶活性大大降低，使得在没有结构特异性核酸酶存在下不能产生可检测的信号。5′→3′核酸酶活性的降低可以通过缺失突变或随机突变或定位诱变来实现。这类酶的实例有大肠杆菌DNA聚合酶克列诺片段、KlenTaq(Barnes，1992)、Stoffel DNA聚合酶(Lawyer，1993)、AmpliTaq FS(Taq DNA聚合酶的点突变体，其5′核酸酶活性大大降低)、R25C和R74H突变体(Merkens，1995)。这类酶包括由中温宿主或嗜热宿主或过热宿主原始分离或克隆的酶。(c)或者缺少功能上有意义的5′→3′核酸酶活性。在这种情况下，具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶可以与特异性抑制剂一起使用，以抑制其核酸酶活性。
本发明所用酶的选择取决于不同的扩增方法。对于SDA、RCA、LAMP、SPIATM及X-SPIATM，DNA聚合酶有强的链置换活性是最重要的因素。最常用的酶是Bst DNA聚合酶大片段。对于NASBA、3SR、TMA等，选用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶，因为它们能使与RNA模板退火的引物延伸而产生互补DNA(cDNA)链。迄今为止所鉴定的天然逆转录酶都来自逆转录病毒，如莫罗尼鼠白血病毒(MMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)、劳斯伴随病毒(RAV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)。这些逆转录酶的很多遗传工程突变体可从商业途径获得。NASBA、3SR、TMA还要求有RNA聚合酶。广泛使用的RNA聚合酶包括来自SP6、T4和T7噬菌体的RNA聚合酶。对于PCR扩增来说，由于要求热循环，所以需要热稳定的DNA聚合酶。许多热稳定的DNA聚合酶都已经被克隆并定性。这些聚合酶包括但不限于以下来源的聚合酶：Pyrococcus abyssi、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus woesei、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus sp.9°N-7、Thermococcus sp.TY、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、Thermus flavus、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima。通过DNA重组产生各种突变体是本领域的公知技术，因此这些突变体也包括在本发明中。
术语“结构特异性核酸酶”是指具有5′内切/外切核酸酶活性并以结构特异性方式切割核苷酸的核酸酶。能被这种核酸酶识别的示例性结构见图1。核酸能够形成各种不同的分子内结构和分子间结构，例如双螺旋、发夹、霍利迪连结体、假Y、三叶草、5′悬垂结构、复制叉、凹陷5′末端等，其中一些分子间结构示于图1。“结构特异性核酸酶”是指能够识别某些类型的上述结构，并在识别后对其进行切割的核酸酶。切割特异性是由底物的结构而不是其序列决定的。相应的核酸结构称为“切割结构”。不同的结构特异性核酸酶具有取决于底物结构的不同底物选择性。这种结构特异性核酸酶不应对线性和单链寡核苷酸具有显著的核酸酶活性。这类核酸酶包括：i)悬垂内切核酸酶-1(FEN-1)；ii)某些DNA聚合酶的5′核酸酶活性。许多FEN-1都已被分离、纯化和鉴定。编码FEN-1的基因已经被克隆并用于生产FEN-1。其实例有以下来源的FEN-1：Archaeglobusfulgidus、人、热自养甲烷杆菌ΔH、Methanococcus jannaschii、鼠、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus woesei、Xenopus laevis、小牛RTH-1蛋白、啤酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)Rad27蛋白、粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)Rad2蛋白。第二类结构特异性核酸酶包括与以下来源的真细菌DNA聚合酶相关的5′内切/外切核酸酶活性：大肠杆菌(DNA聚合酶I)、水生栖热菌、Thermusflavus、Thermus thermophilus。这类DNA聚合酶都含有5′内切/外切核酸酶结构域，已证明该结构域在没有DNA聚合活性存在下能够正确发挥功能。已研究了该核酸酶结构域的结构和功能。由定位突变或缺失突变产生的突变体虽然丧失了DNA聚合功能，但仍保留5′核酸酶活性(Lyamichev，1999；Kaiser，1999)。因此，第二类结构特异性核酸酶也包括由上述方法得到的突变体。
尽管大部分所述结构特异性核酸酶优先切割与DNA模板杂交的探针，但也有一些能够对RNA模板起作用。例如，Taq DNA聚合酶突变体和Tth DNA聚合酶突变体具有显著的RNA模板依赖性5′核酸酶活性(Ma，2000；Eis，2001)。这些酶可用于涉及RNA产生的扩增方法，如NASBA、TMA和3SR。
对于特定的扩增方法，要根据以下几点选择结构特异性核酸酶和核酸聚合酶：
a.反应温度的要求及核酸酶的热稳定性。两种酶都应耐受扩增过程中的反应温度或温度的变化。
b.热稳定性的相容性。要获得最大的靶扩增及信号生成，应该有相容的热稳定性谱。
c.缓冲液的相容性。不同的酶可能要求不同的最适pH、缓冲液和盐的类型和浓度、Mg2+浓度、共溶剂、去污剂等。同一种缓冲体系中两种酶都应在正确行使功能。
d.模板的类型。例如，应选用逆转录酶来扩增RNA靶或RNA中间产物。如果切割结构中的模板分子是RNA，则应使用适当的结构特异性核酸酶，如Ma和Eis所描述的酶(Ma，2000；Eis，2001)。
e.切割结构的类型。结构特异性核酸酶对不同切割结构的作用是不同的。据Hosfield报导(Hosfield，1999)，在切割假Y结构时，Methanococcus jannischii的FEN-1比Archaeglobus fulgidus和Pyrococcus furiosus的FEN-1要有效得多。因此，如果将假Y设计为主要的切割结构，就应该优先选择Methanococcus janni schii FEN-1而不是Archaeglobus fulgidus或Pyrococcus furiosus FEN-1。另一个例子是，对于有发夹结构的底物，Methanococcus jannischii和热自养甲烷杆菌FEN-1比水生栖热菌DNA聚合酶、Thermus thermophilus DNA聚合酶、Archaeglobus fulgidus FEN-1及Pyrococcus furiosus FEN-1具有强得多的活性(Kaiser，1999)。
f.靶扩增的保真度要求。对于任何基于靶扩增的核酸检测来说，高保真复制都是最基本的要求。希望使用具有最高保真度的聚合酶。但是，聚合酶都会产生一些错误，如不同频率的碱基置换、缺失和插入。相对于那些有校正活性的聚合酶来说，没有3′→5′外切核酸酶活性/校正活性的聚合酶通常具有较低的复制保真度。前者的碱基置换错误率是10-6-10-7，而后者是10-2-10-6(Kunkel，1992)。产生不希望的复制错误的几率与复制循环数成比例地增加。如果错误发生得早，则错误序列会呈指数扩增，从而严重影响产物的分析。对靶含量较低的样品影响尤其严重，因为要通过更多的循环才能获得一定量的扩增产物。因此，必须设定保真度要求以满足扩增和检测特异性的要求，并应相应地对聚合酶进行筛选。
核酸聚合酶和结构特异性核酸酶是独立存在的，但是它们可以通过DNA重组技术融合到一起。这种融合蛋白可能同时具有核酸聚合酶和结构特异性核酸酶活性。因此，本发明也包括用这种融合蛋白进行靶核酸的扩增和检测。
“标记探针”指的是一种寡核苷酸，其中含有：(i)一种供模板特异性杂交的模板特异性序列；(ii)一个能够在形成切割结构后被所述结构特异性核酸酶切割的接头；(iii)标记物；(iv)必要的附加序列和/或部分其他序列以便于进行以下过程：a杂交；b切割；c检测；d选择性酶作用或抑制这种作用。
该探针可以含有天然碱基，如腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、胸腺嘧啶，也可以含有碱基类似物，包括但不限于7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤(腺嘌呤和鸟嘌呤)、2-和/或6-硫嘌呤(腺嘌呤和鸟嘌呤)、5-溴尿嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。
除了正常的5′-3′磷酸二酯键外，探针寡核苷酸的骨架上可以含有一些修饰，例如出现于肽核酸(PNA)中的肽键、硫代磷酸酯、N3′→P5′亚磷酰胺、甲基膦酸酯、吗啉核酸。
核糖和/或2-脱氧核糖是优选的糖部分。但是，该探针也可含有其他糖类，如2-O-烷基核糖、阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、2-脱氧-2-氟阿拉伯糖、1，5-脱水己糖醇、2-O，4-C-亚甲基核糖、环己烯。
该探针可含有某些缀合物以便于进行扩增和/或检测。这种缀合物的例子有小沟结合物、芘、胆固醇、吖啶、生物素等。
该探针的骨架上必须至少含有一个易于被结构特异性核酸酶切割的连键。选择性切割可以通过骨架修饰、糖修饰、使用碱基类似物及其他分子部分与探针的缀合来实现。
该探针必须含有与靶核酸基本互补的序列，以使探针/靶核酸双链结构在切割温度下有足够的热稳定性和足够的特异性。非互补序列可以分散于探针内部或定位在5′和/或3′端。探针互补区的长度及选择由多个因素决定，如碱基组成、前后序列、扩增区的大小和序列、切割温度、探针/靶双链的热稳定性、杂交严格性、检测特异性要求、简并性、及修饰基团的存在与否，等等。靶互补区的长度一般是5到500个核苷酸。优选的长度是8到40个核苷酸，更优选的是10到30个核苷酸。
该探针优选不能被核酸聚合酶延伸。因为碱基配对核苷酸的3′羟基是寡核苷酸延伸所必需的，所以可以通过去除或修饰这个3′羟基而使其不能延伸。防止探针延伸的方式有2′，3′-双脱氧核苷酸、3′磷酸、3′烷基化、无环核苷酸等。这种3′修饰是公知技术。因为互补3′端对于用聚合酶进行有效延伸是必要的，所以在探针3′端加入一个非互补序列是防止延伸的另一种方法。探针中也可以引入干扰核酸聚合酶与3′端结合或严重抑制其聚合酶活性的修饰。
探针的“标记物”是指能够提供可以用物理、化学、光化学、免疫化学、生物化学等方法检测的信号的任何原子或基团。这些方法包括但不限于下列方法之一或其组合：荧光、化学发光、生物发光、电化学发光、磷光、时间分辨光谱、荧光偏振、酶反应、放射性、比色法、质谱、磁学法、电泳迁移、色谱。
因为靶核苷酸的定量分析在实际操作中是非常需要的，所以标记物作为靶核酸的指示优选是可定量的。
该探针优选带有可相互作用的多种标记物。结构特异性核酸酶的切割作用应定性和/或定量地中止这种相互作用。这对于密闭均相检测系统来说尤为重要。这种相互作用的一个例子是共振能转移。基于荧光共振能转移(FRET)、发光共振能转移(LRET)、磷光共振能转移(PRET)、生物发光共振能转移(BRET)的检测是本领域的已知技术。这种相互作用可以存在于两个小分子之间，如荧光团及其淬光剂。这是迄今为止制备带有两个相互作用基团的探针的最常用方法。相互作用也可以存在于象蛋白质这样的大分子之间(Boute，2002)。在这些探针中，FRET探针已广泛用于扩增后靶分子的检测。最常用的FRET探针有两个相互作用的部分。一个是荧光供体基团，另一个是荧光受体基团。尽管荧光受体基团可以带荧光，但优选用非荧光基团作受体。供体基团和受体基团都可以位于5′端、中间或3′端，但优选把供体基团置于5′端。探针的切割将使供体基团与受体基团分离，从而解除受体基团对供体荧光的淬灭。FRET探针可以有多于两个相互作用的部分。例如，美国专利5952180公开了一种制备带有独特荧光发射谱的可延伸寡核苷酸的方法。独特荧光发射谱是由一个组合荧光能量转移标记物产生的。尽管该方法据称可用于DNA测序，但它也很容易地用于制备非延伸性FRET探针。另一个例子是美国专利6037130，该专利公开了制备和使用一种波长变换探针的方法。制作这种波长变换探针至少需要三个相互作用的基团。
寡核苷酸本身可以是一个官能团，并与产生信号的基团相互作用。Nurmi报道了一种单标记荧光铽螯合物探针的合成及其在PCR产物检测中的应用(Nurmi，2000)。连接在寡核苷酸上的铽螯合物的荧光大部分被该寡核苷酸淬灭。用核酸酶将该铽螯合物从寡核苷酸上分离下来能够解除这种淬灭。
该探针优选是单分子的，但也可以是双分子或三分子的。美国专利6432642公开了一种制备双元杂交探针的方法。有文献报导了另外一种含有两个互补寡核苷酸的双元探针(Li，2002)。最近报道了一种三元分子灯塔及其在实时PCR中的应用(Nutiu，2000)。
“切割结构”是指在形成后能被所述结构特异性核酸酶识别并切割的结构。它由至少两个形成双链结构的核酸分子组成。这种切割结构优选由三段核酸形成。示例性的切割结构示于图1。有关这些示例性结构的结构特异性核酸酶切割的文献见以下出版物：Harrington，1995；Hosfield，1998；Matsui，1999；Kaiser，1999；Lyamichev，2000；以及这些出版物中引用的文献。图1左边表示的是带有5′无悬垂标记探针的切割结构，右边表示的是带有5′悬垂标记探针的切割结构。标记探针的3′端也可以有悬垂(未示出)。“悬垂”是指与标记探针所杂交的链非互补的序列。
每个线性核酸分子都有5′和3′端。当两个核酸分子与第三个核酸分子杂交时，位于另一核酸分子3′端的核酸分子是另一核酸分子的“下游”。位于另一核酸分子5′端的核酸分子是另一核酸分子的“上游”。
在一个优选实施方案中，“切割结构”由三个核酸分子形成。三个核酸分子中的两个与第三个核酸分子基本互补。这两个核酸分子之一是标记的探针寡核苷酸。当这两个核酸分子与第三个核酸分子结合时，标记的探针应该位于另一核酸分子的下游。
在切割结构中，标记探针与其上游核酸分子的相对位置可以有缺口(图1B、1E、1H)或切口(图1C、1F、1I)或部分重叠(图1D、1G、1J)。“缺口”是指两个核酸分子的杂交序列至少隔开一个核苷酸。“切口”是指两个核酸分子的杂交序列是并列的。“部分重叠”是指上游核酸分子的杂交序列的3′区域至少有一个核苷酸与标记探针杂交序列的5′区域结合到同一靶核酸序列上。
在一个由三个核酸分子形成的切割结构中，上游的寡核苷酸可以是用于扩增的寡核苷酸或其延伸形式(图1B、1C、1D)。该上游寡核苷酸也可以是与标记探针与同一核酸分子杂交的另一寡核苷酸。尤其重要的是用这一寡核苷酸通过线性扩增的方法如线性RCA和SPIATM来检测产物。寡核苷酸可以有5′悬垂(图中未示出)，也可以没有5′悬垂(图1E-1J)。它可以有3′悬垂(图1H、1I、1J)，也可以没有3′悬垂(图1E、1F、1G)。
本发明可应用于许多扩增方法。本发明可用于等温扩增如NASBA、TMA、3SR、RCA、SDA、LAMP、SPIATM和X-SPIATM，也可用于作为热循环扩增方法的聚合酶链反应。实际上，本发明可用于产生单链核酸分子的任何扩增方法。
本发明在NASBA、TMA和3SR中的应用
由于操作原理上的相似性，这些方法被归为一类加以讨论。这些方法主要用于在恒温下扩增靶RNA。扩增包括以下步骤：
i.RNA模板指导的互补DNA(cDNA)酶促合成。
这一过程也叫逆转录，所用的酶是逆转录酶(RT)。逆转录是由在3′区域带有靶序列、5′区域带有RNA聚合酶启动序列的第一寡核苷酸进行的。单链启动序列只有在变成双链时才具有转录功能。逆转录的结果是形成RNA/DNA杂合双链。
常用的逆转录酶是MMLV-RT、AMV-RT、RSV-RT及其突变体。除了RNA模板指导的DNA聚合酶活性外，逆转录酶也能催化DNA模板指导的DNA合成。
ii.RNA酶H降解RNA/DNA杂合双链中的RNA链。
许多逆转录酶也具有RNA酶H的活性，能选择性地降解RNA/DNA杂合双链中的RNA链。为了进行这一步骤，由逆转录酶或另一种RNA酶H来提供需要的RNA酶H活性。除去RNA链后，cDNA基本变成单链。
iii.双链DNA的合成。
第二寡核苷酸与单链cDNA杂交，并被逆转录酶延伸产生DNA/DNA双链。因此，对应RNA聚合酶的启动区是双链的并且是有功能的。
iv.通过体外转录合成单链RNA。
借助有功能的启动子和RNA聚合酶，每一个DNA/DNA双链能产生数百个RNA分子。这完成了一个扩增循环。结果，每一个RNA模板分子被扩增数百次。
v.重复i到iv的步骤。
这将使靶核酸得到指数扩增。
为将本发明应用于NASBA、TMA和3SR中，可以利用步骤ii中产生的单链cDNA和步骤iv中的单链RNA与标记探针形成切割结构。切割结构可以只由这两个分子形成，也可以再加上另一个寡核苷酸，该寡核苷酸与任一单链核酸至少部分互补，并且在标记探针的上游。如果选用单链DNA来形成切割结构，则所述另一个寡核苷酸可以是第二个寡核苷酸或者延伸的第二个寡核苷酸。如果选用所述单链RNA来形成切割结构，则所述另一个寡核苷酸可以是第一个寡核苷酸或者延伸的第一个寡核苷酸。图1B(缺口结构)、1C(切口结构)、1D(重叠结构)是可能的切割结构的实例。另外，也可以加入第三个寡核苷酸形成如图1E和1H(缺口结构)、1F和1I(切口结构)、1G和1J(重叠结构)所示的切割结构。
优选用单链DNA形成切割结构。当用单链RNA形成切割结构时，会发生两种切割。一种是希望的结构特异性核酸酶对探针分子的切割，另一种是不希望的RNA酶H对RNA分子的切割。后一切割破坏模板分子或扩增产物，并大大减慢扩增的速度。这两种扩增同时存在会使扩增变得复杂。而用单链DNA形成的切割结构则完全避免了这个问题。
本发明在RCA中的应用
RCA是等温扩增靶核酸和/或报告序列的方法。线性和指数RCA扩增都曾见诸报道。其应用包括：通过信号或靶扩增检测DNA和RNA；利用结合寡核苷酸的抗体检测蛋白分子进行RCA免疫分析；扩增质粒用于DNA测序；特异序列的原位检测。
用于靶核酸检测时，一个5′磷酸化的单链DNA寡核苷酸的5′及3′末端含有靶互补区。与靶模板杂交后，5′和3′端被一个切口分开。该切口随后被DNA连接酶封闭，产生环状DNA分子。结合到单链DNA环上后，第一个寡核苷酸被具有强链置换活性的DNA聚合酶延伸。每一个杂交的引物都能产生一条线性单链DNA分子，该DNA分子最多带有105个串联重复的串联体DNA环互补链(Lizardi，1998)。这是RCA的线性形式。应用与DNA环同源且与延伸的第一个寡核苷酸互补的第二个寡核苷酸，可以实现指数扩增。
据报道，Bst DNA聚合酶LF、噬菌体φ29 DNA聚合酶、exo-Vent DNA聚合酶、测序酶v2.0都已应用于RCA。Bst DNA聚合酶LF在RCA指数扩增中性能最佳(Lizardi，1998)。
在线性RCA中，可以用单链串联体与探针形成双分子切割结构。在优选实施方案中，加入非延伸性寡核苷酸形成三分子切割结构(图1E-1J)。切割可以重复发生，从而实现信号扩增。这样可以只在一个管中进行模板扩增和信号扩增。经过105模板扩增(Lizardi，1998)和3×103倍的信号扩增，总的扩增倍数可以达到3×108以上。
本发明应用于指数RCA时，延伸的单链第一和第二寡核苷酸都能与标记探针形成切割结构，必要时还可以与第三寡核苷酸一起形成切割结构。示例性的切割结构示于图1。
本发明在SDA中的应用
SDA是一种依赖于DNA链置换的等温指数扩增方法。它用到两种酶，即限制性内切核酸酶和DNA聚合酶，以及两种寡核苷酸，这两种寡核苷酸均含有：(a)标签序列；(b)被限制性内切核酸酶识别的未修饰序列；(c)与双链靶互补的序列。SDA包括以下步骤：i.DNA聚合酶使两个杂交引物延伸，掺如一个2′-脱氧核糖核苷-5′-O-(1-硫代三磷酸)，并产生两个半硫代磷酸限制性内切核酸酶识别位点。ii.限制性内切核酸酶在两个半硫代磷酸识别位点的未修饰链上形成切口。iii.从切口处向3′端延伸置换下游链，产生两个单链DNA分子。iv.新产生的两条单链DNA进入下一轮扩增。
尽管最初的SDA是用嗜温性DNA聚合酶即大肠杆菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷性克列诺片段进行的(Walker，1992)，但是它已被嗜热性SDA系统所取代，这一系统包括嗜热性DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶LF(Spear，1997)。嗜热性系统优于原有系统之处是具有更高的特异性和更快的扩增动力学。
本发明很容易应用到SDA中。两个单链DNA中的任何一个都能用于形成一个或更多个图1所示的切割结构。
用本发明进行线性SDA时，产生可用于形成切割结构并产生可检测信号的单链DNA。也可以以与RCA同样的方法实现信号扩增。
本发明在SPIATM及X-SPIATM中的应用
Nugen Technologies公司的SPIATM(单引物等温扩增)是一种等温扩增技术，它使用的是美国专利6251639所公开的方法。一个RNA/DNA嵌合寡核苷酸结合到靶核酸上，用具有强链置换活性的DNA聚合酶如Bst DNA聚合酶LF使其延伸。延伸的RNA/DNA嵌合寡核苷酸中的RNA部分被RNA酶H降解，而DNA部分仍与靶核酸杂交。DNA聚合酶使保留的DNA序列延伸，从而置换下游的DNA序列，并产生单链DNA。反复重复此过程使靶序列线性扩增。SPIATM产生的扩增产物是单链DNA。为将本发明应用于SPIATM，可以与线性RCA同样的方式形成切割结构。它也提供了一种在同一管中进行模板扩增、信号扩增和检测的方法。
X-SPIATM(指数单引物等温扩增)是SPIATM的指数形式。X-SPIATM是通过制备由SPIATM产生的单链DNA的互补链而完成的。象SDA一样，X-SPIATM产生两条单链DNA。象在SDA中一样，本发明可用于X-SPIATM中。二者均可被用来形成切割结构。
本发明在LAMP中的应用
LAMP中扩增靶核酸序列要用到四个寡核苷酸及一种具有强链置换活性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶LF。在步骤I中，Bst DNA聚合酶LF使两个外部寡核苷酸和两个内部寡核苷酸延伸，形成两个部分单链的哑铃状结构。接着，在步骤II中，两个内部寡核苷酸和两个哑铃状结构进行自动维持指数扩增。在扩增过程中，形成两个哑铃状结构的各种长度的单体和串联体。
为将本发明应用于LAMP，用上述单体和串联体来形成带有探针的切割结构(图1)。切割结构中探针分子的切割产生可检测的信号。
本发明在PCR中的应用
PCR是最常用的核酸扩增技术。它涉及包括以下步骤的热循环：i.双链DNA的热分离。ii.两个寡核苷酸与每个单链DNA退火。iii.退火的寡核苷酸的延伸。iv.重复步骤i-iii。
迄今为止，使用高保真酶的PCR扩增尚未建立均相检测系统。现有的5′核酸酶分析与高保真DNA聚合酶不相容。尽管与5′核酸酶分析中最常用的酶Taq DNA聚合酶相比，Pfu DNA聚合酶的保真度高8倍(Lundberg，1991)，它仍然没有应用到临床核酸检测中。对于临床检测、法医鉴定、食品卫生之类的应用，扩增的保真度意义重大。因此需要建立一种均相检测系统以使高保真DNA聚合酶能够应用于PCR。本发明可应用于高保真PCR中。热变性产生的两个单链DNA都能用于形成切割结构以进一步产生可检测信号。
实施例1寡核苷酸的设计
应用National Biosciences Inc.公司发表的软件0ligo 4.02进行寡核苷酸的设计。影响寡核苷酸设计的一个重要因素是熔点(Tm)，即50％的寡核苷酸与其互补寡核苷酸结合时的温度。根据不同的Tm预测方法，该软件给出了3个Tm值。其中，最近邻值法由于其Tm预测的总准确度最好而得到公认，因此采用最近邻值法确定Tm值。应该尽量避免稳定的二级结构和双链结构尤其是3′双链结构。
为产生最大的信号，探针寡核苷酸的Tm值应明显高于引物寡核苷酸的Tm值。表1列出了寡核苷酸设计的一个实例。
表1 用于人18S rRNA基因PCR扩增的引物和探针的设计 序列 Tm(℃)正向引物18SF 5′-CGA GGC CCT GTA ATT GGA A-3′ 65.1反向引物18SR 5′-CGG CTG CTG GCA CCA GA-3′ 68.7 探针18SPU 5′-6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1-3′** 74.1
*：硫代磷酸修饰。 **：黑洞淬光剂-1。
实施例2用Bst DNA聚合酶和Afu FEN-1进行均相序列检测
在等温扩增法SDA、RCA、LAMP、SPIATM和X-SPIATM中，链置换是最关键的步骤。这些扩增方法中的关键部分是具有强链置换活性的DNA聚合酶。Bst DNA聚合酶LF是经过遗传修饰而切除了其5′核酸酶结构域的Bst DNA聚合酶。它是这些方法中应用最广的DNA聚合酶。这些等温扩增方法都产生单链DNA。如果反应中有模板特异性探针和结构特异性核酸酶存在，则探针会结合到单链DNA上，并在形成了适当的结构时可以被切除。所以，必要的步骤是：i.产生单链DNA；ii.探针与单链DNA的杂交；iii.通过引物与单链DNA的杂交和/或引物的延伸形成切割结构；iv.结构特异性的核酸酶对探针的切割。为了阐明本发明在上述等温扩增中的应用，进行如下实验：
核酸聚合酶：Bst DNA聚合酶LF，由New England Biolabs公司提供(8单位/微升)。
结构特异性核酸酶：Afu FEN-1。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTG
GAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′
*：硫代磷酸修饰。**：黑洞淬光剂-1。
所有的反应中都包含10mM MOPS pH7.75、10mM KCl、3mM MgCl2、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP，反应体积为20μl。除无酶对照(NEC)外，所有反应都使用1单位的Bs t DNA聚合酶。在无酶对照和无核酸酶对照(NNC)反应中不使用Afu FEN-1，其他反应加入5-20ng Afu FEN-1。在无模板对照反应中不加18SmT，在有模板反应中使用200nM 18SmT。
反应混合物在ABI热循环仪9600上60℃温育1小时，然后加入5μl 50mMEDTA-Na2，pH8.0终止反应。在95℃下用ABI Prizm 7900HT对结果进行分析。在95℃时探针不能与模板结合，所以6FAM信号的任何显著增强都表明Afu FEN-1对探针的切割。
在无模板的反应中，即便加入20ng Afu FEN-1也未发现游离18SP被切割(表1和图2A)。在有模板的反应中，观察到与NEC和NNC相比6FAM荧光的显著增强(图2B)。荧光的净改变ΔF＝F有模板-F无模板示于图2C。结果表明，本发明提供了一种低背景检测特异序列的方法。对于实现高灵敏度检测来说，低背景是至关重要的。
表2 Afu FEN-1不切割单链探针 NEC NNC 1 2 3 Bst DNA聚合酶LF 0 1U 1U 1U 1U Afu FEN-1 0ng 0ng 5ng 10ng 20ng 重复数 3 3 3 3 3 6FAM强度 2132 2048 2107 2107 2035 标准偏差 49 76 26 26 58
进行线性扩增时，优选的切割结构由扩增产物、探针分子和非延伸性寡核苷酸形成。已证实这种切割结构中的探针可以被结构特异性核酸酶有效降解。
在一种指数扩增方案中，优选由扩增产物、探针、可延伸寡核苷酸或延伸的寡核苷酸形成切割结构。这种切割结构中的探针分子会发生两种反应。它可能被延伸的上游寡核苷酸置换，也可能被Afu FEN-1切割。增加Afu FEN-1确实能改善切割(图2C)。这是这两种反应确实存在竞争的间接证据。尽管未确定这两种反应的相对频率，但数据明确显示发生了足够的切割。因此，本发明能够应用于上述扩增方法，并提供了以观察不到的背景进行均相检测的方法。
实施例3用逆转录酶和Afu FEN-1进行均相序列检测
对于本发明来说，由核酸聚合酶产生单链核酸是必要的。用NASBA、TMA、3SR进行核酸序列扩增时，有两个产生单链核酸的步骤。第一步是RNA分子的反转录。经过RNA酶H的作用后，RNA/DNA双链中的RNA链被降解，结果新产生的互补DNA包含大部分的单链DNA。本发明可应用于单链DNA的拷贝过程中。逆转录酶负责两条DNA链的合成。第二步是体外转录产生单链RNA分子。应用合适的探针和结构特异性核酸酶，单链RNA分子也能够用于应用本发明进行序列检测。本发明在NASBA、TMA、3SR中的应用可由如下的实验来说明。
核酸聚合酶：Invitrogen的莫洛尼鼠逆转录酶(200U/μl)。
结构特异性核酸酶：Afu FEN-1。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTG
GAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′
*：硫代磷酸修饰。**：黑洞淬光剂-1。
所有反应中均含有10mM MOPS pH7.50、20mM KCl、4mM MgCl2、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.5mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP，反应体积为20μl。除了无酶对照反应和无核酸酶对照(NNC)反应外，所有反应中均使用20ng Afu FEN-1。反应中加入不同量的逆转录酶，分别为0、12.5、25、50、100和200U。无模板对照反应中不加18SmT。在有模板的反应中使用200nM 18SmT。
反应混合物在ABI热循环仪9600上45℃温育1小时。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)终止反应。在95℃下用ABI Prizm 7900HT分析反应混合物的荧光强度。在95℃下探针不能结合到模板上，所以6FAM信号的任何显著增强都是Afu FEN-1对探针的切割所致。
如实施例1中所看到的，缺少模板就观察不到切割(表2)。探针的切割依赖于莫洛尼鼠逆转录酶活性。差示荧光谱(有模板-无模板)示于图3A。在此种反应条件下，12.5U和25U莫洛尼鼠逆转录酶不产生可检测的信号。逆转录酶为50U时，观察到6FAM荧光强度的显著增强。逆转录酶越多产生的信号就越强(图3A、3B)。
表3 NEC 1 2 莫洛尼鼠逆转录酶 0 12.5U 25U Afu FEN-1 0ng 20ng 20ng 重复数 3 3 3 6FAM强度 1699 1613 1631 标准偏差 112 71 36
实施例4用高保真热稳定酶对人类基因组DNA进行实时PCR扩增
高保真核酸扩增对于任何扩增方法都是很关键的。任何核苷酸的错误掺入都会在随后的循环中指数扩增并导致定性和/或定量上的错误结果。这对于基于探针的检测方法尤为关键。具有3′→5′外切核酸酶活性(也叫校正活性)的DNA聚合酶，如Pfu DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶，已被证明比那些缺少这种核酸酶活性的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶具有更高的保真度。由具有校正活性的DNA聚合酶进行基于探针的实时PCR还未见任何报道。为将本发明应用于高保真PCR扩增，进行了如下实验：
核酸聚合酶：Stratagene的PfuTurbo DNA聚合酶(2.5U/μl)。按照Stratagene的说明书，PfuTurbo DNA聚合酶是一种特殊配制的Pfu DNA聚合酶，已知其保真度比Taq DNA聚合酶高8倍。
结构特异性核酸酶：Afu FEN-1。
人类基因组DNA：HaCat细胞基因组DNA。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SR 5′CGG CTG CTG GCA CCA GA 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
*：硫代磷酸修饰。这种修饰是为了抑制PfuTurbo DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性的非特异性探针降解作用。若无这一修饰，这种非特异性降解会使淬光剂BHQ-1从探针上去掉。BHQ-1与6FAM分离的结果是产生干扰检测的6FAM信号的增强。
**：黑洞淬光剂-1。
25μl反应混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SR、200nM 18SP、5ng Afu FEN-1和0.625U PfuTurbo DNA聚合酶。反应中加入不同量的HaCat基因组DNA，分别为0(无模板对照)、6pg、60pg、600pg。
在ABI Prizm 7900HT上进行实时PCR，以如下热循环参数进行40个循环：95℃1分钟→(95℃15秒→60℃1分钟)。实时收集数据，用SDS 2.0版软件(Applied Biosystems)进行分析。
扩增曲线如图4所示。用于基因定量的Ct值示于图4B。虽然不同量的基因组DNA模板产生明显不同的Ct值，但无模板对照(NTC)反应没有产生任何可检测信号(Ct＝40)。在NTC反应中无可检测信号有两方面意义：第一，证明未杂交的单链探针不被Afu FEN-1切割；第二，探针3′端的硫代磷酸修饰保护探针不被PfuTurbo DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性非特异性降解。低至6pg的人类基因组DNA都能用本发明的方法成功扩增和检测，而这些DNA只相当于单个细胞中的DNA量，这证明了本发明的扩增和检测方法具有高度灵敏性。
实施例5用无核酸酶的热稳定酶
对人类基因组DNA进行实时PCR扩增
Taq DNA聚合酶包含两个结构域：1)位于N末端区域的5′外切/内切核酸酶结构域；2)C末端区域的DNA聚合酶结构域。缺失外切/内切核酸酶结构域可以完全去掉核酸酶活性。截短的DNA聚合酶比野生型Taq DNA聚合酶具有更高的复制保真度和更高的热稳定性(Lawyer，1993；Barnes，1992)。这两方面的改进对PCR扩增大有裨益。因为与PCR扩增子杂交的非延伸性探针具有抑制作用，所以实际上很难与这种酶一起使用分子灯塔(Yu，1997)。本发明能同时改善扩增和实时检测。设计了如下的实验：
核酸聚合酶：Stoffel DNA聚合酶(每微升10单位，AppliedBiosystems)，为Taq DNA聚合酶的289氨基酸N末端缺失突变体。
结构特异性核酸酶：Afu FEN-1。
人类基因组DNA：HaCat细胞基因组DNA。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SR 5′CGG CTG CTG GCA CCA GA 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
*：硫代磷酸修饰。**：黑洞淬光剂-1。
25μl反应混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2，四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SR、200nM 18SP、5ng Afu FEN-1和1.0U Stoffel DNA聚合酶。反应中加入不同量的HaCat基因组DNA，分别为0(无模板对照)、6pg、60pg、600pg、6000pg。
在ABI Prizm 7900HT上进行实时PCR，以如下热循环参数进行40个循环：95℃1分钟→(95℃15秒→60℃1分钟)。实时收集数据，用SDS 2.0版软件(Applied Biosystems)进行分析。
扩增曲线如图5A所示。标准曲线见图5B。标准曲线的相关系数是1.00。衡量扩增效率的标准曲线斜率是-3.29，说明扩增效率非常接近100％。低至6pg的人类基因组DNA被可靠地检测到，而这些DNA只相当于单个人细胞的DNA量。
实施例6切割产物的毛细管电泳检测---
用Bst DNA聚合酶LF和Afu FEN-1进行序列检测
实施例2-5的实验是在密闭管中进行的。这样做有几大优点，但是其荧光检测灵敏度低，这是由于未切割探针的不完全淬灭导致高荧光背景。由于难以分辨复杂的发光谱，致使其同时扩增和检测多个靶的能力也受到限制。在检测之前分离切割产物是一种降低荧光背景并使每一部分都得到简化图谱的方法。毛细管电泳已普遍用于DNA测序及DNA片段大小的分析。这种方法高度灵敏，能处理多个靶。作为一种示例性的产物分离和检测方法，用毛细管电泳来检测切割情况。实验具体操作如下：
核酸聚合酶：New England Biolabs的Bst DNA聚合酶LF(8U/μl)。
结构特异性核酸酶：Afu FEN-1。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTG
GAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′
*：硫代磷酸修饰。**：黑洞淬光剂-1。
20μl反应混合物中含有15mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP、200nM 18SmT、1U Bst DNA聚合酶和40ng Afu FEN-1。无酶对照中不加Bst DNA聚合酶LF和Afu FEN-1。
反应混合物在ABI热循环仪9600上60℃温育1小时。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)终止反应。将产物分别稀释500倍(无酶对照)和100倍(加酶)，然后在ABI Prizm 310上进行分析。结果用GeneScan 2.1软件进行分析。
无酶对照反应只出现单峰(图6A)，而加酶的反应则多出现6个条带。毛细管电泳检测确实比ABI Primer 7900的均相检测更灵敏。据估计，灵敏度至少提高100倍。
实施例7切割产物的毛细管电泳检测---
用Stoffel DNA聚合酶和Afu FEN-1进行序列检测
20μl反应混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP、200nM 18SmT、1U Stoffel DNA聚合酶(Applied Biosystem)和10ng Afu FEN-1。无模板对照不含有18SmT。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTG
GAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′
*：硫代磷酸修饰。**：黑洞淬光剂-1。
反应混合物在ABI热循环仪9600上6 0℃温育1小时。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)终止反应。将产物稀释500倍，然后在ABI Prizm 310上进行分析。结果用GeneScan 2.1软件进行分析。
与无酶对照(图7A)一样，无模板对照反应也只出现单峰(图7B)，这再一次证明Afu FEN-1不切割单链探针。在有模板时，观察到5个切割产物(图7C)。
实施例8切割产物的毛细管电泳检测---
用莫洛尼鼠逆转录酶和Afu FEN-1进行序列检测
20μl反应混合物中含有10mM MOPS pH7.50、20mM KCl、4mM MgCl2、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.5mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM18SF、200nM 18SP、200nM 18SmT、200U莫洛尼鼠逆转录酶(Invitrogen)和20ng Afu FEN-1。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTG
GAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′
*：硫代磷酸修饰。**：黑洞淬光剂-1。
反应混合物在ABI热循环仪9600上45℃温育1小时。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)终止反应。将产物稀释50倍，然后在ABI Prizm 310上进行分析。结果用GeneScan 2.1软件进行分析。
与实施例6、实施例7中的反应不同，莫洛尼鼠类逆转录酶和Afu FEN-1产生一个主要切割产物(图8B)。
实施例9切割产物的毛细管电泳检测---
人类基因组DNA的PCR扩增
20μl反应混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SR、200nM 18SP、2.4ng HaCat细胞基因组DNA、1U Stoffel DNA聚合酶(Applied Biosystems)、10ng Afu FEN-1。
寡核苷酸：
名称 序列
18SF 5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′
18SR 5′CGG CTG CTG GCA CCA GA 3′
18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**
*：硫代磷酸修饰。**：黑洞淬光剂-1。
在ABI热循环仪9600上进行PCR(95℃20秒→60℃1分钟)40个循环。加入5μl 50mM EDTA-Na2(pH8.0)终止反应。将产物稀释500倍，然后在ABI Prizm 310上进行分析。结果用GeneScan 2.1软件进行分析。观察到多达8个切割产物。
值得注意的是，每个酶都产生一个独特的切割模式。切割模式的不同可能是由于在特定反应条件下每个酶的特性和探针行为都不同。在某些位点选择性阻断切割应能减少切割产物的数量，有利于多个序列的同时检测。对骨架、碳水化合物及寡核苷酸碱基进行修饰以保护其免受核酸酶的攻击是已知技术。
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