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氧化钛溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法
    技术领域：本发明属于氧化钛溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的方法。

    背景技术：溶胶-凝胶包埋法是近年发展起来的一种有效的固定化酶方法，利用这项技术可在低温下对烷氧化物水解、浓缩能形成网络状的膜，具有生物相容性，非常适合于生物分子的固定，且制得的含酶胶膜具有物理刚性，化学惰性和可忽略的溶涨性等优点。目前已报道的溶胶-凝胶膜固定酶的生物传感器主要集中在硅烷体系，此外邓家祺等人报到了用三氧化二铝溶胶-凝胶膜固定酶，但上述两种固定酶的膜都是不导电的。为了加快酶分子与电极间的电子转移，Glezer and Lev在J.Am.Chem.Soc.1993，115，2533-2534中发表了一种以五氧化二钒胶体包埋葡萄糖氧化酶制备生物传感器的方法，由于四价钒离子有很好地电子导电性，导致该膜具有半导体的性质，适用于活性蛋白质的支持材料，据报道用此法制得的生物传感器在4℃贮存时在10天内活性没有降低。

    发明内容：本发明的目的是提供一种氧化钛溶胶-凝胶复合膜包埋酶制备生物传感器的新方法，即将异丙氧基钛水解制得的二氧化钛溶胶与含酶的聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶水溶液混合，混匀后直接滴涂于电极表面，4℃下放置24-48小时，得到含酶的均匀胶膜且牢固地粘附于电极表面，这样制备出的生物传感器灵敏度高，响应快，使用寿命可维持在一个月以上，适合于检测各种酶底物。

    本发明将20-40μl异丙氧基钛溶于10-15μl的异丙醇中，加入7-14μl0.1mol L-1盐酸和240-480μl水溶液，混匀，超声振荡1小时后，得溶胶A；另将接枝度为12.5％聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为8-10％(w/v)的水溶液，再将1-3毫克的酶，即葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、多酚氧化酶中的一种，加入100μl上述水溶液中，混匀，得溶液B；然后将溶胶A与溶液B按1∶1-2.5的比例混匀，用微量注射器移取该混合液5-10μl滴涂到基底电极表面，4℃下放置24-48小时，即制得所需的生物传感器。

    与传统的溶胶-凝胶包埋酶制备生物传感器的方法相比，本发明提出的制备生物传感器的方法具有许多优点。一方面二氧化钛是一种半导体材料，有利于促进酶分子与电极之间的电子转移；同时二氧化钛粒子具有良好的生物相容性，有利于最大程度保持生物分子活性；此外钛与酶分子表面的胺基、羧基及羟基具有配位作用，有利于酶分子的固定；另一方面聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶可以通过氢键等相互作用稳定酶，同时4-乙烯基吡啶支链在多种电极表面均有较强的吸附作用，能增强含酶胶膜在电极表面的粘附力。当把氧化钛胶体和聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶相混合时，可形成互穿网络，使酶分子牢固的固定在复合膜中。该复合膜的性质优于单独使用每一种物质的性质。

    具体实施方式如下：

    实施例1：

    葡萄糖氧化酶传感器。将30μl异丙氧基钛溶于13μl的异丙醇中，加入360μl水和10μl 0.1mol L-1盐酸混合溶液，混匀，超声振荡1小时后，得溶胶A；另将接枝度为12.5％聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为8％的水溶液，向70μl此溶液中加入2毫克的葡萄糖氧化酶，混匀，得溶液B；然后将溶胶A与溶液B按1∶2.5的比例混匀，用微量注射器移取8μl该混合液滴涂到玻碳电极表面，4℃下放置24小时，即制得葡萄糖生物传感器，可用于水相中检测葡萄糖。该生物传感器平衡时间在6分钟以内；响应时间为15秒；线性范围为5×10-6-9×10-3mol L-1；稳定性保持1个月以上。

    实施例2：

    多酚氧化酶生物传感器。将20μl异丙氧基钛溶于10μl异丙醇中，加入7μ10.1mol L-1盐酸和240μl水溶液，混匀，超声振荡1小时后，得溶胶A；另将接枝度为12.5％聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为10％的水溶液，向100μl此溶液中加入1.5毫克的多酚氧化酶混匀，得溶液B；然后将溶胶A与溶液B按1∶1的比例混匀，用微量注射器移取10μl该混合液滴涂到玻碳电极表面，4℃下放置30小时，即制得多酚氧化酶生物传感器，可用于水相中测定苯酚，儿茶酚等物质。该生物传感器平衡时间在5分钟以内；响应时间为15秒；稳定性保持2个月以上。

    实施例3：

    辣根过氧化物酶传感器。将40μl异丙氧基钛溶于15μl异丙醇中，加入14μl 0.1mol L-1盐酸和480μl水溶液，混匀，超声振荡1小时后，得溶胶A；另将接枝度为12.5％聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶配成浓度为9％的水溶液，向100μl此溶液中加入1毫克的辣根过氧化物酶，混匀，得溶液B；然后将溶胶A与溶液B按1∶2的比例混匀，用微量注射器移取5μl该混合液滴涂于石墨电极表面，4℃下放置48小时，即制得辣根过氧化物酶传感器，可用于水相中检测过氧化氢，酚，胺等物质。该生物传感器平衡时间在5分钟以内；响应时间为15秒；稳定性保持2个月以上。