一种肝癌诊断剂技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断肝癌的试剂及试剂盒。
背景技术
我国是肝癌大国，肝癌的发病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的
准确诊断具有重要的现实意义。
现时，国际上通常用来筛查肝癌的生物标志物是血清AFP(甲胎蛋白)。但其
敏感性只有39％至65％，特异性只有76％至94％。由于其检测肝癌的敏感性
跟特异性不甚理想，因此美国的治疗指南不推荐血清AFP用于肝癌的诊断。中
国跟欧洲的治疗指南都指出，正常个体的AFP水平应小于20ng/ml，大于
400ng/ml则可提示肝癌的诊断。而20至400ng/ml则是诊断的“灰色地带”。因此
利用AFP筛查肝癌容易导致误诊漏诊。
除了血液取样方式，另一种诊断方式是组织取样诊断。然而，肝组织取样
对人体破坏性强，因此，亟须一种没有创伤式而准确的诊断方法。
人体唾液腺中存在许多毛细血管网，因此，唾液是血液循环的末端产物。
血液中存在的分子物质，例如DNA、RNA、蛋白、药物、病毒等，都能在唾液
中找到。因而唾液被认为是人体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内
环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。美国的食品及药物管理局(FDA)
已经批准了利用唾液检测药物滥用、HIV感染、激素水平、中毒等试剂在市场
上应用，现已在全美都已经得到普及。在临床中，于唾液中寻找分子标记物是
最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不
安、操作者易于掌握等优点。研究已经证实了唾液中的转录物、蛋白、代谢物
和其他分子物质能检测出口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥综合征等其他
口腔或者系统性疾病。体内的长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(microRNA，
miRNA)与包括肝癌在内的多种癌症的发病与发展密切相关。研究发现多种
lncRNA和miRNA在肝癌组织中表达失调，组织中表达失调的lncRNA和miRNA
可作为生物标记物对肝癌有较佳的诊断价值。但唾液lncRNA和miRNA是否可
作为生物标记物协助诊断肝癌，目前尚无报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于诊断肝癌的唾液检测试剂和试剂盒。
本发明同时提供了试剂盒的使用方法。
本发明还提供以唾液作为检测样本的方法。
发明首先提供了用于诊断肝癌的唾液检测试剂，该试剂为H19、miR-21和
miR-222检测试剂，该试剂的检测对象为唾液样本。
发明同时提供了H19、miR-21和miR-222唾液检测试剂在制备检测肝癌试
剂或试剂盒中的应用。
以唾液作为样本来进行肝癌标记物的检测，最大的难点在于，需要寻找到
能分泌到唾液中的，且在唾液中能稳定存在的标记物。尽管目前已有大批的肝
癌标记物被发现，这些标记物存在于组织样品或血液样品中，然而，同样的标
记物采用唾液样本取样，往往是另一个结果，不能用作肝癌诊断。这很可能是
因为能被分泌到唾液中的标记物本身就很少，并且唾液中存在大量的酶，标记
物容易降解。因此，以唾液样本检测肝癌，在此前仍未见任何报道。
而本发明的一大突破在于，发明人发现，在肝癌患者中其唾液样本存在大
量的H19、miR-21和miR-222。其稳定而大量地存在，能被高重现性地检出。
而正常样本中，该标记物表达水平非常低。这使得H19、miR-21和miR-222成
为一种良好的唾液样本标记物，对于肝癌的检测或诊断具有突破性的意义。
本发明进一步提供给了用于诊断肝癌的唾液检测试剂盒，其含有蛋白酶和
H19、miR-21和miR-222检测试剂。
1.上述的H19、miR-21和miR-222检测试剂含有检测用引物，所述引物的序列
如H19为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；miR-21为SEQIDNO.3和SEQID
NO.4；miR-222为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
作为可选的实施方式所述的蛋白酶选自蛋白酶K。
优选地，所述的试剂盒还含有酸酚氯仿混合物。并且进一步优选地，还可
含有DEPC(焦碳酸二乙酯)。
可选地，所述的酸酚氯仿混合物为盐酸-苯酚-氯仿混合物；优选地；苯酚与
氯仿的体积比为(4.5-5.5):1；更优选地，所述的酸酚氯仿混合物pH值为4.3-4.7。
发明还提供给了一种检测唾液H19、miR-21和miR-222的方法，包括以下
步骤：提取唾液中总RNA后，进行H19、miR-21和miR-222的逆转录，再通
过qPCR(定量聚合酶链反应)分别检测H19、miR-21和miR-222水平。
提取唾液总RNA的方法可采用以下步骤：
S1.取唾液样本，加入蛋白酶，60-65℃孵育以去除唾液蛋白；
S2.加入酸酚氯仿混合物后，10000-12000g离心4-6分钟，收集上清；
S3.加入1.25倍体积的乙醇，再经5000-6000g离心20-60秒过滤离心，弃滤液；
S4.加入预热的DEPC水，10000-12000g离心20-60秒，收集RNA。
本发明首次在唾液中寻找到诊断肝癌敏感特异的生物标记物——H19、
miR-21和miR-222。
通过统计学分析，建立logistic回归预测诊断肝癌的模型，再构建ROC曲
线可得出联合唾液miR-21、miR-222和H19三种分子物质对肝癌诊断的价值。
预测模型的公式为：logit＝-2.153+miR-21×0.018+miR-222×0.174+H19×0.174。即，
将检测到的miR-21，miR-222和H19的表达量代入上述公式，我们前期研究得
出正常个体的值应小于3.939813。若受检个体检测到的miR-21，miR-222和H19
的表达量代入模型公式后结果大于此值，则受检个体判定为肝癌的敏感性为
81.4％，特异性为91.8％.
唾液H19、miR-21和miR-222在成为协助筛查乙肝相关性肝癌的标志物方
面具有良好的前景，收集唾液的取样方式简单、方便、无创、价廉、不会引起
患者不安、操作者易于掌握、受检者易于接受，且准确率高，对肝癌的早诊早
治，降低死亡率，减轻我国的医疗负担具有重大的意义。
附图说明
图1为不同肝组织样本中的H19(图1A)、miR-21(图1B)、和miR-222(图
1C)表达水平。
图2为不同人群唾液样本中的H19(图2A、B)、miR-21(图2C、D)、和miR-222
(图2E、F)表达水平。
图3为联合唾液H19、miR-21和miR-222检测结果的ROC(ReceiverOperating
Characteristic)曲线。
图4为肝癌患者的血清AFP水平。
图5为不同AFP表达水平患者的唾液H19(图5A)、miR-21(图5B)、和miR-222
(图5C)检出水平。
图6为H19(图6A)、miR-21(图6B)和miR-222(图6C)的qPCR扩增曲
线(图6A),和H19(图6D)、miR-21(图6E)、和miR-222(图6F)的溶
解曲线。
图7为MALAT1(图7A)和miR-224(图7B)的肝组织样本检测结果。
图8为MALAT1(图8A)和miR-224(图8B)的唾液样本检测结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表
对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改
和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1唾液采集
在唾液采集前，研究个体需禁食、禁饮、禁烟和禁止口腔清洁2h以上。
为增加唾液收集量，采用2％柠檬酸溶液湿润无菌棉签棉花头，然后将棉花
头放于研究个体舌头一侧的后侧壁约5s，吐出唾液后，再将棉签放到另一侧的
舌头后侧壁。如此反复收集。唾液收集量需达5ml以上，收集管使用50ml无菌
无酶离心管。4℃、3000g离心15min取上层上清至1.5mlEppendoff管，再以4℃、
12000g离心10min后再弃沉淀取上清。标本处理后均置-80℃保存。
实施例2唾液总RNA的提取
1.将1ml唾液平均分装在两支1.5ml的无酶EP管上，即每支EP管都盛有
500μl的唾液，然后向每只EP管加入蛋白酶K(20mg/ml)15μl，混匀，放于65℃
水浴锅孵育过夜。因为唾液中含有较多的消化酶类等蛋白，影响后续提取唾液
RNA的效果，因此此法可去除唾液蛋白对实验的影响。
2.两支EP管各加0.5ml的酸酚氯仿混合物(主要成分为盐酸、苯酚与氯仿)
到上述唾液混合液中。
酸酚氯仿的配置
2.1苯酚与氯仿的比例为：5:1
2.2用浓盐酸调pH值，pH值定在4.5左右，此pH值最利于提取RNA。混
匀。
3.加入后手动摇匀30到60秒
4.室温下10000g离心5分钟。离心后中层液体需紧致，否则重新离心。
5.收集上清，需谨慎，不能搅动下层液相。
6.将1.25倍体积的100％乙醇加到上清液中。例如收集到500μl上清，则加
625μl无水乙醇。
7.将过滤管放入收集管内，将上述混合物加到过滤管中(过滤管和收集管市
场上有销售)。
8.6000g离心30秒。
9.丢弃过滤液。重复空甩离心1次。保留收集管。
10.将700μl的75％乙醇加到过滤管中，离心15秒。丢弃过滤液。将过滤管
重新放入原来的收集管中。
11.重复第10步，再洗涤一次。
12.丢弃过滤液，将过滤管放入同样的收集管中。空甩离心1分钟。
13.将过滤管放入新的收集管中。加入95℃预热DEPC水。盖好盖子。离心
30秒。收集RNA。
14.收集洗脱液。洗脱液即溶解有从唾液中提取的总RNA。提取后的总RNA
在-80℃以下保存。
实施例3唾液H19、miR-21和miR-222逆转录及表达量检测
1.唾液H19的逆转录反应
取2μLRNA进行反转录。65℃反应5min后立即冰浴2min。
在上述2μLRNA中分别加入2μl5×RTBuffer、0.5μlEnzymeMix、0.5μl
PrimerMix(均为Toyobo公司产品，货号FSK-100)和5μl经DEPC处理的无核
酸酶水，然后继续进行逆转录，反应条件为37℃15min,98℃5min,4℃∞。
2.唾液miR-21和miR-222的逆转录反应
取2μLRNA进行反转录。每2μL的RNA中加入2μL的RTPrimer[锐博公
司，货号为miRQ0000076-1-2(miR-21)或miRQ0004569-1-2(miR-222)]和7μL
的无核酸酶水。70℃反应10min后立即冰浴2min。在上述11μL混合物中分别
加入5μLRTbuffer(TAKARA公司，货号2641A)、2μLdNTP(TAKARA公
司,2.5mM规格，货号DR001B)、0.5μLRNaseinhibitor(TAKARA公司，40U/μL
规格，货号2313A)、0.5μLRT酶(TAKARA公司，200U/μL规格，货号2641A)、
6μLddH2O，然后继续进行反转录，反应条件为42℃60min,70℃10min,4℃
∞。
3.唾液H19、miR-21和miR-222的表达量检测(qPCR反应)
取逆转录产物3μL作为模板,用SYBRPremixExTaqⅡ试剂盒(TaKaRa公
司，货号RB820A)进行RT-qPCR检测,20μL反应体系中加入9μL的5×SYBR
PremixBuffer，0.8μL的上游引物，0.8μL的下游引物,和6.4μL经DEPC处理的
无酶水。
H19的上游引物序列SEQIDNO.1:TGCTGCACTTTACAACCACTG
H19的下游引物序列SEQIDNO.2:ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC
miR-21的上游引物序列
SEQIDNO.3：CGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
miR-21的下游引物序列
SEQIDNO.4：CGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
miR-222的上游引物序列
SEQIDNO.5:ACTTGCCCTCCTTTCCTTTC
miR-222的下游引物序列
SEQIDNO.6:AGGTGTTTCCGACGCATTAC
所有反应采用3复孔,反应条件为95℃2min,然后95℃5s,60℃10s,
50个循环。溶解曲线设置：Meltcurve:65.0to95.0℃,increment0.5℃for0.05
min+plateread。采用ABI7500实时定量PCR仪进行检测。
实施例4提取及检测方法鉴定
在以唾液为实验样本，经过上述总RNA提取、反转录、qPCR反应后，分
别对H19、miR-21和miR-222进行扩增曲线及溶解曲线分析。
得出H19、miR-21和miR-222的qPCR扩增曲线和溶解曲线如图6。结果
表明经上述方法检测唾液H19、miR-21和miR-222，能成功地扩增并检测出特
定的唾液H19、miR-21和miR-222的表达水平，且溶解曲线成单一高峰状态，
表明扩增和检测的H19、miR-21和miR-222具有专一特异性，无非特异性扩增。
实施例5肝组织中的miR-222表达水平检测
挑选50例乙肝相关肝癌组织样本和50例癌旁正常肝组织样本，15例正常
肝组织(从手术切除的离肝血管瘤＞5cm的肝组织中选取)，使用TRIzol法提取
其组织内的RNA并检测H19、miR-21和miR-222在各种组织中的表达水平。
具体提取方法如以下文献所示：
BurchardJ,ZhangC,LiuAM,etal.microRNA-122asaregulatorof
mitochondrialmetabolicgenenetworkinhepatocellularcarcinoma.MolSystBiol
2010；6:402.
结果如图1所示，H19、miR-21和miR-222在癌组织中的表达水平均比在
癌旁或正常肝组织的表达水平都显著增高。
实施例6唾液样本中的H19、miR-21和miR-222表达水平检测
收集健康对照个体、乙肝携带者、慢性活动性乙肝患者、乙肝相关性肝硬
化患者、晚期乙肝相关性肝癌(HCC)患者、可切除乙肝相关性肝癌患者的术
前和术后的唾液各50例共350例样本。
检测唾液H19、miR-21和miR-222在各组中的表达水平与差异性。唾液处
理及检测方法如实施例3。
结果如图2所示。唾液中的H19、miR-21和miR-222在肝癌患者中的表达
水平都均显著高于其它对照组。
通过统计学分析，建立logistic回归预测诊断肝癌的模型，再构建ROC曲
线可得出联合唾液miR-21、miR-222和H19三种分子物质对肝癌诊断的价值。
联合三者对肝癌诊断的敏感性为81.4％，特异性为91.8％，ROC的曲线下面积
(AreaUnderCurve，AUC)为0.9249。AUC值越大，表示对疾病的诊断价值越
大。三者联合的AUC值也大于miR-21(0.8378)、miR-222(0.8485)和H19(0.8392)
单独对肝癌诊断AUC。或两两组合的AUC值(miR-21+miR-222为0.8723；
miR-21+H19为0.8631；miR222+H19为0.8714)。因此，三者联合诊断肝癌的价
值大于三者分别单独或两两组合对肝癌的诊断。
作为对比实验，发明人还检测了所收集的肝癌患者的血清AFP水平。在我
们收集的肝癌患者中，只有20％的个体的血清AFP水平达到肝癌的诊断水平，
约50％的个体处于正常水平。结果如图4所示。
发明人进一步分析了不同AFP表达水平患者的唾液H19、miR-21和miR-222
检出水平，结果如图5所示。无论肝癌患者血清的AFP表达水平如何，唾液H19、
miR-21和miR-222均能检测出肝癌。它们在肝癌患者的唾液中都出现显著性高
表达。唾液H19、miR-21和miR-222均比血清AFP对肝癌更具有诊断价值。
对比例其他现有肝癌标记物的唾液样本检测结果
根据先前的研究报道，lncRNA中的MALAT1和miRNA中的miR-224在
肝癌的癌组织中也表达上调。本发明同时对它进行了研究。
组织中的表达水平研究：
挑选50例乙肝相关肝癌组织样本和50例癌旁正常肝组织样本，15例正常
肝组织(从手术切除的离肝血管瘤＞5cm的肝组织中选取)，提取其总RNA并
检测MALAT1和miR-224在各种组织中的表达水平。
结果如图7所示。结果显示，在肝组织中个，MALAT1和miR-224在癌组
织中的表达水平比在癌旁或正常肝组织的表达水平都显著增高。
唾液中的表达水平研究：
收集健康对照个体、乙肝携带者、慢性活动性乙肝患者、乙肝相关性肝硬
化患者、晚期乙肝相关性肝癌(HCC)患者、可切除乙肝相关性肝癌患者的术
前和术后的唾液各50例共350例样本。检测唾液MALAT1和miR-224在各组
中的表达水平与差异性。
结果如图8所示。结果显示，唾液MALAT1和miR-224在肝癌患者及健康
对照组中的表达均没有显著性差异，不能作为唾液取样的标记物。
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