使用振荡过滤装置富集溶质的方法 本发明的技术背景
本申请是1993年3月9日提交的、系列号为08/028400的、普通受让的共同未决美国专利申请的部分继续申请，后者又是1992年1月10日提出的、流水号为07/818851的、普通受让的美国专利申请的部分继续申请。
本发明一般涉及流体过滤装置，例如血液透析装置以及适于这种装置的生物反应器和膜。具体讲，本发明涉及一种改进的透析装置，这种装置具有整流过滤性质以及适于完成这种透析作用和其他过滤操作的双表面膜。
透析膜和透析装置用在人工肾脏和其他过滤装置上时，具有重要地生命维持功能。高通量透析器的一个公认的问题是不需要的一些分子从透析液反向过滤到血液中。由于使用灭菌的无热源透析液成本高，所以人们迫切需要一种能够除去例如β-2微球蛋白之类相当大的溶质，同时又能阻止类似大小的分子从透析液进入血液中的透析膜。
然而，溶质自血液向透析液高速扩散的这种透析膜，也经历着溶质自透析液向血液中高速率反向扩散的过程。具有高转化率的现有膜也同样具有高速反向过滤作用。因此，现在需要这样一些透析膜，它们能够从血液中有效地除去尿毒性毒素，同时也能够阻止不需要的物质反向进入血液之中。其它一些流体过程也会同样受益于具有这种整流性质膜的问世。
目前，也需要例如生物反应器之类的装置，这种装置中的整流膜既为用于制造传统的化学合成法所不能经济地产出产品的活细胞提供营养物，同时又从该活细胞带走产物和废的副产物。
发明的概述
本发明提供了一种在透析装置这类过滤装置中使用膜的方法。具有所说膜的过滤装置显示出一些整流性质，即不对称筛选系数。某种不对称筛选系数存在于这样一种场合中，其中对于给定的溶质而言，沿一个方向通过所说膜的溶质分数基本不同于沿相反方向通过该膜的溶质分数。
为此在一种实施方案中，提供了一种从溶液中除去不需要物质的方法。该方法包括下列步骤：提供一种装置，该装置是在壳体中以大体上平行取向固定有数根双表面空心膜，每根膜都具有一种微孔结构，这种微孔结构对于含有不需要物质的溶液通过来说具有不对称筛选系数；使所说的溶液通过所说的装置流动数次；并且当溶液穿过所说的装置时从溶液中除去不需要的物质。
在一种实施方案中，所说的筛选系数处于包括两端点在内的0.1-0.9之间。
在一种实施方案中，所说的溶液包括一种透析流体。
在一种实施方案中，所说的方法还包括这样一个步骤，即在膜的一侧提供第一储罐，并且在所说的膜的另一侧提供第二储罐，使溶液在第一储罐和第二储罐之间流动穿过所说的装置。
在一种实施方案中，所说的方法还包括提供一种与所说的膜内部流体相通的流入装置的步骤。
在一种实施方案中，所说的方法还包括提供一种用于所说的溶液流出且与所说的膜端部流体相通的流出装置的步骤。
在一种实施方案中，所说的方法还包括提供一种与所说的壳体内部流体相通的第二流体流动通路的步骤，其中使所说的流体与所说膜的外表面流动接触。
在一种实施方案中，不需要的物质具有所规定的分子量范围。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种从体液中除去不需要物质的方法。该方法包括下列步骤：提供一种具有数根双表面聚合膜的透析装置，每根膜都具有一个壳侧和一个腔侧，它们都以大体平行取向，两端被固定在壳体之中；提供一种透析液的流入装置，该流入装置与所说膜的腔侧流体相通；提供一种用于体液过滤后流出，且与膜的两端流体相通的流出装置；并且使体液流过所说的装置数次，其中不需要的物质收集在所说膜的壳侧内或壳侧上。
在一种实施方案中，数根膜都具有微孔结构。
在一种实施方案中，所说的微孔结构显示出不对称筛选系数。
在本发明的另一种实施方案中，提供了一种通过把活细胞限制在一种生物反应容器中生产生物产品的方法。所说的容器具有带不对称筛选系数的微孔结构的数根双表面空心膜，所说的膜以大体上平行的取向被固定在一个具有内部的壳体中，其中所说的膜外部和所说的壳体内部限定着所说的生物反应容器。该方法包括下列步骤：使含有细胞营养物的流体反复循环流过所说的空心膜，使所说的营养物经膜输送到细胞中；而且以废物料形式除去的由细胞排出的废料，经膜输送到所说的流体中；并且从所说的容器移出生物产品。
因此，本发明的一个优点在于提供了一种分离和富集所需溶质的装置。
本发明的又一个优点在于提供了一种利用使某种溶液穿过膜前后反复循环的方式分离和富集所需溶质的方法。
本发明的另一个优点在于提供了一种于所说的膜的一侧分离和富集溶质的方法。
本发明的进一步优点在于提供了一种于所说膜的腔侧分离溶质的方法。
此外，本发明的又一个优点在于使用整流膜，随着循环次数的增加，连续增加溶质的浓度。
本发明的又一个优点在于使用与操作条件无关的整流膜连续增加溶质的浓度。
本发明的其他特点和优点载于以下优选实施方案的详细说明和附图之中，而且通过这些说明而更加明显。
附图的简要说明
附图1是图示说明以空心纤维形式形成本发明膜时所使用的方法的示意图。
附图2是实施本发明时所使用的环状挤压模子的剖面图。
附图3是本发明过滤装置带有部分剖视的侧视图。
附图4是说明使用本发明过滤装置时所假设发生的过滤机理放大草图。
附图5和6是使用电子显微镜拍摄到的本发明空心纤维在不同放大倍数下的断面图。
附图7是本发明的生物反应器装置侧视图。
附图8-14是表示本文所述的具体实例试验中得到的结果曲线。
附图15是表示使用振荡过滤装置得到的结果和所得到溶质浓度之间关系的曲线。
附图16-20是表示使用具有一定筛选系数的振荡过滤装置得到的结果和所获得溶质浓度之间的关系曲线。
所提供优选实施方案的详细说明
更具体地参照这些附图，附图1图示说明一种空心纤维纺丝系统60。一种聚合物的有机溶剂溶液62盛在容器64中，利用计量泵66由该容器将该溶液输送到环形挤压模68中。一种促凝剂溶液72(它是所说聚合物的一种非溶剂)盛在第二容器70之中，并由另一台泵74将其输送到模68中。
非溶剂72和聚合物溶液62在它们出模时，于互相接触下在形成的界面63上互相反应，这种反应决定着所说内膜的最终结构和性质。
所形成的挤压物然后落下穿过空气间隙76，进入含有第二非溶剂促凝剂溶液80的浴78中。挤出物与第二溶液80的反应决定着外膜的结构和性质。借助于驱动辊82将纤维拉过浴78，而且在必要时还可以穿过另外的一或多个附加浴84，以便将空心纤维与溶剂完全分离。与溶剂分离了的纤维最后缠绕在多段饶丝器86上使之干燥。干燥的纤维88被切成一定长度后放在外壳90中。纤维88用热塑性树脂92密封在外壳90中，组件装上端盖94和96。在外壳90上还备有滤液的入口97和出口98。
附图5和6说明本发明一种典型纤维88的放大断面，示出一种内部微孔结构83，内表面85和具有孔隙率不同于内表面85的外表面87。本发明膜的优选内径约200微米，一般处于100-1000微米范围内。
所说的总筛选系数是与被过滤的流体一起穿过膜时带入溶质的分数。它利用膜下游侧的溶质浓度除以其在该膜上游侧浓度的方法而算出。
对于单面膜来说，总筛选系数等于该膜的筛选系数，后者等于穿过该表面溶质的分数。该表面的筛选系数本身只取决于孔和溶质分子的相对尺寸。表面越密(孔越小)，给定分子穿过它的分数就越小。
然而，对于双表面膜来说，抵达第二表面的溶质浓度取决于第一表面的特性以及流动条件，所以总筛选系数是流动性质和膜性质的函数。对于整流膜来说，其中一个方向的筛选系数不同于其他方向上的筛选系数，关键是沿一个方向流动的溶质在膜的两个表面中积累。
附图4是一种双表面整流膜88的示意图，其中外表面12比内表面14密，而且由于所施加压力梯度的结果流体由内部进入外部。在这种情况下，进入膜88中心区16的一些分子，不能以其与穿过疏松表面14进入时相同的速率穿过较密的外表面12而离开中心区16。由于这种正通量的结果，膜88内部的浓度一直增加到其一个新的稳态值下为止，此稳态值下分子的净通量为零。纤维外部流体20中的浓度也伴随着纤维内部的这些变化而增加。由于纤维腔内的浓度没有变化，所以总筛选系数随时间增加到比单独使用较密膜12时得到的数值更高的稳态值下为止。
假如同样的膜暴露于反向压力梯度下，其中流体由外部流向内部，则溶质首先遇到的是密表面12。穿过所说密表面12的小部分溶质，能够容易地穿过疏松的表面14，这意味着膜88中不存在积累作用。这种情况下，膜88内的浓度以及所说的内部的浓度均为零。总筛选系数小于在其它方向上得到的数值。
本发明方法中可以使用各种聚合物形成空心纤维。所说的聚合物必须能溶于至少一种有机溶剂之中而且不溶于另一种能与所说的溶剂溶混的液体中。适用聚合物的实例是聚砜、聚醚亚胺、聚丙烯晴、聚酰胺、聚偏二氟乙烯、聚丙烯和聚醚砜。适于这些聚合物使用溶剂的代表性实例有N-甲基-2-吡咯烷酮、N，N’-二甲基甲酰胺、N，N’-二甲基乙酰胺和γ-丁酰内酯。能够作为形成表面膜时促凝剂或胶凝剂使用的一种优选的非溶剂是水。其它使用的液体包括甲醇、乙醇-水混合物(例如96或99.5容积％乙醇与水的混合物)或异丙醇。在所说的非溶剂中可以加入各种物质以便形成具有不同孔隙率的表面。具体实例包括聚乙烯醇、四亚乙基二醇、聚乙二醇、高氯酸盐和聚乙烯基吡咯烷酮。
本发明的一个重要优点是能够在滤液不同流动方向提供具有不同筛选系数、适于从液体中滤出分子使用的纤维。另一个优点是能够提供具有不同筛选系数、适于从液体中滤出具有窄分子量范围使用的纤维。例如能够提供这样一些纤维，它们能够从膜的一侧而非另一侧过滤范围在5000-10000分子量的分子。通过适当改变所说的孔隙率，能够使筛选系数差最佳化得适于过滤10000-100000，甚至到200000分子量范围内的分子。通过调节促凝剂溶液的组成和所加入促凝剂的数量和种类，以及通过改变流速、流水线速度和间隙距离等纺丝条件，进行最佳化。实施例
下列实施例详细说明生产和使用本发明膜的优选方法。其中给出的份数除非另外指明，否则均指重量份数。实施例1
使用图1和2所示的纺丝系统和方法，在表1所示的成形和工艺条件下制备了空心纤维。试验方法
试验组件装配如下：在长度约22厘米和内径约0.6厘米的一个微型透析器中装入100根纤维。装入的聚胺酯纤维距每个端盖大约1厘米，留下有效长度约20厘米。每端距装入的纤维大约1厘米处设置透析液出入口。
具有下列组成的标准透析液是用血液透析机比例系统由浓液制备的：
钠 134毫当量/升
钾 2.6毫当量/升
钙 2.5毫当量/升
镁 1.5毫当量/升
氯化物 104毫当量/升
乙酸盐 36.6毫当量/升
葡聚糖 2500毫当量/升在每升透析液中加入330毫克肌红蛋白制备肌红蛋白溶液。使用肌红蛋白(分子量等于17000)作为中分子量(例如分子量等于12000的B-2微球蛋白)的标记，因为它可以用分光光度法测量。
使用注射器和醇(异丙醇或乙醇)冲洗腔室和滤液室。然后使用过量透析液漂洗试验组件，关闭滤液口用泵向腔室中注入250毫升透析液，然后打开一个滤液口再注入200毫升。为了测量入口流速，关闭透析液口，将灌输泵调节到所需的速度(10.5毫升/分)，利用记时收集的方法测定流出速度。
对于筛选系数测量来说，将试验组件固定在竖直的位置上，使纤维垂直于台面。将灌输泵连接到入口储罐上，并且将灌输泵的连接管连接到底端盖上。排废物管连接到上端盖上。关闭透析液出入口，启动泵，试验溶液达到所说装置时的时间记作零时间。
在零时刻下，打开透析液的两个活塞，排出注入的溶液，使透析液侧沥干，然后关闭下透析液口，当滤液室充满时立即由上口取出零时间滤液样品，同时将出口腔样品收集到另一个烧杯中，入口腔样品直接由入口储罐取出。随后的一些滤液样品每隔3分钟收集一次，两次取样之间无滤液损失。使用Gilford分光光度计测定每个样品中的肌红蛋白含量，筛选系数S使用下公式计算：取样连续进行到由先后三次样品算出的筛选系数恒定不变为止。将纤维装入试验组件之中，并按照上述操作测定筛选系数。本例纤维对于肌红蛋白的筛选系数的测定结果如下：滤液径向朝外流动时为0.35，而径向朝内流动时为0.80。
表1
聚合物______________________________________聚砜
溶剂________________________________________N-甲基吡咯烷酮
纺丝液浓度__________________________________15克/100克
中心流体组成________________________________15/85(2-丙醇/水)
沉淀浴组成__________________________________2/98(2-丙醇/水)
洗涤浴组成__________________________________水
间隙距离____________________________________1厘米
生产线速度__________________________________18米/分
纺丝液流速 _________________________________1.8CC/分
中心流体点直径______________________________0.009英寸
模的环状间隙 _______________________________0.0035英寸实施例2
除了中心流体组成为10/90的2-丙醇/水以及沉淀浴的组成是5/95的2-丙醇/水之外，按照实施例1制备了空心纤维。附图5和6是所得到纤维分别在2000倍和400倍放大率下的扫描电子显微图，图中示出手指状结构自每个边界延伸到中间壁处。据测定对于肌红蛋白的筛选系数为：0.45(外流滤液)和0.90(内流滤液)。实施例3
除了中心流体组成为70％的异丙醇和30％的水之外，按照实施例1制备了空心纤维。纺丝液浓度为20重量％聚砜在含10％丙酮的N-甲基吡咯烷酮中的溶液，沉淀浴是水，利用下列操作方法，测得了对于葡聚糖的筛选系数：
1)葡聚糖筛选系数
制备了一种在磷酸盐缓冲的生理盐水(0.9％)中的葡聚糖溶液，其组成如下：
葡聚糖FP1(Serva)0.2克/升
葡聚糖4(Serva)1.0克/升
葡聚糖T40(Pharmacia)1.0克/升
葡聚糖T10(Pharmacia)0.3克/升
通过腔室灌注葡聚糖溶液，从壳侧收集滤液。通过壳侧也灌注葡聚糖溶液，并且由腔室收集滤液。改变试验的顺序。溶液流速为5毫升/分，膜两侧的压力为150-200mmHg。入口样品直接由葡聚糖溶液储罐取出。滤液样品每5分钟取一次。滤液浓度数值在15分钟之后稳定。使用40或60分钟时的滤液浓度计算筛选系数。假定主体溶液浓度等于其入口值，而且在透析器的长度方向上是恒定的。使用高性能液相色谱(HPLC)，利用折射率检测器分析了样品。结果示于图8之中。
使用上面概述的方法并使用市售分析仪器(Sigma Chmical Co.)分析样品，测定了对于醇脱氢酶(MW约150000)和β-淀粉酶(MW约200000)的筛选系数。对于醇脱氢酶的筛选系数为0.05(向外流动)和0.76(向内流动)。对于β-淀粉酶的筛选系数为0.01(向外流动)和0.17(向内流动)。实施例4
除了中心流体组成为50％的异丙醇和50％的水之外，按照实施例1制备了空心纤维。纺丝液含有20重量％聚砜和N-甲基吡咯烷酮(其中有10％丙酮)，沉淀浴是水，测得了葡聚糖对于腔室到壳以及壳到腔室的筛选系数。结果示于图9之中。实施例5
除了中心流体成分为异丙醇之外，按照实施例1制备了空心纤维。纺丝液是浓度15重量％聚砜和15重量％聚乙烯基吡咯烷酮的N-甲基吡咯烷酮溶液。中心流体成分是异丙醇而且沉淀浴是水。按照实施例3测定了葡聚糖的筛选系数。结果示于图10之中。实施例6
制备了外表面具有5000千道尔顿(KD)切断公称分子量(MW)，而内纤维表面的MW更大但却未知的聚砜空心纤维膜。对于这些纤维来说，据测定，各种分子量葡聚糖的筛选系数值，当滤液径向朝内流动时大于其径向朝外流动时的数值。
蛋白质筛选系数。将下列蛋白质溶解在磷酸盐缓冲的生理盐水(0.9％)中：
溶液1(牛血清白蛋白)___________________________2.0克/升
溶液2(卵白蛋白，鸡卵白蛋白)_____________________1.0克/升
溶液3(肌红蛋白)_________________________________0.08克/升
溶液4(细胞色素c)________________________________0.12克/升
通过腔灌输蛋白质溶液，由壳侧收集滤液。也通过壳侧灌输蛋白质溶液，滤液由腔室收集，改变试验顺序，入口样品直接由蛋白质溶液储罐中取出，滤液样品每隔5分钟取一次。滤液浓度值在第15分钟后稳定。使用第40或60分钟的滤液浓度值计算筛选系数。主体溶液浓度假定等于其入口值，且沿透析器长度上恒定。使用分光光度计测定样品在特定波长下的光吸收。在280nm波长下分析牛血清白蛋白和卵白蛋白。在410nm波长下分析肌红蛋白和细胞色素c。
按照上述方法试验测得的葡聚糖和蛋白质的筛选系数结果示于图11之中。实施例7
使用下列物质按照实施例1的方法制备了空心纤维：
聚合物：聚醚亚胺
溶剂：N-甲基吡咯烷酮
纺丝溶液浓度：20重量％
中心流体组成：水
沉淀浴：水
试验时测得对于葡聚糖的筛选系数值示于图12之中。实施例8
使用下列物质按照实施例1的方法制备了空心纤维：
聚合物：聚醚亚胺
溶剂：N-甲基吡咯烷酮
纺丝溶液浓度：25重量％
中心流体组成：水/N-甲基吡咯烷酮，50/50，
沉淀浴：水
测得对于葡聚糖的筛选系数值示于下面的图13之中。实施例9
根据有关整流膜行为的电流理论，溶质的内部浓差极化是造成多于35个实施例的不对称筛选特性的原因。溶质在所说的膜两侧间积累需要有一定时间。因此，在一个方向上的筛选系数在平衡达到之前应当随着时间而增加。对于绝大部分普通的膜来说，筛选系数一般在早期测量时最大，并且由于孔被滞留的溶质所堵塞，可能随着时间的增加而减小。附图14表明，在壳至腔室方向上的筛选系数对于实施例3的膜来说是一个时间的函数。对于这个实验来说，每一分钟收集一次滤液共计收集10分钟。筛选系数的具体数值处于50000-100000范围内，的确随着时间而明显增加。
附图7所示的生物反应器由大体上类似于附图3所示透析装置的装置所组成。然而，在这种情况下，纤维四周由外壳90和热塑性树脂92所封闭的空间89，构成一种适于活细胞生长的反应容器。出入口97和98均被略去，并且可以利用图中所示的阀99和100来密闭。产物依其大小可以反向穿过所说的膜88而纯化除去废物流，或者可以收集在构成所说的反应容器的空间之中，并且以半连续或者间歇方式由所说的反应容器中将其移出1。
营养物、废物和所需的生物产品，可以借助于扩散和/或对流穿过膜输送。在空心纤维中存在的轴向压降导致一种Starling流动，即在装置的入口处由管侧向壳侧的对流作用，而在装置的出口侧由壳侧向管侧的对流作用。
有些种类的细胞需要价格贵的生长介质，其中可能含有10％小牛腓肠血清。使用整流膜可以使血清成分穿过膜进入隔室中，然后富集在壳空间之中，以便减少所需介质的容积。这也可以降低穿过膜的纯化产品的成本，因为纯化物流的容积更小。
整流膜也可以直接用于富集产品。如果所需的产品是由比新陈代谢的废产品以及营养物更大的分子所形成的，则整流膜装置可以用于在壳空间中富集产品，同时借助于穿过空心纤维膜内部的液流使营养物抵达隔室中并将废产物洗出。
因此可以将本发明的膜制得使空心膜的内部或者外部表面更致密。这两种情况下，重要的一点是膜两侧的表面都含有一些在1000倍放大倍数下不可见的孔。这样将确保在膜的两侧存在足够密的表面，从而使得处于膜微孔内部的溶质在其表面之间积聚。据说，溶质的这种积聚作用对于膜的结构来说是很重要的，这种膜对于在不同方向上穿过它的物流来说具有不同的筛选系数。
所说的膜的另一种用途，是可以在滤液中进行溶质的富集。正如前面参照附图4所述的那样，双表面整流膜88具有比内表面14更密的外表面12。由于所施加的压力梯度的结果，流体由内侧进入外侧。所述的膜88显示出不对称筛选特性。即所说的膜88在一个方向上的筛选系数一般来说显著不同于其他方向上的筛选系数。因此，在一个方向上穿过膜88的溶质分数，不同于在其它方向上穿过该膜的溶质的分数。
通过使溶液前后反复穿过所说的膜88，可以在该膜88的一侧得到分离和富集。从膜88壳侧上的浓缩液开始，其中膜88在壳至腔室方向上具有更高的筛选系数，通过使所说的溶液反复前后穿过该膜88的循环，可以将溶质富集在膜88的腔室侧。
这种构思可以用在各种用途上。这些用途包括透析和生物反应器。实施例10
在整流膜壳侧的储罐中置入100毫升0.2％的牛血清白蛋白(BSA)，使流体在300毫升/分速率下于膜的壳侧循环。过滤速率大约为1毫升/分。第一次通过时，向腔侧储罐中过滤60毫升。然后，使大约40毫升于这两个储罐之间向前和向后循环。5次循环之后，于腔室侧的25毫升溶液中所含的BSA浓度，是其壳侧初始浓度的2.8倍。
附图15图示说明在每个循环的中期和后期该装置各侧的BSA浓度(克/升)。从中明显看出，在前半个循环中处于1侧(C1MID)的浓度相对较高，而处于2侧(C2MID)的浓度相对较低。在后半个循环中处于1侧(C1END)的浓度随着由2侧返回的溶液稀释而降低。该图中表明，最终下游浓度(C2END)随着每一个后续循环的进行而显著增加。
附图16-20图示说明的是计算机模拟简单的单表面膜的试验结果，试验中对于膜的不同筛选系数改变每个循环中期和后期的浓度。附图16中，筛选系数等于0.1；附图17中，筛选系数等于0.3；附图18中，筛选系数等于0.5；附图19中，筛选系数等于0.7；附图20中，筛选系数等于0.9。
由附图16-20明显看出，双表面整流膜88表现出2侧的溶质浓度连续增加。然而，绝大多数单表面膜在少数几个循环之内达到平衡。如图16-20所表明的那样，最大的下游浓度被保持在1.62，这相当于筛选系数等于0.3的单表面膜。
由上述可以看出，使用双表面整流膜88导致经过五个实验循环之后下游浓度达到初始浓度的2.8倍。这个数值比任何单表面膜高出70％。当然，根据溶质与膜之间的具体反应以及装置的具体操作条件，还可以达到更高的浓度。
应当知道，对于本文中提出的优选实施方案进行各种变化和改进，对于本领域中普通技术人员来说是显而易见的。在不无违背本发明实质、不超出本发明范围和不损害其优点的情况下，可以作出这些变化和改进。因此，这些变化和改进被包括在后附的权利要求之内。