牛膝活性提取物及其制备方法与用途.pdf

本发明公开了一种牛膝活性提取物，采用如下方法制备得到，步骤包括：（1）牛膝活性粗提物的制备将单味药材怀牛膝饮片粉碎，水煮浸提，将浸提液用硫酸铵分级沉淀，将沉淀透析除盐得到牛膝活性肽粗提物；（2）牛膝活性提取物的HPLC分离：使用C18制备柱进行梯度洗脱。本发明牛膝活性提取物药材来源单一，制备方法先进，工艺合理，制剂成分明确，安全性高，药理作用显著，可用于研发治疗周围神经损伤、脑血管意外（出血性中风）、缺血性脑损伤（缺血性中风）、脑创伤、视神经损伤、脊髓损伤等中枢神经损伤疾病、抗衰老、防治神经退行性变疾病的药物和保健品。

1.  一种牛膝活性提取物，其特征在于采用如下方法制备得到，步骤包括：
（1）牛膝活性粗提物的制备：将单味药材怀牛膝饮片粉碎，水煮浸提，将浸提液用硫酸铵分级沉淀，将沉淀透析除盐得到牛膝活性肽粗提物；
（2）牛膝活性提取物的HPLC分离：使用C18制备柱，流动相A为含有0.1%TFA的H₂O，流动相B为含有0.1% TFA的CH₃CN，梯度洗脱条件为：0 min：80%流动相A，20%流动相B；30 min：47%流动相A，53%流动相B；31 min：100%流动相B，收集保留时间23.35 min的组分。

2.  如权利要求1所述牛膝活性提取物，其特征在于步骤（1）使用饱和度为50%和80%的硫酸铵盐溶液进行分级沉淀。

3.  如权利要求1或2所述牛膝活性提取物在制备治疗周围神经损伤和脑血管意外、缺血性脑损伤、脑创伤、视神经损伤、脊髓损伤、中枢神经损伤及抗衰老、防治神经退行性变疾病的药物和保健品中的应用。

牛膝活性提取物及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于天然药物领域，具体涉及一种牛膝活性提取物及其用途。 
背景技术
随着现代社会的发展，人口老龄化、交通意外伤害、自然灾害、战争等因素，使得神经损伤及神经系统退行性变疾病的发生率呈显著上升趋势，寻找促进损伤神经修复和再生、预防和治疗神经系统退行性变的有效药物，是当今医药研究中引人关注的课题。 
传统药物中的植物药具有疗效确切、毒副作用小的优点，引起国内外医药界的研究兴趣，具有开发利用的广阔前景。一些植物药在治疗神经损伤、神经退行性疾病已有较多的临床报道，近年来也相继从天然药物中提取出具有神经营养或神经保护作用的有效成分。目前，分离鉴定的肽类化合物大多为动物来源，如胰岛素、脑活素、生长激素释放抑制素、多肽疫苗等，与生命活动许多环节密切相关。从植物中分离鉴定出的生物活性多肽相对较少，主要为植物寡肽、小肽、环肽、环肽生物碱、糖肽等，目前对一些重要寡肽的药理学作用研究方向主要包括抗肿瘤、抗AIDS病毒、抗菌、心血管活性和神经活性等方面。随着多肽蛋白质研究的不断深入，多肽的生物活性日益受到重视，而随着现代分离技术的不断发展，越来越多的植物多肽被分离鉴定，但迄今为止对于植物活性肽成分促神经生长、再生或发挥神经保护作用的研究还为数较少，在临床上可有效促进神经再生修复、防治神经退行性变的植物来源的肽类新药也不多见，尚不能满足临床患者的需要。 
牛膝（Achyranthes bidentata Bl.）为苋科牛膝属植物，常用其根入药，味苦、甘、酸，性平，归肝、肾经，能活血通经、补肝肾、强筋骨、利水通淋、引火下行，可用于腰膝酸痛、筋骨无力、肝阳眩晕等证。牛膝含多糖、皂苷、甾酮、甾醇、香豆素和生物碱等成分，另外还含有少量挥发油、无机盐和氨基酸（多肽或蛋白质）。目前对牛膝提取物在防治神经损伤的研究均为牛膝粗提物。申请号为CN200710019780.4，发明名称为“中药牛膝提取物及制备方法和用途”的中国专利公开了一种中药牛膝提取物及制备方法和用途，包括将单味药材怀牛膝饮片，用0～95％乙醇水溶液提取1～3次，合并提取液，经凝胶柱层析分离纯化，洗脱液经冷冻干燥，得产品，可用于制备抗衰老、防治神经退行性变疾病及治疗脑中风、视神经损伤、脊髓损伤、周围神经损伤等神经损伤性疾病的药物和保健品。文献The protective effects of Achyranthes bidentata polypeptides in an experimental model of mouse sciatic nerve crush injury.（Yuan Y，Shen H M，Yao J，[J].Brain Research Bulletin，2010，81：25-32）公开将牛膝水提物经硫酸铵沉淀，得到一种牛膝粗提物，发现对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的海马神经元细胞凋亡以及受损的小鼠坐骨神经具有保护作用。然而上述研究采用的牛膝提取物仅使用了简单的提取步骤，成分复杂，杂质多，具体是哪类物质发挥药理活性不清楚，成为药物的可能很小。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂质少，药理活性明确的可用于促进神经生长，防治神经损伤以及防止神经退行性变的牛膝活性提取物及其制备方法与用途。
本发明具体技术方案如下： 
一种牛膝活性提取物，其特征在于采用如下方法制备得到，步骤包括：
（1）牛膝活性粗提物的制备：具体的将单味药材怀牛膝饮片粉碎，于80℃水煮浸提，浸提液于4℃条件下加入硫酸铵盐粉末至形成50%饱和度的硫酸铵盐溶液，充分沉淀12 h后于4℃、15000 rpm离心30 min，去除沉淀，收集上清液。上清液中再次加入硫酸铵粉末至形成80%饱和度的硫酸铵盐溶液，充分沉淀2 h后于4℃、15000 rpm离心30 min，去除上清，收集沉淀。将沉淀用灭菌双蒸水充分溶解，移至截留分子量为1000的透析袋中，4℃纯水充分透析，至透析袋内、外液离子浓度达到平衡，收集透析袋内的保留液进行冷冻干燥，得到牛膝活性粗提物冻干粉；
（2）牛膝活性提取物的HPLC分离：使用C18制备柱，流动相A为含有0.1% TFA的H₂O，流动相B为含有0.1% TFA的CH₃CN，梯度洗脱条件为：0 min：80%流动相A，20%流动相B；30 min：47%流动相A，53%流动相B；31 min：100%流动相B，收集保留时间29.0 min的组分。
本发明还提供了上述牛膝活性提取物在制备治疗周围神经损伤和脑血管意外、缺血性脑损伤、脑创伤、视神经损伤、脊髓损伤、中枢神经损伤及抗衰老、防治神经退行性变疾病的药物和保健品中的应用。 
本发明优点： 
本发明采用高效液相的方法对牛膝粗提物进行分离，去除了大量的杂质，提取物主要成分为蛋白质和肽类，经实验证明，本发明所述牛膝活性提取物具有促进神经生长、防止神经元凋亡、促进损伤的周围神经再生，防治中枢神经损伤的作用，其药材来源单一，制备方法先进，工艺合理，制剂成分明确，安全性高，药理作用显著，可用于研发治疗周围神经损伤、脑血管意外（出血性中风）、缺血性脑损伤（缺血性中风）、脑创伤、视神经损伤、脊髓损伤等中枢神经损伤疾病、抗衰老、防治神经退行性变疾病的药物和保健品。
附图说明
图1为牛膝活性提取物HPLC液相色谱图。 
图2为牛膝活性提取物促进背根神经节突起生长示意图（A. 阴性对照组，B. 牛膝活性提取物2 ng/ml组，C. 牛膝活性提取物10 ng/ml组，D. 牛膝活性提取物50 ng/ml组，E. NGF 10 ng/ml组）。 
图3为牛膝活性提取物对背根神经节突起生长的作用。 
图4为牛膝活性提取物对DRG神经元GAP43和PSD95蛋白表达的影响。 
图5为牛膝活性提取物对小鼠坐骨神经夹伤后感觉功能恢复的作用。 
图6为牛膝活性提取物对小鼠坐骨神经夹伤后SFI恢复的作用。 
图7 为牛膝活性提取物对小鼠坐骨神经夹伤后夹伤部位近、远端CMAP的影响。 
图8为牛膝活性提取物对小鼠坐骨神经夹伤后神经再生的影响（A. 正常侧神经；B-F，术侧神经：B. 生理盐水组；C. 牛膝活性提取物低剂量组；D. 牛膝活性提取物中剂量组；E. 牛膝活性提取物高剂量组；F. 弥可保组，bar=5 μm。与生理盐水组相比，* p<0.05）。 
图9为牛膝活性提取物对小鼠坐骨神经夹伤后靶肌肉萎缩的影响（A. 正常侧肌肉；B-F，术侧肌肉：B. 生理盐水组；C. 牛膝活性提取物低剂量组；D. 牛膝活性提取物中剂量组；E. 牛膝活性提取物高剂量组；F. 弥可保组，bar=20 μm。与生理盐水组相比，* P<0.05）。 
图10为牛膝活性提取物对OGD损伤皮层神经元形态学的影响。 
图11为牛膝活性提取物对OGD损伤皮层神经元活力的影响。 
图12为牛膝活性提取物对OGD损伤皮层神经元凋亡的影响。 
图13为牛膝活性提取物对OGD损伤皮层神经元cleaved caspase-3蛋白表达的影响。 
图14为牛膝活性提取物对MCAO大鼠的脑保护作用。 
图15为牛膝活性提取物对MCAO大鼠脑组织cleaved caspase-3蛋白表达的影响。 
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的应用范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 
实施例1 牛膝活性提取物的制备
（1）牛膝活性粗提物的制备：将单味药材怀牛膝饮片粉碎，于80℃水煮浸提，浸提液于4℃条件下加入硫酸铵盐粉末至形成50%饱和度的硫酸铵盐溶液，充分沉淀12 h后于4℃、15000 rpm离心30 min，去除沉淀，收集上清液。上清液中再次加入硫酸铵粉末至形成80%饱和度的硫酸铵盐溶液，充分沉淀2 h后于4℃、15000 rpm离心30 min，去除上清，收集沉淀。将沉淀用灭菌双蒸水充分溶解，移至截留分子量为1000的透析袋中，4℃纯水充分透析，至透析袋内、外液离子浓度达到平衡，收集透析袋内的保留液进行冷冻干燥，得到牛膝活性粗提物冻干粉；
（2）牛膝活性提取物的HPLC分离：使用C18制备柱（XBridge Prep C18 5 μm, 10×150 mm），流动相A为含有0.1% TFA的H₂O，流动相B为含有0.1% TFA的CH₃CN，梯度洗脱条件为：0 min：80%流动相A，20%流动相B；30 min：47%流动相A，53%流动相B；31 min：100%流动相B，收集保留时间29.0 min的组分。
实施例2 牛膝活性提取物对新生1天的大鼠背根神经节突起生长的促进作用
无菌条件下取新生1天的大鼠双侧背根神经节，置于DMEM基础培养基中，解剖显微镜下仔细剥去神经根及神经外膜，接种于预先用多聚赖氨酸包被的96孔培养板中，每孔1个，加入100 μl含有10% FBS的DMEM培养基，37℃，5%CO₂培养箱中培养，6 h后背根神经节贴壁，将培养基换成含有不同浓度牛膝活性提取物的neurobasal培养基（牛膝活性提取物浓度分别为2 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml），加入含有10 ng/ml NGF的neurobasal者为阳性对照组，neurobasal为阴性对照组。
培养24h，48h及72h后，分别采用生长相关蛋白(growth associated protein 43, GAP43)免疫细胞化学染色，荧光显微镜下观察背根神经节，采用图像分析系统测量并分析突起生长的情况，如图2所示（A. 阴性对照组，B. 牛膝活性提取物2 ng/ml组，C. 牛膝活性提取物10 ng/ml组，D. 牛膝活性提取物50 ng/ml组，E. NGF 10 ng/ml组），结果显示，培养不同时间后，牛膝活性提取物能显著促进背根神经节突起的生长。 
对培养72 h的背根神经节突起生长情况进行统计，结果如图3所示（与阴性对照组相比，*p<0.05），结果表明牛膝活性提取物能显著促进新生1天的大鼠背根神经节突起生长。 
实施例3牛膝活性提取物对新生1天的大鼠背根神经节神经元生长的促进作用
无菌条件下取新生1天大鼠双侧背根神经节，置于DMEM基础培养基中，加入0.1 %胶原酶和0.125 %胰蛋白酶37℃消化30 min，加入含10% FBS的DMEM完全培养基终止消化，所得细胞用DMEM基础培养基清洗2遍，调整细胞密度为5×10⁶，移入预先用多聚赖氨酸包被的6孔培养板继续培养，6 h后背根神经节贴壁，将培养基换成含有不同浓度牛膝活性提取物的neurobasal培养基（牛膝活性提取物浓度分别为2 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml），加入含有10 ng/ml NGF的neurobasal者为阳性对照组，neurobasal为阴性对照组。
牛膝活性提取物处理分离培养的DRG神经元24 h后终止培养，提取总蛋白并用Bradford法测定总蛋白浓度，将蛋白上清溶于1×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，进行12% SDS-PAGE电泳，再将蛋白湿法转移至PVDF膜，5% 脱脂奶粉封闭后，依次加入一抗（mouse anti GAP43 monoclonal antibody, 1:200; mouse anti monoclonal PSD95, 1:1000）及二抗（HRP goat-anti-mouse IgG, 1:200; HRP-goat-anti-rabbit IgG, 1:200），以GAPDH（1:200）作为内参，最后用ECL法显色，压片、曝光、显影，GS800 Calibrated Densitometer扫描仪（BIO-RAD）进行灰度扫描，PDQuest 7.2.0软件分析结果如图4所示（与阴性对照组相比，*p<0.05-），结果表明10 ng/ml和50 ng/ml的牛膝活性提取物能显著增加DRG神经元生长相关蛋白43（GAP43）和突触后致密蛋白95（PSD95）的表达量。 
实施例4 牛膝活性提取物对坐骨神经夹伤的小鼠神经再生的促进作用
ICR小鼠50只，雌雄各半，行坐骨神经夹伤术：动物以复合麻醉剂（赛拉嗪10 mg/kg，氯胺酮95 mg/kg，乙酰丙嗪0.7 mg/kg）腹腔注射麻醉。无菌条件下，左臀部作一1 cm切口，在距梨状肌下缘0.3 cm处以一特制止血钳，钳夹坐骨神经30秒，挤压损伤的宽度为2 mm。损伤远端以9-0显微缝线在神经外膜上作一标记，缝合切口。术后随机分为五组：牛膝活性提取物高、中、低剂量组（剂量分别为10 mg/kg、5 mg/kg、2.5 mg/kg），弥可保组（0.13 mg/kg，按体表面积折算相当于临床人推荐剂量），阴性对照组（给予生理盐水）。每日腹腔注射给药，连续20天。术后每日行撤足反射实验，检测小鼠术侧肢体感觉功能的恢复；术后第5、10、15、20天行足迹实验，检测小鼠坐骨神经功能指数(sciatic function index, SFI)的恢复；术后第21天行电生理学检测，评价小鼠术侧神经近远侧端复合肌动作电位幅度的恢复；并行组织形态学方法及电镜检查，观察牛膝活性提取物对损伤侧坐骨神经再生和靶肌肉萎缩的影响。
术后每日行撤足反射实验，以带有0.1 mA的弱电流的两个电极（间隔3 mm）刺激小鼠术侧足底，以小鼠脚掌回缩为感觉恢复的标志，记录每日感觉恢复的小鼠数量。结果显示，牛膝活性提取物能促进小鼠感觉功能的恢复，高剂量牛膝活性提取物组第7天开始出现小鼠术侧感觉功能的恢复，至第10天已有70%的小鼠术侧感觉功能恢复，如图5所示。 
 术后第5、10、1、15、20天分别行足迹实验。小鼠双侧后足蘸红色印泥行走后每侧足留下8-10个足印，测量双侧足印长度（print length, PL）和足趾宽度（toe spread, TS），将上述四个变量代入Bain公式计算出坐骨神经功能指数（sciatic function index, SFI）：SFI=-51.2（EPL-NPL）/NPL+118.9（ETS-NTS）/NTS-7.5。公式中各变量前E代表术侧，N代表健侧。SFI以0为正常值，-100为神经完全断离的指标。足迹实验结果显示，牛膝活性提取物能促进小鼠坐骨神经功能的恢复。结果显示，牛膝活性提取物能显著促进小鼠坐骨神经功能的恢复，如图6所示（与生理盐水组相比，*p<0.05）。 
 术后第21天，室温条件下以肌电图仪行电生理学检测。在麻醉条件下钝性分离出小鼠损伤侧和正常侧坐骨神经。将记录电极插入腓肠肌内，刺激电极分别置于损伤神经的近侧和远侧端，用超强刺激强度刺激数次，分别记录近端和远端动作电位幅度（CMAP，mV）。结果显示，牛膝活性提取物能够促进小鼠损伤神经远端CMAP的恢复，如图7所示（与正常侧相比，# p<0.05；与生理盐水组相比，* p<0.05）。 
 术后21天，每组随机取两只小鼠，切取其夹伤远端神经约3 mm，戊二醛固定，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片定位，半薄切片，铀-铅复染，透射电镜观察。结果显示，牛膝活性提取物能显著促进损伤神经的再生，增加再生有髓神经纤维的髓鞘厚度和髓鞘板层数目，如图8所示（A. 正常侧神经；B-F，术侧神经：B. 生理盐水组；C. 牛膝活性提取物低剂量组；D. 牛膝活性提取物中剂量组；E. 牛膝活性提取物高剂量组；F. 弥可保组，bar=5 μm。与生理盐水组相比，* p<0.05）。 
术后21天，小鼠用4％多聚甲醛灌注固定，取双侧腓肠肌，石蜡包埋，横切作HE染色，利用Leica Qwin图像分析系统进行肌细胞截面积测定。结果显示，牛膝活性提取物能显著增加腓肠肌肌细胞截面积，有效防止神经损伤后靶肌肉的萎缩，如图9所示（A. 正常侧肌肉；B-F，术侧肌肉：B. 生理盐水组；C. 牛膝活性提取物低剂量组；D. 牛膝活性提取物中剂量组；E. 牛膝活性提取物高剂量组；F. 弥可保组，bar=20 μm。与生理盐水组相比，* P<0.05）。 
实施例5 牛膝活性提取物对原代培养的胚胎17天大鼠皮层神经元缺血缺氧损伤的保护作用
皮层神经元的正常培养：取孕16-18天SD系大鼠的胚胎皮层组织，经0.25%胰蛋白酶消化、吹打，制备皮层神经元单细胞悬液，用DMEM高糖完全培养基（含10%胎牛血清）接种于以L-多聚赖氨酸包被处理过的培养皿或培养板中，置于5％CO₂、饱和湿度、37℃培养箱内培养。培养4h至细胞贴壁后，换神经元培养液（Neurobasal+2% B27）培养3 d，观察神经元生长状况。换用阿糖胞苷培养液(终浓度2.5 μg/ml，换半液)培养3 d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞。每隔3 d换全培养液1次，每次换半液。经神经元免疫化学鉴定，皮层神经元的纯度达到90%以上。
皮层神经元氧糖剥夺（OGD）损伤处理： 
①吸出原来的培养基，用无糖DMEM基础培养基漂洗细胞两次，每次5分钟；
②各OGD损伤组均加入DMEM无糖培养基，置于Billups-Rothenberg 厌氧培养小室中，充以95% N₂ / 5％ CO₂ 20 min并密闭作用6 h。光学显微镜下观察培养的神经元，如图10所示（×20），正常的皮层神经元胞体表面光洁，突起交织成网络状，胞体透亮，折光性明显。当细胞在OGD条件下培养6 h后，可见部分细胞胞体逐渐减小，细胞突起淡化、减少或消失，折光性下降，已有部分细胞死亡；牛膝活性提取物处理组（1.0 μg/ml）和尼莫地平组（80 μg/ml）与OGD损伤组相比，也有部分细胞突起回缩，但细胞胞体皱缩较少，贴壁较多，细胞死亡数明显减少。
 皮层神经元的活力分析：每孔加入0.5 mg/ml MTT溶液100 μl，继续培养4 h；加20％SDS溶液100 μl（助溶剂50％二甲基甲酰胺），在37℃下放置20 h；酶标仪上570 nm波长下测定每孔样品的光密度（OD）值。每个实验组设6个复孔，实验重复3次。结果显示：OGD损伤后6 h，皮层神经元活力明显下降（p <0.01）；预先加入牛膝活性提取物，可有效拮抗OGD损伤所引起的皮层神经元活力的下降，在所观察测量范围内，随着牛膝活性提取物剂量的增加，其保护作用越明显，结果见图11（与正常对照组相比，# p<0.01；与OGD损伤组相比，* p<0.05，** p<0.01）。 
TUNEL 染色： 
细胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗细胞三遍，按照TUNEL检测试剂盒的说明染色。于激光共聚焦显微镜下观察拍照（激发波长520±20 nm，发射波长>620 nm）。每组设3个复孔，每孔随机选10个视野，每个视野细胞计数不少于100个，计算凋亡细胞占总细胞的百分比。实验重复3次。结果显示：正常对照组TUNEL阳性细胞数量很少，OGD损伤6 h后，TUNEL阳性细胞数量明显增多，随机选取10个视野，每个视野细胞计数不少于100个，对凋亡细胞的比率进行计算。牛膝活性提取物组（1.0 μg/ml）的TUNEL阳性细胞数量与OGD损伤组相比明显减少，表明牛膝活性提取物可有效地保护OGD损伤所引起的皮层神经元凋亡，如图12所示（与正常对照组相比，# p<0.01；与OGD损伤组相比，* p<0.05，** p<0.01）。
 Western blotting分析： 
①总蛋白提取及蛋白浓度测定：各组经相应处理后移去培养基，以预冷的0.01M PBS漂洗一遍，移去PBS，加入细胞蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度；
②SDS-PAGE和Western blot分析：将蛋白上清溶于2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，各取上清10 μl进行15% SDS-PAGE。采用半干转移至PVDF膜90 min，转膜结束后，室温下用25ml TBS/T漂洗5 min后，将PVDF膜放入含有5%脱脂奶粉的TBS/T中，4℃包被过夜。TBS/T漂洗5min×3次，采用anti-cleaved caspase3 antibody（1：1000），一抗4℃过夜。TBS/T漂洗5 min×3次，相应二抗 IRDye 800 Conjugated Affinity Purified Donkey Anti-Rabbit IgG（1：10000），室温1.5 h。TBS/T漂洗5 min×3次。显色后，Odyssey Infrared Imaging System（Rockland，USA）进行灰度扫描，PDQuest7.2.0软件分析结果。以β-actin作为内参，相同实验重复4次。结果显示：OGD损伤后6 h，cleaved caspase-3蛋白表达与正常对照组相比明显增强，而牛膝活性提取物预处理能显著拮抗OGD损伤引起的皮层神经元cleaved caspase-3蛋白表达的增强，并呈现一定的剂量相关性，如图13所示（与正常对照组相比，# p<0.01；与OGD损伤组相比，* p<0.05，** p<0.01）。
 实施例6 牛膝活性提取物对大脑中动脉栓塞后再灌注的大鼠的脑保护作用
大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型的制备：SD雄性大鼠，200±20 g，随机分为假手术组、MCAO组、牛膝活性提取物组和尼莫地平组。分别给牛膝活性提取物组和尼莫地平组大鼠再灌注前静脉注射牛膝活性提取物（0.2 mg/kg）和尼莫地平（1 mg /kg），其他两组注射等容量0.9%氯化钠注射液。MCAO模型制备如下：术前12小时禁食，自由进水。10%水合氯醛麻醉（5 ml/kg）。将大鼠置于鼠板上固定。颈部备皮，颈部正中切口，分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，分离翼腭动脉及入颅支。动脉夹夹住颈总动脉、颈内动脉。颈外动脉远心端结扎，切断。在颈外动脉近心端，插入尼龙线（线上包被0.1%多聚赖氨酸，尼龙线插入长度20-22 mm，线直径0.3 mm，酒精清洁后置生理盐水备用），尼龙线经颈内动脉进入入颅支，感到有阻力时停止。将尼龙线固定好，打开动脉夹。缺血2 h后拔出尼龙线，血液从颈总动脉通过颈内动脉入颅。再灌注24 h后，麻醉处死。
神经行为学评分：术后24 h，进行Longa评分。评分标准： 0分＝无神经损伤，1分＝左前肢伸展障碍，2分＝向左打圈，3分＝行走时向左侧倾倒，4分＝意识昏迷，5分＝死亡。 
脑梗死面积测定：断头取大脑，-20℃ 冷冻20 min 后，行厚1. 5 mm的冠状切片。将脑片立即置于0.5% 的TTC 磷酸盐缓冲液中，避光， 37℃孵育20 min，正常脑组织染为深红色，脑梗死区不染色（灰白色）。脑梗死面积计算，[(Vc-Vl)/Vc] ×100，其中Vc代表正常侧大脑半球体积，Vl代表手术侧大脑半球体积。结果显示：SD大鼠MCAO 2h，再灌注24 h后，对脑片进行TTC染色发现手术侧大脑半球出现明显梗死灶，而牛膝活性提取物能够明显减轻梗死灶体积，同时牛膝活性提取物组的大鼠死亡率与MCAO组相比明显减少，术后行为学评分与MCAO组相比也明显下降，其保护作用接近于尼莫地平组，提示牛膝活性提取物对大脑中动脉栓塞后再灌注的大鼠具有一定的脑保护作用，如图14所示（与MCAO组相比，* p<0.01)。 
Western blotting分析： 
①总蛋白提取及蛋白浓度测定：各组经相应处理后取脑组织，加入组织蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂提取总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度；
②SDS-PAGE和Western blot分析：将蛋白上清溶于2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，各取上清10 μl进行15% SDS-PAGE。采用半干转移至PVDF膜90 min，转膜结束后，室温下用25 ml TBS/T漂洗5 min后，将PVDF膜放入含有5%脱脂奶粉的TBS/T中，4℃包被过夜。TBS/T漂洗5 min×3次，采用anti-cleaved caspase3 antibody（1：1000），一抗4℃过夜。TBS/T漂洗5 min×3次，相应二抗 IRDye 800 Conjugated Affinity Purified Donkey Anti-Rabbit IgG（1：10000），室温1.5 h。TBS/T漂洗5min×3次。显色后，Odyssey Infrared Imaging System（Rockland，USA）进行灰度扫描，PDQuest7.2.0软件分析结果。以β-actin作为内参，相同实验重复4次。结果显示MCAO 2 h再灌注24 h后，cleaved caspase-3蛋白表达与正常对照组相比明显增强，而牛膝活性提取物预处理能显著拮抗MCAO损伤引起的脑组织cleaved caspase-3蛋白表达的增强，如图15所示（与正常对照组相比，#  p<0.01；与MCAO组相比，* p<0.01）。